KR20190137112A - 주사가능 세포 및 스캐폴드 조성물 - Google Patents

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Abstract

본원에서 제공되는 것은 특히 생체활성 세포 군집과 같은 활성 작용제를 함유하는 치료 제제, 및 그의 제조 및 사용 방법이다.

Description

주사가능 세포 및 스캐폴드 조성물
[관련 출원의 상호-참조]
본 출원은 2017년 3월 31일자 U.S. 특허 가출원 제62/480,166호의 우선권 혜택을 주장하는 바, 그 전체 내용이 전체적으로 참조로써 개재된다.
[기술 분야]
본 발명은 특히 신장 질환을 치료하기 위한 세포, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
만성 신장 질환 (CKD)은 미국에서 1천 9백만명이 넘는 사람들에게 영향을 주고 있는데, - 세계적으로 상승 추세에 있기도 한 3대 질환인 - 비만, 당뇨병 및 고혈압과 연관되는 대사 장애의 결과인 경우가 많다 (문헌 [United States Renal Data System: Costs of CKD and ESRD. ed. Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2007 pp 223-238]). 비만, 고혈압 및 저조한 혈당 조절은 모두 사구체 및 요세관 병변을 야기하며 단백뇨, 및 신장 여과 기능의 전신성으로-검출가능한 기타 변경으로 이어지는 신장 손상의 독립적인 위험 인자인 것으로 나타나 있다 (문헌 [Aboushwareb, et al., World J Urol, 26: 295-300, 2008]; [Amann, K. et al., Nephrol Dial Transplant, 13: 1958-66, 1998]).
통상적으로, 만성 신장 부전의 치료에 대한 임상적 접근법은 신장 여과 및 소변 생성의 복구를 위한 투석 및 신장 이식, 그리고 적혈구량을 복구하기 위한 재조합 EPO 또는 EPO 유사체의 전신성 전달을 포함한다. 투석은 중간-에서-후기 단계 신장 부전 환자에게 생존상의 이익을 제공하나, 심각한 삶의-질 문제를 야기한다. 신장 이식은 더 후기 단계의 신장 부전이 있는 환자들이 고도로 소망하는 (그리고 종종 유일한) 선택사항이지만, 고-품질 공여자 신장의 공급이 신장 부전 군집의 수요를 충족하지 못하고 있다. 빈혈을 치료하기 위한 재조합 EPO의 일시주사 투여는 현재 약물에 대한 FDA의 블랙 박스 경고문(black box warning)으로 이어지는 심각한 후속 건강 위험성과 연관되어 있어서, 이와 같은 군집에서의 적혈구 항상성을 복구하기 위한 대안 치료에 대한 추가적인 조사를 필요로 하고 있다.
더 최근에는, 실질적이며 지속적인 신장 기능의 강화를 제공하며 질환의 진행을 늦추고 이와 같은 환자 군집에서의 삶의 질을 향상시키는, 조직 공학 적용분야와 연관되어 있는 새로운 치료 패러다임들이 기술되고 있다. 단리된 생체활성 신장 세포는 만성 신장 질환의 치료를 위한 예비 세포-기재 재생 치료법을 대표한다 (프레스넬(Presnell) 등의 WO/2010/056328호; 일라간(Ilagan) 등의 PCT/US2011/036347호). 그러나, 그와 같은 세포-기재 치료법은 생체 외에서 그리고 표준 세포 배양 환경의 부재하에서 지속적이며 생리학적으로 적절한 생체활성이 유지되는 것을 필요로 한다. 생물학적으로 뒷받침하는 제제 또는 캐리어 없이는 세포-기재 치료 제품으로서의 생체활성 세포의 포장시 생성물 효능이 상실될 수 있다. 이에 따라, 예를 들면 조직 공학 및 재생 의학 적용분야를 위한 생체활성 세포와 같은 생체활성 작용제의 필요로 하는 대상체에의 전달에 적합한 치료 제제에 대한 필요성이 존재한다. 신-신장 강화제(neo-kidney augment) (NKA)로의 단리된 생체활성 신장 및/또는 비-신장 세포의 제제화는 강화된 세포의 안정성을 제공함으로써, 생성물 저장 수명을 연장하고, 수송 동안, 그리고 임상 적용을 위한 표적 기관 또는 구성체로의 전달 동안의 안정성을 향상시킬 수 있다.
[발명의 개요]
본 개시내용은 일반적으로 특히 생체활성 세포 군집에 대하여 지지하는 3차원 환경을 제공함으로써 신장 질환의 개선을 위한 치료 생성물로서의 세포 분획의 생물학적 효능 연장을 촉진하는 매트릭스, 젤 또는 스캐폴드(scaffold)와 복합체화된 생물학적으로 활성인 신장 및/또는 비-신장 세포 조성물로 구성되는, 신장 구조 및/또는 기능의 재생, 복구 및/또는 구제를 위한 조합 재생 구성체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 주사가능 제제이다. 특정 실시양태에서, 상기 제제는 a) 온도-민감성 세포-안정화 생체재료 및 b) 생체활성 신장 세포 (BRC) 군집을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 온도-민감성 세포-안정화 생체재료는 (i) 약 8 ℃ 이하에서는 실질적으로 고체인 상태를 유지하며, 여기서 상기 실질적으로 고체인 상태는 젤 상태이고, (ii) 대략 주변 온도 이상에서는 실질적으로 액체인 상태를 유지하며, (iii) 약 8 ℃ 내지 대략 주변 온도 이상에서는 고체-에서-액체 전이 상태를 가지는 수화젤(hydrogel)이다. 특정 실시양태에서, 상기 수화젤은 재조합 기원의 세포외 매트릭스 단백질을 포함하거나, 신장 또는 또 다른 조직 또는 기관으로부터 기원하는 세포외 매트릭스로부터 유래하거나, 또는 젤라틴을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 젤라틴은 유형 I 알파 I 콜라겐으로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 상기 BRC (예컨대 선택된 신장 세포 군집(selected renal cell population))는 생체재료로 코팅되거나, 그 위에 침착되거나, 그에 매립되거나, 그에 부착되거나, 시딩되거나, 또는 그에 포획된다. 특정 실시양태에서, 상기 생체재료는 다공성 발포체, 젤, 액체, 비드 또는 고체로서 구성된다.
특정 실시양태에서, 젤라틴은 돼지 유형 I 알파 I 콜라겐 또는 재조합 인간 유형 I 알파 I 콜라겐으로부터 유래한다.
특정 실시양태에서, BRC는 선택된 신장 세포 (SRC) 군집이다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC 군집은 개시 신장 세포 군집과 비교하였을 때 1종 이상의 세포 군집을 더 큰 백분율로 함유하며, 1종 이상의 다른 세포 군집은 없거나 결핍되어 있다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC 군집에는 요세관 신장 세포(tubular renal cell)가 보강되어 있다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC 군집은 요세관 신장 세포를 표시하는 세포 형태구조를 나타낸다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC 군집은 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커의 표현형 발현을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커는 CK18 및/또는 GGT1을 포함한다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC 군집은 생존가능하며 대사적으로 활성인 신장 세포를 표시하는 세포 성장 동역학(cell growth kinetics)을 나타낸다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC 군집은 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커의 표현형 발현을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커는 VEGF 및/또는 KIM-1을 포함한다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC 군집은 LAP 및/또는 GGT 효소 활성을 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, 젤라틴은 약 0.5 % 내지 약 1 % (w/v)로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 젤라틴은 약 0.8 % 내지 약 0.9 % (w/v)로 제제 중에 존재한다. 특정 실시양태에서, 제제는 추가로 세포 생존력 작용제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포 생존력 작용제는 항산화제, 산소 캐리어, 성장 인자, 세포-안정화 인자, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 항-염증 작용제, 면역억제제, 혈관생성 인자 및 상처 치유 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 생존력 작용제는 인간 혈장, 인간 혈소판 용해물, 소 태아 혈장 또는 소 뇌하수체 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제제는 신장 세포 군집에 의해 분비되는 생성물을 포함한다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 이식가능한 제제이다. 특정 실시양태에서, 상기 제제는 a) 인간 또는 동물 기원의 탈세포화된 신장, 또는 3차원 바이오프린팅(bioprinting)을 통하여 구조적으로 조작된 세포-안정화 생체재료 및 b) BRC 군집을 포함한다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 주사가능 제제이다. 특정 실시양태에서, 상기 제제는 a) 유형 I 알파 I 콜라겐으로부터 유래되는 약 0.88 % (w/v)의 젤라틴을 포함하는 생체재료 및 b) SRC 군집을 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, SRC 군집은 요세관 신장 세포의 보강된 군집을 포함하며, 약 1.04 g/mL를 초과하는 밀도를 가진다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 온도-민감성 세포-안정화 생체재료 및 생체활성 신장 세포 혼합물을 포함하는 주사가능 제제의 제조 방법으로써, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: i) 공여자/수용자로부터 신장 피질 조직을 수득하는 단계; ii) 효소 분해에 의해 상기 신장 조직으로부터 신장 세포를 단리하고, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 신장 세포를 증식시키는 단계; iii) 수확된 신장 세포를 밀도 경계 또는 밀도 계면 또는 단일 단계 불연속 구배를 가로지르는 분리에 적용하여 SRC 군집을 수득하는 단계; 및 iv) 생체활성 세포를 젤라틴-기재 수화젤 생체재료와 재구성하는 단계이며, 여기서 상기 젤라틴은 유형 I 알파 I 콜라겐으로부터 유래되는 것인 단계.
특정 실시양태에서, 선택된 신장 세포는 요세관 신장 세포의 보강된 군집을 포함하며, 약 1.04 g/mL를 초과하는 밀도를 가진다.
특정 실시양태에서, 상기 수확된 신장 세포는 밀도 경계 또는 밀도 계면 또는 연속 또는 불연속 단일 단계 또는 다단계 밀도 구배를 가로지르는 분리 전에, 저산소 배양 조건에 노출된다.
특정 실시양태에서, 신장 세포는 요세관 신장 세포가 보강된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 세포 증식 동안 신장 세포의 세포 형태구조를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 신장 세포는 요세관 신장 세포를 표시하는 세포 형태구조를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 각 세포 계대에서 신장 세포의 세포 성장 동역학을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 대사 활성의 평가를 위해 시약을 사용하여 신장 세포 계수 및 생존율을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커의 표현형 발현에 대하여 신장 세포를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커는 VEGF 및/또는 KIM-1을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커의 표현형 발현에 대하여 신장 세포를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커는 CK18 및/또는 GGT1을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 유전자 발현 프로파일링 또는 효소 활성의 측정에 의해 신장 세포 기능성을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 측정되는 효소 활성은 LAP 및/또는 GGT에 대한 것이다.
특정 실시양태에서, 신장 세포는 자가 또는 동종이형 신장 샘플로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 신장 세포는 비-자가 신장 샘플로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 상기 샘플은 신장 생검에 의해 수득된다.
특정 실시양태에서, SRC는 26-30 ℃에서 액화된 젤라틴 용액에 재현탁된다. 특정 실시양태에서, SRC는 100 x 106개 세포/ml의 SRC 농도를 달성하도록 충분한 젤라틴 용액에 재현탁된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 SRC/젤라틴 용액을 빠르게 냉각시킴으로써 SRC가 저장시 젤에 현탁되어 유지되게 되도록 생체재료를 안정화하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 제제는 2-8 ℃의 온도 범위에서 저장된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 세포 생존력 작용제의 첨가를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포 생존력 작용제는 항산화제, 산소 캐리어, 성장 인자, 세포-안정화 인자, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 항-염증 작용제, 면역억제제, 혈관생성 인자 및 상처 치유 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 생존력 작용제는 인간 혈장, 인간 혈소판 용해물, 소 태아 혈장 또는 소 뇌하수체 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 대상체에서의 신장 질환의 치료 방법으로써, 상기 방법은 본원에서 개시되는 제제, 조성물 또는 세포 군집을 대상체에게 주사하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 제제, 조성물 또는 세포 군집은 18 내지 30 게이지 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 20 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 21 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 22 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 23 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 24 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 25 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 26 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 27 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 28 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 29 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 20 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 21 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 22 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 23 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 24 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 25 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 26 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 27 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 28 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 29 게이지인 바늘을 통하여 주사된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 온도-민감성 세포-안정화 생체재료, 및 생체활성 신장 세포 군집 (BRC)을 포함하는 조성물을 포함하는 주사가능 제제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 주사가능 제제 중 생체활성 신장 세포 군집은 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 증식된 신장 세포의 분리 (예컨대 단일-단계 불연속 밀도 구배 분리) 후에 수득되는 선택된 신장 세포 (SRC) 군집이다. 실시양태에서, 상기 SRC는 대략 1.04 g/mL를 초과하는 부력 밀도(buoyant density)를 나타낼 수 있다. 실시양태에서, SRC는 대략 1.0419 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타낼 수 있다. 실시양태에서, SRC는 대략 1.045 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC 주사가능 제제는 개시 신장 세포 군집과 비교하였을 때, 1종 이상의 세포 군집을 더 큰 백분율로 함유하며, 1종 이상의 다른 세포 군집은 없거나 결핍되어 있다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC는 요세관 신장 세포가 보강될 수 있다. BRC 또는 SRC는 요세관 신장 세포를 표시하는 세포 형태구조를 나타낼 수 있고/거나, 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커의 표현형 발현을 특징으로 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커는 CK18 및/또는 GGT1을 포함한다.
특정 실시양태에서, 주사가능 제제의 BRC 또는 SRC는 생존가능하며 대사적으로 활성인 신장 세포를 표시하는 세포 성장 동역학을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, BRC 또는 SRC는 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커의 표현형 발현을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커는 VEGF 및/또는 KIM-1을 포함한다. 주사가능 제제의 특정 실시양태에서, 상기 BRC 또는 SRC 기능성은 유전자 발현 프로파일링 또는 효소 활성의 측정에 의해 추가로 확인될 수 있다. 측정되는 효소 활성은 LAP 및/또는 GGT에 대한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 주사가능 제제의 BRC 또는 SRC는 자가 또는 동종이형 신장 샘플로부터 유래한다. 일부 다른 실시양태에서, BRC 또는 SRC는 비-자가 신장 샘플로부터 유래한다. 상기 샘플은 신장 생검에 의해 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 주사가능 제제 중 온도-민감성 세포-안정화 생체재료는 약 8 ℃ 이하에서는 실질적으로 고체인 상태를, 그리고 대략 주변 온도 이상에서는 실질적으로 액체인 상태를 유지한다. 특정 실시양태에서, 상기 생체재료는 약 8 ℃ 내지 대략 주변 온도 이상에서는 고체-에서-액체 전이 상태를 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 고체인 상태는 젤 상태일 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 젤라틴-기재 수화젤을 포함한다. 젤라틴은 약 0.5 % 내지 약 1 % (w/v)로 제제 중에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 젤라틴은 약 0.8 % 내지 약 0.9 % (w/v)로 제제 중에 존재한다.
하나 이상의 실시양태에서, 주사가능 제제 중 생체활성 세포는 세포-안정화 생체재료의 부피 전체에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분산된다. 일부 실시양태에서, 주사가능 제제는 세포 생존력 작용제를 추가로 포함한다. 상기 세포 생존력 작용제는 항산화제, 산소 캐리어, 성장 인자, 세포-안정화 인자, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 항-염증 작용제, 면역억제제, 혈관생성 인자 및 상처 치유 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 생존력 작용제는 인간 혈장, 인간 혈소판 용해물, 소 태아 혈장 또는 소 뇌하수체 추출물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 주사가능 제제는 약 0.88 % (w/v)의 젤라틴을 포함하는 생체재료, 및 생체활성 신장 세포 군집 (BRC)을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 BRC는 요세관 신장 세포의 보강된 군집을 포함하고, 약 1.04 g/mL를 초과하는 밀도를 가진다. 특정 실시양태에서, 주사가능 제제는 약 0.88 % (w/v)의 젤라틴을 포함하는 생체재료, 및 생체활성 신장 세포 군집 (BRC)을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 BRC는 요세관 신장 세포의 보강된 군집을 포함하고, 약 1.0419 g/mL 또는 약 1.045 g/mL를 초과하는 밀도를 가진다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 온도-민감성 세포-안정화 생체재료 및 생체활성 신장 세포 혼합물을 포함하는 주사가능 제제의 제조 방법에 관한 것으로써, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: i) 공여자/수용자로부터 신장 피질 조직을 수득하는 단계; ii) 효소 분해에 의해 상기 신장 조직으로부터 신장 세포를 단리하고, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 신장 세포를 증식시키는 단계; iii) 수확된 신장 세포를 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의한 분리에 적용하여 선택된 신장 세포 (SRC)를 수득하는 단계; 및 iv) 생체활성 세포를 젤라틴-기재 수화젤 생체재료와 재구성하는 단계. 실시양태에서, 선택된 신장 세포는 요세관 신장 세포의 보강된 군집을 포함할 수 있으며, 약 1.04 g/mL를 초과하는 밀도를 가진다. 선택된 신장 세포는 요세관 신장 세포의 보강된 군집을 포함할 수 있으며, 약 1.0419 g/mL 또는 1.045 g/mL를 초과하는 밀도를 가진다. 특정 실시양태에서, 상기 수확된 신장 세포는 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의한 분리 전에, 저산소 배양 조건에 노출된다. 특정 실시양태에서, 신장 세포는 요세관 신장 세포가 보강된다.
특정 실시양태에서, 주사가능 제제의 상기 제조 방법은 세포 증식 동안 신장 세포의 세포 형태구조를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 선택된 신장 세포는 요세관 신장 세포를 표시하는 세포 형태구조를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 각 세포 계대에서 신장 세포의 세포 성장 동역학을 모니터링하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 대사 활성의 평가를 위해 시약을 사용하여 신장 세포 계수 및 생존율을 모니터링하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커의 표현형 발현에 대하여 신장 세포를 모니터링하는 단계를 포함한다. 상기 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커는 VEGF 및/또는 KIM-1을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커의 표현형 발현에 대하여 신장 세포를 모니터링하는 단계를 포함한다. 상기 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커는 CK18 및/또는 GGT1을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 유전자 발현 프로파일링 또는 효소 활성의 측정에 의해 신장 세포 기능성을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 측정되는 효소 활성은 LAP 및/또는 GGT 활성을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 주사가능 제제의 제조 방법에서 사용되는 신장 세포는 자가 또는 동종이형 신장 샘플로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 신장 세포는 비-자가 신장 샘플로부터 유래한다. 신장 샘플은 신장 생검에 의해 수득될 수 있다.
특정 실시양태에서, 주사가능 제제의 제조 방법에서 사용되는 SRC는 26-30 ℃에서 액화된 젤라틴 용액에 재현탁된다. 상기 SRC는 충분한 젤라틴 용액에 재현탁됨으로써, 100 x 106개 세포/ml의 SRC 농도를 달성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 SRC/젤라틴 용액을 빠르게 냉각시킴으로써 SRC가 저장시 젤에 현탁되어 유지되게 되도록 생체재료를 안정화하는 단계를 포함한다. 상기 제제는 2-8 ℃의 온도 범위에서 저장될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 주사가능 제제의 제조 방법은 세포 생존력 작용제의 첨가를 포함한다. 상기 세포 생존력 작용제는 항산화제, 산소 캐리어, 성장 인자, 세포-안정화 인자, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 항-염증 작용제, 면역억제제, 혈관생성 인자 및 상처 치유 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 생존력 작용제는 인간 혈장, 인간 혈소판 용해물, 소 태아 혈장 또는 소 뇌하수체 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 측면 및 실시양태들은 하기에서 개시된다. 본원에서 개시되는 각 실시양태는 개시되는 다른 실시양태들 각각에 적용가능한 것으로 생각된다. 이에 따라, 본원에서 기술되는 다양한 요소들의 모든 조합은 본 개시내용의 영역에 속한다.
도 1: 배양물 중 인간 신장 세포 형태구조.
도 2: 밀도 경계를 가로지르는 원심분리에 의한 SRC 밴드화.
도 3: 젤화를 위한 젤라틴 용액 온도 프로파일.
도 4: NKA 젤화 동안의 회전 시간.
도 5: 인간 SRC 군집에서의 신장 세포 마커들의 발현.
도 6: 인간 SRC의 효소 활성.
도 7: 저온에서의 3일 유지 시간에 걸친 SRC 침강.
도 8: 공초점 현미경법을 사용한 NKA 중 SRC 분포.
도 9: 주사기 전체에 걸친 NKA 샘플링.
도 10: 주사기 전체에 걸친 NKA 중 총 살아있는 세포 분포.
도 11: 제제화 후의 NKA 중 SRC 분산.
도 12: 3일 유지 후의 주사기 전체에 걸친 NKA 중 SRC 분산.
도 13: 저온 저장시의 트리판 블루에 의한 NKA 생존율의 안정성.
도 14: 저온 저장시의 CK18에 의한 NKA 표현형의 안정성.
도 15: 저온 저장시의 GGT1에 의한 NKA 표현형의 안정성.
도 16: 저온 저장시의 프레스토블루 대사에 의한 NKA의 안정성.
도 17: 저온 저장시의 VEGF에 의한 NKA 기능의 안정성.
도 18: 전달 캐뉼러의 NKA와의 상용성.
도 19: NKA 전달 및 이식의 예시.
도 20: 전체적인 NKA 제조 방법의 비-제한적인 예의 흐름도.
도 21a-d: 도 20에 도시되어 있는 비-제한적인 예시적 방법의 추가적인 세부사항을 제공하는 흐름도.
지금부터, 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 언급이 상세하게 이루어지게 된다. 본 개시내용의 측면들이 실시양태와 연계되어 기술될 것이기는 하지만, 그것이 해당 실시양태로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니라는 것은 이해될 것이다. 오히려, 본 발명은 청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 영역 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가물들을 포괄하고자 한다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 발명의 실시에 사용될 수 있을 본원에서 기술되는 것과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 재료들을 알고 있을 것이다. 본 발명은 어떠한 방식으로도 기술되는 방법 및 재료로 제한되지 않는다.
본 개시내용 전체에 걸쳐 인용되는 모든 참고문헌은 그 전체가 명시적으로 본원에 참조로써 개재된다. 개재되는 문헌, 특허 및 유사 자료들 중 하나 이상이 비제한적으로 정의되는 용어, 용어 사용법, 기술되는 기술 등을 포함한 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선한다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 문헌 [Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007]이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어들에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 발명의 실시에 사용될 수 있을 본원에서 기술되는 것과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 재료들을 알고 있을 것이다. 실제로는, 본 발명은 어떠한 방식으로도 기술되는 방법 및 재료로 제한되지 않는다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용될 때의 "포함하다", "포함하는", "포함되다(include)", "포함한" 및 "포함되다(includes)"라는 용어는 언급되는 특징, 정수, 구성요소 또는 단계의 존재를 명시하고자 하는 것이나, 그것이 1종 이상의 다른 특징, 정수, 구성요소, 단계 또는 이들의 군의 존재 또는 추가를 배제하는 것은 아니다.
본원에서 사용될 때의 "세포 군집"이라는 용어는 보통 포유동물 유래인 적합한 조직 공급원으로부터의 직접적인 단리에 의해 수득되는 많은 수의 세포들을 지칭한다. 예를 들면, 세포 군집은 신장 세포 및 그의 혼합물의 군집을 포함할 수 있다. 단리된 세포 군집은 이후 시험관 내에서 배양될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 개시내용 및 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 다양한 수의 세포 군집 중 세포와 함께 사용하기 위하여 세포 군집을 단리하고 배양하기 위한 다양한 방법들을 알고 있을 것이다. 세포 군집은 분획화되지 않은 비균질 세포 군집, 또는 기관 또는 조직, 예컨대 신장으로부터 유래되는 보강된 균질 세포 군집일 수 있다. 예를 들면, 비균질 세포 군집은 조직 생검물 또는 전기관 조직으로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 비균질 세포 군집은 조직 생검물 또는 전기관 조직으로부터 확립된 포유동물 세포의 시험관 내 배양으로부터 유래할 수 있다. 분획화되지 않은 비균질 세포 군집은 비-보강 세포 군집으로 지칭될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 세포 군집은 생체활성 세포를 함유한다. 분획화되지 않은 비균질 세포 군집과 비교하였을 때, 균질 세포 군집은 공통적인 표현형을 공유하거나 유사한 물리적 특성을 가지는 동일 세포 유형 세포들을 더 큰 비율로 포함한다. 예를 들면, 균질 세포 군집은 비균질 신장 세포 군집으로부터 단리, 추출 또는 보강될 수 있다. 특정 실시양태에서, 균질 세포 군집은 비균질 세포 현탁액의 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의한 분리를 사용하여 세포 분획으로서 수득된다. 특정 실시양태에서, 균질 세포 군집은 비균질 세포 현탁액의 연속 또는 불연속 (단일 단계 또는 다-단계) 밀도 구배 분리를 사용하여 세포 분획으로서 수득된다. 특정 실시양태에서, 신장으로부터 기원하는 균질 또는 비균질 세포 군집은 신장이 아닌 다른 조직 또는 기관으로부터 기원하는 균질 또는 비균질 세포 군집과 혼합되나, 추가적인 제한은 아니다.
본원에서 사용될 때, "생체활성"이라는 용어는 약학 또는 치료 활성과 같은 "생물학적 활성을 보유하는 것"을 의미한다. 특정 실시양태에서, 생체활성은 신장 기능의 강화 및/또는 신장 항상성에 대한 효과이다. 특정 실시양태에서, 상기 생물학적 활성은 비제한적으로 진통; 항바이러스; 항-염증; 항신생물; 면역 자극; 면역 조절; 세포 생존력 강화, 항산화, 산소 캐리어, 세포 동원, 세포 부착, 면역억제, 혈관생성, 상처 치유 활성, 숙주 줄기 또는 선조 세포의 가동화, 세포 증식, 손상 부위로의 세포 이동의 자극, 세포 및 조직 섬유증의 개선, 상피-중간엽 신호전달 연속단계의 방해, 시토카인의 분비, 성장 인자, 단백질, 핵산, 엑소좀, 미세소포 또는 이들의 임의 조합이다.
본원에서 사용될 때의 "생체활성 신장 세포" 또는 "BRC"라는 용어는 대상체의 신장에 투여되었을 때 하기 특성들 중 1종 이상을 가지는 신장 세포를 지칭한다: 만성 신장 질환 또는 그 증상의 악화 또는 진행을 감소시키는 (예컨대 늦추거나 중단시킴) 능력, 신장 기능을 강화하는 능력, 신장 항상성에 영향을 주는 (그것을 향상시키는) 능력, 및 신장 조직 또는 신장의 치유, 복구 및/또는 재생을 촉진하는 능력. 실시양태에서, 이러한 세포에는 기능성 요세관 세포 (예컨대 크레아티닌 배설 및 단백질 보유의 향상에 기초함), 사구체 세포 (예컨대 단백질 보유의 향상에 기초함), 혈관 세포 및 기타 피질수질 연접부 세포가 포함될 수 있다. 실시양태에서, BRC는 신장 조직으로부터의 신장 세포의 단리 및 증식으로부터 수득된다. 실시양태에서, BRC는 생체활성 세포용으로 선택되는 방법을 사용한 신장 조직으로부터의 신장 세포의 단리 및 증식으로부터 수득된다. 실시양태에서, BRC는 신장에 대하여 재생 효과를 가진다. 실시양태에서, BRC는 선택된 신장 세포 (SRC)를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 구성되거나, 또는 그것으로 구성된다. 실시양태에서, BRC는 SRC이다.
실시양태에서, SRC는 적합한 신장 조직 공급원으로부터의 신장 세포의 단리 및 증식으로부터 수득되는 세포로써, 여기서 SRC는 개시 신장 세포 군집과 비교하였을 때 1종 이상의 세포 유형은 더 큰 백분율로 함유하며, 1종 이상의 다른 세포 유형은 없거나 낮은 백분율로 보유한다. 실시양태에서, SRC는 개시 신장 세포 군집에 비해 증가된 비율의 BRC를 함유한다. 실시양태에서, SRC 군집은 신장 질환의 치료, 즉 신장 기능의 안정화 및/또는 향상 및/또는 재생을 제공하는 데에 사용하기 위하여 특정 생체활성 구성요소 및/또는 세포 유형이 보강되고/거나 특정 불활성 및/또는 비선호 구성요소 또는 세포 유형이 제거된, 단리된 신장 세포 군집이다. SRC는 개시 군집과 비교하였을 때 탁월한 치료 및 재생 성과를 제공한다. 실시양태에서, SRC는 신장 생검을 통하여 환자의 신장 피질 조직으로부터 수득된다. 실시양태에서, SRC는 그의 1종 이상의 마커의 발현을 바탕으로 선택된다 (예컨대 형광-활성화 세포 분류 또는 "FACS"에 의함). 실시양태에서, SRC는 세포 유형에 대한 1종 이상의 마커의 발현을 바탕으로 1종 이상의 세포 유형이 제거된다 (예컨대 형광-활성화 세포 분류 또는 "FACS"에 의함). 실시양태에서, SRC는 생체활성 신장 세포의 군집으로부터 선택된다. 실시양태에서, SRC는 증식된 신장 세포의 밀도 구배 분리에 의해 선택된다. 실시양태에서, SRC는 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리, 또는 단일 단계 불연속 단계 구배 분리에 의한 증식된 신장 세포의 분리에 의해 선택된다. 실시양태에서, SRC는 저산소 조건하에서 배양된 증식된 신장 세포의 연속 또는 불연속 밀도 구배 분리에 의해 선택된다. 실시양태에서, SRC는 적어도 약 8, 12, 16, 20 또는 24시간 동안 저산소 조건하에서 배양된 증식된 신장 세포의 밀도 구배 분리에 의해 선택된다. 실시양태에서, SRC는 저산소 조건하에서 배양된 증식된 신장 세포의 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의한 분리에 의해 선택된다. 실시양태에서, SRC는 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리 (예컨대 단일-단계 불연속 밀도 구배 분리)에 의한, 적어도 약 8, 12, 16, 20 또는 24시간 동안 저산소 조건하에서 배양된 증식된 신장 세포의 분리에 의해 선택된다. 실시양태에서, SRC는 주로 신장 요세관 세포로 구성된다. 실시양태에서는, 다른 실질 (예컨대 혈관) 및 간질 (예컨대 집합관) 세포들이 SRC에 존재할 수 있다. 실시양태에서, SRC 군집 세포의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % 또는 1 % 미만은 혈관 세포이다. 실시양태에서, SRC 군집 세포의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % 또는 1 % 미만은 집합관 세포이다. 실시양태에서, SRC 군집 세포의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % 또는 1 % 미만은 혈관 또는 집합관 세포이다.
"선천 기관(native organ)"이라는 용어는 살아있는 대상체의 기관을 의미할 수 있다. 상기 대상체는 건강하거나 건강하지 않을 수 있다. 건강하지 않은 대상체는 그 특정 기관과 연관되어 있는 질환에 걸려 있을 수 있다.
"선천 신장"이라는 용어는 살아있는 대상체의 신장을 의미할 수 있다. 상기 대상체는 건강하거나 건강하지 않을 수 있다. 건강하지 않은 대상체는 신장 질환에 걸려 있을 수 있다.
"재생 효과"라는 용어는 신장과 같은 선천 기관에 이익을 제공하는 효과를 의미할 수 있다. 상기 효과에는 비제한적으로 선천 기관의 손상 정도 감소 또는 선천 기관 기능의 향상, 복구 또는 안정화가 포함될 수 있다. 신장 손상은 섬유증, 염증, 사구체 비대 등의 형태일 수 있으며, 대상체에서의 선천 기관과 연관되어 있는 질환과 관련될 수 있다.
본원에서 사용될 때의 "혼합물"이라는 용어는 분획화되지 않은 비균질 세포 군집으로부터 유래되는 단리되어 보강된 세포 군집 2종 이상의 조합을 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, 본 개시내용의 세포 군집은 신장 세포 군집이다. 대안적인 실시양태에서, 세포 군집은 신장 세포 군집과 비제한적으로 중간엽 줄기 세포 및 내피 선조 세포를 포함한 비-신장 세포 군집의 혼합물일 수 있다.
