CN110662563A - 可注射细胞和支架组合物 - Google Patents

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Abstract

本文中特别提供了含有活性剂，诸如生物活性细胞群体的治疗配制剂和其制备和使用方法。

Description

可注射细胞和支架组合物
对相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月31日提交的美国临时专利申请No.62/480,166的优先权权益，该专利申请的全部内容通过引用完整并入本文。
发明领域
本发明特别涉及用于治疗肾疾病的细胞、组合物和方法。
发明背景
慢性肾疾病(CKD)在美国影响了超过1900万人，并经常是涉及肥胖、糖尿病和高血压——也在全球范围内上升的三种疾病的代谢病症的结果(United States Renal DataSystem:Costs of CKD and ESRD.Bethesda,MD编,National Institutes of Health,National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases，2007年，第223-238页)。肥胖、高血压和血糖控制不良都显示是肾损伤的独立风险因素，引起肾小球和肾小管病变并导致蛋白尿和肾过滤功能的其它系统可检测改变(Aboushwareb等人,WorldJ Urol,26:295-300,2008；Amann,K.等人,Nephrol Dial Transplant,13:1958-66,1998)。
传统上，用于治疗慢性肾衰竭的临床方法包括恢复肾过滤和尿液产生的透析和肾移植和恢复块(erythroid mass)的重组EPO或EPO类似物的系统性递送。透析为中至晚期肾衰竭患者提供存活益处，但是引起重大的生活质量问题。对于较晚期肾衰竭的患者，肾移植物是非常期望的(并且通常是唯一的)选择，但是高质量的供体肾的供应不能满足肾衰竭人群的需求。用重组EPO的推注施用以治疗贫血现在已经与严重的下游健康风险联系起来，导致FDA对药物发出黑匣子警告，并且有必要进一步研究替代治疗以恢复此种人群的红系稳态。
最近，已描述了涉及组织工程应用的新治疗方案，其在此患者群体中提供实质性和持久性的肾功能增强，减缓疾病进展并改善生活质量。分离的生物活性肾细胞代表了用于治疗慢性肾疾病的基于候选细胞的再生疗法(Presnell等人WO/2010/056328；Ilagan等人PCT/US2011/036347)。然而，此类基于细胞的疗法需要持续的生理上相关的生物活性，以在离体且在没有标准细胞培养环境的情况下维持。在没有生物学支持配制剂或载体的情况下，将生物活性细胞包装为基于细胞的治疗产品时，产品效力可能丧失。因此，需要适合于将生物活性剂，诸如例如用于组织工程和再生医学应用的生物活性细胞递送至有需要的受试者的治疗配制剂。将分离的生物活性肾和/或非肾细胞配制成新肾增强剂(neo-kidneyaugment，NKA)可以提供增强的细胞稳定性，从而延长产品的货架期，改善运输期间以及对目标器官或构建体递送以进行临床应用期间的稳定性。
发明概述
一般而言，本公开内容特别涉及用于再生、修复和/或挽救肾结构和/或功能的组合再生构建体，其由与基质、凝胶或支架复合的生物活性肾和/或非肾细胞活性组合物构成，所述基质、凝胶或支架为生物活性细胞群体提供支持性的三维环境，从而促进作为改善肾疾病的治疗产品的细胞级份的生物学效力的延长。
一方面，本文中提供了可注射配制剂。在某些实施方案中，配制剂包含a)温度敏感性细胞稳定化生物材料，和b)生物活性肾细胞(BRC)群体。在某些实施方案中，温度敏感性细胞稳定化生物材料是水凝胶，所述水凝胶(i)在约8℃以下维持基本上固体状态，其中所述基本上固体状态是凝胶状态，(ii)在约环境温度以上维持基本上液体状态，并且(iii)具有约8℃和约环境温度以上之间的固体至液体过渡状态。在某些实施方案中，水凝胶包含重组起源的胞外基质蛋白，衍生自源自肾或其它组织或器官的胞外基质，或包含明胶。
在某些实施方案中，明胶衍生自I型alpha I胶原。在某些实施方案中，BRC(例如，选定的肾细胞群体)用所述生物材料包被，在所述生物材料上沉积，在所述生物材料中嵌入，在所述生物材料中接种或包埋。在某些实施方案中，生物材料配置为多孔泡沫、凝胶、液体、珠或固体。