"보강된" 세포 군집 또는 조제물은 개시 군집에서의 그 세포 유형의 백분율에 비해 더 큰 백분율의 특정 세포 유형을 함유하는, 개시 기관 세포 군집 (예컨대 분획화되지 않은 비균질 세포 군집)으로부터 유래되는 세포 군집을 지칭한다. 예를 들면, 개시 신장 세포 군집은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 등의 해당 세포 군집이 보강될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "세포 군집", "세포 조제물" 및 "세포 표현형"이라는 용어들은 호환가능하게 사용된다.
본원에서 사용될 때의 "저산소" 배양 조건이라는 용어는 세포가 주변 산소 농도 (약 21 %)에서 배양되는 표준 배양 조건에 대비하였을 때, 배양 시스템 중 가용 산소 농도의 감소에 세포가 적용되는 배양 조건을 지칭한다. 비-저산소 조건은 본원에서 정상 또는 정상산소(normoxic) 배양 조건으로 지칭된다.
본원에서 사용될 때의 "산소-조정가능(oxygen-tunable)"이라는 용어는 세포에 가용한 산소의 양을 바탕으로 유전자 발현을 조절하는 (상향 또는 하향) 세포의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "생체재료"라는 용어는 선택된 생체활성 세포를 생존가능한 상태로 지지하는, 살아있는 조직에의 도입에 적합한 천연 또는 합성 생체적합성 재료를 지칭한다. 천연 생체재료는 살아있는 시스템으로 제조되거나 그로부터 기원하는 재료이다. 합성 생체재료는 살아있는 시스템으로 제조되거나 그로부터 직접 기원하지는 않으나 대신 관련 기술분야 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 특정 화학적 절차 및 프로토콜에 의해 합성되거나 제조되는 재료이다. 본원에서 개시되는 생체재료는 천연 및 합성 생체적합성 재료의 조합일 수 있다. 본원에서 사용될 때, 생체재료에는 예를 들면 중합체 매트릭스 및 스캐폴드가 포함된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 생체재료(들)가 다양한 형태, 예를 들면 다공성 발포체, 젤, 액체, 비드, 고체로 구성될 수 있으며, 1종 이상의 천연 또는 합성 생체적합성 재료를 포함할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 수화젤이 될 수 있는 용액의 액체 형태이다.
본원에서 사용될 때, 생체재료에는 예를 들면 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 세제 및/또는 기타 화학 작용제의 적용을 통하여 선천 세포 군집이 제거되어 있는 기존 인간 또는 동물 기원 신장 유래의 세포외 매트릭스가 포함된다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 수화젤이 될 수 있으며 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 3-차원 바이오프린팅 방법론의 적용에 의해 특정 세포 군집과 함께 또는 그것 없이 층상화되는 용액의 액체 형태이다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 탈세포화된 신장의 3차원 프랙탈 조직(three dimensional fractal organization)을 모방하도록 구성된다.
"변형 방출"이라는 용어 또는 등가의 용어인 "조절 방출", "지연 방출" 또는 "저속 방출"은 개체에의 투여 후 오랜 시간 동안 또는 1회를 초과하는 시점에 생체활성 세포와 같은 활성 작용제를 방출하는 제제를 지칭한다. 원하는 시간 범위, 예컨대 제제에 따라 수분, 수시간, 수일, 수주 또는 그 이상에 걸쳐 이루어질 수 있는 활성 작용제의 변형 방출은 실질적으로 전체 투약 단위가 투여 직후에 가용한 표준 제제와는 대조된다. 조직 공학 및 재생 의학 적용분야의 경우, 바람직한 변형 방출 제제는 국소 투여 (예컨대 고형 기관에의 직접적인 활성 작용제의 투여) 후 다수 시점에서의 활성 작용제의 방출을 제공한다. 예를 들면, 생체활성 세포의 변형 방출 제제는 바로 투여 시점에서의 세포의 최초 방출 및 후기 시점에서의 세포의 후기 이차 방출을 제공하게 된다. 활성 작용제의 이차 방출을 위한 시간 지연은 최초 투여 후 수분, 수시간 또는 수일일 수 있다. 일반적으로, 방출 지연을 위한 시간 기간은 활성 작용제의 생체재료 캐리어가 그의 구조적 완전성을 상실하는 데에 걸리는 시간 기간에 상응한다. 활성 작용제의 지연 방출은 그와 같은 완전성이 훼손되기 시작하자마자 개시되어 완전성이 완전히 붕괴되는 시점까지 완료된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 방출 메커니즘들을 알고 있을 것이다.
"구성체" 또는 "제제"라는 용어는 1종 이상의 합성 또는 자연-발생 생체적합성 재료로 구성되는 스캐폴드 또는 매트릭스의 표면상 또는 그 안에 침착된 1종 이상의 세포 군집을 지칭한다. 상기 1종 이상의 세포 군집은 1종 이상의 합성 또는 자연-발생 생체적합성 재료, 중합체, 단백질 또는 펩티드로 구성되는 생체재료로 코팅되거나, 그 위에 침착되거나, 그에 매립되거나, 그에 부착되거나, 시딩되거나 또는 그에 포획될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 자연 발생 생체재료는 인간 또는 동물 기원의 탈세포화된 신장이다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 3차원 바이오프린팅을 통하여 구조적으로 조작되어 있다. 상기 1종 이상의 세포 군집은 시험관 내 또는 생체 내에서 생체재료 또는 스캐폴드 또는 매트릭스와 조합될 수 있다. 구성체 또는 제제를 생성시키는 데에 사용되는 상기 1종 이상의 생체재료는 구성체 중 세포 구성요소의 내생 숙주 조직과의 분산 및/또는 통합을 유도하거나, 촉진하거나 또는 가능하게 하도록, 또는 구성체 또는 제제 중 세포 구성요소의 생존, 생착, 관용 또는 기능적 성능을 유도하거나, 촉진하거나 또는 가능하게 하도록 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 스캐폴드/생체재료를 형성시키는 데에 사용되는 1종 이상의 생체적합성 재료는 그에 침착되는 세포 군집들 중 적어도 1종의 다세포 3-차원 조직의 형성을 유도하거나, 촉진하거나 또는 가능하게 하도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 비제한적으로 조직화 극성(organizational polarity)을 포함한 선천 신장 조직의 측면들을 재현하는 정해진 3차원 세포 응집체 또는 기관유사체(organoid)의 조립을 유도한다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 내강을 포함한 선천 신장 조직의 측면들을 재현하는 정해진 요세관 구조의 조립을 유도한다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 그에 침착되는 세포 군집으로부터의 단백질, 핵산 및 멤브레인-결합 소포의 분비를 촉진하거나 용이하게 한다. 일반적으로, 구성체를 생성시키는 데에 사용되는 1종 이상의 생체재료는 해당 세포 군집이 유래하였던 원래의 생물학적 환경에 상당하는 선천 신장 또는 신장 실질 내의 특정 3차원 조직 또는 환경 니치(niche)의 측면들을 모방하거나 재현하도록 선택될 수도 있다. 해당 세포 군집이 기원하였던 원래 생물학적 니치의 재생성은 세포 생존력 및 효능을 추가로 촉진하거나 용이하게 하는 것으로 여겨진다.
"세포 응집체" 또는 "구상체"라는 용어는 단층으로서의 성장과 대조되는 것으로서 3D 성장을 가능하게 하도록 배양된 세포의 응집체 또는 조립체를 지칭한다. "구상체"라는 용어가 응집체가 기하 구체임을 뜻하지는 않는다는 것을 알아야 한다. 응집체는 충분히 정형화된 형태구조 및 극성에 의해 고도로 조직화될 수 있거나, 또는 조직화되지 않은 집합체일 수 있으며; 단일 세포 유형 또는 1종을 초과하는 세포 유형을 포함할 수 있다. 상기 세포는 초대 단리물 또는 영구 세포주, 또는 2종의 조합일 수 있다. 이와 같은 정의에 포함되는 것으로, 기관유사체 및 기관형적 배양물(organotypic culture)이 있다. 특정 실시양태에서, 구상체 (예컨대 세포 응집체 또는 기관유사체)는 스피너 플라스크(spinner flask)에서 형성된다. 특정 실시양태에서, 구상체 (예컨대 세포 응집체 또는 기관유사체)는 3-차원 매트릭스에서 형성된다.
"주변 온도"라는 용어는 본 개시내용의 제제가 대상체에게 투여되게 되는 온도를 지칭한다. 일반적으로, 주변 온도는 온도-조절 환경의 온도이다. 주변 온도는 약 18 ℃ 내지 약 30 ℃의 범위이다. 특정 실시양태에서, 주변 온도는 약 18 ℃, 약 19 ℃, 약 20 ℃, 약 21 ℃, 약 22 ℃, 약 23 ℃, 약 24 ℃, 약 25 ℃, 약 26 ℃, 약 27 ℃, 약 28 ℃, 약 29 ℃ 또는 약 30 ℃이다.
"수화젤"이라는 용어는 본원에서 유기 중합체 (천연 또는 합성)가 공유, 이온 또는 수소 결합을 통하여 가교결합됨으로써 물 분자를 포획하여 젤을 형성하는 3-차원 개방-격자(open-lattice) 구조를 생성시키는 경우에 형성되는 물질을 지칭하는 데에 사용된다. 수화젤을 형성시키는 데에 사용될 수 있는 재료의 예에는 다당류 예컨대 이온에 의해 가교결합되는 알기네이트, 폴리포스파진 및 폴리아크릴레이트, 또는 블록 공중합체 예컨대 각각 온도 또는 pH에 의해 가교결합되는 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체인 플루로닉스(Pluronics)™ 또는 테트로닉스(Tetronics™)가 포함된다. 본원에서 사용되는 수화젤은 바람직하게는 생분해성 젤라틴-기재 수화젤이다.
"신-신장 강화제(Neo-Kidney Augment) (NKA)"라는 용어는 젤라틴-기재 수화젤로 구성되는 생체재료 중에 제제화된 자가 선택된 신장 세포 (SRC)로 구성되는 주사가능 생성물인 생체활성 세포 제제를 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "신장 질환"이라는 용어는 혈액 여과, 및 혈액으로부터의 과량의 유체, 전해질 및 폐기물의 제거 기능을 수행하는 신장 능력의 상실을 초래하는 임의 단계 또는 정도의 급성 또는 만성 신장 부전과 연관되어 있는 장애를 지칭한다. 신장 질환에는 빈혈 (에리트로포이에틴-결핍) 및 무기질 불균형 (비타민 D 결핍)과 같은 내분비 기능장애도 포함될 수 있다. 신장 질환은 신장에서 기원할 수 있거나, 또는 (비제한적으로) 심장 부전, 고혈압, 당뇨병, 자가면역 질환 또는 간 질환을 포함한 다양한 이상들에 부속할 수 있다. 신장 질환은 신장의 급성 손상 후 발생하는 만성 신장 부전의 상태일 수 있다. 예를 들면, 허혈 및/또는 독물에의 노출에 의한 신장의 손상은 급성 신장 부전을 야기할 수 있으며, 급성 신장 손상 후의 불완전한 회복은 만성 신장 부전의 발생으로 이어질 수 있다.
"치료"라는 용어는 신장 질환, 요세관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍의 치료적 치료 및 예방 또는 방지 수단 모두를 지칭하는 것으로써, 목적은 표적 장애를 반전시키거나, 방지하거나 늦추는 (저감하는) 것이다. 치료를 필요로 하는 사람에는 이미 신장 질환, 요세관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍에 걸려 있는 사람은 물론, 신장 질환, 요세관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍에 걸리기 쉬운 사람 또는 신장 질환, 요세관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍이 예방되어야 하는 사람도 포함된다. 본원에서 사용될 때의 "치료"라는 용어에는 신장 기능의 안정화 및/또는 향상이 포함된다.
본원에서 사용될 때의 "생체 내 접촉"이라는 용어는 생체 내에서의 보강된 세포 군집에 의해 분비되는 생성물과 선천 기관 사이의 직접적인 접촉을 지칭한다. 예를 들면, 보강된 신장 세포 군집 (또는 신장 세포/신장 세포 분획을 함유하는 혼합물 또는 구성체)에 의해 분비되는 생성물은 생체 내에서 선천 신장과 접촉할 수 있다. 직접적인 생체 내 접촉은 특성상 주변분비, 내분비 또는 근접분비일 수 있다. 분비되는 생성물은 본원에서 기술되는 상이한 생성물들의 비균질 군집일 수 있다.
"대상체"라는 용어는 신장 질환의 1종 이상의 신호, 증상 또는 기타 징후를 겪고 있거나 겪었던 치료 적격인 환자를 포함한 임의의 단일 인간 대상체를 의미할 수 있다. 그와 같은 대상체에는 비제한적으로 새롭게 진단되거나 이전에 진단되어 있어서 현재 재발 또는 복귀를 경험하고 있거나, 또는 이유에 관계없이 신장 질환의 위험성이 있는 대상체가 포함된다. 대상체는 신장 질환에 대하여 이전에 치료된 바가 있거나, 그렇게 치료된 바가 없을 수 있다.
"환자"라는 용어는 치료가 요구되는 임의의 단일 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물 (예를 들면 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류와 같은 비-인간 동물 포함)을 지칭한다. 가장 바람직하게는, 본원에서 환자는 인간이다.
"샘플" 또는 "환자 샘플" 또는 "생물학적 샘플"이라는 용어는 일반적으로 대상체 또는 환자, 체액, 신체 조직, 세포주, 조직 배양물 또는 기타 공급원으로부터 수득되는 임의의 생물학적 샘플을 의미할 수 있다. 상기 용어에는 예를 들면 신장 생검물과 같은 조직 생검물이 포함된다. 상기 용어에는 예를 들면 배양된 포유동물 신장 세포와 같은 배양된 세포가 포함된다. 포유동물로부터의 조직 생검물 및 배양된 세포의 수득 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. "샘플"이라는 용어가 단독으로 사용되는 경우, 그것은 나아가 "샘플"이 "생물학적 샘플" 또는 "환자 샘플"이라는 것을 의미할 수 있는 바, 다시 말하자면 용어들은 호환가능하게 사용된다. "시험 샘플"이라는 용어는 본 개시내용의 방법에 의해 치료된 대상체로부터의 샘플을 지칭한다. 시험 샘플은 비제한적으로 혈액, 정액, 혈청, 소변, 골수, 점막, 조직 등을 포함한 포유동물 대상체의 다양한 공급원으로부터 기원할 수 있다.
"대조" 또는 "대조 샘플"이라는 용어는 음성 또는 양성인 결과가 시험 샘플에서의 결과를 상관시키는 것을 도울 것으로 예상되는 음성 또는 양성 대조를 지칭한다. 본 개시내용에 적합한 대조에는 비제한적으로 정상 신장 기능 특유의 지표를 나타내는 것으로 알려져 있는 샘플, 신장 질환에 걸리지 않은 것으로 알려져 있는 대상체로부터 수득되는 샘플, 및 신장 질환에 걸린 것으로 알려져 있는 대상체로부터 수득되는 샘플이 포함된다. 또한, 대조는 본 개시내용의 방법에 의해 치료되기 전에 대상체로부터 수득되는 샘플일 수 있다. 추가적인 적합한 대조는 임의 유형 또는 단계의 신장 질환에 걸린 것으로 알려져 있는 대상체로부터 수득되는 시험 샘플, 및 임의 유형 또는 단계의 신장 질환에 걸리지 않은 것으로 알려져 있는 대상체로부터의 샘플일 수 있다. 대조는 정상적인 건강한 일치 대조일 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 다른 대조들을 알고 있을 것이다.
"재생 예후", "재생성 예후" 또는 "재생의 예후"는 일반적으로 본원에서 기술되는 세포 군집, 혼합물 또는 구성체 투여 또는 이식의 있을 수 있는 재생 과정 또는 성과에 대한 예보 또는 예측을 지칭한다. 재생 예후에 있어서, 상기 예보 및 예측은 하기 중 1종 이상에 의해 알려질 수 있다: 이식 또는 투여 후의 기능성 기관 (예컨대 신장)의 개선, 이식 또는 투여 후의 기능성 신장의 발현, 이식 또는 투여 후의 향상된 신장 기능 또는 능력의 발현, 및 이식 또는 투여 후의 선천 신장에 의한 특정 마커의 발현.
"재생된 기관"은 본원에서 기술되는 바와 같은 세포 군집, 혼합물 또는 구성체 이식 또는 투여 후의 선천 기관을 지칭한다. 재생된 기관은 비제한적으로 선천 기관의 기능 또는 능력 발현, 선천 기관의 기능 또는 능력 향상, 질환과 연관되어 있는 특정 마커 및 생리학적 지수들의 개선, 및 선천 기관에서의 특정 마커의 발현을 포함한 다양한 지표를 특징으로 한다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 지표들이 재생된 기관을 특성화하는 데에 적합할 수도 있다는 것을 알고 있을 것이다.
"재생된 신장"은 본원에서 기술되는 바와 같은 세포 군집, 혼합물 또는 구성체 이식 또는 투여 후의 선천 신장을 지칭한다. 재생된 신장은 비제한적으로 선천 신장의 기능 또는 능력 발현, 선천 신장의 기능 또는 능력 향상, 신장 질환과 연관되어 있는 특정 마커 및 생리학적 지수들의 개선, 및 선천 신장에서의 특정 마커의 발현을 포함한 다양한 지표를 특징으로 한다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 지표들이 재생된 신장을 특성화하는 데에 적합할 수도 있다는 것을 알고 있을 것이다.
2. 세포 군집
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 예를 들면 그 전체 내용이 본원에 참조로써 개재되는 프레스넬 등의 U.S. 8,318,484호 및 일라간 등의 PCT/US2011/036347호에서 이전에 기술된 바와 같이 신장 질환의 치료, 즉 신장 기능의 안정화 및/또는 향상 및/또는 재생을 제공하는 데에 사용하기 위하여 특정 생체활성 구성요소 또는 세포 유형이 보강되고/거나 특정 불활성 또는 비선호 구성요소 또는 세포 유형이 제거된, 단리된 비균질 신장 세포 군집 및/또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 상기 제제는 아직 치료 특성을 보유하고 있는, 건강한 개체와 비교하였을 때 세포 구성요소들이 결핍되어 있는 단리된 신장 세포 분획을 함유할 수 있는 바, 다시 말하자면 신장 기능의 안정화 및/또는 향상 및/또는 재생을 제공할 수 있다. 본원에서 기술되는 세포 군집, 세포 분획 및/또는 세포 혼합물은 건강한 개체, 신장 질환이 있는 개체 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 대상체로부터 유래할 수 있다.
본 개시내용은 비제한적으로 단리된 세포 군집(들), 세포 분획(들), 혼합물(들), 보강된 세포 군집(들), 세포 응집체(들), 기관유사체, 요세관 및 기타 3차원 조직-유사 구조 및 이들의 임의 조합을 포함한 다양한 생체활성 세포 군집과 함께 사용하기에 적합한, 본원에서 기술되는 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 생체활성 세포 군집은 생체활성 신장 세포이다. 특정 실시양태에서, 생체활성 세포 군집은 내피 세포가 보충된 생체활성 신장 세포이다. 특정 실시양태에서, 생체활성 세포 군집은 중간엽, 내피 또는 상피 계통의 줄기 또는 선조 세포가 보충된 생체활성 신장 세포이다. 특정 실시양태에서, 생체활성 세포 군집은 지방의 간질 혈관 분획으로부터 기원하는 세포가 보충된 생체활성 신장 세포이다. 특정 실시양태에서는, 생체활성 세포 군집으로부터 유래되는 분비된 생성물만이 최종 구성체에 통합된다. 그와 같은 분비 생성물은 비제한적으로 엑소좀, miRNA, 분비된 시토카인 및 성장 인자, 세포외 소포, 지질 및 컨디셔닝된 배지를 포함할 수 있다.
생체활성 세포 군집
실시양태에서, 본원에서 제공되는 치료 조성물 또는 제제는 특정 생체활성 구성요소 또는 세포 유형이 보강되고/거나 특정 불활성 또는 비선호 구성요소 또는 세포 유형이 제거된, 단리된 비균질 신장 세포 군집을 함유한다. 실시양태에서, 이와 같은 조성물 및 제제는 신장 질환의 치료, 예를 들면 신장 기능 및/또는 구조의 안정화 및/또는 향상 및/또는 재생을 제공하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 상기 조성물은 아직 치료 특성을 보유하고 있는, 건강한 개체와 비교하였을 때 세포 구성요소들이 결핍되어 있는 단리된 신장 세포 분획을 함유함으로써, 예를 들면 신장 기능의 안정화 및/또는 향상 및/또는 재생을 제공한다. 실시양태에서, 본원에서 기술되는 세포 군집은 건강한 개체, 신장 질환이 있는 개체 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 대상체로부터 유래할 수 있다.
본원에 포함되는 것은 대상체 내의 표적 기관 또는 조직에 투여될 수 있는 선택된 신장 세포 군집의 치료 조성물이다. 실시양태에서, 생체활성 선택된 신장 세포 군집은 일반적으로 대상체에의 투여시 잠재적으로 치료 특성을 가지는 세포 군집을 지칭한다. 실시양태에서, 필요로하는 대상체에의 투여시, 생체활성 신장 세포 군집은 대상체에서의 신장 기능의 안정화 및/또는 향상 및/또는 복구 및/또는 재생을 제공할 수 있다. 실시양태에서, 상기 치료 특성은 복구 또는 재생 효과를 포함할 수 있다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 신장으로부터 유래되는 분획화되지 않은 비균질 세포 군집 또는 보강된 균질 세포 군집이다. 실시양태에서, 상기 비균질 세포 군집은 조직 생검물 또는 전기관 조직으로부터 단리된다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 조직 생검물 또는 전기관 조직으로부터 확립된 포유동물 세포의 시험관 내 배양으로부터 유래한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 생체활성 구성요소들 (예컨대 생체활성 신장 세포)이 보강되고 불활성 또는 비선호 구성요소 또는 세포가 제거된, 비균질 신장 세포 군집의 하위분획 또는 하위군집을 포함한다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 GGT 및 시토케라틴을 발현한다. 실시양태에서, 상기 GGT는 약 10 %, 약 15 %, 약 18 %, 약 20 %, 약 25 %, 약 30 %, 약 35 %, 약 40 %, 약 45 %, 약 50 %, 약 55 % 또는 약 60 %를 초과하는 발현농도를 가진다. 실시양태에서, GGT는 GGT-1이다. 실시양태에서, 신장 세포 군집의 세포는 GGT-1, 시토케라틴, VEGF 및 KIM-1을 발현한다. 실시양태에서는, 신장 세포 군집 중 18 %를 초과하는 세포가 GGT-1을 발현한다. 실시양태에서는, 신장 세포 군집 중 80 %를 초과하는 세포가 시토케라틴을 발현한다. 실시양태에서, 상기 시토케라틴은 CK8, CK18, CK19 및 이들의 조합에서 선택된다. 실시양태에서, 시토케라틴은 CK8, CK18, CK19, CK8/CK18, CK8/CK19, CK18/CK19 또는 CK8/CK18/CK19이며, 여기서 "/"는 그에 인접한 시토케라틴들의 조합을 지칭한다. 실시양태에서, 시토케라틴은 약 80 %, 약 85 %, 약 90 % 또는 약 95 %를 초과하는 발현 농도를 가진다. 실시양태에서는, 신장 세포 군집 중 80 %를 초과하는 세포가 시토케라틴을 발현한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 AQP2를 발현한다. 실시양태에서는, 40 % 미만의 세포가 AQP2를 발현한다. 실시양태에서는, 신장 세포 군집 중 적어도 3 %의 세포가 AQP2를 발현한다.
실시양태에서는, 세포 군집 내의 18 %를 초과하는 세포가 GGT-1을 발현하며, 세포 군집 내의 80 %를 초과하는 세포가 시토케라틴을 발현한다. 실시양태에서, 상기 시토케라틴은 CK18이다. 실시양태에서는, 세포 군집 중 4.5 % 내지 81.2 %의 세포가 GGT-1을 발현하며, 세포 군집 내의 3.0 % 내지 53.7 %의 세포가 AQP2를 발현하고, 세포 군집 내의 81.1 % 내지 99.7 %의 세포가 CK18을 발현한다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 AQP1, AQP2, AQP4, 칼빈딘, 칼포닌, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK7, CK8, CK8, CK18, CK19, CK8과 CK18 및 CK19의 조합, 코넥신 43, 큐빌린, CXCR4 (푸신), DBA, E-카드헤린 (CD324), EPO (에리트로포이에틴) GGT1, GLEPP1 (사구체 상피 단백질 1), 합토글로불린, Itgbl (인테그린 01), KIM-1 (신장 손상 분자-1), T1M-1 (T-세포 이뮤노글로불린 및 뮤신-함유 분자), MAP-2(미세소관-연관 단백질 2), 메갈린, N-카드헤린, 네프린, NKCC (Na-K-Cl-보조수송체), OAT-1 (유기 음이온 수송체 1), 오스테오폰틴, Pan-카드헤린, PCLP1 (포도칼릭신-유사 1 분자), 포도신, SMA (평활근 알파-액틴), 시냅토포딘, THP (탐-호스폴 단백질), 비니엔틴 및 αGST-1 (알파 글루타치온 S-트랜스퍼라제)에서 선택되는 임의의 바이오마커 조합들 중 1종 이상을 발현하는 세포를 포함한다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 신장 조직 생검물 또는 그의 초대 배양물의 세포 군집과 같은 개시 군집에 비해 상피 세포가 보강된다 (예컨대 신장 세포 군집은 개시 군집에 비해 적어도 약 5 %, 10 %, 15 %, 20 % 또는 25 % 더 많은 상피 세포를 포함함). 실시양태에서, 신장 세포 군집은 신장 조직 생검물 또는 그의 초대 배양물의 세포 군집과 같은 개시 군집에 비해 요세관 세포가 보강된다 (예컨대 신장 세포 군집은 개시 군집에 비해 적어도 약 5 %, 10 %, 15 %, 20 % 또는 25 % 더 많은 요세관 세포를 포함함). 실시양태에서, 상기 요세관 세포는 근위 요세관 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 개시 군집에 비해 더 적은 비율의 원위 요세관 세포, 집합관 세포, 내분비 세포, 혈관 세포 또는 선조-유사 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 개시 군집에 비해 더 적은 비율의 원위 요세관 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 개시 군집에 비해 더 적은 비율의 집합관 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 개시 군집에 비해 더 적은 비율의 내분비 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 개시 군집에 비해 더 적은 비율의 혈관 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 개시 군집에 비해 더 적은 비율의 선조-유사 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 비-보강 군집 (예컨대 개시 신장 세포 군집)과 비교하였을 때, 더 큰 비율의 요세관 세포, 및 더 적은 비율의 EPO 생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 비-보강 군집과 비교하였을 때, 더 큰 비율의 요세관 세포, 및 더 적은 비율의 EPO 생성 세포 및 혈관 세포를 포함한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 비-보강 군집과 비교하였을 때, 더 큰 비율의 요세관 세포, 및 더 적은 비율의 사구체 세포 및 혈관 세포를 포함한다.
실시양태에서, 신장 세포 군집의 세포는 히아루론산 (HA)을 발현한다. 실시양태에서, HA의 크기 범위는 약 5 kDa 내지 약 20000 kDa이다. 실시양태에서, 상기 HA는 5 kDa, 60 kDa, 800 kDa 및/또는 3000 kDa의 분자량을 가진다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 특히 신장-내 이식 후에 히아루론산 신타제-2 (HAS-2)의 발현을 통하여 고분자량 HA를 합성하고/거나 그의 합성을 자극한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집의 세포는 HAS-2의 작용을 통하여 시험관 내 및/또는 생체 내에서 더 큰 분자량의 HA 종을 발현한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집의 세포는 HAS-2의 작용을 통하여 시험관 내 및 생체 내 모두에서 더 큰 분자량의 HA 종을 발현한다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 적어도 100 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 약 800 kDa 내지 약 3500 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 약 800 kDa 내지 약 3000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 적어도 800 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 적어도 3,000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 약 800 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 약 3000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, HAS-2는 2 x 105 내지 2 x 106 Da의 분자량을 가지는 HA를 합성한다. 실시양태에서, 더 작은 HA 종은 분해성 히아루로니다제의 작용을 통하여 형성된다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 약 200 kDa 내지 약 2000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 약 200 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 약 2000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 적어도 200 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 적어도 2000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 적어도 5000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 적어도 10000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 적어도 15000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다. 실시양태에서, 더 큰 분자량의 HA 종은 약 20000 kDa의 분자량을 가지는 HA이다.
실시양태에서, 상기 군집은 수용체-매개 알부민 수송을 할 수 있는 세포를 포함한다.
실시양태에서, 신장 세포 군집의 세포는 저산소증 내성이다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: 메갈린, 큐빌린, N-카드헤린, E-카드헤린, 아쿠아포린-1 및 아쿠아포린-2.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: 메갈린, 큐빌린, 히아루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-히드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버(member) RAS 종양유전자 계열 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절인자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 계열 9 (소듐/수소 교환인자), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 데히드로제나제 3 계열, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데히드 데히드로제나제 1 계열, 멤버 A3 (Aldh1a3) 및 칼파인-8 (Capn8).
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: 메갈린, 큐빌린, 히아루론산 신타제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-히드록실라제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 계열 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절인자 4 (Fxyd4), 용질 캐리어 계열 9 (소듐/수소 교환인자), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 데히드로제나제 3 계열, 멤버 81 (Aldh3b1), 알데히드 데히드로제나제 1 계열, 멤버 A3 (Aldh1a3) 및 칼파인-8 (Capn8), 및 아쿠아포린-4 (Aqp4).
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: 아쿠아포린 7 (Aqp7), FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절인자 2 (Fxyd2), 용질 캐리어 계열 17 (소듐 포스페이트), 멤버 3 (Slc17a3), 용질 캐리어 계열 3, 멤버 1 (Slc3a1), 클라우딘 2 (Cldn2), 나프신 A 아스파르틱 펩티다제 (Napsa), 용질 캐리어 계열 2 (촉진된 글루코스 수송체), 멤버 2 (Slc2a2), 알라닐 (멤브레인) 아미노펩티다제 (Anpep), 막횡단 단백질 27 (Tmem27), 아실-CoA 신테타제 중간-사슬 계열 멤버 2 (Acsm2), 글루타치온 퍼옥시다제 3 (Gpx3), 프럭토스-1,6-비포스파타제 1 (Fbp1), 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 2 (Agxt2), 혈소판 내피 세포 부착 분자 (Pecam) 및 포도신 (Podn).
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: PECAM, VEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146, 포도신 (Podn), 및 네프린 (Neph), 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 4 (Cxcr4), 엔도텔린 수용체 유형 B (Ednrb), 콜라겐, 유형 V, 알파 2 (Col5a2), 카드헤린 5 (Cdh5), 플라스미노겐 활성화인자, 조직 (Plat), 안지오포이에틴 2 (Angpt2), 키나제 삽입 도메인 단백질 수용체 (Kdr), 분비 단백질, 산성, 시스테인-풍부 (오스테오넥틴) (Sparc), 세르글리신 (Srgn), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 3 (Timp3), 윌름 종양 1 (Wt1), 무익-유형 MMTV 통합 부위 계열, 멤버 4 (Wnt4), G-단백질 신호전달 4 (Rgs4)의 조절인자, 에리트로포이에틴 (EPO).
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, 포도신, 네프린, EPO, CK7, CK8/18/19.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: 포도신 (Podn) 및 네프린 (Neph).
실시양태에서, 신장 세포 군집은 하기의 임의 조합 1종 이상을 발현하는 1종 이상의 세포 유형을 포함한다: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a 및 EPO.
실시양태에서, 샘플 또는 세포 군집 중 다양한 바이오마커들의 존재 (예컨대 발현) 및/또는 농도/양은 수많은 방법론에 의해 분석될 수 있는데, 그들 중 많은 것이 관련 기술분야에 알려져 있으며 숙련 기술자에 의해 이해되고 있는 바, 면역조직화학 ("IHC"), 웨스턴 블럿 분석, 면역침전, 분자 결합 검정, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 ("FACS"), 매스어레이(MassARRAY), 단백질체학, 생화학적 효소 활성 검정, 제자리 혼성화, 서던 분석, 노던 분석, 전게놈 서열분석, 정량 실시간 PCR ("qRT-PCR") 및 예를 들면 분지화 DNA, SISBA, TMA 등과 같은 기타 증폭 유형 검출 방법들을 포함한 폴리머라제 연쇄 반응 ("PCR"), RNA-서열분석, FISH, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현 프로파일링 및/또는 유전자 발현의 연속 분석 ("SAGE")은 물론, 단백질, 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 검정들 중 어느 것이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 유전자 및 유전자 생성물의 상태를 평가하기 위한 프로토콜의 비-제한적인 예에는 노던 블러팅, 서던 블러팅, 면역블러팅 및 PCR 분석이 포함된다. 실시양태에서는, 룰스 베이스드 메디신(Rules Based Medicine) 또는 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)로부터 구입가능한 것들과 같은 다중화된 면역검정들이 사용될 수도 있다. 실시양태에서, 샘플 또는 세포 군집 중 다양한 바이오마커들의 존재 (예컨대 발현) 및/또는 농도/양은 수많은 방법론에 의해 분석될 수 있는데, 그들 중 많은 것이 관련 기술분야에 알려져 있으며 숙련 기술자에 의해 이해되고 있는 바, 비제한적으로 전-게놈 전사체학, 단백질체학, 분비체학, 지질체학, 포스페이트체학(phospatomics), 엑소좀체학(exosomics) 등과 같은 "-omics" 계통이 포함되며, 이들 중 고-처리량 방법론은 고려중인 세포 군집에 의해 발현되고 발현되지 않는 유전자, miRNA, 단백질, 분비 단백질, 지질 등의 완전한 생물학적 특징을 밝히기 위하여, 컴퓨터 생물학 및 생물정보학 기술과 연계된다.
실시양태에서, 신장 세포 군집에서의 2종 이상 바이오마커의 존재를 검출하는 방법은 해당 동족 리간드 (즉 바이오마커)에의 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 샘플을 바이오마커에 대하여 유도된 항체와 접촉시키는 것, 및 예를 들면 항체와 바이오마커 사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것에 의해 결합된 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커 존재의 검출은 면역조직화학에 의한다. 본원에서 사용될 때의 "검출하는 것"이라는 용어는 정량 및/또는 정성 검출을 포괄한다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 AQP1, AQP2, AQP4, 칼빈딘, 칼포닌, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK7, CK8, CK8/18, CK8/18/19, 코넥신 43, 큐빌린, CXCR4 (푸신), DBA, E-카드헤린 (CD324), EPO (에리트로포이에틴), GGT1, GLEPP1 (사구체 상피 단백질 1), 합토글로불린, Itgbl (인테그린 p), KIM-1 (신장 손상 분자-1), T1M-1 (T-세포 이뮤노글로불린 및 뮤신-함유 분자), MAP-2 (미세소관-연관 단백질 2), 메갈린, N-카드헤린, 네프린, NKCC (Na-K-Cl-보조수송체), OAT-1 (유기 음이온 수송체 1), 오스테오폰틴, Pan-카드헤린, PCLP1 (포도칼릭신-유사 1 분자), 포도신, SMA (평활근 알파-액틴), 시냅토포딘, THP (탐-호스폴 단백질), 비멘틴 및 αGST-1 (알파 글루타치온 5-트랜스퍼라제)과 같은 본원에서 개시되는 바이오마커의 검출을 가능하게 하는 1종 이상의 시약을 사용하여 확인된다. 실시양태에서, 바이오마커는 단일클론 또는 다클론 항체에 의해 검출된다.
실시양태에서, 세포의 공급원은 예정된 표적 기관 또는 조직과 동일하다. 실시양태에서, BRC 또는 SRC는 신장에 투여될 제제에서 사용될 신장으로부터 기원할 수 있다. 실시양태에서, 세포 군집은 신장 생검물로부터 유래한다. 실시양태에서, 세포 군집은 전신장 조직으로부터 유래한다. 실시양태에서, 세포 군집은 신장 생검물 또는 전신장 조직으로부터 확립된 포유동물 신장 세포의 시험관 내 배양물로부터 유래한다.
실시양태에서, BRC 또는 SRC는 생체활성 신장 세포의 비균질 혼합물 또는 분획들을 포함한다. 실시양태에서, BRC 또는 SRC는 건강한 개체로부터의 신장 세포 분획으로부터 유래하거나 그 자체일 수 있다. 실시양태에서, 본원에 포함되는 것은 (예컨대 신장 또는 그의 생검물에서) 건강한 개체의 신장 세포 군집과 비교하였을 때 특정 세포 유형이 결핍되어 있을 수 있는 건강하지 않은 개체로부터 수득된 신장 세포 군집 또는 분획이다. 실시양태에서, 본원에서 제공되는 것은 건강한 개체에 비해 세포 유형들이 결핍되어 있는 치료-활성 세포 군집이다. 실시양태에서, 세포 군집은 자가 세포 군집으로부터 단리되어 증식된다.
실시양태에서, SRC는 신장 생검을 통한 환자 신장 피질 조직으로부터의 신장 세포의 단리 및 증식으로부터 수득된다. 실시양태에서, 신장 세포는 효소 분해에 의해 신장 조직으로부터 단리된 후, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 증식되고, 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의해 증식된 신장 세포로부터 선택된다. 실시양태에서, 신장 세포는 효소 분해에 의해 신장 조직으로부터 단리된 후, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 증식되고, 연속 또는 불연속 단일 또는 다단계 밀도 구배 원심분리에 의해 증식된 신장 세포로부터 선택된다. 실시양태에서, SRC는 주로 그의 재생 가능성이 알려져 있는 신장 상피 세포로 구성된다. 실시양태에서는, 다른 실질 (혈관) 및 간질 세포가 자가 SRC 군집 중에 존재할 수 있다.
실시양태에서, 생체활성 신장 세포는 효소 분해에 의해 신장 조직으로부터 단리된 후 표준 세포 배양 기술을 사용하여 증식된 신장 세포로부터 수득된다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 재생 능력을 가지는 생체활성 신장 세포를 증식시키도록 설계된다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 어떠한 재조합 또는 정제된 분화 인자도 함유하지 않는다. 실시양태에서, 증식된 비균질 신장 세포 혼합물은 재생 능력을 가지는 세포의 조성을 더 보강하기 위하여 저산소 조건에서 배양된다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 이는 하기 현상들 중 1종 이상에 기인할 수 있다: 1) 저산소 배양 기간 동안의 특정 세포 구성요소의 선택적 생존, 사멸 또는 증식; 2) 저산소 배양에 반응한 세포 과립성(granularity) 및/또는 크기의 변경에 의해 밀도 구배 분리 동안 또는 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리 동안 부력 밀도 및 이후의 국소화 변경에 영향을 줌; 및 3) 저산소 배양 기간에 반응한 세포 유전자/단백질 발현의 변경에 의해 단리 및 증식된 군집 내에서의 세포의 차별적인 특징을 초래함.
실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 신장 재생을 할 수 있는 세포를 보강하는 배양 조건하에서의 신장 조직 (예컨대 생검물로부터 수득되는 조직) 유래 신장 세포의 단리 및 증식으로부터 수득된다.
실시양태에서, 신장 조직 (예컨대 생검물로부터 수득된 조직)으로부터의 신장 세포는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 회수로 계승되어, 증식된 생체활성 신장 세포 (예컨대 신장 재생을 할 수 있는 세포가 보강된 세포 군집)를 산출한다. 실시양태에서, 신장 조직 (예컨대 생검물로부터 수득된 조직)으로부터의 신장 세포는 1회 계승되어, 증식된 생체활성 신장 세포를 산출한다. 실시양태에서, 신장 조직 (예컨대 생검물로부터 수득된 조직)으로부터의 신장 세포는 2회 계승되어, 증식된 생체활성 신장 세포를 산출한다. 실시양태에서, 신장 조직 (예컨대 생검물로부터 수득된 조직)으로부터의 신장 세포는 3회 계승되어, 증식된 생체활성 신장 세포를 산출한다. 실시양태에서, 신장 조직 (예컨대 생검물로부터 수득된 조직)으로부터의 신장 세포는 4회 계승되어, 증식된 생체활성 신장 세포를 산출한다. 실시양태에서, 신장 조직 (예컨대 생검물로부터 수득된 조직)으로부터의 신장 세포는 5회 계승되어, 증식된 생체활성 신장 세포를 산출한다. 실시양태에서, 세포를 계승시키는 것은 세포 군집에서 비-생체활성 신장 세포를 고갈시킨다. 실시양태에서, 세포를 계승시키는 것은 세포 군집에서 적어도 1종의 세포 유형을 고갈시킨다. 실시양태에서, 세포를 계승시키는 것은 세포 군집에서 1.095 g/ml를 초과하는 밀도를 가지는 세포를 고갈시킨다. 실시양태에서, 세포를 계승시키는 것은 세포 군집에서 낮은 과립성의 소형 세포를 고갈시킨다. 실시양태에서, 세포를 계승시키는 것은 세포 군집에서 적혈구에 비해 소형인 세포를 고갈시킨다. 실시양태에서, 세포를 계승시키는 것은 세포 군집에서 6 ㎛ 미만의 직경을 가지는 세포를 고갈시킨다. 실시양태에서, 세포를 계승시키는 것은 세포 군집에서 2 ㎛ 미만의 직경을 가지는 세포를 고갈시킨다. 실시양태에서, 세포를 계승시키는 것은 세포 군집에서 적혈구에 비해 더 낮은 과립성을 가지는 세포를 고갈시킨다. 실시양태에서는, 1회 이상의 계승 후 세포 군집의 생존율이 증가한다. 실시양태에서, 예를 들면 세포가 드러나는 곳의 분산-플롯(scatter-plot) X-Y 축을 사용하여 형광 활성화 세포 분류 (FACs)에 의해 세포를 분석하는 경우, 소형 세포 및 낮은 과립성이라는 설명이 사용된다.
실시양태에서, 증식된 생체활성 신장 세포는 적어도 약 6, 9, 10, 12 또는 24시간, 그러나 48시간 미만, 또는 6 내지 9시간, 또는 6 내지 48시간, 또는 약 12 내지 약 15시간, 또는 약 8시간, 또는 약 12시간, 또는 약 24시간, 또는 약 36시간, 또는 약 48시간 동안 저산소 조건하에서 성장된다. 실시양태에서, 저산소 조건하에서 성장된 세포는 밀도를 바탕으로 선택된다. 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 (예컨대 계승 및/또는 저산소 조건하에서의 배양 후의) 증식된 신장 세포의 연속 또는 불연속 (단일 단계 또는 다단계) 밀도 구배 분리 후 수득되는 선택된 신장 세포 (SRC) 군집이다. 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 (예컨대 계승 및/또는 저산소 조건하에서의 배양 후의) 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의한 증식된 신장 세포의 분리 후 수득되는 선택된 신장 세포 (SRC) 군집이다. 실시양태에서, 저산소 배양 조건은 세포가 주변 산소 농도 (약 21 %)에서 배양되는 표준 배양 조건에 대비하였을 때, 배양 시스템 중 가용 산소 농도의 감소에 세포가 적용되는 배양 조건이다. 실시양태에서, 저산소 배양 조건하에서 배양되는 세포는 약 5 % 내지 약 15 %, 또는 약 5 % 내지 약 10 %, 또는 약 2 % 내지 약 5 %, 또는 약 2 % 내지 약 7 %, 또는 약 2 % 또는 약 3 % 또는 약 4 % 또는 약 5 %의 산소 농도에서 배양된다. 실시양태에서, SRC는 대략 1.0419 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타낸다. 실시양태에서, SRC는 대략 1.04 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타낸다. 실시양태에서, SRC는 대략 1.045 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타낸다. 실시양태에서, BRC 또는 SRC는 개시 신장 세포 군집과 비교하였을 때, 1종 이상의 세포 군집을 더 큰 백분율로 함유하며, 1종 이상의 다른 세포 군집은 없거나 결핍되어 있다.
실시양태에서는, 증식된 생체활성 신장 세포가 밀도 구배 분리에 적용됨으로써, SRC가 수득될 수 있다. 실시양태에서, 세포 부력 밀도를 바탕으로 수확된 신장 세포 군집을 분리하는 데에는, 연속 또는 불연속 단일 단계 또는 다단계 밀도 구배 원심분리가 사용된다. 실시양태에서는, 증식된 생체활성 신장 세포가 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의해 분리됨으로써, SRC가 수득될 수 있다. 실시양태에서, 세포 부력 밀도를 바탕으로 수확된 신장 세포 군집을 분리하는 데에는, 밀도 경계 또는 계면을 가로지르는 원심분리가 사용된다. 실시양태에서, SRC는 부분적으로 수중 60 % (w/v) 비이온계 아이오딘화 화합물 아이오딕사놀의 용액을 포함하는 옵티프레프(OPTIPREP) (악시스-쉴드(Axis-Shield)) 매체를 사용하여 생성된다. 그러나, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 매체, 밀도 구배 (연속 또는 불연속), 밀도 경계, 장벽, 계면 또는 다른 수단, 예를 들면 본원에서 기술되는 세포 군집을 단리하는 데에 필요한 특징을 포함하는 관련 기술분야에 알려져 있는 세포 표면 마커를 사용한 면역학적 분리가 생체활성 신장 세포를 수득하는 데에 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.04 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 실시양태에서, 1.04 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다. 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.0419 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 실시양태에서, 1.0419 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다. 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.045 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 실시양태에서, 1.045 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다.
실시양태에서, SRC 군집을 수득하는 데에, 및/또는 신장 세포 군집이 생체활성 신장 세포 군집인지를 확인하는 데에는, 세포 부력 밀도가 사용된다. 실시양태에서, 세포 부력 밀도는 생체활성 신장 세포를 단리하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 세포 부력 밀도는 단일-단계 옵티프레프 (7 % 아이오딕사놀; 옵티멤(OptiMEM) 중 60 % (w/v)) 밀도 계면 (단일 단계 불연속 밀도 구배)를 가로지르는 원심분리에 의해 측정된다. 옵티프레프는 수중 아이오딕사놀 60 % w/v 용액이다. 대표적인 밀도 계면 또는 단일 단계 불연속 밀도 구배에 사용되는 경우, 옵티프레프는 7 % 아이오딕사놀 (물 및 옵티멤 중)의 최종 용액을 형성하도록 옵티멤 (세포 배양 기본 배지)을 사용하여 희석된다. 옵티멤의 제제는 HEPES 및 소듐 비카르보네이트에 의해 완충되고 하이포크산틴, 티미딘, 소듐 피루베이트, L-글루타민 또는 글루타맥스(GLUTAMAX), 미량 원소 및 성장 인자가 보충된, 이글 최소 필수 배지의 변형이다. 단백질 농도는 최소 (15 ㎍/mL)로써, 인슐린 및 트랜스페린이 유일한 단백질 보충물이다. pH 지표로서, 페놀 레드가 감소된 농도로 포함된다. 실시양태에서, 옵티멤에는 사용 전에 2-메르캅토에탄올이 보충될 수 있다.
실시양태에서는, 옵티프레프 용액이 제조된 후, 사용 전에 원하는 밀도를 표시하는 굴절률이 측정된다 (R.I. 1.3456 +/- 0.0004). 실시양태에서, 신장 세포는 용액의 상부에 층상화된다. 실시양태에서는, 밀도 계면 또는 단일 단계 불연속 밀도 구배가 원심분리 튜브 (예컨대 50 ml 원추형 튜브) 또는 세포 처리기 (예컨대 코브(COBE) 2991) 중 어느 하나에서 실온으로 20분 동안 (중단 없이) 800 g로 원심분리된다. 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.04 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 실시양태에서, 1.04 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다. 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.0419 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 실시양태에서, 1.0419 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다. 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.045 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 실시양태에서, 1.045 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다. 실시양태에서, 세포 밀도의 평가 또는 밀도를 바탕으로 한 선택 전에, 세포는 그것이 적어도 50 % 전면생장될 때까지 배양되며, 37 ℃의 5 % CO2 환경 중 2 % 산소로 설정된 저산소 인큐베이터에서 밤새 (예컨대 적어도 약 8 또는 12시간) 인큐베이팅된다.
실시양태에서, 신장 샘플로부터 수득되는 세포는 증식된 다음, (예를 들면 저산소 및 원심분리 분리에 의해) 처리됨으로써, SRC 군집을 제공한다. 실시양태에서, SRC 군집은 본원에서 기술되는 시약 및 절차를 사용하여 제조된다. 실시양태에서, SRC 군집으로부터의 세포 샘플은 군집의 세포가 대상체에게 투여되기 전에 생존율에 대하여 시험된다. 실시양태에서, SRC 군집으로부터의 세포 샘플은 군집의 세포가 대상체에게 투여되기 전에 본원에서 개시되는 1종 이상의 바이오마커의 발현에 대하여 시험된다.
SRC를 제조하기 위한 조성물 및 방법의 비-제한적인 예는 그 전체 내용이 본원에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 출원 공개 제2017/0281684 A1호에 개시되어 있다.
실시양태에서, BRC 또는 SRC는 선천 자가 또는 동종이형 신장 샘플로부터 유래한다. 실시양태에서, BRC 또는 SRC는 비-자가 신장 샘플로부터 유래한다. 실시양태에서, 샘플은 신장 생검에 의해 수득될 수 있다.
실시양태에서, 신장 세포 단리 및 증식은 신장 상피 세포 및 간질 세포를 포함한 신장 세포 유형들의 혼합물을 제공한다. 실시양태에서, SRC는 증식된 신장 세포의 연속 또는 불연속 밀도 구배 분리에 의해 수득된다. 실시양태에서, 밀도 구배 분리된 SRC 군집에서의 주요 세포 유형은 요세관 상피 표현형의 것이다. 실시양태에서, SRC는 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의한 증식된 신장 세포의 분리에 의해 수득된다. 실시양태에서, 밀도 경계/장벽/계면을 가로질러 분리된 SRC 군집에서의 주요 세포 유형은 요세관 상피 표현형의 것이다. 실시양태에서, 증식된 신장 세포로부터 수득되는 SRC의 특징은 다-방면 접근법을 사용하여 평가된다. 실시양태에서는, 신장 세포 증식 과정 동안 세포 형태구조, 성장 동역학 및 세포 생존율이 모니터링된다. 실시양태에서, SRC 부력 밀도 및 생존율은 밀도 구배 매체에서의, 또는 그를 통한 원심분리 및 트리판 블루 배제(Trypan Blue exclusion)에 의해 특성화된다. 실시양태에서, SRC 표현형은 유동 세포측정법에 의해 특성화되며, SRC 기능은 VEGF 및 KIM-1의 발현에 의해 입증된다. 실시양태에서는, SRC 예비-제제의 세포 기능 역시 하기 2종의 특정 효소의 활성을 측정하는 것에 의해 평가될 수 있다: 신장 근위 요세관에서 발견되는 GGT (γ-글루타밀 트랜스펩티다제) 및 LAP (류신 아미노펩티다제).
실시양태에서, 밀도 매체 (크기 및 과립성)를 통한 세포 하위군집의 분리에 기여하는 세포 특징은 유동 세포측정법 (정면 스캐터 = 유동 세포측정법을 통한 크기의 반영, 측면 스캐터 = 과립성의 반영)을 통하여 세포 하위군집을 분리하는 데에 활용될 수 있다. 실시양태에서, 밀도 구배 또는 분리 매체는 해당하는 특정 세포에 대하여 낮은 독성을 가져야 한다. 실시양태에서, 밀도 매체가 해당하는 특정 세포에 대하여 낮은 독성을 가져야 하기는 하지만, 본 개시내용은 해당 세포의 선택 과정에서 역할을 하는 매체의 사용을 고려한다. 실시양태에서, 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 아이오딕사놀을 포함하는 매체에 의해 회수되는 본원에서 개시되는 세포 군집은 아이오딕사놀-내성인데, 적재와 회수 단계 사이에 눈에 띄는 세포 손실이 존재함으로써 밀도 구배 또는 밀도 경계, 밀도 장벽 또는 밀도 계면의 조건하에서의 아이오딕사놀에의 노출이 특정 세포들의 제거로 이어진다는 것을 암시하고 있기 때문인 것으로 보인다. 실시양태에서, 아이오딕사놀 밀도 구배 또는 밀도 경계 분리 후 사라지는 세포들은 아이오딕사놀 및/또는 밀도 구배 또는 경계 노출의 임의의 불리한 효과에 대하여 내성이다. 실시양태에서는, 묽음 내지 중간의 네프로톡신을 포함하는 대조 매체(contrast medium)가 세포 군집, 예컨대 SRC 군집의 단리 및/또는 선택에 사용된다. 실시양태에서, SRC는 아이오딕사놀-내성이다. 실시양태에서, 밀도 매체는 인간 혈장 중 단백질에 결합하거나 해당 세포의 핵심 기능에 부정적인 영향을 주지 않아야 한다.
실시양태에서, 세포 군집은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 1종 이상의 신장 세포 유형이 보강 및/또는 고갈되어 있다. 실시양태에서, 신장 세포 유형은 BD FACS아리아(FACSAria)™ 또는 등가물을 사용하여 보강 및/또는 고갈될 수 있다. 실시양태에서, 신장 세포 유형은 FACS아리아 III™ 또는 등가물을 사용하여 보강 및/또는 고갈될 수 있다.
실시양태에서, 세포 군집은 자기 세포 분류를 사용하여 1종 이상의 신장 세포 유형이 보강 및/또는 고갈되어 있다. 실시양태에서, 1종 이상의 신장 세포 유형은 밀테니이(Miltenyi) 오토(auto)MACS® 시스템 또는 등가물을 사용하여 보강 및/또는 고갈될 수 있다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 3-차원 배양에 적용되어 있다. 실시양태에서, 세포 군집의 배양 방법은 연속 관류를 통한다. 실시양태에서, 3-차원 배양 및 연속 관류를 통하여 배양되는 세포 군집은 정적으로 배양된 세포 군집과 비교하였을 때, 더 큰 세포충실성(cellularity) 및 상호연결성을 나타낸다. 실시양태에서, 3-차원 배양 및 연속 관류를 통하여 배양되는 세포 군집은 그와 같은 세포 군집의 정적 배양과 비교하였을 때, 더 많은 EPO 발현은 물론, E-카드헤린과 같은 신장 요세관-연관 유전자의 강화된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 연속 관류를 통하여 배양되는 세포 군집은 정적으로 배양된 세포 군집과 비교하였을 때, 더 큰 글루코스 및 글루타민 소비 수준을 나타낸다.
실시양태에서는, 낮거나 저산소인 산소 조건이 본원에 제공되는 세포 군집을 제조하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 실시양태에서, 세포 군집의 제조 방법은 저산소 컨디셔닝 단계 없이 사용될 수도 있다. 실시양태에서는, 정상산소 조건이 사용될 수도 있다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 신장 조직으로부터 단리 및/또는 배양되어 있다. 본원에서는, 신장 세포 구성요소들, 예컨대 신장 질환, 빈혈, EPO 결핍, 요세관 수송 결핍 및 사구체 여과 결핍의 치료를 포함한 치료 용도의 제제에 사용될 보강된 세포 군집을 분리하고 단리하기 위한 방법의 비-제한적인 예들이 개시된다. 실시양태에서, 세포 군집은 새로 분해된, 즉 기계적 또는 효소적으로 분해된 신장 조직, 또는 포유동물 신장 세포의 비균질 시험관 내 배양물로부터 단리된다.
실시양태에서, 신장 세포 군집은 EPO-생성 신장 세포를 포함한다. 실시양태에서, 대상체는 빈혈 및/또는 EPO 결핍에 걸려 있다. 실시양태에서, EPO-생성 신장 세포 군집은 EPO 발현 및 산소에 대한 생체반응성(bioresponsiveness)을 특징으로 함으로써, 배양 시스템 중 산소 분압의 감소가 EPO 발현의 유도를 초래하도록 한다. 실시양태에서, EPO-생성 세포 군집은 EPO-생성 세포가 보강된다. 실시양태에서, EPO 발현은 정상적인 주변 (약 21 %) 가용 산소 농도에서 배양되는 세포 군집과 비교하였을 때 배양 시스템 중 가용 산소 농도의 감소에 세포가 적용되는 조건하에서 세포 군집이 배양되는 경우에 유도된다. 실시양태에서, 저산소 조건에서 배양되는 EPO-생성 세포는 정상적인 산소 조건에서 배양되는 EPO-생성 세포 대비 더 높은 농도의 EPO를 발현한다. 일반적으로, 감소된 가용 산소 농도 (저산소 배양 조건으로도 지칭됨)에서의 세포의 배양은 감소된 산소 농도가 정상적인 주변 가용 산소 농도 (정상 또는 정산산소 배양 조건으로도 지칭됨)에서의 세포의 배양에 대비하여 감소된다는 것을 의미한다. 실시양태에서, 저산소 세포 배양 조건은 약 1 % 미만의 산소, 약 2 % 미만의 산소, 약 3 % 미만의 산소, 약 4 % 미만의 산소 또는 약 5 % 미만의 산소에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 정상 또는 정상산소 배양 조건은 약 10 %의 산소, 약 12 %의 산소, 약 13 %의 산소, 약 14 %의 산소, 약 15 %의 산소, 약 16 %의 산소, 약 17 %의 산소, 약 18 %의 산소, 약 19 %의 산소, 약 20 %의 산소 또는 약 21 %의 산소에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
실시양태에서, EPO의 유도 또는 증가된 발현은 약 5 % 미만의 가용 산소에서 세포를 배양하는 것, 및 EPO 발현 농도를 주변 (약 21 %) 산소에서 배양된 세포와 비교하는 것에 의해 달성되어 관찰될 수 있다. 실시양태에서, EPO의 유도는 세포의 배양물이 소정의 시간 기간 동안 주변 산소 (약 21 %)에서 배양되는 제1 배양 단계, 및 가용 산소 농도가 감소되고 동일한 세포가 약 5 % 미만의 가용 산소에서 배양되는 제2 배양 단계를 포함하는 방법에 의한 EPO를 발현할 수 있는 세포의 배양에서 수득된다. 실시양태에서, 저산소 조건에 대하여 반응성인 EPO 발현은 HIF1α에 의해 조절된다. 실시양태에서는, 관련 기술분야에 알려져 있는 다른 산소 조작 배양 조건이 본원에서 기술되는 세포에 사용될 수도 있다.
실시양태에서, 제제는 관류 조건에 대한 생체-반응성 (예컨대 EPO 발현)을 특징으로 하는 EPO-생성 포유동물 세포의 보강된 군집을 함유한다. 실시양태에서, 상기 관류 조건에는 일시적, 간헐적 또는 연속적 유체 유동 (관류)이 포함된다. 실시양태에서, EPO 발현은 유동을 통하여 동적인 힘이 세포로 전달되는 방식으로 세포가 배양되는 배지가 간헐적 또는 연속적으로 순환 또는 교반되는 경우에, 기계적으로-유도된다. 실시양태에서, 일시적, 간헐적 또는 연속적 유체 유동에 적용되는 세포는 해당 3-차원 구조가 형성되는 골격 및/또는 공간을 제공하는 재료 내 또는 재료상에 3-차원 구조로서 그것이 존재하도록 하는 방식으로 배양된다. 실시양태에서, 세포는 다공성 비드상에서 배양되며, 요동 플랫폼, 궤도선회(orbiting) 플랫폼 또는 스피너 플라스크에 의해 간헐적 또는 연속적 유체 유동에 적용된다. 실시양태에서, 세포는 3-차원 스캐폴딩(scaffolding) 상에서 배양된 후, 그에 의해 스캐폴드가 고정되며 유체가 스캐폴딩을 통하거나 가로질러 지향성으로 유동하는 장치에 배치된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 관련 기술분야에 알려져 있는 다른 관류 배양 조건이 본원에서 기술되는 세포에 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
실시양태에서, 세포 군집은 신장 생검물로부터 유래한다. 실시양태에서, 세포 군집은 전신장 조직으로부터 유래한다. 실시양태에서, 세포 군집은 신장 생검물 또는 전신장 조직으로부터 확립된 포유동물 신장 세포의 시험관 내 배양물로부터 유래한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 SRC 군집이다. 실시양태에서, 세포 군집은 본원에서 비-보강 세포 군집으로도 지칭되는 분획화되지 않은 세포 군집이다.
다양한 활성 작용제 (예컨대 신장 세포가 아닌 다른 것)를 함유하는 조성물이 본원에 포함된다. 적합한 활성 작용제의 비-제한적인 예에는 비제한적으로 세포 응집체, 무세포 생체재료, 생체활성 세포 분비 생성물, 대형 및 소형 분자 치료제는 물론, 이들의 조합이 포함된다. 예를 들면, 한 가지 유형의 생체활성 세포가 치료 분자가 있거나 없는 생체재료-기재 마이크로캐리어 또는 또 다른 유형의 생체활성 세포와 조합될 수 있다. 실시양태에서, 부착되지 않은 세포는 무세포 입자와 조합될 수 있다.
실시양태에서, 신장 세포 군집의 세포는 구상체 내에 존재한다. 실시양태에서, 신장 세포 군집은 구상체의 형태로 존재한다. 실시양태에서는, 생체활성 신장 세포를 포함하는 구상체가 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 상기 구상체는 적어도 1종의 비-신장 세포 유형 또는 세포 군집을 포함한다. 실시양태에서, 구상체는 (i) 생체활성 신장 세포 군집과 비-신장 세포 군집을 조합하는 단계 및 (ii) 구상체가 형성될 때까지, 스피너 플라스크를 포함하는 3-차원 배양 시스템에서 상기 생체활성 신장 세포 군집 및 비-신장 세포 군집을 배양하는 단계를 포함하는 방법에서 제조된다.
실시양태에서, 비-신장 세포 군집은 내피 세포 군집 또는 내피 선조 세포 군집을 포함한다. 실시양태에서, 생체활성 세포 군집은 내피 세포 군집이다. 실시양태에서, 상기 내피 세포 군집은 세포주이다. 실시양태에서, 내피 세포 군집은 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 포함한다. 실시양태에서, 비-신장 세포 군집은 중간엽 줄기 세포 군집이다. 실시양태에서, 비-신장 세포 군집은 조혈, 포유동물, 장, 태반, 폐, 골수, 혈액, 제대, 내피, 치수, 지방, 신경, 후각, 신경 능선 또는 고환 기원의 줄기 세포 군집이다. 실시양태에서, 비-신장 세포 군집은 지방-유래 선조 세포 군집이다. 실시양태에서, 상기 세포 군집은 이종발생, 동계, 동종이형, 자가 또는 이들의 조합이다. 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집 및 비-신장 세포 군집은 0.1:9.9 내지 9.9:0.1의 비로 배양된다. 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집 및 비-신장 세포 군집은 약 1:1의 비로 배양된다. 실시양태에서, 신장 세포 군집 및 생체활성 세포 군집은 성장 배지 중에 현탁된다.
증식된 생체활성 신장 세포는 또한 SRC를 수득하기 위하여 연속 또는 불연속 밀도 매체 분리에 적용될 수 있다. 구체적으로, 연속 또는 불연속 단일 단계 또는 다단계 밀도 구배 원심분리가 세포 부력 밀도를 바탕으로 수확된 신장 세포 군집을 분리하는 데에 사용된다. 특정 실시양태에서, 증식된 생체활성 신장 세포는 또한 SRC를 수득하기 위하여 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의한 분리에 적용될 수 있다. 구체적으로, 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리가 세포 부력 밀도를 바탕으로 수확된 신장 세포 군집을 분리하는 데에 사용된다. 특정 실시양태에서, SRC는 부분적으로 수중 비이온계 아이오딘화 화합물 아이오딕사놀의 60 % 용액을 포함하는 옵티프레프 (악시스-쉴드) 매체를 사용하여 생성된다. 그러나, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 구체적인 매체에 대한 제한이 없는 임의의 밀도 구배 매체 또는 다른 수단, 예를 들면 본 개시내용의 세포 군집을 단리하는 데에 필요한 특징을 포함하는 관련 기술분야에 알려져 있는 세포 표면 마커를 사용한 면역학적 분리가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 퍼콜 또는 수크로스가 밀도 구배 또는 밀도 경계를 형성하는 데에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.04 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 특정 실시양태에서, 1.04 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다. 특정 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.0419 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 특정 실시양태에서, 1.0419 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다. 특정 실시양태에서는, 별도 펠렛으로서의 원심분리 후, 대략 1.045 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 수집된다. 특정 실시양태에서, 1.045 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다.
본 개시내용의 치료 조성물 및 그의 제제는 예를 들면 그 전체 내용이 본원에 참조로써 개재되는 프레스넬 등의 U.S. 8,318,484호 및 일라간 등의 PCT/US2011/036347호에서 이전에 기술된 바와 같이 신장 질환의 치료, 즉 신장 기능 및/또는 구조의 안정화 및/또는 향상 및/또는 재생을 제공하는 데에 사용하기 위하여 특정 생체활성 구성요소 또는 세포 유형이 보강되고/거나 특정 불활성 또는 비선호 구성요소 또는 세포 유형이 제거된, 신장 세포의 단리된 비균질 군집 및/또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 아직 치료 특성을 보유하고 있는, 건강한 개체와 비교하였을 때 세포 구성요소들이 결핍되어 있는 단리된 신장 세포 분획을 함유할 수 있는 바, 다시 말하자면 신장 기능의 안정화 및/또는 향상 및/또는 재생을 제공할 수 있다. 본원에서 기술되는 세포 군집, 세포 분획 및/또는 세포 혼합물은 건강한 개체, 신장 질환이 있는 개체 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 대상체로부터 유래할 수 있다.
본 개시내용은 필요로 하는 대상체 내의 표적 기관 또는 조직에 투여될 수 있는 선택된 신장 세포 군집의 치료 조성물을 고려한다. 생체활성 선택된 신장 세포 군집은 일반적으로 대상체에의 투여시 잠재적으로 치료 특성을 가지는 세포 군집을 지칭한다. 예를 들면, 필요로 하는 대상체에의 투여시, 생체활성 신장 세포 군집은 대상체에서의 신장 기능의 안정화 및/또는 향상 및/또는 복구 및/또는 재생을 제공할 수 있다. 상기 치료 특성은 재생 효과를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포의 공급원은 예정된 표적 기관 또는 조직과 동일하다. 실시양태에서, BRC 및/또는 SRC는 신장에 투여될 제제에서 사용될 신장으로부터 기원할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 군집은 신장 생검물로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 세포 군집은 전신장 조직으로부터 유래한다. 다른 한 실시양태에서, 세포 군집은 신장 생검물 또는 전신장 조직으로부터 확립된 포유동물 신장 세포의 시험관 내 배양물로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, BRC 및/또는 SRC는 생체활성 신장 세포의 비균질 혼합물 또는 분획들을 포함한다. BRC 및/또는 SRC는 건강한 개체로부터의 신장 세포 분획으로부터 유래하거나 그 자체일 수 있다. 또한, 본 개시내용은 아직 치료 특성을 보유하고 있는, 건강한 개체의 상응하는 신장 세포 분획과 비교하였을 때 특정 세포 구성요소들이 결핍되었을 수 있는 건강하지 않은 개체로부터 수득된 신장 세포 분획을 제공한다. 본 개시내용은 또한 건강한 개체에 비해 세포 구성요소들이 결핍되어 있는 치료적으로 활성인 세포 군집을 제공하는 바, 특정 실시양태에서 상기 세포 군집은 다양한 질환 상태에 있는 자가 공급원으로부터 단리 및 증식될 수 있다.
특정 실시양태에서, SRC는 신장 생검을 통한 환자 신장 피질 조직으로부터의 신장 세포의 단리 및 증식으로부터 수득된다. 신장 세포는 효소 분해에 의해 신장 조직으로부터 단리된 후, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 증식되고, 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 증식된 신장 세포의 원심분리에 의해 선택된다. 이와 같은 실시양태에서, SRC는 주로 그의 재생 가능성이 알려져 있는 신장 요세관 상피 세포로 구성된다 (문헌 [Bonventre JV. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003;14(Suppl. 1):S55-61]; [Humphreys BD, Czerniak S, DiRocco DP, et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. PNAS. 2011;108:9226-31]; [Humphreys BD, Valerius MT, Kobayashi A, et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2008;2:284-91]). 다른 실질 (혈관) 및 간질 세포가 자가 SRC 군집 중에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 신장 세포는 연속 또는 불연속 단일 단계 또는 다단계 구배를 통한 원심분리에 의해 선택된다.
본원에서 기술될 때, 본 개시내용은 부분적으로 생체활성 구성요소가 보강되고 불활성 또는 비선호 구성요소가 제거된 비균질 신장 세포 군집의 특정 하위분획이 개시 군집에 비해 탁월한 치료 및 재생 성과를 제공한다는 놀라운 발견에 기초한다.
신장 세포 단리 및 증식은 신장 요세관 상피 세포 및 간질 세포를 포함한 신장 세포 유형들의 혼합물을 제공한다. 상기에서 주지된 바와 같이, SRC는 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 원심분리에 의한 증식된 신장 세포의 분리에 의해 수득된다. 분리된 SRC 군집에서의 주요 세포 유형은 요세관 상피 표현형의 것이다. 증식된 신장 세포로부터 수득되는 SRC의 특징은 다-방면 접근법을 사용하여 평가된다. 신장 세포 증식 과정 동안에는 세포 형태구조, 성장 동역학 및 세포 생존율이 모니터링된다. SRC 부력 밀도 및 생존율은 밀도 계면 및 트리판 블루 배제에 의해 특성화된다. SRC 표현형은 유동 세포측정법에 의해 특성화되며, SRC 기능은 VEGF 및 KIM-1의 발현에 의해 입증된다.
관련 기술분야 통상의 기술자라면, 관련 기술분야에 알려져 있는 다른 단리 및 배양 방법들이 본원에서 기술되는 세포에 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 생체활성 세포 군집이 비제한적으로 신장, 체액 및 지방이 아닌 다른 조직 및 기관을 포함하여, 상기에서 구체적으로 열거된 것들이 아닌 다른 공급원으로부터 유래할 수 있다는 것 역시 알고 있을 것이다.
SRC 표현형
특정 실시양태에서, 세포 표현형은 유동 세포측정법을 사용한 신장 세포 마커들의 발현 분석에 의해 모니터링된다. 세포의 표현형 분석은 분석되는 세포 유형 특유의 항원성 마커 사용을 바탕으로 한다. 유동 세포측정법 분석은 분석되는 항원성 마커를 발현하는 샘플 군집 중 세포의 정량 측정을 제공한다.
하기의 다양한 마커들이 신장 세포의 표현형 특성화에 유용한 것으로 문헌에 보고되어 있다: (i) 시토케라틴; (ii) 수송 멤브레인 단백질 (아쿠아포린 및 큐빌린); (iii) 세포 결합 분자 (어드헤린, 렉틴 및 기타 단백질들); 및 (iv) 대사 효소 (글루타치온 및 감마-글루타밀 트랜스펩티다제 (GGT)) (표 1). 전신장 분해물로부터 유래되는 배양물에서 발견되는 대부분의 세포가 상피 및 내피 세포이기 때문에, 조사되는 마커들은 일반적으로 이들 2종의 군과 연관되어 있는 단백질의 발현에 초점을 맞추고 있다.
<표 1>
Figure pct00001
표 2는 SRC 군집 표현형의 선택된 마커, 범위 및 평균 백분율 값 및 그의 선택 이유를 제공한다.
<표 2>
Figure pct00002
세포 기능
SRC는 컨디셔닝된 배지의 분석을 통하여 검출될 수 있는 단백질들을 활발하게 분비한다. 세포 기능은 프레스토블루를 대사하고 VEGF (혈관 내피 성장 인자) 및 KIM-1 (신장 손상 분자-1)을 분비하는 세포의 능력에 의해 평가된다.
표 3은 신장 세포 및 SRC 배양물로부터의 컨디셔닝된 배지에 존재하는 VEGF 및 KIM-1 양을 제공한다. 신장 세포는 거의 전면생장까지 배양하였다. 신장 세포 배양물에의 밤샘 노출로부터의 컨디셔닝된 배지를 VEGF 및 KIM-1에 대하여 시험하였다.
<표 3>
Figure pct00003
SRC 효소 활성
SRC 예비-제제의 세포 기능은 신장 근위 요세관에서 발견되는 2종의 특정 효소인 GGT (γ-글루타밀 트랜스펩티다제) 및 LAP (류신 아미노펩티다제)의 활성을 측정하는 것에 의해 평가될 수도 있다.
본원에서 선택된 신장 세포 조성물이 기술되기는 하지만, 본 개시내용은 신장이 아닌 다른 조직 및 기관으로부터 기원하는 세포 및 세포 혼합물을 포함한 다양한 다른 활성 작용제들을 함유하는 조성물을 고려한다. 다른 적합한 활성 작용제에는 비제한적으로 세포 응집체 및 기관유사체, 무세포 생체재료, 생체활성 세포로부터 분비된 생성물, 대형 및 소형 분자 치료제는 물론, 이들의 조합이 포함된다. 예를 들면, 한 가지 유형의 생체활성 세포가 치료 분자가 있거나 없는 생체재료-기재 마이크로캐리어 또는 또 다른 유형의 생체활성 세포와 조합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 부착되지 않은 세포는 무세포 입자와 조합될 수 있다.
세포 응집체
다른 한 측면에서, 본 개시내용의 제제는 세포 응집체 또는 구상체를 함유한다. 특정 실시양태에서, 세포 응집체는 본원에서 기술되는 생체활성 세포 군집을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 응집체는 예를 들면 신장 세포 혼합물, 보강된 신장 세포 군집, 그리고 신장 세포 분획 및 신장 세포 혼합물의 비제한적으로 중간엽 줄기 세포, 내피 선조 세포, 지방의 간질 혈관 분획으로부터 유래되는 세포 또는 임의의 다른 비-신장 세포 군집과의 조합과 같은 생체활성 신장 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 생체활성 신장 세포는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이 3D 포맷(format)으로 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, "기관유사체"라는 용어는 선천 신장의 측면들을 재현하는 표현형 및/또는 기능을 가지는 세포 축적물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기관유사체는 통상적으로 생체 내의 주어진 조직에서 발견되는 다양한 계통을 가지는 세포들의 혼합 군집을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 기관유사체는 본 개시내용의 세포들이 그에 의해 응집체를 형성하고 다시 구상체, 기관유사체 또는 이들의 조합을 형성할 수 있는 임의의 수단을 통하여 시험관 내에서 형성된다. 일부 실시양태에서, 그와 같은 응집체, 구상체 또는 기관유사체는 특정 기관과 일치하는 구조를 취한다. 일부 실시양태에서, 그와 같은 응집체, 구상체 또는 기관유사체는 특정 기관의 세포에 의해 통상적으로 발현되는 표면 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 그와 같은 응집체, 구상체 또는 기관유사체는 특정 기관의 세포에 의해 통상적으로 발현되는 화합물 또는 물질을 생성한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 세포는 천연 기재, 예컨대 젤라틴상에서 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 세포는 합성 기재, 예컨대 PLGA상에서 배양될 수 있다.
3. 생체재료
다양한 생체재료들이 활성 작용제와 조합되어 본 개시내용의 치료 제제를 제공할 수 있다. 생체재료는 임의의 적합한 형상 (예컨대 비드) 또는 형태 (예컨대 액체, 젤 등)로 존재할 수 있다. 베르트람(Bertram) 등의 U.S. 출원 공개 20070276507호 (그 전체가 본원에 참조로써 개재됨)에 기술되어 있는 바와 같이, 중합체 매트릭스 또는 스캐폴드는 어떠한 수의 전체 시스템, 기하학 또는 공간 제한도 충족하는 어떠한 수의 바람직한 배열구조로도 형상화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체재료는 액체 현탁액의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 매트릭스 또는 스캐폴드는 3-차원으로써, 기관 또는 조직 구조의 차원 및 형상에 부합하도록 형상화될 수 있다. 예를 들어, 신장 질환, 요세관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 치료하는 데에 있어서의 중합체 스캐폴드의 사용시에는, 선천 신장 조직 구조 및 체제는 물론 신장 실질의 그것의 측면 또는 완전성을 재현한 3-차원 (3-D) 매트릭스가 사용될 수 있다.
다양한 상이하게 형상화된 3-D 스캐폴드들이 사용될 수 있다. 당연히, 중합체 매트릭스는 상이한 크기의 환자에 부합하는 상이한 크기 및 형상으로 형상화될 수 있다. 중합체 매트릭스는 환자의 특수한 필요성을 수용하는 다른 방식으로 형상화될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 중합체 매트릭스 또는 스캐폴드는 생체적합성의 다공성 중합체 스캐폴드일 수 있다. 스캐폴드는 비제한적으로 개방-셀(open-cell) 폴리락트산 (OPLA®), 셀룰로스 에테르, 셀룰로스, 셀룰로스계 에스테르, 플루오린화 폴리에틸렌, 페놀계물질, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤즈옥사졸, 폴리카르보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카르보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오로올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥시드, 폴리페닐렌 술피드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리술피드, 폴리술폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 재생 셀룰로스, 실리콘, 우레아-포름알데히드, 콜라겐, 젤라틴, 알기네이트, 라미닌, 피브로넥틴, 실크, 엘라스틴, 알기네이트, 히아루론산, 아가로스, 또는 이들의 공중합체 또는 물리적 블렌드를 포함한 다양한 합성 또는 자연-발생 재료로부터 형성될 수 있다. 스캐폴딩 배열구조는 연질 다공성 스캐폴드로부터 경질의 형상-유지 다공성 스캐폴드까지의 범위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 스캐폴드는 수화젤, 예컨대 융점을 초과하는 수화젤이 될 수 있는 액체 용액으로 구성된다.
특정 실시양태에서, 스캐폴드는 기존의 신장, 또는 인간 또는 동물 기원의 다른 기관으로부터 유래되는데, 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 세제 및/또는 기타 화학 작용제 및/또는 기타 효소 및/또는 물리적 방법론의 적용을 통하여 선천 세포 군집이 제거되어 있다. 이와 같은 실시양태에서, 기원 기관의 선천 3차원 구조는 그의 선천적인 생물학적 활성 맥락에서 모든 연관되어 있는 세포외 매트릭스 구성요소들과 함께 유지된다. 특정 실시양태에서, 스캐폴드는 인간 또는 동물 신장 또는 다른 기관으로부터 유래되는 세포외 매트릭스이다. 특정 실시양태에서, 배열구조는 3차원 바이오프린팅 방법론의 적용을 통하여 조직-유사 구조로 조립된다. 특정 실시양태에서, 배열구조는 수화젤이 될 수 있는 용액의 액체 형태이다.
수화젤은 다양한 중합체 재료로부터 형성될 수 있으며, 다양한 생물의학 적용분야에 유용하다. 수화젤은 물리적으로는 친수성 중합체의 3-차원 네트워크로 기술될 수 있다. 수화젤의 유형에 따라, 그것은 가변적인 백분율의 수분을 함유하지만, 전혀 물에 용해되지는 않는다. 그의 높은 수분 함량에도 불구하고, 수화젤은 친수성 잔기들의 존재로 인하여 막대한 부피의 액체와 추가로 결합할 수 있다. 수화젤은 그의 젤라틴성 구조를 변화시키지 않으면서도 크게 팽창한다. 수화젤의 기본적인 물리적 특징은 사용되는 중합체 및 수화젤을 투여하는 데에 사용되는 장치의 특성에 따라 구체적으로 변형될 수 있다.
수화젤 재료는 바람직하게는 염증 반응을 유도하지 않는다. 수화젤을 형성하는 데에 사용될 수 있는 다른 재료의 예에는 (a) 변형된 알기네이트, (b) 1가 양이온에의 노출에 의해 젤화되는 다당류 (예컨대 젤란 검 및 카라기난), (c) 매우 점성인 액체이거나, 또는 요변성이어서 시간이 지나면서 느린 구조 발현에 의해 젤을 형성하는 다당류 (예컨대 히아루론산), (d) 젤라틴 또는 콜라겐, 및 (e) 중합체성 수화젤 전구체 (예컨대 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체 및 단백질)가 포함된다. U.S. 특허 제6,224,893 B1호가 본 개시내용에 따른 수화젤을 제조하는 데에 적합한 다양한 중합체 및 그와 같은 중합체의 화학적 특성에 대한 상세한 설명을 제공하고 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 생체재료를 제제화하는 데에 사용되는 수화젤은 젤라틴-기재이다. 젤라틴은 중간엽 조직 세포외 매트릭스 (ECM)의 주요 성분인 콜라겐으로부터 유래되는 비-독성의 생분해성이며 수용성인 단백질이다. 콜라겐은 동물 신체 내 다양한 결합 조직에서의 세포외 공간의 주 구조 단백질이다. 결합 조직의 주 성분으로서, 그것은 포유동물에서 가장 풍부한 단백질로써, 전-신 단백질 함량의 25 % 내지 35 %를 구성한다. 무기질화 정도에 따라, 콜라겐 조직은 경질이거나 (골), 유연성이거나 (건), 또는 경질 내지 유연성의 구배 (연골)를 가질 수 있다. 연장된 피브릴(fibril) 형태인 콜라겐은 건, 인대 및 피부와 같은 섬유질 조직에서 가장 많이 발견된다. 그것은 각막, 연골, 골, 혈관, 창자, 추간판 및 치아의 상아질에도 풍부하다. 근육 조직에서, 그것은 근내막의 주요 성분으로 작용한다. 콜라겐은 근육 조직의 1 내지 2 %를 구성하며, 강한 건 근육 중량의 6 %를 차지한다. 콜라겐은 신체 전체에 걸쳐 많은 위치에서 출현한다. 그러나, 인간 신체의 콜라겐 중 90 % 초과가 유형 I이다.
오늘날까지, 28종 유형의 콜라겐이 식별 및 기술되어 있다. 그들은 그들이 형성하는 구조에 따라 하기 몇 가지 군으로 나누어질 수 있다: 피브릴 (유형 I, II, III, V, XI), 비-피브릴 FACIT (단속되는 삼중 나선이 있는 피브릴 연관 콜라겐) (유형 IX, XII, XIV, XVI, XIX), 단쇄 (유형 VIII, X), 기저 멤브레인 (유형 IV), 멀티플렉신 (단속이 있는 다중 삼중 나선 도메인) (유형 XV, XVIII), MACIT (단속되는 삼중 나선이 있는 멤브레인 연관 콜라겐) (유형 XIII, XVII), 기타 (유형 VI, VII). 5종의 가장 흔한 유형은 하기이다: 유형 I: 피부, 건, 혈관 결찰재, 기관, 골 (골 유기 부분의 주 성분), 유형 II: 연골 (연골의 주 콜라겐성 성분), 유형 III: 망상체 (망상 섬유의 주 성분), 보통 유형 I과 함께 발견됨, 유형 IV: 기저 층을 형성함, 기저 멤브레인의 상피-분비 층, 유형 V: 세포 표면, 모발 및 태반.
젤라틴은 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD) 서열을 포함한 정보 신호를 보유하는데, 이는 세포 부착, 증식 및 줄기 세포 분화를 촉진한다. 젤라틴의 특징적인 특성은 그것이 상부 임계 용액 온도 거동(Upper Critical Solution Temperature behavior) (UCST)를 나타낸다는 것이다. 40 ℃의 특정 온도 임계치를 넘어가면, 젤라틴은 유연성 무작위 단일 코일의 형성에 의해 물에 용해될 수 있다. 냉각시에는, 수소 결합 및 반 데르 발스 상호작용(Van der Waals interaction)이 발생하여 삼중 나선의 형성을 초래한다. 이러한 콜라겐-유사 삼중 나선은 연접 구역으로 작용함으로써 졸-젤 전이(sol-gel transition)를 촉발한다. 젤라틴은 제약 및 의료 적용분야에서 광범위하게 사용되고 있다.
특정 실시양태에서, 본원의 주사가능 세포 조성물을 제제화하는 데에 사용되는 수화젤은 돼지 피부로부터 기원할 수 있는 돼지 젤라틴을 기재로 하는데, 예를 들면 니타 젤라틴 NA 인크.(Nitta Gelatin NA Inc.) (미국 노스 캐롤라이나) 또는 젤리타 USA 인크.(Gelita USA Inc.) (미국 아이오와)로부터 시중에서 구입가능하다. 젤라틴은 예를 들면 둘베코 포스페이트-완충 식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline) (DPBS)에 용해되어 상이한 온도에서 젤화 및 액화될 수 있는 열적으로 반응성인 수화젤을 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원의 주사가능 세포 조성물을 제제화하는 데에 사용되는 수화젤은 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법론을 사용하여 발현 및 정제된 재조합 인간 또는 동물 젤라틴을 기재로 한다. 특정 실시양태에서는, 유형 I 알파 I 인간 콜라겐용 cDNA의 전부 또는 일부를 함유하는 발현 벡터가 효모인 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된다. 다른 발현 벡터 시스템 및 생물체에 대해서는 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 젤라틴-기재 수화젤은 실온 (22-28 ℃) 이상에서 액체이며, 냉장 온도 (2-8 ℃)로 냉각될 경우 젤화된다.
관련 기술분야 통상의 기술자라면, 관련 기술분야에 알려져 있는 다른 유형의 합성 또는 자연-발생 재료가 본원에서 기술되는 바와 같은 스캐폴드를 형성시키는 데에 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용되는 생체재료는 5.1 kDA 내지 >2 x 105 kDa 크기 범위의 HA 분자를 함유하는 수화젤 형태의 히아루론산 (HA)으로 구성된다. HA는 연관되어 있는 생체활성 세포 군집의 분지화 형태형성 및 3차원 자기-조직화를 촉진할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용되는 생체재료는 역시 5.1 kDA 내지 >2 x 105 kDa 크기 범위의 HA 분자를 함유하는 다공성 발포체 형태의 히아루론산으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 수화젤은 비제한적으로 신장, 또는 임의의 다른 조직 또는 기관으로부터 기원하는 세포외 매트릭스로부터 유래하거나 그것을 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용되는 생체재료는 개방-셀 구조 및 약 50 마이크로미터 내지 약 300 마이크로미터의 세공 크기를 가지는 폴리-락트산 (PLA)-기재의 발포체로 구성된다.
온도-민감성 생체재료
본원에서 기술되는 생체재료는 예를 들면 시험관 내 또는 생체 내의 특정 외부 조건에 반응하도록 설계되거나 적합화될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 (예를 들면 시험관 내 또는 생체 내 중 어느 하나에서) 온도-민감성이다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 (예를 들면 시험관 내 또는 생체 내 중 어느 하나에서) 효소 분해에의 노출에 반응하도록 적합화된다. 외부 조건에 대한 생체재료의 반응은 본원에서 기술되는 바와 같이 미세-조정될 수 있다. 기술되는 제제의 온도 민감성은 제제 중 생체재료의 백분율을 조정하는 것에 의해 달라질 수 있다. 예를 들면, 용액 중 젤라틴의 백분율은 최종 제제 (예컨대 액체, 젤, 비드 등)에서의 젤라틴의 온도 민감성을 조절하기 위하여 조정될 수 있다. 대안적으로, 생체재료는 효소 분해에 대하여 더 큰 내성을 제공하기 위하여 화학적으로 가교결합될 수 있다. 예를 들면, 젤라틴 비드들을 화학적으로 가교결합시킴으로써 내생 효소에 대하여 감소된 감수성을 제공하기 위하여, 카르보디이미드 가교결합제가 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본원에서 기술되는 제제는 대상체에 투여될 생체활성 신장 세포와 같은 활성 작용제에 바람직한 환경을 생성시키는 특성을 가지는 생체재료를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 활성 작용제가 생체재료와 제제화되는 시점부터 대상체에의 투여 시점까지 바람직한 환경을 제공하는 제1 생체재료를 함유한다. 다른 한 실시양태에서, 상기 바람직한 환경은 대상체에의 투여 전에 유체 (본원에서 기술되는 바와 같음) 중 세포에 대비하여 실질적으로 고체인 상태로 현탁된 생체활성 세포를 포함하는 것의 장점에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 재료는 온도-민감성 생체재료이다. 온도-민감성 생체재료는 (i) 약 8 ℃ 이하에서의 실질적으로 고체인 상태, 및 (ii) 주변 온도 이상에서의 실질적으로 액체인 상태를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 주변 온도는 대략 실온이다.
특정 실시양태에서, 생체재료는 온도에 따라 적어도 2종의 상이한 상 또는 상태를 유지할 수 있는 온도-민감성 생체재료이다. 생체재료는 제1 온도에서는 제1 상태를, 제2 온도에서는 제2 상태를, 그리고/또는 제3 온도에서는 제3 상태를 유지할 수 있다. 상기 제1, 제2 또는 제3 상태는 실질적으로 고체, 실질적으로 액체, 또는 실질적으로 반-고체 또는 반-액체인 상태일 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 제1 온도에서 제1 상태를, 그리고 제2 온도에서 제2 상태를 가지며, 상기 제1 온도가 상기 제2 온도에 비해 더 낮다.
다른 한 실시양태에서, 온도-민감성 생체재료의 상태는 약 8 ℃ 이하의 온도에서 실질적으로 고체인 상태이다. 특정 실시양태에서, 상기 실질적으로 고체인 상태는 약 1 ℃, 약 2 ℃, 약 3 ℃, 약 4 ℃, 약 5 ℃, 약 6 ℃, 약 7 ℃ 또는 약 8 ℃에서 유지된다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 고체인 상태는 젤의 형태를 가진다. 특정 실시양태에서, 온도-민감성 생체재료의 상태는 주변 온도 이상에서는 실질적으로 액체인 상태이다. 특정 실시양태에서, 상기 실질적으로 액체인 상태는 약 25 ℃, 약 25.5 ℃, 약 26 ℃, 약 26.5 ℃, 약 27 ℃, 약 27.5 ℃, 약 28 ℃, 약 28.5 ℃, 약 29 ℃, 약 29.5 ℃, 약 30 ℃, 약 31 ℃, 약 32 ℃, 약 33 ℃, 약 34 ℃, 약 35 ℃, 약 36 ℃ 또는 약 37 ℃에서 유지된다. 특정 실시양태에서, 상기 주변 온도는 대략 실온이다.
특정 실시양태에서, 온도-민감성 생체재료의 상태는 대략 주변 온도 이하인 온도에서 실질적으로 고체인 상태이다. 특정 실시양태에서, 상기 주변 온도는 대략 실온이다. 특정 실시양태에서, 상기 실질적으로 고체인 상태는 약 17 ℃, 약 16 ℃, 약 15 ℃, 약 14 ℃, 약 13 ℃, 약 12 ℃, 약 11 ℃, 약 10 ℃, 약 9 ℃, 약 8 ℃, 약 7 ℃, 약 6 ℃, 약 5 ℃, 약 4 ℃, 약 3 ℃, 약 2 ℃ 또는 약 1 ℃에서 유지된다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 고체인 상태는 비드의 형태를 가진다. 특정 실시양태에서, 온도-민감성 생체재료의 상태는 약 37 ℃ 이상의 온도에서 실질적으로 액체인 상태이다. 다른 한 실시양태에서, 상기 실질적으로 고체인 상태는 약 37 ℃, 약 38 ℃, 약 39 ℃ 또는 약 40 ℃에서 유지된다.
온도-민감성 생체재료는 용액의 형태, 고체의 형태, 비드의 형태, 또는 본원에서 기술되고/거나 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 다른 적합한 형태로 제공될 수 있다. 본원에서 기술되는 세포 군집 및 조제물은 온도-민감성 생체재료로 코팅되거나, 그 위에 침착되거나, 그에 매립되거나, 그에 부착되거나, 시딩되거나, 그에 현탁되거나 또는 그에 포획될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 세포 군집은 온도-민감성 생체재료와 복합체화되기 전에 3차원 세포 응집체 또는 기관유사체 또는 3차원 요세관 구조로 조립될 수 있거나, 또는 온도-민감성 생체재료와의 복합체화시 그와 같이 조립될 수 있다. 대안적으로, 온도-민감성 생체재료는 예를 들면 스페이서 비드(spacer bead)의 형태에서와 같이 어떠한 세포도 없이 제공될 수 있다. 이와 같은 실시양태에서, 온도 민감성 생체재료는 단순히 수동적인 역할로 기능함으로써, 재생 생체활성, 예를 들면 혈관생성, 또는 숙주 세포 군집의 침습 및 이주를 위한 표적 기관 내의 공간을 창출한다.
특정 실시양태에서, 온도-민감성 생체재료는 제1 상태와 제2 상태 사이의 전이 상태를 가진다. 특정 실시양태에서, 상기 전이 상태는 약 8 ℃의 온도 내지 대략 주변 온도에서의 고체-에서-액체 전이 상태이다. 특정 실시양태에서, 상기 주변 온도는 대략 실온이다. 다른 한 실시양태에서, 상기 고체-에서-액체 전이 상태는 약 8 ℃, 약 9 ℃, 약 10 ℃, 약 11 ℃, 약 12 ℃, 약 13 ℃, 약 14 ℃, 약 15 ℃, 약 16 ℃, 약 17 ℃ 및 약 18 ℃ 중 1종 이상의 온도에서 출현한다.
온도-민감성 생체재료는 센티푸아즈 (cP)로 측정되는 주어진 온도에서의 특정 점도를 가진다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 약 1 cP 내지 약 5 cP, 약 1.1 cP 내지 약 4.5 cP, 약 1.2 cP 내지 약 4 cP, 약 1.3 cP 내지 약 3.5 cP, 약 1.4 cP 내지 약 3.5 cP, 약 1.5 cP 내지 약 3 cP, 약 1.55 cP 내지 약 2.5 cP 또는 약 1.6 cP 내지 약 2 cP의 25 ℃에서의 점도를 가진다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 약 1.0 cP 내지 약 1.15 cP의 37 ℃에서의 점도를 가진다. 상기 37 ℃에서의 점도는 약 1.0 cP, 약 1.01 cP, 약 1.02 cP, 약 1.03 cP, 약 1.04 cP, 약 1.05 cP, 약 1.06 cP, 약 1.07 cP, 약 1.08 cP, 약 1.09 cP, 약 1.10 cP, 약 1.11 cP, 약 1.12 cP, 약 1.13 cP, 약 1.14 cP 또는 약 1.15 cP일 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 생체재료는 젤라틴 용액이다. 젤라틴은 용액 중에 약 0.5 %, 약 0.55 %, 약 0.6 %, 약 0.65 %, 약 0.7 %, 약 0.75 %, 약 0.8 %, 약 0.85 %, 약 0.9 %, 약 0.95 % 또는 약 1 % (w/v)로 존재한다. 하나의 예에서, 생체재료는 PBS 중 0.75 % (w/v) 젤라틴 용액이다. 특정 실시양태에서, 상기 0.75 % (w/v) 용액은 약 1.6 cP 내지 약 2 cP의 25 ℃에서의 점도를 가진다. 특정 실시양태에서, 0.75 % (w/v) 용액은 약 1.07 cP 내지 약 1.08 cP의 37 ℃에서의 점도를 가진다. 젤라틴 용액은 PBS, DMEM 또는 또 다른 적합한 용매 중으로 제공될 수 있다.
또 다른 측면에서, 제제는 제제화 시점부터 대상체에의 투여 후 시점까지 조합된 세포에 바람직한 환경을 제공하는 제2 생체재료와 조합된 생체활성 세포를 함유한다. 특정 실시양태에서, 제2 생체재료에 의해 제공되는 상기 바람직한 환경은 대상체에의 투여 시점까지, 그리고 투여 후의 일정 시간 기간 동안 구조적 완전성을 유지하는 생체재료 중으로 세포를 투여하는 것의 장점에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 이식 후의 제2 생체재료의 구조적 완전성은 수분, 수시간, 수일 또는 수주이다. 특정 실시양태에서, 상기 구조적 완전성은 1개월 미만, 1주 미만, 1일 미만 또는 1시간 미만이다. 상대적으로 짧은 기간의 구조적 완전성은 그것이 위치되는 조직 또는 기관과의 도입되는 요소의 상호작용에 대하여 방해 또는 장벽이 되지 않으면서 조절되는 취급, 위치지정 또는 분산으로 조직 또는 기관 내 표적 위치에 활성 작용제 및 생체재료를 전달할 수 있는 제제를 제공한다.
특정 실시양태에서, 제2 생체재료는 상기 제1 생체재료와 상이한 민감성을 가지는 온도-민감성 생체재료이다. 상기 제2 생체재료는 (i) 대략 주변 온도 이하에서의 실질적으로 고체인 상태, 및 (ii) 약 37 ℃ 이상에서의 실질적으로 액체인 상태를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 주변 온도는 대략 실온이다.
특정 실시양태에서, 제2 생체재료는 가교결합된 비드이다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 상기 가교결합된 비드는 가교결합 정도에 따라 미세하게 조정가능한 생체 내 체류 시간을 가질 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 특정 실시양태에서, 가교결합된 비드는 생체활성 세포를 포함하며, 효소 분해에 대하여 내성이다. 본 개시내용의 제제는 활성 작용제, 예컨대 생체활성 세포와 조합된 제2 생체재료가 있거나 없이, 활성 작용제, 예컨대 생체활성 세포와 조합된 제1 생체재료를 포함할 수 있다. 제제가 제2 생체재료를 포함하는 경우, 그것은 온도 민감성 비드 및/또는 가교결합된 비드일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 수분, 수시간 또는 수일 수준의 시간 기간에 걸쳐 분해되는 생체재료를 함유하는 제제를 제공한다. 이는 나중에 수일, 수주 또는 수개월에 걸쳐 천천히 분해되는 고체 재료의 이식에 초점을 맞추고 있는 대부분의 연구와 반대되는 것이다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 하기 특징들 중 1종 이상을 가진다: 생체적합성, 생분해성/생체흡수성(bioresorbablity), 대상체에의 이식 전 및 동안의 실질적으로 고체인 상태, 이식 후의 구조적 완전성 (실질적으로 고체인 상태)의 상실, 및 세포 생존력 및 증식을 지지하는 세포적합성 환경. 이식 동안 이식되는 입자들을 이격시켜 유지하는 생체재료의 능력은 선천 조직 내성장을 강화한다. 생체재료는 또한 고체 제제의 이식을 용이하게 한다. 생체재료는 본원에서 기술되는 제제의 국소화를 제공하는데, 고체 유닛(unit)의 삽입이 이식 동안 전달되는 재료가 조직 내에서 분산되는 것을 방지하는 것을 돕기 때문이다. 세포-기재 제제의 경우, 고체 생체재료는 또한 유체에 현탁된 세포에 비해 고정 의존성 세포의 안정성 및 생존력을 향상시킨다. 그러나, 짧은 구조적 완전성 기간은 이식 후 머지않아 생체재료가 조직 내성장 또는 전달된 세포/재료의 숙주 조직과의 통합에 대하여 상당한 장벽을 제공하지 않는다는 것을 의미한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 실질적으로 고체인 형태로 이식된 다음, 신체에의 이식 후 액화/용융되거나 또는 달리 구조적 완전성을 상실하는 생체재료를 함유하는 제제를 제공한다. 이는 나중에 신체 내에서 고체화되는 액체로서 주사될 수 있는 재료의 사용에 초점을 맞추고 있는 상당 부분의 연구와 반대되는 것이다.
생체적합성 비드
다른 한 측면에서, 제제는 본원에서 기술되는 온도-민감성 생체재료, 및 생체재료를 함유하는 생체적합성 비드들의 군집을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 비드들은 가교결합된다. 가교결합은 예를 들면 카르보디이미드; 알데히드 (예컨대 푸르푸랄, 아크롤레인, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 글리세릴 알데히드); 숙신이미드-기재 가교결합제 {비스(술포숙신이미딜) 수베레이트 (BS3), 디숙신이미딜 글루타레이트 (DSG), 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS), 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트), 에틸렌 글리콜비스(술포숙신이미딜숙시네이트), 에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트) (EGS), 비스(술포숙신이미딜) 글루타레이트 (BS2G), 디숙신이미딜 타르트레이트 (DST)}; 에폭시드 (에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 1,4부탄디올 디글리시딜 에테르); 다당류 (글루코스 및 알도스 당); 술폰산 및 p-톨루엔 술폰산; 카르보닐디이미다졸; 제니핀; 이민; 케톤; 디페닐포스포릴아지드 (DDPA); 테트라프탈로일 클로라이드; 세륨 (III) 니트레이트 6수화물; 미생물 트랜스글루타미나제; 및 수소 퍼옥시드와 같은 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 임의의 적합한 가교결합제를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 다른 적합한 가교결합제 및 가교결합 방법에 대해 알고 있을 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 비드는 카르보디이미드-가교결합된 비드이다. 가르보디이미드-가교결합된 비드는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), DCC-N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIPC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 카르보디이미드를 사용하여 가교결합될 수 있다. 더 낮은 농도의 EDC로 처리된 비드는 더 많은 수의 자유 1차 아민을 가질 것으로 예상되었지만, 고농도의 가교결합제로 처리된 샘플은 대부분의 1차 아민이 아미드 결합에 관여하게 되었다. 335 nm에서 분광광도법에 의해 검출가능한 1차 아민과 피크릴술폰산 사이의 공유 결합에 의해 발현되는 오렌지색 색상의 강도는 샘플에 존재하는 1차 아민의 수에 비례한다. 샘플에 존재하는 단백질 밀리그램 당으로 표준화될 경우, 존재하는 자유 아민의 수와 가교결합에 사용되는 개시 EDC 농도 사이의 역의 상관관계가 관찰될 수 있다. 이와 같은 결과는 반응에 사용되는 카르보디이미드의 양에 의해 좌우되는 차별적인 비드 가교결합을 표시한다. 일반적으로, 가교결합된 비드는 비-가교결합된 비드와 비교하였을 때 감소된 자유 1차 아민 수를 나타낸다.
가교결합된 비드는 비-가교결합 생체적합성 비드와 비교하였을 때 효소 분해에 대하여 감소된 감수성을 가짐으로써, 미세하게 조정가능한 생체내 체류 시간을 가지는 비드를 제공한다. 예를 들면, 가교결합된 비드는 콜라게나제와 같은 내생 효소에 대하여 내성이다. 가교결합된 비드의 제공은 하기 중 1종 이상을 돕는 전달 시스템의 일부이다: (a) 원하는 부위로의 부착된 세포의 전달, 및 선천 조직 및 혈관 공급물의 재생 및 내성장을 위한 공간의 창출; (b) 세포가 그의 미세환경을 확립하고, 기능하여, 리모델링함으로써 그 자체의 세포외 매트릭스 (ECM)를 분비하는 것을 가능하게 하기에 충분하게 오래 그 부위에서 지속하는 능력; (c) 이식된 세포의 주변 조직과의 통합 촉진; (d) 실질적으로 고체인 형태로 세포를 이식하는 능력; (e) 조직 내성장, 새로운 혈관생성 또는 전달되는 세포/재료의 숙주 조직과의 통합에 대하여 상당한 장벽을 제공하지 않는, 단기간의 구조적 완전성; (f) 그에 의해 이식 동안의 조직 내에서의 세포의 분산을 방지하는, 실질적으로 고체인 형태로의 국소화된 생체 내 전달; (g) 유체 중에 현탁되는 세포에 비해 향상된 고정 의존성 세포의 안정성 및 생존력; 및 (h) 세포가 1) 실질적으로 고체인 형태 (예컨대 비드에 부착된 것) 및 2) 실질적으로 액체인 형태 (예컨대 유체에 현탁된 것)로 전달될 때의 2상 방출 프로파일; (i) 해당 생체활성 세포 군집이 유래하였던 3차원 생물학적 니치 또는 신장 실질의 재현 및 모방.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 젤라틴을 함유하는 가교결합된 비드를 제공한다. 비-가교결합 젤라틴 비드는 생체활성 세포 제제용으로 적합하지 않은데, 그것이 빠르게 완전성을 상실함으로써, 세포가 주사 부위로부터 소산되기 때문이다. 반면, 고도로 가교결합된 젤라틴 비드는 주사 부위에서 너무 오래 지속할 수 있어서, 새로운 ECM 분비, 세포 통합, 혈관생성 및 조직 재생을 방해할 수 있다. 본 개시내용은 가교결합된 비드의 생체 내 체류 시간이 미세하게 조정되는 것을 가능하게 한다. 생체재료의 생분해성을 설계하기 위하여, 전체적인 반응 조건은 모든 샘플에 대하여 일정하게 유지하면서 상이한 카르보디이미드 가교결합제 농도가 사용된다. 예를 들면, 카르보디이미드-가교결합된 비드의 효소 감수성은 약 0으로부터 약 1 M까지 가교결합제의 농도를 변화시키는 것에 의해 미세하게 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 농도는 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 약 30 mM, 약 31 mM, 약 32 mM, 약 33 mM, 약 34 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 37 mM, 약 38 mM, 약 39 mM, 약 40 mM, 약 41 mM, 약 42 mM, 약 43 mM, 약 44 mM, 약 45 mM, 약 46 mM, 약 47 mM, 약 48 mM, 약 49 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM 또는 약 100 mM이다. 가교결합제 농도는 약 0.15 M, 약 0.2 M, 약 0.25 M, 약 0.3 M, 약 0.35 M, 약 0.4 M, 약 0.45 M, 약 0.5 M, 약 0.55 M, 약 0.6 M, 약 0.65 M, 약 0.7 M, 약 0.75 M, 약 0.8 M, 약 0.85 M, 약 0.9 M, 약 0.95 M 또는 약 1 M일 수도 있다. 특정 실시양태에서, 가교결합제는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC)이다. 특정 실시양태에서, EDC-가교결합된 비드는 젤라틴 비드이다. 비드의 % 분해는 가교결합제의 농도에 따라 미세하게 조절될 수 있다. 특정 실시양태에서, 젤라틴 비드는 전달되는 생체활성 세포 군집의 효능을 추가로 촉진하기 위하여 젤라틴이 아닌 다른 비드 또는 미세입자 (예를 들면 비제한적으로 알기네이트 또는 HA)와 혼합될 수 있다.
가교결합된 비드는 생체활성 세포 군집의 시딩, 부착 또는 캡슐화를 돕는 소정의 특징들을 가질 수 있다. 예를 들면, 비드는 다공성의 표면을 가질 수 있고/거나, 실질적으로 중공형일 수 있다. 세공의 존재는 증가된 세포 부착 표면을 제공함으로써, 비-다공성 또는 평활 표면과 비교하였을 때 더 많은 수의 세포가 부착되는 것을 가능하게 한다. 또한, 세공 구조는 다공성 비드와의 숙주 조직 통합을 지지함으로써, 새로운 조직의 형성을 지지할 수 있다. 비드는 일반적인 입자 분포 패턴에 상응하는 와이불(Weibull) 플롯에 부합할 수 있는 크기 분포를 가진다. 특정 실시양태에서, 가교결합된 비드는 약 120 ㎛, 약 115 ㎛, 약 110 ㎛, 약 109 ㎛, 약 108 ㎛, 약 107 ㎛, 약 106 ㎛, 약 105 ㎛, 약 104 ㎛, 약 103 ㎛, 약 102 ㎛, 약 101 ㎛, 약 100 ㎛, 약 99 ㎛, 약 98 ㎛, 약 97 ㎛, 약 96 ㎛, 약 95 ㎛, 약 94 ㎛, 약 93 ㎛, 약 92 ㎛, 약 91 ㎛ 또는 약 90 ㎛ 미만의 평균 직경을 가진다. 가교결합된 비드의 특징은 캐스팅(casting) 과정에 따라 달라진다. 예를 들어, 상기-언급된 특징들을 가지는 비드를 제공하는 데에는, 공기의 스트림을 사용하여 액체 젤라틴 용액을 에어로졸화하고 박층 크로마토그래피 시약 분무기 (ACE 글래스웨어(Glassware))를 사용하여 그것을 액체 질소에 분무하는 과정이 사용된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 캐스팅 과정의 파라미터들을 조절하는 것이 상이한 비드의 특징, 예를 들면 상이한 크기 분포를 설계할 기회를 제공한다는 것을 알고 있을 것이다. 특정 실시양태에서는, 세포 부착을 촉진하기 위하여, 비드의 미세국소형태, 표면 및 내부 특징들이 추가로 변형될 수 있다.
제제화 전에, 비드가 최종 생체활성 세포 제제에 상응하는 세포와 함께 배양되는 세포 배양기술을 사용하여 시험관 내에서 가교결합된 비드의 세포적합성이 평가된다. 예를 들면, 생체활성 신장 세포 제제의 제조 전에 초대 신장 세포와 함께 비드가 배양된 후, 살아있는/사멸된 세포 검정을 사용하여 세포적합성이 확인된다. 세포 생존력 이외에, 세포 대사 활성, 특정 핵심 시토카인 및 성장 인자 및 엑소좀의 분비, 그리고 기능적으로 생체활성인 신장 세포 군집과 연관되어 있는 특정 핵심 단백질 및 miRNA를 포함한 핵산 마커들의 발현을 측정하기 위한 구체적인 기능 시험들이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 잘 알려져 있어서, 가교결합된 비드와의 제제화시 세포 효능을 확인하는 데에 추가로 사용된다.
특정 실시양태에서, 생체적합성 가교결합된 비드는 용액 부피의 약 5 % (w/w) 내지 약 15 % (w/w)로 용액 중 온도-민감성 생체재료와 조합된다. 가교결합된 비드는 용액 부피의 약 5 % (w/w), 약 5.5 % (w/w), 약 6 % (w/w), 약 6.5 % (w/w), 약 7 % (w/w), 약 7.5 % (w/w), 약 8 % (w/w), 약 8.5 % (w/w), 약 9 % (w/w), 약 9.5 % (w/w), 약 10 % (w/w), 약 10.5 % (w/w), 약 11 % (w/w), 약 11.5 % (w/w), 약 12 % (w/w), 약 12.5 % (w/w), 약 13 % (w/w), 약 13.5 % (w/w), 약 14 % (w/w), 약 14.5 % (w/w) 또는 약 15 % (w/w)로 존재할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 수분, 수시간 또는 수일 수준의 시간 기간에 걸쳐 분해되는 생체재료를 함유하는 제제를 제공한다. 이는 나중에 수일, 수주 또는 수개월에 걸쳐 천천히 분해되는 고체 재료의 이식에 초점을 맞추고 있는 대부분의 연구와 반대되는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 전달 매트릭스와 함께 생체활성 세포가 시딩되어 있는 생체적합성 가교결합된 비드를 포함하는 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 전달 매트릭스는 하기의 특징들 중 1종 이상을 가진다: 생체적합성, 생분해성/생체흡수성, 대상체에의 이식 전 및 동안의 실질적으로 고체인 상태, 이식 후의 구조적 완전성 (실질적으로 고체인 상태)의 상실, 및 세포 생존력을 지지하는 세포적합성 환경. 이식 동안 이식되는 입자들 (예컨대 가교결합된 비드들)을 이격시켜 유지하는 상기 전달 매트릭스의 능력은 선천 조직 내성장을 강화한다. 전달 매트릭스가 없는 경우라면, 이식 동안의 세포화된 비드의 압축이 충분한 조직 내성장에 부적정한 공간으로 이어질 수 있다. 전달 매트릭스는 고체 제제의 이식을 용이하게 한다. 또한, 짧은 구조적 완전성 기간은 이식 후 머지않아 매트릭스가 조직 내성장, 새로운 혈관생성, 또는 전달된 세포/재료의 숙주 조직과의 통합에 대하여 상당한 장벽을 제공하지 않는다는 것을 의미한다. 전달 매트릭스는 본원에서 기술되는 제제의 국소화를 제공하는데, 고체 유닛의 삽입이 이식 동안 전달되는 재료가 조직 내에서 분산되는 것을 방지하는 것을 돕기 때문이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 전달 매트릭스의 적용은 신장 실질에의 전달시 배뇨를 통한 이식된 세포의 빠른 상실을 방지하는 것을 돕는다. 세포-기재 제제의 경우, 고체 전달 매트릭스는 유체에 현탁된 세포에 비해 고정 의존성 세포의 안정성 및 생존력을 향상시킨다.
특정 실시양태에서, 전달 매트릭스는 세포가 시딩되어 있지 않은 생체적합성 비드의 군집이다. 특정 실시양태에서, 비시딩 비드는 세포-시딩된 개별 비드들 전체에 걸쳐 그들 사이에 분산된다. 상기 비시딩 비드는 이식 전 및 직후에 세포-시딩된 비드들 사이에서 "스페이서(spacer) 비드"로 작용한다. 상기 스페이서 비드는 제1 온도에서는 실질적으로 고체인 상태를, 그리고 제2 온도에서는 실질적으로 액체인 상태를 가지는 온도-민감성 생체재료를 함유하며, 여기서 상기 제1 온도는 상기 제2 온도에 비해 더 낮다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 바와 같이, 스페이서 비드는 대략 주변 온도 이하에서는 실질적으로 고체인 상태를, 그리고 약 37 ℃에서는 실질적으로 액체인 상태를 가지는 생체재료를 함유한다. 특정 실시양태에서, 상기 주변 온도는 대략 실온이다. 특정 실시양태에서, 상기 생체재료는 젤라틴 용액이다. 상기 젤라틴 용액은 약 4 %, 약 4.5 %, 약 5 %, 약 5.5 %, 약 6 %, 약 6.5 %, 약 7 %, 약 7.5 %, 약 8 %, 약 8.5 %, 약 9 %, 약 9.5 %, 약 10 %, 약 10.5 % 또는 약 11 % (w/v)로 존재한다. 젤라틴 용액은 PBS, 세포 배양 배지 (예컨대 DMEM) 또는 또 다른 적합한 용매 중으로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 히아루론산이다. 특정 실시양태에서, 생체재료는 추가로 수화젤로 재구성될 수 있는, 인간 또는 동물 신장으로부터 기원하는 탈세포화된 세포외 매트릭스이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 실질적으로 고체인 형태 (예컨대 스페이서 비드)로 이식된 다음, 신체에의 이식 후 액화/용융되거나 또는 달리 구조적 완전성을 상실하는 생체재료를 함유하는 제제를 제공한다. 이는 나중에 신체 내에서 고체화되는 액체로서 주사될 수 있는 재료의 사용에 초점을 맞추고 있는 상당 부분의 연구와 반대되는 것이다.
스페이서 비드의 온도-민감성은 제제화 전에 시험관 내에서 평가될 수 있다. 스페이서 비드는 표지된 후 표지되지 않은 비-온도-민감성 비드와 혼합될 수 있다. 다음에, 물리적 전이의 변화를 관찰하기 위하여, 37 ℃에서 혼합물이 인큐베이팅된다. 시간이 지나면서 더 높은 온도에서의 표지된 온도-민감성 비드의 형상 상실이 관찰된다. 예를 들면, 온도-민감성 젤라틴 비드는 물리적 전이의 마커로서 작용하는 알시안 블루(Alcian blue) 염료와 함께 제조될 수 있다. 청색 젤라틴 비드는 가교결합된 비드 (백색)와 혼합되고, 카테터에 적재된 다음, 압출되어, 37 ℃로 1X PBS, pH 7.4 중에서 인큐베이팅된다. 상이한 시점에서 현미경에 의해 청색 젤라틴 비드의 형상 상실이 추적된다. 청색 젤라틴 비드의 물리적 상태 변화는 30분 후에 가시적이 되어 인큐베이션 시간 연장에 따라 더욱 현저해진다. 재료의 점성으로 인하여, 비드가 완전히 소산되지는 않는다.
변형 방출 제제
한 측면에서, 본 개시내용의 제제는 변형 방출 제제로서 제공된다. 일반적으로, 변형 방출은 투여시의 제1 활성 작용제의 최초 방출 후 이어지는 제2 활성 작용제의 적어도 1회의 추가적인 차후 방출을 특징으로 한다. 상기 제1 및 제2 활성 작용제는 동일할 수 있거나, 상이할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 동일 제제 중의 다수의 구성요소들을 통하여 변형 방출을 제공한다. 특정 실시양태에서, 변형 방출 제제는 활성 작용제가 제제의 부피 전체에 걸쳐 자유롭게 이동하는 것을 허용함으로써 투여시 표적 부위에서의 즉시 방출을 가능하게 하는 제1 구성요소의 일부로서 활성 작용제를 함유한다. 상기 제1 구성요소는 실질적으로 액체인 상 및 실질적으로 고체인 상을 가지는 온도-민감성 생체재료일 수 있는데, 제1 구성요소는 투여 시점에는 실질적으로 액체인 상으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제제의 부피 전체에 걸쳐 그것이 실질적으로 자유롭게 이동하고 그에 따라 투여시 표적 부위에 즉시 방출되도록, 활성 작용제는 실질적으로 액체인 상에 존재한다.
특정 실시양태에서, 변형 방출 제제는 활성 작용제가 표적 부위에의 투여 전 및 후에 지속되는 제2 구성요소에 부착되거나, 그 위에 침착되거나, 그것으로 코팅되거나, 그에 매립되거나, 그에 시딩되거나, 또는 그에 포획되는 제2 구성요소의 일부로서 활성 작용제를 포함한다. 상기 제2 구성요소는 활성 작용제가 그와 결합됨으로써 투여 시점에서의 제2 구성요소로부터의 활성 작용제의 즉시 방출을 방지할 수 있는 구조적 요소를 함유한다. 예를 들면, 제2 구성요소는 실질적으로 고체인 형태, 예컨대 가교결합되어 생체 내 효소 분해를 방지하거나 지연할 수 있는 생체적합성 비드로 제공된다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 고체인 상 중 활성 작용제는 투여 전 및 후에 제제 내에서 그의 구조적 완전성을 유지하며, 그에 따라 투여시 표적 부위로 활성 작용제를 즉시 방출하지 않는다. 변형 방출 제제용으로 적합한 캐리어들이 본원에 기술되어 있지만, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 개시내용에 사용하기에 적절한 다른 캐리어들을 알고 있을 것이다.
특정 실시양태에서, 제제는 세포, 나노입자, 치료 분자 등을 포함한 전달되는 요소의 빠른 최초 전달/방출 후 이어지는 후기의 지연된 요소 방출을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제제는 신장 또는 다른 세포 군집으로부터 기원하는 생체활성 생성물인 가용성이며 분비성인 엑소좀, miRNA 및 기타 생체활성 핵산 또는 단백질 분자의 빠른 최초 전달/방출을 제공한다. 재생 생체활성과 연관되어 있는 다른 분자 또는 치료제에 대해서는 관련 기술분야 통상의 기술자가 알고 있을 것이다. 본 개시내용의 제제는 전달될 작용제가 부착되지 않은 형태 (예컨대 용액 중 세포) 및 부착된 형태 (예컨대 비드 또는 또 다른 적합한 캐리어와 함께인 세포) 모두로 제공되는 그와 같은 2상 방출 프로파일용으로 설계될 수 있다. 최초 투여시, 자유로운 작용제는 즉시 전달 부위에 제공되는 반면, 구속된 작용제의 방출은 캐리어 (예컨대 비드)의 구조적 완전성이 붕괴되고 그 시점에 이전에는 결합되어 있던 작용제가 방출될 때까지 지연된다. 하기에서 논의되는 바와 같이, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 방출 메커니즘들에 대해 알고 있을 것이다.
방출을 위한 시간 지연은 활성 작용제의 특성을 바탕으로 조정될 수 있다. 예를 들면, 생체활성 세포 제제에서의 방출을 위한 시간 지연은 수초, 수분, 수시간 또는 수일 수준의 것일 수 있다. 일부 상황에서는, 수주 수준의 지연이 적절할 수 있다. 소형 또는 대형 분자와 같은 다른 활성 작용제의 경우, 제제에서의 방출을 위한 시간 지연은 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월 수준의 것일 수 있다. 제제가 상이한 시간 지연 방출 프로파일을 제공하는 상이한 생체재료들을 함유하는 것 역시 가능하다. 예를 들면, 제1 활성 작용제를 포함하는 제1 생체재료는 제1 방출 시간을 가질 수 있으며, 제2 활성 작용제를 포함하는 제2 생체재료는 제2 방출 시간을 가질 수 있다. 상기 제1 및 제2 활성 작용제는 동일하거나 상이할 수 있다.
본원에서 논의되는 바와 같이, 지연 방출의 시간 기간은 일반적으로 생체재료의 구조적 완전성 상실을 위한 시간 기간에 상응할 수 있다. 그러나, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 지연 방출 메커니즘에 대해 알고 있을 것이다. 예를 들면, 활성 작용제는 임의의 특정 생체재료의 분해 시간에 관계없이 시간 경과에 따라 계속해서 방출될 수 있는데, 예컨대 중합체 매트릭스로부터의 약물의 확산이다. 또한, 생체활성 세포가 생체재료 및 생체활성 세포를 함유하는 제제로부터 선천 조직으로 이동하여 벗어날 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체활성 세포는 생체재료, 예컨대 비드로부터 선천 조직으로 이동 분리된다. 한 실시양태에서, 생체활성 세포는 생체재료로부터 선천 조직으로 이동 분리되어 성장 인자, 시토카인, 엑소좀, miRNA, 및 재생 생체활성과 연관되어 있는 기타 핵산 및 단백질의 분비를 유도한다. 특정 실시양태에서는, 엑소좀 및 기타 세포외 소포는 물론, miRNA, 기타 생체활성 핵산 및 단백질이 생체재료로부터 이동 분리된다. 또 다른 실시양태에서, 생체활성 세포는 생체재료로부터 선천 조직으로 이동 분리되어 나중에 손상 또는 질환 위치를 향하여 이동하거나 유도되는 숙주 줄기 및 선조 세포의 가동화를 매개한다.
에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성인 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 주사가능 제제의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 제제에 포함시키는 것에 의해 초래될 수 있다. 그와 같은 제제의 제조를 위한 많은 방법들이 특허화되어 있거나, 일반적으로 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조하라. 폴리펩티드 작용제의 조절 또는 연장 방출에 적용가능한 추가적인 방법들이 예를 들면 U.S. 특허 제6,306,406호 및 6,346,274호는 물론, 예를 들면 U.S. 특허 출원 제US20020182254호 및 US20020051808호에 기술되어 있는 바, 모두 본원에 참조로써 개재된다.
4. 생체활성 세포 제제
본원에서 기술되는 생체활성 세포 제제는 필요로 하는 대상체에서의 신장 질환의 치료용으로 본원에서 기술되는 생체활성 신장 세포를 포함하는, 상기-언급된 생체재료로부터 제조되는 이식가능 구성체를 함유한다. 특정 실시양태에서, 상기 구성체는 1종 이상의 합성 또는 자연-발생 생체적합성 재료로 구성되는 생체적합성 재료 또는 생체재료, 스캐폴드 또는 매트릭스, 그리고 부착 및/또는 포획에 의해 스캐폴드의 표면상에 침착되거나 그에 매립되는 본원에서 기술되는 1종 이상의 세포 군집 또는 세포 혼합물로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 구성체는 생체재료, 그리고 생체재료 구성요소(들)로 코팅되거나, 그 위에 침착되거나, 그 내부에 침착되거나, 그에 부착되거나, 그에 포획되거나, 그에 매립되거나, 시딩되거나, 또는 그와 조합되는 본원에서 기술되는 1종 이상의 세포 군집 또는 세포 혼합물로 구성된다. 보강된 세포 군집 또는 그의 혼합물을 포함하여 본원에서 기술되는 어떠한 세포 군집도 매트릭스와의 조합으로써 사용되어 구성체를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체활성 세포 제제는 생체적합성 재료 또는 생체재료, 및 본원에서 기술되는 SRC 군집으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 생체활성 세포 제제는 생체적합성 재료 또는 생체재료, 그리고 비제한적으로 내피 선조 세포, 중간엽 줄기 세포 및 지방의 간질 혈관 분획으로부터 유래되는 세포를 포함할 수 있는 또 다른 세포 군집과의 본원에서 기술되는 SRC 세포 군집의 혼합물로 구성된다.
신-신장 강화제 기술사항 및 조성물
특정 실시양태에서, 생체활성 세포 제제는 생체재료 (젤라틴-기재 수화젤) 중에 제제화된 자가 선택된 신장 세포 (SRC)로 구성되는 주사가능 생성물인 신-신장 강화제 (NKA)이다. 한 측면에서, 자가 SRC는 신장 생검을 통한 환자 신장 피질 조직으로부터의 신장 세포의 단리 및 증식, 그리고 밀도 경계, 장벽 또는 계면을 가로지르는 증식된 신장 세포의 원심분리에 의한 선택으로부터 수득된다. 특정 실시양태에서, 자가 SRC는 신장 생검을 통한 환자 신장 피질 조직으로부터의 신장 세포의 단리 및 증식, 그리고 연속 또는 불연속 단일 단계 또는 다단계 밀도 구배상에서의 증식된 신장 세포의 선택으로부터 수득된다. SRC는 주로 그의 재생 가능성에 대해 잘 알려져 있는 신장 요세관 상피 세포로 구성된다 (문헌 [Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91]). 자가 SRC 군집에는, 다른 실질 (혈관) 및 간질 (집합관) 세포들이 희박하게 존재할 수 있다. 전임상 연구에서, 수용자 신장에의 SRC의 주사는 동물 생존, 소변 농축 및 여과 기능의 상당한 향상을 초래하였었다. 그러나, SRC는 제한된 저장 수명 및 안정성을 가지고 있다. 젤라틴-기재 수화젤 생체재료 중 SRC의 제제는 강화된 세포 안정성을 제공함으로써, 생성물 저장 수명을 연장하고, 임상적 유용성을 위한 신장 피질에의 NKA의 수송 및 전달 동안 NKA의 안정성을 향상시킨다.
또 다른 측면에서, NKA는 먼저 임상-관리-표준(standard-of-clinical-care) 신장 생검 절차를 사용하여 공여자/수용자로부터 신장 피질 조직을 수득하는 것에 의해 제조된다. 신장 세포는 효소 분해에 의해 신장 조직으로부터 단리된 후, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 증식된다. 세포 배양 배지는 초대 신장 세포를 증식시키고 어떠한 분화 인자도 함유하지 않도록 설계된다. 수확된 신장 세포는 SRC를 수득하기 위한 밀도 경계 또는 계면 또는 밀도 구배를 가로지르는 분리에 적용된다.
온도-민감성 제제
본 개시내용의 한 측면은 추가로 본원에서 기술되는 바와 같은 외부 조건에 반응하도록 설계되거나 적합화된 생체재료로 구성되는 제제를 제공한다. 결과적으로, 구성체에서의 생체활성 세포 군집의 생체재료와의 결합의 특성은 외부 조건에 따라 변화하게 된다. 예를 들면, 온도-민감성 생체재료와의 세포 군집의 결합은 온도에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 구성체는 생체활성 신장 세포 군집, 그리고 약 8 ℃ 이하에서는 실질적으로 고체인 상태를, 그리고 대략 주변 온도 이상에서는 실질적으로 액체인 상태를 가지는 생체재료를 함유하는데, 여기서 상기 세포 군집은 약 8 ℃ 이하에서 생체재료 중에 현탁되어 있다. 그러나, 대략 주변 온도 이상에서는, 세포 군집이 생체재료의 부피 전체에 걸쳐 실질적으로 자유롭게 이동한다. 더 낮은 온도에서 실질적으로 고체인 상태로 세포 군집을 현탁시키는 것은 유체 중 세포와 비교하였을 때 고정-의존성 세포와 같은 세포에 대하여 안정성상의 장점을 제공한다. 또한, 실질적으로 고체인 상태로 세포를 현탁시키는 것은 하기의 이점들 중 1종 이상을 제공한다: i) 세포의 침강을 방지함; ii) 세포가 현탁된 상태에서 생체재료에 고정되어 유지되는 것을 가능하게 함; iii) 세포가 생체재료의 부피 전체에 걸쳐 더 균일하게 분산되어 유지되는 것을 가능하게 함; iv) 세포 응집체의 형성을 방지함; 및 v) 제제의 저장 및 수송 동안 세포에 대하여 더 우수한 보호를 제공함. 대상체에의 투여시까지 계속하여 이와 같은 특징들을 보유할 수 있는 제제는 유리한데, 적어도 제제 중 세포의 전체적인 건강이 더 우수하고 더 균일할 것이며, 일관된 투약량의 세포가 투여될 것이기 때문이다.
바람직한 실시양태에서, SRC를 NKA로 제제화하기 위하여 사용되는 젤라틴-기재 수화젤 생체재료는 열적으로 반응성인 수화젤을 형성시키기 위하여 완충제에 용해된 돼지 젤라틴이다. 이와 같은 수화젤은 실온에서는 유체이나, 냉장 온도 (2-8 ℃)로 냉각될 경우 젤화된다. NKA를 수득하기 위하여, SRC는 수화젤과 함께 제제화된다. NKA는 냉각에 의해 젤화된 후, 냉장 온도 (2-8 ℃)하에 임상으로 수송된다. NKA는 3일의 저장 수명을 가진다. 임상 현장에서, 생성물은 환자의 신장에 주사되기 전에 실온으로 가온된다. NKA는 경피 또는 복강경 시술을 통한 NKA의 전달에 적합한 바늘 및 주사기를 사용하여 신장 피질에 이식된다. 특정 실시양태에서, 상기 수화젤은 젤라틴, 또는 재조합 기원의 또 다른 세포외 매트릭스 단백질로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 수화젤은 신장 또는 또 다른 조직 또는 기관으로부터 기원하는 세포외 매트릭스로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 수화젤은 재조합 세포외 매트릭스 단백질로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 수화젤은 재조합 콜라겐으로부터 유래되는 젤라틴 (즉 재조합 젤라틴)을 포함한다.
제조 방법
특정 실시양태에서, 생체활성 세포 제제의 제조 방법은 환자의 생검으로부터 생성물 이식까지 대략 4주 이내에 생성물을 전달하도록 설계된다. 본질적인 환자별 조직 가변성은 고정된 이식 일정으로 생성물을 전달하는 과제를 부과한다. 증식된 신장 세포는 항상 세포 증식에 있어서의 이와 같은 환자-의존성 변이를 수용하기 위하여 세포 증식 동안 냉동보존된다. 냉동보존된 신장 세포는 또 다른 치료가 요구되는 경우에 (예컨대 환자의 질병, 예기치않은 과정상의 문제 등으로 인한 지연), 그리고 필요에 따라 재-이식을 위한 다수의 투여분을 제조하기 위하여, 계속적인 세포 공급원을 제공한다.
생체활성 세포 제제가 생체재료 (젤라틴-기재 수화젤) 중에 제제화된 자가 균질 세포로 구성되는 실시양태의 경우, 최종 조성은 둘베코 포스페이트 완충 식염수 (DPBS)를 포함하는 젤라틴 용액 중 mL 당 약 20 x 106개 세포 내지 mL 당 약 200 x 106개 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성물 mL 당 세포의 수는 mL 당 약 20 x 106개 세포, mL 당 약 40 x 106개 세포, mL 당 약 60 x 106개 세포, mL 당 약 100 x 106개 세포, mL 당 약 120 x 106개 세포, mL 당 약 140 x 106개 세포, mL 당 약 160 x 106개 세포, mL 당 약 180 x 106개 세포 또는 mL 당 약 200 x 106개 세포이다. 일부 실시양태에서, 젤라틴은 약 0.5 %, 약 0.55 %, 약 0.6 %, 약 0.65 %, 약 0.7 %, 약 0.75 %, 약 0.8 %, 약 0.85 %, 약 0.9 %, 약 0.95 % 또는 약 1 % (w/v)로 용액 중에 존재한다. 하나의 예에서, 생체재료는 DPBS 중 0.88 % (w/v) 젤라틴 용액이다.
바람직한 실시양태에서, NKA는 멸균된 단일-사용 10 mL 주사기 중에 제공된다. 최종 부피는 100 x 106 SRC/mL NKA의 농도 및 3.0 x 106 SRC/g 신장 중량 (MRI에 의해 추정)의 목표 투여량으로부터 계산된다. 투약량은 환자의 신장 중량을 기준으로 주사 시점에 외과의에 의해 결정될 수도 있다.
NKA를 개발하기 위한 이와 같은 접근법은 활성의 생물학적 구성요소인 SRC의 광범위한 과학적 평가를 바탕으로 한 것이다 (www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Bruce-EB2011-podium_compressed_Final-AB.pdf에서 입수가능한 문헌 [Bruce et al. (2011) Exposure of Cultured Human Renal Cells Induces Mediators of cell migration and attachment and facilitates the repair of tubular cell monolayers in vitro. Experimental Biology, Washington, DC]; 문헌 [Ilagan et al. (2010a) Exosomes derived from primary renal cells contain microRNAs that can potentially drive therapeutically-relevant outcomes in models of chronic kidney disease. TERMIS Conference, Orlando, FL]; www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Ilagan-2010-TERMIS-poster-FINAL.pdf에서 입수가능한 문헌 [Ilagan et al. (2010b) Secreted Factors from Bioactive Kidney Cells Attenuate NF-kappa-B. TERMIS Conference, Orlando, FL]; 문헌 [Ilagan et al. (2009) Characterization of primary adult canine renal cells (CRC) in a three-dimensional (3D) culture system permissive for ex vivo nephrogenesis. KIDSTEM Conference, Liverpool, England, UK]; 문헌 [Kelley et al. (2012) A Population of Selected Renal Cells Augments Renal Function and Extends Survival in the ZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy. Cell Transplant 22(6), 1023-1039]; www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/ADA-2011-rwk_Tengion-FINAL.pdf에서 입수가능한 문헌 [Kelley et al. (2011) Intra-renal Transplantation of Bioactive Renal Cells Preserves Renal Functions and Extends Survival in the ZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy. ADA Conference, San Diego, CA]; 문헌 [Kelley et al. (2010a) A tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in a rodent model of chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299(5), F1026-1039]; www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2010-ISCT-podium-FINAL.pdf에서 입수가능한 문헌 [Kelley et al. (2010b) Bioactive Renal Cells Augment Kidney Function In a Rodent Model Of Chronic Kidney Disease. ISCT Conference, Philadelphia, PA]; www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2008-KIDSTEM-poster-SEP2008_v1.pdf에서 입수가능한 문헌 [Kelley et al. (2008) Enhanced renal cell function in dynamic 3D culture system. KIDSTEM Conference, Liverpool, England, UK]; www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2010-TERMIS-FINAL.pdf에서 입수가능한 문헌 [Kelley et al. (2010c) Bioactive Renal Cells Augment Renal Function in the ZSF1 model of Diabetic Nephropathy. TERMIS Conference, Orlando, FL]; 문헌 [Presnell et al. (2010) Isolation, Characterization and Expansion (ICE) methods for Defined Primary Renal Cell Populations from Rodent, Canine and Human Normal and Diseased Kidneys. Tissue Engineering Part C Methods. 17(3):261-273]; www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Presnell-EB-poster-APR2009.pdf에서 입수가능한 문헌 [Presnell et al. (2009) Isolation and characterization of bioresponsive renal cells from human and large mammal with chronic renal failure. Experimental Biology, New Orleans, LA]; www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Wallace-2010-ISCT-podium-FINAL.pdf에서 입수가능한 문헌 [Wallace et al. (2010) Quantitative Ex Vivo Characterization of Human Renal Cell Population Dynamics via High-Content Image-Based Analysis (HCA). ISCT Conference, Philadelphia, PA]; 문헌 [Yamaleyeva et al. (2010) Primary Human Kidney Cell Cultures Containing Erythropoietin-Producing Cells Improve Renal Injury. TERMIS Conference, Orlando, FL.]). 특정 실시양태에서, SRC는 자연상에서 신장 복구 및 재생과 연관되어 있는 자가의 균질 세포 군집이다. 일련의 비임상 약학, 생리학 및 기계-생물학 연구에서, SRC의 특징들이 밝혀져 있으며, 신장 구조 및 기능을 강화하는 것에 의해 CKD의 진행을 지연하는 능력이 입증되어 있다 (프레스넬 등의 WO/2010/056328호 및 일라간 등의 PCT/US2011/036347호).
세포의 총 수는 제제 당으로 선택될 수 있으며, 제제의 부피는 적정한 투약량에 도달하도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 단일 투약량 또는 단일 투약량 + 추가 투약량인 대상체에의 세포 투약량을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 투약량은 본원에서 기술되는 바와 같은 구성체에 의해 제공될 수 있다. 본원에서 기술되는 생체활성 신장 세포 군집 또는 신장 세포 군집 혼합물의 치료적 유효량은 대상체에 의해 안전하게 수용되는 최대 세포 수로부터 신장 질환의 치료, 예컨대 안정화, 감소된 감쇠율 또는 1종 이상의 신장 기능의 향상에 필요한 최대 세포 수까지의 범위일 수 있다.
본원에서 기술되는 생체활성 신장 세포 군집 또는 그 혼합물의 치료적 유효량은 제약상 허용되는 캐리어 또는 부형제에 현탁될 수도 있다. 그와 같은 캐리어에는 기본 배양 배지 + 1 % 혈청 알부민, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 콜라겐, 알기네이트, 히아루론산, 피브린 아교, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 카르복시메틸셀룰로스 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제형은 투여 양식에 적합해야 한다.
생체활성 신장 세포 조제물(들), 또는 그의 혼합물, 또는 조성물은 일상적인 절차에 따라 인간에의 투여에 적합화된 제약 조성물로 제제화된다. 통상적으로, 정맥내 투여, 동맥내 투여 또는 신장 피막(kidney capsule)내 투여용 조성물은 예를 들면 멸균된 등장성 수성 완충제 중 용액이다. 필요할 경우, 조성물은 주사 부위에서의 임의의 통증을 개선하기 위한 국소 마취제를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 별도, 또는 단위 투약 형태, 예를 들면 활성 작용제의 양을 표시하는 앰풀과 같은 기밀 밀봉된 용기 중 냉동보존 농축물로 함께 혼합되는 것 중 어느 하나로 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균된 제약 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병을 사용하여 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에는, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록, 멸균된 주사용수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있다.
제약상 허용되는 캐리어는 부분적으로 투여되는 구체적인 조성물은 물론, 조성물을 투여하는 데에 사용되는 구체적인 방법에 의해 결정된다. 이에 따라, 매우 다양한 적합한 제약 조성물의 제형들이 존재한다 (예를 들면 그 전체가 본원에 참조로써 개재되는 문헌 [Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, formerly Remington's Pharmaceutical Sciences 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2003] 참조). 제약 조성물은 일반적으로 멸균되고, 실질적으로 등장성이며, 미국 식품의약국의 우수 제조 기준(Good Manufacturing Practice) (GMP) 법령을 전적으로 준수하도록 제제화된다.
세포 생존력 작용제
한 측면에서, 생체활성 세포 제제는 또한 세포 생존력 작용제(cell viability agent)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포 생존력 작용제는 항산화제, 산소 캐리어, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 항-염증 작용제, 혈관생성 인자, 매트릭스 메탈로프로테아제, 상처 치유 인자, 및 생체활성 세포로부터 분비되는 생성물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항산화제는 다른 분자의 산화를 억제하는 능력을 특징으로 한다. 항산화제에는 비제한적으로 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산 (트롤록스(Trolox)®), 카로티노이드, 플라보노이드, 이소플라본, 유비퀴논, 글루타치온, 리포산, 수퍼옥시드 디스뮤타제, 아스코르브산, 비타민 E, 비타민 A, 혼합 카로티노이드 (예컨대 베타 카로틴, 알파 카로틴, 감마 카로틴, 루테인, 리코펜, 피토펜, 피토플루엔 및 아스타크산틴), 셀레늄, 조효소 Q10, 인돌-3-카르비놀, 프로안토시아니딘, 레스베라트롤, 퀘르세틴, 카테킨, 살리실산, 커큐민, 빌리루빈, 옥살산, 피트산, 리포산, 바닐산, 폴리페놀, 페룰산, 테아플라빈 및 이들의 유도체 중 1종 이상이 포함된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 항산화제들이 본 개시내용의 특정 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
산소 캐리어는 산소를 운반하고 방출하는 능력을 특징으로 하는 작용제이다. 거기에는 비제한적으로 퍼플루오로탄소 및 퍼플루오로탄소를 함유하는 약제가 포함된다. 적합한 퍼플루오로탄소-기재 산소 캐리어에는 비제한적으로 퍼플루오로옥틸 브로마이드 (C8F17Br); 퍼플루오로디크로로탄 (C8F16C12); 퍼플루오로데실 브로마이드; 퍼플루오브론; 퍼플루오로데칼린; 퍼플루오로트리포필아민; 퍼플루오로메틸시클로피페리딘; 플루오졸(Fluosol)® (퍼플루오로데칼린 & 퍼플루오로트리포필아민); 퍼프토란(Perftoran)® (퍼플루오로데칼린 & 퍼플루오로메틸시클로피페리딘); 옥시젠트(Oxygent)® (퍼플루오로데실 브로마이드 & 퍼플루오브론); 오시사이트(Ocycyte)™ (퍼플루오로 (tert-부틸시클로헥산))이 포함된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 퍼플루오로탄소-기재 산소 캐리어가 본 개시내용의 특정 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
면역조절 인자에는 비제한적으로 오스테오폰틴, FAS 리간드 인자, 인터류킨, 전환 성장 인자 베타, 혈소판 유래 성장 인자, 클루스테린, 트랜스페린, 작용시 조절되는 정상 T-세포 발현 분비 단백질 (RANTES), 플라스미노겐 활성화인자 억제제-1 (Pai-1), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파), 인터류킨 6 (IL-6), 알파-1 마이크로글로불린 및 베타-2-마이크로글로불린이 포함된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 면역조절 인자가 본 개시내용의 특정 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
항-염증 작용제 또는 면역억제제 (하기함) 역시 제제의 일부일 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 항산화제가 본 개시내용의 특정 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
세포 동원 인자에는 비제한적으로 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-1) 및 CXCL-1이 포함된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 세포 동원 인자가 본 개시내용의 특정 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
세포 부착 인자에는 비제한적으로 피브로넥틴, 프로콜라겐, 콜라겐, ICAM-1, 결합 조직 성장 인자, 라미닌, 프로테오글리칸, 특이적 세포 부착 펩티드 예컨대 RGD 및 YSIGR이 포함된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 세포 부착 인자가 본 개시내용의 특정 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
혈관생성 인자에는 비제한적으로 혈관 내피 성장 인자 F (VEGF) 및 안지오포이에틴-2 (ANG-2)가 포함된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 혈관생성 인자가 본 개시내용의 특정 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
매트릭스 메탈로프로테아제에는 비제한적으로 매트릭스 메탈로프로테아제 1 (MMP1), 매트릭스 메탈로프로테아제 2 (MMP2), 매트릭스 메탈로프로테아제 9 (MMP9), 및 조직 억제제 겸 메탈로프로테아제-1 (TIMP-1)이 포함된다.
상처 치유 인자에는 비제한적으로 각질세포 성장 인자 1 (KGF-1), 조직 플라스미노겐 활성화인자 (tPA), 칼빈딘, 클루스테린, 시스타틴 C, 트레포일 인자(trefoil factor) 3이 포함된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 다른 적합한 상처 치유 인자가 본 개시내용의 특정 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
본원에서 기술되는 생체활성 세포로부터 분비되는 생성물 역시 세포 생존력 작용제로서 생체활성 세포 제제에 첨가될 수 있다.
비제한적으로 인간 혈장, 인간 혈소판 용해물, 소 태아 혈장 또는 소 뇌하수체 추출물을 포함한 인간 또는 동물 공급원 유래의 체액, 조직 또는 기관으로부터 기원하는 조성물 역시 세포 생존력 작용제로서 생체활성 세포 제제에 첨가될 수 있다.
관련 기술분야 통상의 기술자라면, 세포 군집을 생체재료로 침착하거나 달리 그와 조합하여 구성체를 형성시키기 위한 몇 가지 적합한 방법들이 존재한다는 것을 알고 있을 것이다.
5. 사용 방법
한 측면에서, 본 개시내용의 구성체 및 제제는 본원에서 기술되는 사용 방법에서 사용하기에 적합하다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 질환의 치료를 위하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체활성 세포는 본원에서 기술되는 제제의 일부로서 선천 기관에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체활성 세포는 투여의 대상인 선천 기관으로부터, 또는 표적 선천 기관이 아닌 공급원으로부터 기원할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에서 기술되는 바와 같은 생체활성 신장 세포 군집을 함유하는 제제를 사용한 필요로 하는 대상체에서의 신장 질환의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료 제제는 선택된 신장 세포 군집 또는 그의 혼합물을 함유한다. 실시양태에서, 제제는 향상된 신장 기능을 필요로 하는 대상체에의 투여에 적합하다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 방법에 의한 대상체에서의 신장 질환의 효과적인 치료는 신장 기능의 다양한 지표들을 통하여 관찰될 수 있다. 특정 실시양태에서, 신장 기능의 지표에는 비제한적으로 혈청 알부민, 알부민 대 글로불린 비 (A/G 비), 혈청 인, 혈청 소듐, 신장 크기 (초음파에 의해 측정가능), 혈청 칼슘, 인:칼슘 비, 혈청 칼륨, 단백뇨, 소변 크레아티닌, 혈청 크레아티닌, 혈중 질소 우레아 (BUN), 콜레스테롤 농도, 트리글리세리드 농도 및 사구체 여과율 (GFR)이 포함된다. 또한, 일반적인 건강 및 안녕의 몇 가지 지표로써 비제한적으로 체중 이득 또는 상실, 생존, 혈압 (평균 전신성 혈압, 확장기 혈압 또는 수축기 혈압) 및 신체적 내구 능력이 포함된다.
또 다른 측면에서, 생체활성 신장 세포 제제를 사용한 효과적인 치료는 1종 이상의 신장 기능 지표의 안정화에 의해 입증된다. 신장 기능의 안정화는 본 개시내용의 방법에 의해 치료되지 않은 대상체에서의 동일 지표와 비교하였을 때의 본 개시내용의 방법에 의해 치료된 대상체에서의 지표 변화의 관찰에 의해 입증된다. 대안적으로, 신장 기능의 안정화는 치료 전의 동일 대상체에서의 동일 지표와 비교하였을 때의 본 개시내용의 방법에 의해 치료된 대상체에서의 지표 변화의 관찰에 의해 입증될 수 있다. 제1 지표의 변화는 값의 증가 또는 감소일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 치료에는 대상체에서 관찰되는 BUN 농도가 본 개시내용의 방법에 의해 치료되지 않은 유사 질환 상태의 대상체와 비교하였을 때 더 낮은, 대상체에서의 혈중 우레아 질소 (BUN) 농도의 안정화가 포함될 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 치료에는 대상체에서 관찰되는 혈청 크레아티닌 농도가 본 개시내용의 방법에 의해 치료되지 않은 유사 질환 상태의 대상체와 비교하였을 때 더 낮은, 대상체에서의 혈청 크레아티닌 농도의 안정화가 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 신장 기능 지표들 중 1종 이상의 안정화는 선택된 신장 세포 제제를 사용한 치료의 결과이다.
관련 기술분야 통상의 기술자라면, 대상체에서의 신장 질환의 효과적인 치료를 확인하기 위하여 본원에서 기술되거나 관련 기술분야에 알려져 있는 1종 이상의 추가적인 지표들이 측정될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
또 다른 측면에서, 생체활성 신장 세포 제제를 사용한 효과적인 치료는 1종 이상의 신장 기능 지표의 향상에 의해 입증된다. 특정 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 향상된 혈청 혈액 우레아 질소 (BUN) 농도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 혈청에서의 단백질의 향상된 체류를 제공한다. 특정 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 비-보강 세포 군집과 비교하였을 때 향상된 혈청 알부민 농도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 비-보강 세포 군집과 비교하였을 때 향상된 A:G 비를 제공한다. 특정 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 향상된 혈청 콜레스테롤 및/또는 트리글리세리드 농도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 향상된 비타민 D 농도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 비-보강 세포 군집과 비교하였을 때 향상된 인:칼슘 비를 제공한다. 특정 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 비-보강 세포 군집과 비교하였을 때 향상된 헤모글로빈 농도를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 비-보강 세포 군집과 비교하였을 때 향상된 혈청 크레아티닌 농도를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 생체활성 신장 세포 군집은 비-보강 세포 군집과 비교하였을 때 향상된 적혈구용적률(hematocrit) 수준을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 신장 기능 지표들 중 1종 이상의 향상은 선택된 신장 세포 제제를 사용한 치료의 결과이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 그를 필요로 하는 대상체에서의 선천 신장의 재생 방법에서 사용하기 위한 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 본원에서 기술되는 생체활성 세포 군집, 혼합물 또는 구성체를 대상체에게 투여하거나 이식하는 단계를 포함한다. 재생되는 선천 신장은 비제한적으로 선천 신장에서의 기능 또는 능력의 발현, 선천 신장에서의 기능 또는 능력의 향상, 및 선천 신장에서의 특정 마커의 발현을 포함한 수많은 지표들을 특징으로 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현되거나 향상되는 기능 또는 능력은 상기한 다양한 신장 기능 지표들을 바탕으로 관찰될 수 있다. 특정 실시양태에서, 재생된 신장은 1종 이상의 줄기 세포 마커의 차별적인 발현을 특징으로 한다. 상기 줄기 세포 마커는 하기 중 1종 이상일 수 있다: SRY (성 결정 영역 Y)-박스(box) 2 (Sox2); 미분화 배아 세포 전사 인자 (UTF1); 마우스 유래의 결절 동종체 (NODAL); 프로미닌 1 (PROM1) 또는 CD133 (CD133); CD24; 및 이들의 임의 조합 (그 전체가 본원에 참조로써 개재되는 일라간 등의 PCT/US2011/036347호 참조). 그 전체가 참조로써 개재되는 문헌 [Genheimer et al., 2012. Molecular characterization of the regenerative response induced by intrarenal transplantation of selected renal cells in a rodent model of chronic kidney disease. Cells Tissue Organs 196: 374-384]도 참조하라. 특정 실시양태에서, 줄기 세포 마커(들)의 발현은 대조에 비해 상향-조절된다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 대상체에서의 신장 질환의 치료 방법으로써, 상기 방법은 본원에서 개시되는 제제, 조성물 또는 세포 군집을 대상체에게 주사하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 제제, 조성물 또는 세포 군집은 18 내지 30 게이지 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 20 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 21 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 22 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 23 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 24 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 25 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 26 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 27 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 28 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 29 게이지 미만인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 20 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 21 게이지인 바늘을 통하여 주사된다.
특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 22 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 23 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 24 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 25 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 26 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 27 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 28 게이지인 바늘을 통하여 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제, 조성물 또는 세포 군집은 약 29 게이지인 바늘을 통하여 주사된다.
특정 실시양태에서, 바늘의 내부 직경은 0.84 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 내부 직경은 0.61 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 내부 직경은 0.51 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 내부 직경은 0.41 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 내부 직경은 0.33 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 내부 직경은 0.25 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 내부 직경은 0.20 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 내부 직경은 0.15 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 외부 직경은 1.27 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 외부 직경은 0.91 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 외부 직경은 0.81 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 외부 직경은 0.71 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 외부 직경은 0.64 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 외부 직경은 0.51 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 외부 직경은 0.41 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘의 외부 직경은 0.30 mm 미만이다. 특정 실시양태에서, 바늘은 하기 표의 크기들 중 하나를 가진다:
Figure pct00004
분비 생성물
특정 실시양태에서는, 세포 자체 및/또는 세포로부터 분비되는 생성물에 의해 효과가 제공될 수 있다. 재생 효과는 하기 중 1종 이상을 특징으로 할 수 있다: 상피-중간엽 전이의 감소 (TGF-β 신호전달의 감쇠를 통할 수 있음); 신장 섬유증의 감소; 신장 염증의 감소; 선천 신장 중 줄기 세포 마커의 차별적인 발현; 이식된 세포 및/또는 선천 세포의 신장 손상 예컨대 요세관 손상 부위로의 이동, 신장 손상 예컨대 요세관 손상 부위에서의 이식된 세포의 생착; 1종 이상의 신장 기능 지표 (본원에서 기술되는 바와 같음)의 안정화; 신장생성(nephrogenesis)과 연관되어 있는 S-형상체/콤마-형상체의 새로운 형성, 신장 요세관 또는 신장단위(nephron)의 새로운 형성, 적혈구 항상성의 복구 (본원에서 기술되는 바와 같음); 및 이들의 임의 조합 (각각의 전체 내용이 본원에 참조로써 개재되는 문헌 [Basu et al., 2011. Functional evaluation of primary renal cell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissue engineering. Cell Transplantation 20: 1771-90]; [Bruce et al., 2015. Selected renal cells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney disease via NF-κB 및 TGF-β1 pathways. Regenerative Medicine 10: 815-839]도 참조).
조직 생검의 대안으로서, 치료를 받는 대상체에서의 재생 성과는 체액, 예컨대 소변의 조사로부터 평가될 수 있다. 대상체-유래 소변 공급원으로부터 수득되는 미세소포가 비제한적으로 궁극적으로는 본 개시내용의 세포 군집을 사용한 치료에 의해 영향을 받은 신장 세포 군집으로부터 유래되는 특정 단백질 및 miRNA를 포함한 특정 성분들을 함유한다는 것이 발견되었다. 이러한 성분에는 비제한적으로 줄기 세포 복제 및 분화, 세포자멸사, 염증 및 면역-조절, 섬유증, 상피-중간엽 전이, TGF-β 신호전달 및 PAI-1 신호전달에 연관되어 있는 인자들이 포함될 수 있다. 미세소포-연관 miRNA/단백질 발현 패턴의 시간별 분석은 본 개시내용의 세포 군집, 혼합물 또는 구성체를 투여받는 대상체 신장 내에서의 재생 성과의 연속적인 모니터링을 가능하게 한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 신장 질환 (KD) 환자가 치료 제제를 사용한 치료에 대하여 응답성인지 여부의 평가 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료제를 사용한 치료 전에 동일 환자로부터 유래한 대조 샘플에서의 소포의 양과 비교하거나 대비하였을 때의 치료제를 사용하여 치료된 KD 환자로부터 수득된 시험 샘플에서의 소포의 양 또는 그의 루미날 함량(luminal content)을 측정 또는 검출하는 단계를 포함할 수 있는 바, 여기서, 대조 샘플에서의 소포의 양 또는 그의 루미날 함량과 비교하였을 때의 시험 샘플에서의 더 높거나 더 낮은 소포의 양 또는 그의 루미날 함량은 치료제를 사용한 치료에 대한 치료되는 환자의 응답성을 표시한다.
이러한 신장-유래 소포 및/또는 신장 유래 소포의 루미날 함량은 대상체의 소변으로 유출될 수도 있으므로, 재생 성과 또는 치료 효능을 표시하는 바이오마커에 대하여 분석될 수 있다. 비-침습성 예후법은 본원에서 기술되는 세포 군집, 혼합물 또는 구성체의 투여 또는 이식 전 및/또는 후에 대상체로부터 소변 샘플을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 소포 및 기타 분비 생성물들은 비제한적으로 원치 않는 잔사를 제거하기 위한 원심분리 (각각 그 전체가 본원에 참조로써 개재되는 문헌 [Zhou et al. 2008. Kidney Int. 74(5):613-621]; 스코그(Skog) 등의 U.S. 특허 출원 공개 제20110053157호), 소변으로부터 엑소좀을 분리하기 위한 침전, 특정 핵산을 확인하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응 및 핵산 서열분석, 그리고 재생 성과와 연관되어 있는 특정 단백질을 확인하기 위한 질량 분광법 및/또는 2D 겔 전기영동을 포함한 표준 기술들을 사용하여 소변 샘플로부터 단리될 수 있다.
전기에 기재된 상세한 설명이면, 관련 기술분야 통상의 기술자가 본 발명을 실시하는 것을 가능하게 하기에 충분할 것으로 생각된다. 본 발명이 바람직한 실시양태 및 임의의 특징들에 의해 구체적으로 개시되기는 하였지만, 관련 기술분야 통상의 기술자라면 본원에서 개시되는 개념의 변형 및 변이들에 의존할 수 있다는 것, 그리고 그와 같은 변형 및 변이들이 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 영역 내에 속하는 것으로 간주된다는 것이 이해되어야 한다. 하기의 실시예는 오로지 예시 목적으로 제공되는 것으로써, 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다. 실제로, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 전기한 상세한 설명으로부터 본원에서 나타내고 기술된 것들 이외의 다양한 본 발명의 변형들이 떠오르게 될 것인 바, 첨부된 청구범위의 영역 내에 속하게 된다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 문헌상 참고문헌들은 그 전체가 의거 참조로써 개재된다.
[ 실시예 ]
실시예 1: NKA 제제 구성요소
1. 세포 구성요소 및 재료
SRC는 NKA의 생물학적으로 활성인 구성요소를 구성한다. SRC는 주로 그의 재생 가능성이 잘 알려져 있는 신장 요세관 상피 세포로 구성된다. 다른 실질 (혈관), 중간엽, 내피 및 간질 (집합관) 세포가 자가 SRC 군집 중에 존재할 수도 있다.
SRC는 신장 조직의 코어(core)를 수집하기 위한 임상-관리-표준 신장 생검 절차를 사용하여 수득되는 신장 피질 조직으로부터 제조된다. 신장 세포는 효소 분해에 의해 신장 조직으로부터 단리된 후, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 증식된다. 세포는 신장 세포 형태구조를 확인하기 위하여 현미경하에서의 배양물의 시각적 관찰에 의해 평가된다. 서로 클러스터화하는 세포로 인하여, 배양물은 특징적으로 긴밀한 포장도로(pavement) 또는 포장석(cobblestone)과 같은 외관을 나타낸다 (도 1). SRC는 밀도 경계 또는 밀도 계면 또는 단일 단계 불연속 밀도 구배를 가로지르는 단리 및 증식된 세포의 분리에 의해 수득된다.
세포 부력 밀도를 바탕으로 수확된 신장 세포 군집을 분리하는 데에는, 밀도 경계 또는 계면을 가로지르는 원심분리가 사용된다. 신장 세포 현탁액은 옵티프레프 (7 % 아이오딕사놀; 옵티멤 중 60 % (w/v)) 매체의 용액상에서 분리된다. 대략 1.0419 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획이 원심분리 후 별도 펠렛으로서 수집된다 (도 2). 1.0419 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제되어 폐기된다.
상기 SRC 펠렛은 DPBS 중에 재-현탁된다. 최종 생성물 중 잔류 옵티프레프, FBS, 배양 배지 및 보조 재료들의 이월은 세척 단계에 의해 최소화된다.
2. 생체재료 구성요소 및 보조 재료
하기의 생체재료 구성요소 및 보조 재료들이 NKA로의 SRC의 제제화에 사용된다:
1. 돼지 젤라틴 - 열적으로 반응성인 수화젤을 제조하는 데에 사용됨.
2. 둘베코 포스페이트-완충 식염수 (DPBS) - 돼지 젤라틴을 용해시키는 데에 사용됨. 상기 완충제는 인간 혈장 또는 인간 혈소판 용해물로 대체되거나 그와 혼합될 수 있음.
생체재료 제조
생체재료는 DPBS 중 돼지 젤라틴으로 구성되는 젤라틴 용액이다. 열적으로 반응성인 수화젤의 젤라틴 용액을 형성시키기 위하여, 젤라틴은 특정 농도로 DPBS 또는 인간 혈장/인간 혈소판 용해물 또는 둘 다의 혼합물에 용해된다. 젤라틴 용액은 0.1 ㎛ 필터를 통하여 필터 여과된 후, 제제용으로 준비된 단일 사용 분취량으로 냉장 또는 냉동되어 저장된다.
생체재료의 핵심 특성은 그것이 열적으로 반응성인 수화젤이어서, 상이한 온도에서 젤화 및 액화될 수 있다는 것이다. NKA 제제에서 사용되는 젤라틴 용액은 실온 (22-28 ℃) 이상에서는 액체이며, 냉장 온도 (2-8 ℃)로 냉각될 경우 젤화된다.
젤라틴 용액 농도
0.5-1.0 % 범위의 젤라틴 농도를 젤라틴 특성 - 냉장 온도에서 젤을 형성하고 (전도시켰을 때 유동 없음) 실온에서 유체가 되는 (전도시켰을 때 자유롭게 유동함) 능력 -에 대하여 평가하였다. 표 4는 상이한 젤라틴 용액 농도의 젤화 특성을 나타낸다.
<표 4>
Figure pct00005
0.63 % 이상의 젤라틴 용액을 사용하여 제제화된 NKA가 허용 기준을 일관되게 충족할 수 있었기 때문에, 0.88 ± 0.12 %의 범위를 NKA 제제용 젤라틴 농도로 선택하였다. 그러나, 약 0.63 % 내지 약 1 % 농도 범위의 젤라틴을 포함하는 제제 역시 적합하다는 것을 알아야 한다.
3. NKA 제제
SRC는 젤라틴-기재의 열적으로 반응성인 수화젤인 젤라틴 용액을 사용하여 NKA로 제제화된다. 젤라틴-기재의 열적으로 반응성인 수화젤은 향상된 세포의 안정성을 제공함으로써, 생성물 저장 수명, 임상 용도를 위한 신장 피질에의 SRC 수송 및 전달 동안의 안정성을 연장한다. 제제 개발은 젤라틴 용액의 조성, 농도 및 안정성을 평가하였다.
세척된 SRC는 트리판 블루 염료 배제를 사용하여 계수된다. 젤라틴 용액은 저온 저장으로부터 분리된 후, 26-30 ℃로 가온하는 것에 의해 액화된다. 필요한 수의 세포를 함유하는 일정 부피의 SRC 현탁액이 원심분리된 후, 최종 세척 단계를 위하여 액화된 젤라틴 용액에 재-현탁된다. 이와 같은 현탁액이 원심분리된 후, SRC 펠렛이 제제화된 NKA에서 100 x 106개 세포/mL의 결과적인 SRC 농도를 달성하도록 충분한 젤라틴 용액 중에 재-현탁된다.
NKA 충전 및 젤화
NKA 생성물은 무균으로 주사기에 충전된다. 충전 과정의 기간 동안에는, 생존가능 및 비-생존가능 샘플링을 포함하여, 동적 공기 샘플링이 수행된다. NKA 패키지는 최종 젤화된 NKA를 형성시키기 위하여 2-8 ℃로 냉각하면서 최소 2시간 동안 회전됨으로써 세포가 현탁액 중에 유지된다. 젤라틴 용액 중에 세포가 침강되지 않도록 젤화가 이루어지기 위해서는, 빠른 냉각이 요구된다. 냉장되는 조건에 그것이 위치될 때, 주사기에서의 젤라틴 용액의 온도를 모니터링하였다. 바른 온도 강하는 도 3에 나타낸 바와 같이 관찰된다. 1시간 후, 온도는 통상적으로 최종 온도 4.4 ℃의 0.3 ℃ 이내로 강하한다.
젤라틴 용액의 냉각이 젤화 과정을 개시하기는 하지만, 형성되는 젤이 안정화됨으로써 저장시 SRC가 젤에 현탁되어 유지되게 되도록 하는 데에는, 일정량의 시간이 요구된다. 제제화된 NKA를 함유하는 주사기는 밤새 또는 1.25시간 동안 중 어느 하나로 회전시킨 다음, 밤새 세워 유지하였다. 이어서, 내용물을 분리한 후, 4개의 상이한 생성물 분절에서 세포 농도를 측정하였다. 분석은 4개 분절들 사이의 차이가 없으며, 그에 따라 일단 NKA가 저온에서 최소 1.25시간 동안 회전되고 나면, 측정가능한 세포 침강이 발생하지 않는다는 것을 표시한다 (도 4).
실시예 2. NKA 및 구성요소들의 특성화
본 부문에서 기술되는 분석 기술들을 사용하여, NKA 및 그의 구성요소들인 SRC 및 생체재료를 특성화하였다.
SRC의 특성화
방출 시험 목적으로, 그리고 연장된 배양에서 정량 목적으로, SRC를 특성화하였다. 또한, 정보 및 개발 목적으로 사용될 수 있으며 배양물에서의 효능 검정을 확립하는 데에 도움이 될 수 있는 다른 특징들에 대하여 SRC를 시험하였다.
SRC 특징
신장 세포 단리 및 증식은 신장 요세관 상피 세포 및 간질 세포를 포함한 신장 세포 유형들의 혼합물을 제공한다. SRC는 증식된 신장 세포의 단일 단계 불연속 밀도 구배 분리 또는 밀도 경계/밀도 계면을 가로지르는 원심분리에 의해 수득된다. 밀도 분리된 SRC 군집에서의 주요 세포 유형은 상피 표현형의 것이다. 증식된 신장 세포로부터 수득되는 SRC의 특징들을 확립하는 데에는 다-방면 접근법을 채택하였다. 신장 세포 증식 과정 동안에는, 세포 형태구조, 성장 동역학 및 세포 생존율이 모니터링된다. SRC 부력 밀도는 밀도 계면을 가로지르는 원심분리의 사용에 의해 확립된다. 세포 계수 및 생존율은 트리판 블루 염료 배제에 의해 측정된다. SRC 표현형은 유동 세포측정법에 의해 특성화된다. 생존가능 세포 및 SRC 기능의 존재는 프레스토블루의 대사, 그리고 VEGF 및 KIM-1의 생성에 의해 입증된다.
임상 연구용 NKA의 제조에 사용되는 SRC는 하기의 핵심 특징들에 대하여 시험될 것이다:
Figure pct00006
SRC 계수 및 생존율
Figure pct00007
SRC 표현형
Figure pct00008
SRC 기능
SRC 계수 및 생존율
세포 계수 및 생존율은 트리판 블루 염료 배제에 의해 측정된다.
SRC 표현형
세포 표현형은 유동 세포측정법을 사용한 신장 세포 마커의 발현 분석에 의해 모니터링된다. 세포의 표현형 분석은 분석되는 세포 유형 특유의 항원성 마커 사용을 바탕으로 한다. 유동 세포측정법 분석은 분석되는 항원성 마커를 발현하는 샘플 군집 중 세포의 정량 측정을 제공한다.
하기의 다양한 마커들이 신장 세포의 표현형 특성화에 유용한 것으로 문헌에 보고되어 있다: (i) 시토케라틴; (ii) 수송 멤브레인 단백질 (아쿠아포린 및 큐빌린); (iii) 세포 결합 분자 (어드헤린, 렉틴 및 기타); 및 (iv) 대사 효소 (글루타치온). 전신장 분해물로부터 유래되는 배양물에서 발견되는 대부분의 세포가 상피 및 내피 세포이기 때문에, 조사되는 마커들은 이들 2종 군 특유의 단백질 발현에 초점을 맞추고 있다.
시토케라틴은 가변적인 정도로 많은 유형의 상피 세포에 의해 발현되는 계열의 중간 필라멘트 단백질이다. 상피 세포에 의해 발현되는 시토케라틴의 하위세트는 상피의 유형에 따라 달라진다. 예를 들면, 시토케라틴 7, 8, 18 및 19는 모두 신장의 정상적인 단순 상피에 의해 발현되어, 비뇨생식관은 물론, 소화관 및 기도에 남는다. 이러한 시토케라틴은 조합되어 상피 세포의 구조적 완전성을 담당한다. 이와 같은 조합은 산성 (유형 I) 및 염기성 (유형 II) 케라틴 계열 모두를 대표하며, 신장 세포에서 풍부하게 발현되는 것으로 밝혀져 있다 (문헌 [Oosterwijk et al. (1990) Expression of intermediate-sized filaments in developing and adult human kidney and in renal cell carcinoma. J Histochem Cytochem, 38(3), 385-392]).
아쿠아포린은 이온 및 기타 용질들의 통과는 막으면서 세포로의, 그리고 세포로부터의 물의 통과는 가능하게 하는 수송 멤브레인 단백질이다. 문헌에 기술되어 있는 13종의 아쿠아포린이 존재하는데, 이들 중 6종이 신장에서 발견된다 (문헌 [Nielsen et al. (2002) Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiol Rev, 82(1), 205-244]). 아쿠아포린 2는 물의 유동을 조절하는 데에 있어서 긴밀한 조절력을 발휘하는 것에 의해 물에 대하여 고도의 투과성을 가지는 신장 집합관 상피 세포의 혈장 멤브레인을 담당함으로써, 물이 삼투 구배의 방향으로 유동하는 것을 가능하게 한다 (문헌 [Bedford et al. (2003) Aquaporin expression in normal human kidney and in renal disease. J Am Soc Nephrol, 14(10), 2581-2587]; [Takata et al. (2008) Localization and trafficking of aquaporin 2 in the kidney. Histochem Cell Biol, 130(2), 197-209]; [Tamma et al. (2007) Hypotonicity induces aquaporin-2 internalization and cytosol-to-membrane translocation of ICln in renal cells. Endocrinology, 148(3), 1118-1130]). 아쿠아포린 1은 근위 요세관의 특징이다 (문헌 [Baer et al. (2006) Differentiation status of human renal proximal and distal tubular epithelial cells in vitro: Differential expression of characteristic markers. Cells Tissues Organs, 184(1), 16-22]; [Nielsen et al. (2002) Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiol Rev, 82(1), 205-244]).
큐빌린은 수송 멤브레인 수용체 단백질이다. 그것이 단백질 메갈린과 공동-국소화되는 경우, 그들은 함께 알부민과 같은 큐빌린-결합 리간드의 내재화를 촉진한다. 큐빌린은 장 및 신장의 상피 내에 위치된다 (문헌 [Christensen & Birn (2001) Megalin and cubilin: synergistic endocytic receptors in renal proximal tubule. Am J Physiol Renal Physiol, 280(4), F562-573]).
CXCR4는 SDF1에 대하여 케모카인 수용체로서 작용하는 수송 멤브레인 단백질이다. 리간드 결합시에는, 세포내 칼슘 농도가 증가하며, MAPK1/MAPK3 활성화가 증가된다. CXCR4는 신장에서 상시적으로 발현되어, 신장 발생 및 요세관생성(tubulogenesis)에서 중요한 역할을 한다 (문헌 [Ueland et al. (2009). A novel role for the chemokine receptor Cxcr4 in kidney morphogenesis: an in vitro study. Dev Dyn, 238(5), 1083-1091]). 또한, CXCR4는 SDF1의 리간드 결합을 위한 수용체이다. SDF1/CXCR4 축은 내피 선조 세포 및 중간엽 줄기 세포의 손상 부위로의 이동 및 유도에서 중요한 역할을 한다 (문헌 [Stem-cell approaches for kidney repair: choosing the right cells. (Sagrinati et al. Trends Mol Med. 2008; 14(7):277-85)]).
카드헤린은 칼슘-의존성 세포 부착 단백질이다. 그것은 4종의 군으로 분류되는데, E-카드헤린은 상피 조직에서 발견되는 것으로써, 이동성 및 증식을 조절하는 것에 연관되어 있다. E-카드헤린은 신장의 원위 요세관을 구성하는 상피 세포의 어드헤린 연접부에 국소화되는 것으로 밝혀져 있는 막횡단 당단백질이다 (문헌 [Prozialeck et al. (2004) Differential expression of E-cadherin, N-cadherin and beta-catenin in proximal and distal segments of the rat nephron. BMC Physiol, 4, 10]; [Shen et al. (2005) Kidney-specific cadherin, a specific marker for the distal portion of the nephron and related renal neoplasms. Mod Pathol, 18(7), 933-940]).
DBA (돌리초스 비플로루스 ( Dolichos biflorus ) 응집소)는 신장 집합관 구조의 표면상에 보유되는 α-N-아세틸갈락토스아민-결합 렉틴 (세포 결합 단백질)으로써, 발생중인 신장 집합관 및 원위 요세관의 일반적인 마커로 간주 및 사용되고 있다 (문헌 [Michael et al. (2007) The lectin Dolichos biflorus agglutinin is a sensitive indicator of branching morphogenetic activity in the developing mouse metanephric collecting duct system. J Anat 210(1), 89-97]; [Lazzeri et al. (2007) Regenerative potential of embryonic renal multipotent progenitors in acute renal failure. J Am Soc Nephrol 18 (12), 3128-3138]).
CD31 (혈소판 내피 세포 부착 분자 PECAM-1으로도 알려져 있음)은 면역 세포는 물론 내피 세포의 선택 군집에 의해 발현되는 세포 부착 단백질이다. 내피 세포에서, 이와 같은 단백질은 세포 경계에 농축된다 (문헌 [DeLisser et al. (1997) Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. Am J Pathol, 151(3), 671-677]). CD146은 액틴 세포골격과 연관되어 있는 세포내 연접부에서의 내피 세포의 세포 부착 및 응집에 연관되어 있다. 혈관 내피 및 평활근에 의해 강하게 발현되기 때문에, CD146은 현재 내피 세포 계통에 대한 마커로 사용되고 있는데 (문헌 [Malyszko et al. (2004) Adiponectin is related to CD146, a novel marker of endothelial cell activation/injury in chronic renal failure and peritoneally dialyzed patients. J Clin Endocrinol Metab, 89(9), 4620-4627]), CD31의 개 등가물이다.
감마-글루타밀 트랜스펩티다제 (GGT)는 글루타치온의 감마-글루타밀 잔기의 아미노산, 펩티드 또는 물일 수 있는 수용체로의 전달을 촉매촉진함으로써 글루타메이트를 형성시키는 대사 효소이다. 이와 같은 효소는 글루타치온의 합성 및 분해, 그리고 세포 멤브레인을 가로지르는 아미노산의 전달에서도 역할을 한다. GGT는 신장의 근위 요세관 세포를 포함한 많은 조직의 세포 멤브레인에 존재한다 (문헌 [Horiuchi et al. (1978) Gamma-glutamyl transpeptidase: sidedness of its active site on renal brush-border membrane. Eur J Biochem, 87(3), 429-437]; [Pretlow et al. (1987). Enzymatic histochemistry of mouse kidney in plastic. J Histochem Cytochem, 35(4), 483-487]; [Welbourne & Matthews (1999) Glutamate transport and renal function. Am J Physiol, 277(4 Pt 2), F501-505]). 표 5는 유동 세포측정법에 의해 검출될 때 이러한 마커들을 발현하는 구체적인 신장 세포 유형들의 목록을 제공한다.
<표 5>
Figure pct00009
도 5는 군집 중 각 표현형의 백분율 값으로 플로팅된 SRC 군집에서의 이러한 마커들의 정량된 발현을 나타낸다. CK8/18/19는 종들 전체에 걸쳐 검출되는 가장 일관되게 발현되는 신장 세포 단백질이다. GGT1 및 아쿠아포린-1 (AQP1)은 일관되지만 가변적인 농도로 발현된다. DBA, 아쿠아포린 2 (AQP2), E-카드헤린 (CAD), CK7 및 CXCR4 역시 더 큰 가변성을 가지기는 하지만 적당한 농도로 관찰되며, CD31/146 및 큐빌린은 발현상 가장 저조하다. 공개된 데이터 (문헌 [Kelley et al. (2012) A Population of Selected Renal Cells Augments Renal Function and Extends Survival in the ZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy. Cell Transplant 22(6), 1023-1039]; [Kelley et al. (2010a) A tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in a rodent model of chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299(5), F1026-1039]) 및 본 발명자들의 공표되지 않은 연구 (도 5)를 바탕으로, CK18 및 GGT1을 NKA의 제조 동안 SRC의 일상적인 표현형 분석에 이용될 마커로서 선택하였다. AQP2 발현 역시 표현형 분석을 위한 유용한 마커이기는 하지만, 발현이 가변적이며, 그에 따라 AQP2 발현은 정보 목적으로 모니터링될 것이다. 표 6은 SRC에서의 표현형 발현의 선택 마커, 범위 및 평균 백분율 값, 그리고 그의 선택 이유를 제공한다.
<표 6>
Figure pct00010
세포 기능
SRC는 컨디셔닝된 배지의 분석을 통하여 검출될 수 있는 단백질들을 활발하게 분비한다. 세포 기능은 프레스토블루를 대사하고 VEGF (혈관 내피 성장 인자) 및 KIM-1 (신장 손상 분자-1)을 분비하는 세포의 능력에 의해 평가된다.
생존가능한 기능성 세포는 프레스토블루를 대사하는 그의 능력에 의해 NKA에서 모니터링될 수 있다. 프레스토블루 세포 생존율 시약은 세포 투과성의 비-형광 청색 염료인 변형된 레사주린-기재 검정 시약이다. 증식하기에 충분하게 생존가능성인 세포에의 진입시, 상기 염료는 데히드로제나제 효소가 연관되어 있는 자연 세포 과정을 통하여 형광 또는 흡광도에 의해 측정될 수 있는 밝은 적색의 형광단으로 환원된다.
생체분자 VEGF 및 KIM-1은 신장 손상 및 기능의 민감하고 특이적인 분석용 비임상 바이오마커로서 제안된 것들로부터의 분자의 선택을 대표한다 (문헌 [Sistare et al. (2010) Towards consensus practices to qualify safety biomarkers for use in early drug development. Nat Biotechnol, 28(5), 446-454]; [Warnock & Peck (2010) A roadmap for biomarker qualification. Nat Biotechnol, 28(5), 444-445]). 생체 내에서, 이들 마커 둘 다는 요세관 기능, 손상 및/또는 복구를 표시하며, 시험관 내에서는 요세관 상피 세포 배양의 인식되는 특징이다. KIM-1은 손상 및 세포 전환 동안 유출되는 세포자멸사 세포를 인식하여 포식하는 작용을 하는 신장 근위 요세관 세포의 멤브레인에 고정되는 세포외 단백질이다. 신장 세포에 의해 상시적으로 발현되는 VEGF는 세포 분열, 이동, 내피 세포 생존 및 혈관 발아를 촉진하는 중추적인 혈관생성 및 생존-전구(pro-survival) 인자이다. SRC는 VEGF mRNA를 상시적으로 발현하고 (표 8) 단백질을 활발하게 생성시키는 (표 7) 것으로 특성화되어 있다. 이러한 단백질들은 신장 세포 및 SRC에 노출된 배양 배지에서 검출될 수 있다. 표 7은 신장 세포 및 SRC 배양물로부터의 컨디셔닝된 배지에 존재하는 VEGF 및 KIM-1의 양을 나타낸다. 신장 세포는 거의 전면생장시까지 배양하였다. 신장 세포 배양물 및 SRC에의 밤샘 노출로부터의 컨디셔닝된 배지를 VEGF 및 KIM-1용으로 시험하였다.
<표 7>
Figure pct00011
기타 SRC 특징들의 확인
유전자 발현 프로파일링 및 세포 효소 활성의 측정에 의해 SRC를 추가로 특성화하였다.
유전자 발현 프로파일
단백질 생성에 대해서도 시험하였던 아쿠아포린 2, E-카드헤린, 큐불린, VEGF 및 CD31을 포함하여, 정량 실-시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해, 인간 신장 세포 배양물로부터 단리된 SRC의 유전자 발현 프로파일을 조사하였다. 표 14의 유전형 마커들은 신장 세포 배양물에서 발견될 것으로 예상될 수 있는 세포 군집을 대표한다. NCAD, 큐빌린 및 CYP2R1은 요세관 상피 세포의 마커이며, AQP2 및 ECAD는 집합관 및 원위 요세관의 마커이다. 포도신 및 네프린은 발세포(podocyte)의 마커이다. VEGF 및 CD31은 내피 마커이다. VEGF 및 EPO는 다양한 상이한 조직 및 세포 유형들에 존재하는 관련 mRNA를 포함하는 산소 반응성 유전자이다.
사용된 유전자 프로브(probe)는 타크만(TaqMan)으로부터 입수하였다. 계대 2 인간 신장 세포를 70-90 % 전면생장에서 수확하였다. 키아젠 알앤이지 플러스 미니 키트(Qiagen's RNeasy Plus Mini Kit)를 사용하여, 동물 세포로부터의 총 RNA의 정제(Purification of Total RNA from Animal Cells) 프로토콜에 따라 세포로부터 RNA를 정제하였다. 인비트로겐 수퍼스크립트(Invitrogen's SuperScript)® 빌로(VILO)™ cDNA 합성 키트를 사용하여 제조자의 지침에 따라 1.4 ㎍에 상당하는 일정 부피의 RNA로부터 cDNA를 생성시켰다. SRC 군집들 (n=3)에 대한 평균된 qPCR 데이터를 분획화되지 않은 신장 세포에 대비하여 표 8에 나타내었다.
결과는 NCAD, 큐빌린 및 CYP2R1의 상대적으로 더 높은 발현 농도에 의해 입증되는 바와 같이, 요세관 상피 세포의 군집이 존재한다는 것을 암시하고 있다. 원위 집합관 요세관 및 원위 요세관 마커 AQP2 및 ECAD는 상대적으로 저조하며, 내피 마커인 CD31은 더 저조하다 (표 8).
<표 8>
Figure pct00012
표현형 및 기능성 마커들은 초기의 유전형 평가를 바탕으로 선택하였다. VEGF 유전자 발현 농도는 높으며 아쿠아포린 2 유전자 발현 농도는 낮아서, 단백질 분석 데이터와 일치한다 (표 6 및 표 7).
SRC 효소 활성
예비-제제인 SRC의 세포 기능은 하기 2종 특정 효소의 활성을 측정하는 것에 의해서도 평가될 수 있다: 신장 근위 요세관에서 발견되는 GGT (γ-글루타밀 트랜스펩티다제) 및 LAP (류신 아미노펩티다제) (문헌 [Chung et al. (1982) Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium. J Cell Biol, 95(1), 118-126]). 세포에서의 이들 효소의 활성을 측정하기 위한 방법은 활성인 효소를 발현하는 세포에 첨가될 경우 절단되어 색소원성 생성물을 방출하는 효소-특이적 용액 중 기질을 이용한다 (문헌 [Nachlas et al. (1960) Improvement in the histochemical localization of leucine aminopeptidase with a new substrate, L-leucyl-4-methoxy-2-naphthylamide. J Biophys Biochem Cytol, 7( ), 261-264]; [Tate & Meister (1974) Stimulation of the hydrolytic activity and decrease of the transpeptidase activity of gamma-glutamyl transpeptidase by maleate; identity of a rat kidney maleate-stimulated glutaminase and gamma-glutamyl transpeptidase. Proc Natl Acad Sci U S A, 71(9), 3329-3333]. 세포-노출 용액의 흡광도가 측정된 후, 활성 효소로부터 생성되는 절단 생성물의 양에 대비된다. GGT용으로 이용되는 기질은 L-글루탐산 γ-p-니트로아날리드 히드로클로라이드이며, LAP 용은 L-류신 p-니트로아날리드이다. 도 6은 인간 공여자로부터 제조된 6개 SRC 샘플에서의 LAP 및 GGT 활성을 나타낸다. LAP 및 GGT 검정은 정보용으로만 수행된다. 검정은 오랜 세포 배양 기간을 필요로 하며, 그에 따라 생성물 방출에 대해서는 수행될 수 없다.
SRC 특성화 요약:
Figure pct00013
세포 증식 동안 이미지 라이브러리의 이미지들을 사용한 배양물 관찰사항의 비교에 의해 세포 형태구조가 모니터링됨.
Figure pct00014
각 세포 계대에서 세포 성장 동역학이 모니터링됨. 세포 성장은 환자별로 가변적일 것으로 예상됨.
Figure pct00015
트리판 블루 염료 배제 및 프레스토블루의 대사에 의해 SRC 계수 및 생존율이 모니터링됨.
Figure pct00016
CK18, GGT1의 표현형 발현에 의해 SRC가 특성화됨. 정보 목적으로는 AQP2 발현이 모니터링될 것임.
Figure pct00017
생존가능하며 기능성인 SRC의 존재에 대한 마커로는 프레스토블루의 대사, 그리고 VEGF 및 KIM-1의 생성이 사용됨.
Figure pct00018
SRC 기능은 유전자 발현 프로파일링, 그리고 LAP 및 GGT를 사용한 효소 활성의 측정으로 추가 확인될 수 있음.
생체재료의 특성화
NKA (젤라틴 용액)에 사용되는 생체재료는 2종의 핵심적인 파라미터를 통하여 특성화된다:
농도 - 분광광도계를 사용한 280 nm에서의 흡광도에 의해 젤라틴 용액의 농도가 측정됨. 젤라틴 농도는 흡광도 대 농도의 보정 곡선으로부터 측정됨.
전도 시험 - 전도 시험은 2-8 ℃의 온도에서 젤을 형성하고 유지하며 실온에서 젤을 액화하는 (유동화하는) 젤라틴 용액 능력의 시각적 평가를 제공함.
기타 생체재료 특징들의 확인
NKA에 사용되는 생체재료는 유변학적 특성 및 점도에 대하여 추가로 특성화될 수 있다.
유변학적 특성
생체재료의 유변학적 특성은 쿠에트 셀(Couette Cell) 유형 유변물성측정기의 사용을 통하여 먼저 4 ℃에서, 다음에는 25 ℃에서 측정될 수 있다. 샘플은 각 온도에서 적어도 30분 동안 평형화된다. 더 낮은 온도에서의 허용가능한 저장 모듈러스 (G' > 10)는 2-8 ℃의 NKA 선적 및 수송 온도에서 젤을 형성하고 유지하는 용액의 능력을 반영한다. 더 높은 온도에서의 허용가능한 상실 모듈러스(loss modulus) (G" < 10)는 NKA의 전달 및 이식에 요구되는 바와 같은 실온에서 액화하는 젤의 능력을 반영한다.
점도
생체재료의 점도는 37 ℃ 및 200-300 s-1의 전단 속도에서 원추 및 판 점도계를 사용하여 측정된다. 1.05-1.35 cP 범위의 점도를 가지는 용액이 18-27 게이지 바늘을 통하여 효율적으로 전달될 수 있다.
NKA의 특성화
NKA는 생체재료 (젤라틴-기재 수화젤) 중에 제제화된 자가 SRC로 구성된다. 젤라틴-기재 수화젤 생체재료 중 SRC의 제제화는 강화된 세포 안정성을 제공함으로써, 생성물 저장 수명을 연장하고, 임상 용도를 위한 신장 피질에의 SRC의 수송 및 전달 동안 NKA의 안정성을 향상시킨다.
NKA는 프레스토블루의 대사, CK18, GGT1 및 AQP2의 표현형 발현, 그리고 VEGF 및 KIM-1의 생성에 의해 생존가능 세포인 SRC의 표현형 및 세포 기능의 존재에 대하여 특성화된다. 세부사항은 상기 SRC의 특성화 부문에 제공되어 있다.
인간 신장 공여자로부터 수득된 SRC를 사용하여 제조되며 젤라틴을 사용하여 제제화되는 NKA가 저장 및 수송 동안 주사기 내에서 응집 없이 균일한 세포 분포를 유지함으로써 방출 후 및 주사시의 최종 NKA 생성물에서 향상된 세포의 안정성을 보장한다는 것을 입증하기 위한 실험을 수행하였다. NKA에서의 SRC 분포 및 응집의 결과는 하기 부문에서 제공된다. 저온 저장시의 NKA의 안정성에 대한 세부사항은 하기에서 제공된다.
NKA 중 SRC 분포
세포 침강의 정량적 관찰, 공초점 현미경법을 사용한 생/사멸 생존율의 영상화, 및 트리판 블루 염료 배제를 사용한 살아있는 세포 분포의 측정에 의해 NKA 중 SRC 분포를 확립하였다.
세포 침강의 정량적 관찰
제제화된 NKA 중 SRC를 침강에 대하여 시각적으로 관찰하고, DPBS에만 현탁된 SRC와 비교하였다. DPBS에 현탁된 SRC는 유지 기간 동안 현탁액으로부터 침강 분리되었다. DPBS 중 0.88 % 젤라틴을 사용한 SRC의 NKA 제제는 저온에서의 3일 저장 동안 주사기 내에서의 침강으로부터 세포를 지킬 수 있었다 (도 7).
공초점 현미경법을 사용한 생/사멸 생존율의 영상화
공초점 현미경법 (BD 패스웨이(Pathway) 855)을 사용하여 제제화된 NKA 내에서의 SRC 분포를 영상화하였다. NKA (젤라틴 중에 제제화된 SRC)를 유리 챔버 슬라이드상으로 압출하고, 형광 생 (녹색)/사멸 (적색) 염료를 사용하여 염색하였다. 도 8은 젤라틴 내에 분포된 생존가능 SRC (녹색)의 대표적인 이미지를 나타낸다.
NKA 주사기 전체에 걸친 SRC 분포
트리판 블루 염색을 사용하여, 제제화된 NKA 주사기 전체에 걸친 SRC 분포를 측정하였다. NKA는 표준 절차를 사용하여 주사기 중에 제조하였다. 저온에서의 3일 동안의 유지 후, 실온으로 가온하고, 도 9에 나타낸 바와 같이 주사기로부터 4개의 분획으로 NKA를 압출하였다. 각 분획에 대하여 계수를 수행하고, 살아있는 세포 총 분포 및 평균 생존율을 측정하였다.
주사기 내 SRC 분포의 측정
트리판 블루 염료 배제를 사용하여, 압출된 분획에서 SRC를 계수하였다. 도 10은 침착 시점에서의 주사기 통을 따른 분포 패턴을 보여주는 선택된 분획에서의 총 생존가능 세포 계수를 나타낸다. SRC는 주사기 전체에 걸쳐 균일하게 분포된다.
NKA에서의 SRC 응집
상 대조 현미경법하에서 라이카(Leica) LAS 이미지 소프트웨어를 사용하여 NKA에서의 SRC 응집을 평가하였다. 제제화시, 그리고 또한 저온에서의 3일 유지 기간 후에 세포 응집을 평가하였다. 도 11은 제제화 직후의 SRC의 라이카 이미지를 나타낸다 (10X). 0.88 % 젤라틴에 현탁된 SRC의 NKA 제제에서 세포의 응집은 관찰되지 않는다. 도 12는 NKA로부터 채취된 샘플 (분획 1-4)의 상 대조 이미지 (10X)를 나타낸다. 3일 유지 기간 후 주사기 전체에 걸쳐 세포 응집은 관찰되지 않는다.
NKA 특성화 요약:
Figure pct00019
SRC의 젤라틴 제제는 NKA의 저장 및 수송 동안 세포가 NKA 중에 현탁 및 분포되어 유지되는 것을 가능하게 함. 젤라틴 제제는 또한 주사 동안 NKA의 균일한 전달을 보장함.
Figure pct00020
DPBS에만 현탁된 SRC는 3일 동안의 저온에서의 저장 동안 침강 분리됨.
Figure pct00021
SRC는 제제화 후 또는 그의 3일 생성물 저장 수명 동안의 저장시에 NKA 중에서 응집되지 않음.
실시예 3: 안정성 시험
젤라틴 용액 안정성
제조된 젤라틴 용액은 냉장고 (2-8 ℃) 또는 냉동고 (-20 ℃ 미만)에서 저장된다. 8주 이하 동안 저온 (2-8 ℃)에서, 또는 24주 이하 동안 냉동 (-20 ℃ 미만)으로 재료를 유지한 후, NKA 제제에 사용되는 젤라틴 용액의 안정성을 평가하였다.
여과 멸균 후, 젤라틴 용액을 15 mL 튜브로 분취하고, 냉장고 (2-8 ℃) 또는 냉동고 (-20 ℃ 미만) 중 어느 하나에서 저장하였다. 평가 시점에, 하나의 젤라틴 용액 튜브를 저온 저장으로부터 분리하여, 26-30 ℃ 수조에 위치시켰다. 수조에서 2시간 후, 튜브를 전도시켰을 때 젤라틴 용액이 "유동하는" 것이 관찰된 경우, 용액은 액화되는 능력에 있어서 허용되는 것으로 간주되었다. 튜브를 2-8 ℃ 저온 저장으로 복귀시키고, 다음날 관찰하였다. 전도시켰을 때 젤라틴 용액이 유동하지 않은 경우, 용액은 젤화되는 능력에 있어서 허용되는 것으로 간주되었다. 시험된 기간에, 젤화 또는 액화에 있어서의 중요한 경향은 관찰되지 않는다.
또한, 냉동된 샘플에 대하여, 37 ℃ 및 150-250 s-1의 전단 속도에서 원추-및-판 점도계를 사용하여 액화된 젤라틴 용액의 점도를 측정하였다. 시험된 기간에, 젤라틴 점도에 있어서의 중요한 경향은 관찰되지 않았다.
냉장 및 냉동 저장 안정성 연구의 일부로서, 멸균성 (BacT/Alert)에 대하여 샘플을 시험하였다. 8주 냉장 및 24주 냉동 후, 시험은 음성이었다 (5일 이내에 성장 없음).
NKA 안정성
인간 신장 공여자에 의해 제조되는 NKA가 저온 (2-8 ℃)에서 저장될 수 있다는 것을 입증하기 위한 실험도 수행하였다. 생성물에서의 생존율, 표현형 특성화 및 세포 기능의 측정을 사용하여, NKA 안정성을 확립하였다.
4개의 신장 조직 샘플로부터의 신장 조직 생검으로 SRC를 수득하고, 표준 절차를 사용하여 NKA를 제조하였다. 제조 종료 후, 저장 수명을 평가하기 위하여, NKA를 7일 이하 동안 저온에서 유지하였다. 1, 2, 3, 4 및 7일차에 분석을 위하여 샘플을 채취하였다.
NKA에서의 SRC 생존율의 안정성
트리판 블루 염료 배제에 의해 NKA에서의 SRC의 생존율을 측정하였다. 도 13은 생성물이 제조 후 7일 이하 동안 저온에서 저장된 후의 SRC 생존율의 안정성을 도시한다. SRC 생존율은 저온 저장에서 적어도 4일 동안 70 % (산업 표준)를 초과하여 유지된다.
NKA에서의 SRC 표현형의 안정성
CK18 및 GGT1의 발현에 의해 NKA 중 SRC 표현형을 측정하였다. 도 14 및 15는 생성물이 제조 후 7일 이하 동안 저온 저장에서 유지된 후의 SRC 표현형의 안정성을 도시한다. CK18 및 GGT1에 의한 SRC 표현형은 저온 저장에서 적어도 4일 동안 방출 기준을 초과하여 유지된다.
NKA에서의 SRC 기능의 안정성
프레스토블루 대사 및 VEGF 생성을 생성물에서의 SRC 기능의 척도로 사용하였다. 도 16은 제조 후 7일 이하 동안 저온 저장 후의 프레스토블루 대사를 도시한다. 영양 없이 저장되는 세포에 대하여 예상되게 될 바와 같이, 프레스토블루를 대사하는 NKA 중 SRC의 능력은 저장 시간에 따라 서서히 감쇠된다. 저온 저장 3일차에, NKA 대사는 최초 프레스토블루 값의 50 %를 초과함으로써, 제안된 방출 기준을 충족하였다. NKA 저온 저장시의 SRC 기능으로 볼 때, 3일의 저장 수명이 추정된다.
도 17은 생성물이 제조 후 7일 이하 동안 저온 저장에서 유지된 후의 VEGF 생성을 도시한다. VEGF를 발현하는 NKA 중 SRC의 능력은 3일차까지 안정하며 (0일차와 통계적 차이 없음), 영양 없이 저장되는 세포에 대하여 예상되게 되는 바와 같이, 저장 시간이 더하면서 감쇠된다. 저온 저장 3일차에, VEGF 생성은 제안된 방출 기준을 충족한다. NKA 저온 저장 동안의 SRC 기능의 평가로 볼 때, 3일의 저장 수명이 추정된다.
저장 3일차에서의 ≥ 70 %의 SRC 생존율 유지로 볼 때, NKA에는 3일의 저장 수명이 할당된다. 3일차에, 세포 기능의 척도로서의 프레스토블루 대사는 0일차 최초 값의 50 %를 초과한다. 영양 없이 저장되는 세포에서는, 프레스토블루 대사의 감쇠가 예상된다.
목표 수준인 70 %에서의 SRC 생존율의 유지, 및 방출 세부사항을 충족하는 세포 표현형 및 기능의 유지로 볼 때, NKA는 저온에서 제조-후 3일 동안 저장될 수 있다.
실시예 4: NKA 전달 및 이식
NKA는 세포 전달 시스템을 사용한 환자 신장 피질로의 주사를 목표로 한다. 하기 부문에서는, 전달 시스템 및 주사 시술에 사용되는 구성요소들을 다룬다.
NKA 전달 시스템
NKA 전달 시스템은 세포 전달 및 주사기와 상용성인 캐뉼러 (바늘)로 구성된다. 여러 판매자들이 캐뉼러 또는 바늘이라는 용어를 사용하여 세포 전달 제품을 기술하고 있다. 본 상세한 설명에서는, 투관침, 캐뉼러 및 바늘이라는 용어들이 호환가능하게 사용된다.
NKA 전달 시스템의 주 구성요소는 전달 바늘/캐뉼러이다. 임상에서의 NKA의 효과적인 전달을 위한 전달 캐뉼러의 바람직한 특징을 표 9에 열거하였다. 나아가, NKA와 상용성인 캐뉼러를 사용하게 될 것이다.
<표 9>
Figure pct00022
주사기 재료는 USP 클래스 VI 지침에 부합하는 것으로써, 생체적합성을 평가하기 위하여 ISO 10993 방법에 따라 시험된 것이다. 주사기는 메리트 메디칼(Merit Medical), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 또는 생체적합성 분류 및 생성물 상용성 시험을 충족하는 유사 판매자로부터 공급된다. 전달 바늘/캐뉼러는 인디애나 블루밍턴 소재 쿡 메디칼(Cook Medical), 유타 헌츠빌 소재 인터내셔널 메디칼 디벨롭먼트(International Medical Development), 캘리포니아 어빈 소재 이노베이티브 메드 인크.(Innovative Med Inc.), 또는 생체적합성 요건 및 생성물 상용성 시험을 충족하는 유사 사로부터 입수하였다. NKA를 사용하는 18-32 게이지 전달 캐뉼러의 생성물 상용성 시험을 도 18에 나타내었다. 캐뉼러를 통한 통과시의 SRC 생존율은 18 내지 26 게이지의 캐뉼러에 대하여 주사기 단독에서와 동일해서, 이러한 캐뉼러가 SRC와 상용성임을 입증하고 있다. SRC 생존율은 26 게이지 미만의 바늘 크기에서는 떨어지는 것으로 보인다.
NKA 이식
이식 준비시, NKA는 생성물을 액화하기 위하여 신장에의 주사 직전에 실온으로 가온된다.
NKA는 세포 전달과 상용성인 바늘/캐뉼러 및 주사기를 통한 신장 피질에의 이식을 목표로 한다. 목적은 신장 피막의 관통 및 신장 피질의 다수 부위에의 침착을 통하여 NKA를 도입하는 것이다. 처음에는, 신장 피질로 대략 1 cm 삽입되는 (그러나 신장으로 더 진행하지는 않음) 15-20 게이지 접속(access) 투관침/캐뉼러를 사용하여, 신장 피막을 천공하게 된다. NKA는 둔단 내부 세포 전달 바늘 또는 유연성 캐뉼러 (18-26 게이지, 접속 캐뉼러에 적합한 것)에 결합될 주사기 내에 함유되게 된다. 단계 1 임상 연구에서는, 18 G 전달 바늘을 통하여 NKA를 전달하였다. 제안된 단계 II 연구는 18 게이지 이하의 바늘을 세포 전달에 이용하게 된다. 전달 바늘은 접속 캐뉼러 내부로 관통되어, NKA가 투여될 신장으로 진행하게 된다. NKA의 주사는 1-2 mL/분 속도가 될 것이다. 각 1-2분 주사 후, 내부 바늘은 피질 내의 바늘 행로를 따라 바늘 단부가 접속 캐뉼러의 단부에 올 때까지 제2의 주사 부위로 물러서게 되는 등이거나, 또는 전체 세포 부피가 주사된다. 이와 같은 시스템은 복강경 및 경피 전달 둘 다를 가능하게 한다. 경피 전달하에서는, 접속 캐뉼러/투관침 및 전달 바늘의 위치지정이 직접적인 실-시간 이미지 안내를 사용하여 수행되게 된다. NKA 침착물의 미세기포 족적(footprint)를 가시화하기 위하여, NKA의 주사는 초음파 이미지 안내에 의해 모니터링되게 된다.
도 19의 개략도는 고형 기관에의 세포 전달 및 분포와 상용성인 바늘을 사용하여 신장에 NKA를 주사하는 개념을 도시한다. NKA는 직접 신장 피막으로 전달되게 된다. 환자에서의 NKA 전달은 처음에는 표준화된 경피 또는 복강경 시술을 사용하게 된다.
실시예 5: SRC를 제조하기 위한 방법 및 조성의 비-제한적인 예
실시예 5.1 - 용액의 제조
본 실시예 부문은 비균질 신장 세포 군집의 단리 및 특성화, 그리고 본 실시예에서의 재생 치료 생성물의 제조에 사용되는 다양한 배지 배합물 및 용액의 조성을 제공한다.
<표 10>
Figure pct00023
모든 세포 세척에는 둘베코 포스페이트 완충 식염수 (DPBS)를 사용하였다.
실시예 5.2 - 비균질 비분획화 신장 세포 군집의 단리
본 실시예 부문은 인간으로부터의 분획화되지 않은 (UNFX) 비균질 신장 세포 군집의 단리를 예시한다. 최초 조직 분리를 수행하여 인간 신장 조직으로부터 비균질 세포 현탁액을 생성시켰다.
신장 생검을 통한 신장 조직은 비균질 신장 세포 군집을 위한 공급 재료를 제공하였다. 피질, 피질수질 연접부 또는 수질 조직 중 1종 이상을 포함하는 신장 조직이 사용될 수 있다. 피질수질 연접부 조직을 사용하는 것이 바람직하다. CKD 신장으로부터의 흉터 조직을 피한 다수의 생검 코어 (최소 2개)를 필요로 한다. 계획된 최종 NKA 이식 대략 4주 전에, 임상 현장에서 환자로부터 임상 조사자에 의해 신장 조직을 수득하였다. 상기 조직을 실시예 5.1의 조직 수송 배지 중으로 수송하였다.
다음에, 세포 추출용으로 조직을 처리하기 전에, 미생물존재량 유입을 감소시키기 위하여 실시예 5.1의 조직 세척 용액을 사용하여 조직을 세척하였다.
신장 조직을 세절하고, 칭량한 후, 실시예 5.1의 분해 용액에서 분리하였다. 생성되는 세포 현탁액을 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) + 10 % 소 태아 혈청 (FBS) (인비트로겐, 캘리포니아 칼스배드)에서 중화하고, 세척한 후, 무-혈청 무-보충제 각질세포 배지 (KSFM) (인비트로겐)에 재현탁하였다. 다음에, 실시예 5.1의 신장 세포 성장 배지에서의 cm2 당 25,000 세포의 밀도에서의 조직 배양 처리된 폴리스티렌 플라스크 또는 디쉬상으로의 배양의 개시 전에 세포 현탁액을 15 % (w/v) 아이오딕사놀 (옵티프레프™, 시그마(Sigma)) 밀도 경계상에서 원심분리하여 적혈구 및 잔사를 제거하였다. 예를 들면, 세포는 150 ml의 50:50 배지 중에서 25 x 106개 세포/플라스크로 T500 눈크(Nunc) 플라스크상에 도말될 수 있다.
실시예 5.3 - 단리된 신장 세포 군집의 세포 증식
신장 세포 증식은 제공받은 조직의 양 및 입수 조직으로부터의 신장 세포 단리의 성공에 따라 달라진다. 필요할 경우 (하기 참조), 단리된 세포는 냉동보존될 수 있다. 개별 환자로부터 단리되는 세포의 본질적인 가변성으로 인하여, 신장 세포 성장 동역학은 샘플마다 달라질 수 있다.
입수되는 조직의 가변성에 기인하는 세포 회수율 범위를 수용하는 정형화된 세포 증식 방법을 개발하였다 (표 11). 신장 세포의 증식은 정해진 세포 배양 절차를 사용한 신장 세포 성장 배지 (표 10) 중 폐쇄된 배양 용기 (예컨대 T-플라스크, 셀 팩토리즈(Cell Factories), 하이퍼 스탁스(HyperStacks)®) 내에서의 연속 계승을 포함한다.
BPE의 사용과 연관되어 있는 본질적인 위험성을 제거하기 위하여, 인간 임상 시험용으로 무-BPE 배지를 개발하였다. 무-BPE 배지에서 세포 성장, 표현형 (CK18) 및 세포 기능 (GGT 및 LAP 효소 활성)을 평가하고, 동물 연구에서 사용된 BPE 함유 배지와 비교하였다. 신장 세포 성장, 표현형 및 기능은 2종의 배지에서 동등하였다 (데이터는 나타내지 않음)
<표 11>
Figure pct00024
일단 최초 T-플라스크 (계대 0)에서 세포 성장이 관찰되고 시각적인 오염 징후가 없으면, 이후 2-4일마다 배양 배지를 교체하여 변화시켰다 (도 21b). 현미경하에서의 배양물의 시각적 관찰에 의해 신장 세포 형태구조를 확인함으로써, 세포를 평가하였다. 서로 클러스터화하는 세포로 인하여, 배양물은 특징적으로 긴밀한 포장도로 또는 포장석의 외관을 나타내었다. 이러한 형태구조적 특징은 증식 동안 가변적이어서, 모든 계대에서 나타나지는 않을 수 있다. 세포 증식 전체에 걸쳐 사용되는 배양 용기에서의 다양한 전면생장 수준에서 세포의 이미지 라이브러리를 사용하여 세포 배양 전면생장을 추정하였다.
배양 용기가 적어도 50 % 전면생장 상태일 때 트립신처리에 의해 신장 세포를 계승시켰다 (도 21b). 탈착된 세포를 신장 세포 성장 배지가 들어있는 용기에 수집하고, 계수하여, 세포 생존율을 계산하였다. 각 세포 계대에서, NKA의 제제화에 필요한 만큼 세포 수를 증식시키기 위하여, 충분한 수의 배양 용기에 500-4000개 세포/cm2로 세포를 시딩하였다 (도 21b). 배양 용기는 5 % CO2 환경의 37 ℃ 인큐베이터에 위치시켰다. 상기한 바와 같이, 세포 형태구조 및 전면생장을 모니터링하면서, 2-4일마다 조직 배양 배지를 교체하였다. 표 12는 인간 공여자로부터의 6개 신장 생검물의 세포 단리 및 증식 동안 관찰된 인간 신장 세포의 생존율을 열거한다.
<표 12>
Figure pct00025
상이한 환자 유래 조직의 본질적인 가변성은 상이한 배양물 중 세포 수율로 이어졌다. 따라서, 세포 계대의 시점, 또는 목표 세포 수를 달성하기 위하여 각 계대에서 요구되는 배양 용기의 수 및 유형을 엄격하게 규정하는 것은 실용적이지 않다. 통상적인 신장 세포는 2 또는 3 계대를 겪지만; 배양 기간 및 세포 수율은 세포 성장 속도에 따라 가변적일 수 있다.
EDTA (인비트로겐)와 함께 0.25 % 트립신을 사용하여, 수확 또는 계승을 위해 세포를 탈착시켰다. 트리판 블루 배제를 통하여 생존율을 평가하고, 혈구계를 사용하여, 또는 자동화된 셀로메터(Cellometer).RTM. 계수 시스템 (넥셀롬 바이오사이언스(Nexcelom Bioscience), 매사추세츠 로렌스)을 사용하여 수동으로 계수를 수행하였다.
실시예 5.4 - 배양된 세포의 냉동보존
개별 환자로부터의 세포 성장의 본질적인 가변성을 수용하고 예정된 임상 일정으로 생성물을 전달하기 위하여, 증식된 신장 세포는 항상 냉동보존하였다. 또 다른 NKA가 필요한 경우 (예컨대 환자의 질병, 예기치않은 과정상의 문제 등으로 인한 지연), 냉동보존된 세포는 세포의 백업 공급원도 제공한다. 세포를 냉동보존하고 해동시 생존가능한 기능성 세포를 회수하는 데에 사용된 조건을 확립하였다.
냉동보존을 위해서는, 세포를 냉동보존 용액 (실시예 5.1 참조)에 약 50 x 106개 세포/mL의 최종 농도로 현탁하고, 바이알에 분배하였다. 약 50 x 106개 세포/mL를 함유하는 1 ml 바이알을 조절되는 속도의 냉동고의 냉동 챔버에 위치시키고, 사전-프로그래밍된 속도로 냉동시켰다. 냉동 후, 제조-중 저장을 위하여 액체 질소 냉동고로 세포를 옮겼다.
실시예 5.5 - SRC 세포 군집의 제조
선택된 신장 세포 (SRC)는 일정에 따라 냉동보존된 세포로부터, 또는 직접 증식 배양물로부터 성장된 최종 배양 용기로부터 제조될 수 있다 (도 21b).
냉동보존된 세포를 사용할 경우, 세포를 해동하고, 1회의 최종 증식 단계를 위하여 조직 배양 용기에 도말하였다. 최종 배양 용기가 대략 50-100 % 전면생장이 되었을 때, 세포는 SRC 분리를 위한 처리 준비가 되었다. 배지 교환 및 NKA의 회종 세척은 최종 생성물 중 임의의 잔류 냉동보존 용액을 희석한다.
일단 최종 세포 배양 용기가 적어도 50 % 전면생장에 도달하고 나면, 배양 용기를 37 ℃에서 5 % CO2 환경 중 2 % 산소로 설정된 저산소 인큐베이터로 옮기고 (도 21c), 밤새 배양하였다. 세포는 48시간 만큼 오랜 동안 2 % 산소로 설정된 산소-조절 인큐베이터에서 유지될 수 있다. 더 생리적으로 적격인 저-산소 (2 %) 환경에의 노출은 세포 분리 효율을 향상시키고, VEGF와 같은 저산소-유도 마커들의 더 많은 검출을 가능하게 하였다.
세포를 충분한 시간 (예컨대 밤샘 내지 48시간) 동안 저산소 조건에 노출시킨 후, EDTA (인비트로겐)와 함께 0.25 % 트립신을 사용하여 세포를 탈착시켰다. 트리판 블루 배제를 통하여 생존율을 평가하고, 혈구계를 사용하여, 또는 자동화된 셀로메터® 계수 시스템 (넥셀롬 바이오사이언스, 매사추세츠 로렌스)을 사용하여 수동으로 계수를 수행하였다. 세포를 DPBS로 1회 세척하고, DPBS 중 약 850 x 106개 세포/mL로 재현탁하였다.
밀도 경계/계면을 가로지르는 원심분리를 사용하여 세포 부력 밀도를 바탕으로 수확된 신장 세포 군집을 분리하였다. 7 % 아이오딕사놀 용액 (옵티프레프; 옵티멤 중 60 % (w/v); 실시예 5.1 참조)상에서의 원심분리에 의해 신장 세포 현탁액을 분리하였다.
7 % 옵티프레프 밀도 계면 용액을 제조하고, 사용 전에, 원하는 밀도를 표시하는 굴절률을 측정하였다 (R.I. 1.3456 +/- 0.0004). 수확된 신장 세포는 용액의 상부에 층상화되었다. 원심분리 튜브 또는 세포 처리기 (예컨대 코브(COBE) 2991) 중 어느 하나에서, 실온으로 20분 동안 (중단 없이) 800 g에서 밀도 계면을 원심분리하였다. 원심분리 후, 대략 1.045 g/mL를 초과하는 부력 밀도를 나타내는 세포 분획을 별도 펠렛으로서 수집하였다. 1.045 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 배제하여 폐기하였다.
SRC 펠렛을 DPBS 중에 재-현탁하였다 (도 21c). 4회의 DPBS 세척 및 1회의 젤라틴 용액 단계에 의해, 최종 생성물 중 잔류 옵티프레프, FBS, 배양 배지 및 보조 재료들의 이월을 최소화한다.

Claims (49)

  1. a) 온도-민감성 세포-안정화 생체재료, 및
    b) 생체활성 신장 세포 (BRC) 군집
    을 포함하고,
    여기서 온도-민감성 세포-안정화 생체재료는 (i) 약 8 ℃ 이하에서는 실질적으로 고체인 상태를 유지하며, 여기서 실질적으로 고체인 상태는 젤 상태이고, (ii) 대략 주변 온도 이상에서는 실질적으로 액체인 상태를 유지하며, (iii) 약 8 ℃ 내지 대략 주변 온도 이상에서는 고체-에서-액체 전이 상태를 가지는 수화젤이고,
    수화젤은 재조합 기원의 세포외 매트릭스 단백질을 포함하거나, 신장 또는 또 다른 조직 또는 기관으로부터 기원하는 세포외 매트릭스로부터 유래하거나, 또는 젤라틴을 포함하는 것인, 주사가능 제제.
  2. 제1항에 있어서, 젤라틴이 유형 I 알파 I 콜라겐으로부터 유래되는 것인 주사가능 제제.
  3. 제1항에 있어서, BRC 군집이 생체재료로 코팅되거나, 그 위에 침착되거나, 그에 매립되거나, 그에 부착되거나, 시딩되거나, 또는 그에 포획되는 것인 주사가능 제제.
  4. 제1항에 있어서, 생체재료가 다공성 발포체, 젤, 액체, 비드 또는 고체로서 구성되는 것인 주사가능 제제.
  5. 제2항에 있어서, 젤라틴이 돼지 유형 I 알파 I 콜라겐 또는 재조합 인간 유형 I 알파 I 콜라겐으로부터 유래되는 것인 주사가능 제제.
  6. 제1항에 있어서, BRC가 선택된 신장 세포 (SRC) 군집인 주사가능 제제.
  7. 제6항에 있어서, BRC 또는 SRC 군집이 개시 신장 세포 군집과 비교하였을 때, 1종 이상의 세포 군집을 더 큰 백분율로 함유하며, 1종 이상의 다른 세포 군집은 없거나 결핍되어 있는 것인 주사가능 제제.
  8. 제7항에 있어서, BRC 또는 SRC 군집에 요세관 신장 세포가 보강되는 것인 주사가능 제제.
  9. 제8항에 있어서, BRC 또는 SRC 군집이 요세관 신장 세포를 표시하는 세포 형태구조를 나타내는 것인 주사가능 제제.
  10. 제8항에 있어서, BRC 또는 SRC 군집이 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커의 표현형 발현을 특징으로 하는 것인 주사가능 제제.
  11. 제10항에 있어서, 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커가 CK18 및/또는 GGT1을 포함하는 것인 주사가능 제제.
  12. 제8항에 있어서, BRC 또는 SRC 군집이 생존가능하며 대사적으로 활성인 신장 세포를 표시하는 세포 성장 동역학을 나타내는 것인 주사가능 제제.
  13. 제12항에 있어서, BRC 또는 SRC 군집이 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커의 표현형 발현을 특징으로 하는 것인 주사가능 제제.
  14. 제13항에 있어서, 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커가 VEGF 및/또는 KIM-1을 포함하는 것인 주사가능 제제.
  15. 제12항에 있어서, BRC 또는 SRC 군집이 LAP 및/또는 GGT 효소 활성을 특징으로 하는 것인 주사가능 제제.
  16. 제1항에 있어서, 젤라틴이 약 0.5 % 내지 약 1 % (w/v)로 제제 중에 존재하는 것인 주사가능 제제.
  17. 제1항에 있어서, 젤라틴이 약 0.8 % 내지 약 0.9 % (w/v)로 제제 중에 존재하는 것인 주사가능 제제.
  18. 제1항에 있어서, 세포 생존력 작용제를 추가로 포함하는 주사가능 제제.
  19. 제18항에 있어서, 세포 생존력 작용제가 항산화제, 산소 캐리어, 성장 인자, 세포-안정화 인자, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 항-염증 작용제, 면역억제제, 혈관생성 인자 및 상처 치유 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제를 포함하는 것인 주사가능 제제.
  20. 제18항에 있어서, 세포 생존력 작용제가 인간 혈장, 인간 혈소판 용해물, 소 태아 혈장 또는 소 뇌하수체 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 주사가능 제제.
  21. a) 인간 또는 동물 기원의 탈세포화된 신장, 또는 3차원 바이오프린팅을 통하여 구조적으로 조작된 세포-안정화 생체재료, 및
    b) 생체활성 신장 세포 (BRC) 군집
    을 포함하는 이식가능 제제.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 세포 군집에 의해 분비되는 생성물을 추가로 포함하는 제제.
  23. a) 유형 I 알파 I 콜라겐으로부터 유래되는 약 0.88 % (w/v)의 젤라틴을 포함하는 생체재료, 및
    b) SRC 군집을 포함하는 조성물
    을 포함하며, 여기서 SRC 군집은 요세관 신장 세포의 보강된 군집을 포함하고, 약 1.04 g/mL를 초과하는 밀도를 갖는 것인 주사가능 제제.
  24. i) 공여자/수용자로부터 신장 피질 조직을 수득하는 단계; ii) 효소 분해에 의해 신장 조직으로부터 신장 세포를 단리하고, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 신장 세포를 증식시키는 단계; iii) 수확된 신장 세포를 밀도 경계 또는 밀도 계면 또는 단일 단계 불연속 구배를 가로지르는 분리에 적용하여 SRC 군집을 수득하는 단계; 및 iv) 생체활성 세포를 젤라틴-기재 수화젤 생체재료와 재구성하는 단계이며, 여기서 젤라틴은 유형 I 알파 I 콜라겐으로부터 유래되는 것인 단계를 포함하는, 온도-민감성 세포-안정화 생체재료 및 생체활성 신장 세포 혼합물을 포함하는 주사가능 제제의 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, 선택된 신장 세포가 요세관 신장 세포의 보강된 군집을 포함하며, 약 1.04 g/mL를 초과하는 밀도를 갖는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 수확된 신장 세포가 밀도 경계 또는 밀도 계면 또는 연속 또는 불연속 단일 단계 또는 다단계 밀도 구배를 가로지르는 분리 전에, 저산소 배양 조건에 노출되는 것인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 신장 세포에 요세관 신장 세포가 보강되는 것인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 세포 증식 동안 신장 세포의 세포 형태구조를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 신장 세포가 요세관 신장 세포를 표시하는 세포 형태구조를 나타내는 것인 방법.
  30. 제24항에 있어서, 각 세포 계대에서 신장 세포의 세포 성장 동역학을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 대사 활성의 평가를 위해 시약을 사용하여 신장 세포 계수 및 생존율을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제24항에 있어서, 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커의 표현형 발현에 대하여 신장 세포를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 1종 이상의 생존력 및/또는 기능성 마커가 VEGF 및/또는 KIM-1을 포함하는 것인 방법.
  34. 제24항에 있어서, 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커의 표현형 발현에 대하여 신장 세포를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 1종 이상의 요세관 상피 세포 마커가 CK18 및/또는 GGT1을 포함하는 것인 방법.
  36. 제24항에 있어서, 유전자 발현 프로파일링 또는 효소 활성의 측정에 의해 신장 세포 기능성을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 측정되는 효소 활성이 LAP 및/또는 GGT에 대한 것인 방법.
  38. 제24항에 있어서, 신장 세포가 자가 또는 동종이형 신장 샘플로부터 유래되는 것인 방법.
  39. 제24항에 있어서, 신장 세포가 비-자가 신장 샘플로부터 유래되는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 샘플이 신장 생검에 의해 수득되는 것인 방법.
  41. 제24항에 있어서, SRC가 26-30 ℃에서 액화된 젤라틴 용액에 재현탁되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, SRC가 100 x 106개 세포/ml의 SRC 농도를 달성하도록 충분한 젤라틴 용액에 재현탁되는 것인 방법.
  43. 제24항에 있어서, SRC/젤라틴 용액을 빠르게 냉각시킴으로써 SRC가 저장시 젤에 현탁되어 유지되게 되도록 생체재료를 안정화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 제제가 2-8 ℃의 온도 범위에서 저장되는 것인 방법.
  45. 제42항에 있어서, 세포 생존력 작용제의 첨가를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 세포 생존력 작용제가 항산화제, 산소 캐리어, 성장 인자, 세포-안정화 인자, 면역조절 인자, 세포 동원 인자, 세포 부착 인자, 항-염증 작용제, 면역억제제, 혈관생성 인자 및 상처 치유 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제를 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 세포 생존력 작용제가 인간 혈장, 인간 혈소판 용해물, 소 태아 혈장 또는 소 뇌하수체 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  48. 제1항에 따른 제제를 대상체에게 주사하는 것을 포함하며, 여기서 제제는 18 내지 30 게이지 바늘을 통하여 주사되는 것인, 대상체에서의 신장 질환의 치료 방법.
  49. 제48항에 있어서, 바늘이 약 27 게이지, 약 26 게이지, 약 25 게이지, 약 24 게이지, 약 23 게이지, 약 22 게이지, 약 21 게이지 또는 약 20 게이지의 직경을 갖는 것인 방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3962500A4 (en) * 2019-05-02 2023-06-07 Timothy A. Bertram TREATMENT OF KIDNEY DISEASE IN SUBJECTS WITH KIDNEY AND/OR URINARY TRACT ABNORMALITIES
WO2020264128A1 (en) * 2019-06-27 2020-12-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions related to printed cellular niches for preserving and controlling synthetic microbial consortia
KR102160587B1 (ko) * 2019-12-24 2020-09-28 주식회사 팡세 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물
WO2021152578A1 (en) * 2020-01-28 2021-08-05 Kidneycure Ltd Process for kidney cell manufacture and treatment
TWI779450B (zh) * 2021-01-04 2022-10-01 國立清華大學 去細胞的細胞外基質及其製備方法與用途
JP2023040935A (ja) * 2021-09-10 2023-03-23 日機装株式会社 腎細胞の保管方法及び輸送方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6479064B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
KR101913874B1 (ko) * 2010-11-10 2018-10-31 인리젠 장기 확대를 위한 주사가능 제제
EP2892577B1 (en) * 2012-09-04 2019-01-30 Anthrogenesis Corporation Methods of tissue generation
WO2014066699A1 (en) * 2012-10-24 2014-05-01 Tengion, Inc. Renal cell populations and uses thereof
CN106421917A (zh) * 2016-11-08 2017-02-22 华南生物医药研究院 制备用于软骨损伤修复的组合物的方法

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