在某些实施方案中，明胶衍生自猪I型，alpha I胶原蛋白或重组人I型，alpha I胶原蛋白。
在某些实施方案中，BRC是选定的肾细胞(SRC)群体。在某些实施方案中，与起始肾细胞群体相比，BRC或SRC群体含有更大百分比的一个或多个细胞群体，并且缺乏或缺少一个或多个其它细胞群体。在某些实施方案中，BRC或SRC群体富含肾小管肾细胞。在某些实施方案中，BRC或SRC群体表现出指示肾小管肾细胞的细胞形态。在某些实施方案中，BRC或SRC群体以一种或多种肾小管上皮细胞标志物的表型表达为特征。在某些实施方案中，一种或多种肾小管上皮细胞标志物包括CK18和/或GGT1。在某些实施方案中，BRC或SRC群体表现出指示存活的且有代谢活性的肾细胞的细胞生长动力学。在某些实施方案中，BRC或SRC群体以一种或多种存活力和/或功能性标志物的表型表达为特征。在某些实施方案中，一种或多种存活力和/或功能性标志物包含VEGF和/或KIM-1。在某些实施方案中，BRC或SRC群体以LAP和/或GGT酶促活性为特征。
在某些实施方案中，明胶在所述配制剂中以约0.5％至约1％(w/v)存在。在某些实施方案中，明胶在所述配制剂中以约0.8％至约0.9％(w/v)存在。在某些实施方案中，所述配制剂进一步包含细胞存活力剂。在某些实施方案中，细胞存活力剂包括选自下组的试剂：抗氧化剂、氧载体、生长因子、细胞稳定化因子、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子和伤口愈合因子。在某些实施方案中，细胞存活力剂选自下组：人血浆、人血小板裂解物、牛胎血浆或牛垂体提取物。
在某些实施方案中，本文提供的配制剂包含由肾细胞群体分泌的产物。
一方面，本文中提供了可植入配制剂。在某些实施方案中，配制剂包含：a)人或动物起源的脱细胞化肾或已经经由三维生物打印在结构上进行了工程化改造的细胞稳定化生物材料，和b)BRC群体。
一方面，本文提供了可注射配制剂。在某些实施方案中，配制剂包含a)包含约0.88％(w/v)明胶的生物材料，其中所述明胶衍生自I型，alpha I胶原，和b)包含SRC群体的组合物。在某些实施方案中，SRC群体包含肾小管肾细胞的富集群体且具有大于约1.04g/mL的密度。
一方面，本文提供用于制备包含温度敏感性细胞稳定化生物材料和生物活性肾细胞混合物的可注射配制剂的方法，所述方法包括以下步骤：i)从供体/接受者获得肾皮质组织；ii)通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，并使用标准细胞培养技术扩增所述肾细胞；iii)使收获的肾细胞跨越(across)密度边界或密度界面或单步不连续梯度进行分离以获得SRC群体；和iv)用基于明胶的水凝胶生物材料重建生物活性细胞，其中明胶衍生自I型alpha I胶原蛋白。
在某些实施方案中，选定的肾细胞包含肾小管肾细胞的富集群体并且具有大于约1.04g/mL密度。
在某些实施方案中，在跨越密度边界或密度界面或连续或不连续单步或多步密度梯度的分离之前将收获的肾细胞暴露于低氧培养条件。
在某些实施方案中，肾细胞富含肾小管肾细胞。
在某些实施方案中，方法进一步包括在细胞扩增期间监测所述肾细胞的细胞形态。
在某些实施方案中，肾细胞表现出指示肾小管肾细胞的细胞形态。
在某些实施方案中，方法进一步包括在每次细胞传代时监测所述肾细胞的细胞生长动力学。在某些实施方案中，方法进一步包括使用用于评估代谢活性的试剂来监测肾细胞计数和存活力。方法还包括对所述肾细胞监测一种或多种存活力和/或功能性标志物的表型表达。
在某些实施方案中，一种或多种存活力和/或功能性标志物包括VEGF和/或KIM-1。
在某些实施方案中，方法进一步包括对所述肾细胞监测一种或多种肾小管上皮细胞标志物的表型表达。在某些实施方案中，一种或多种肾小管上皮细胞标志物包括CK18和/或GGT1。
在某些实施方案中，方法进一步包括通过基因表达序型分析(gene expressionprofiling)或酶促活性的测量来监测肾细胞功能性。在某些实施方案中，测量的酶促活性是针对LAP和/或GGT。
在某些实施方案中，肾细胞衍生自自体或同种异体肾样品。在某些实施方案中，肾细胞衍生自非自体肾样品。在某些实施方案中，通过肾活组织检查获得所述样品。
在某些实施方案中，将所述SRC重悬于26-30℃的液化明胶溶液中。在某些实施方案中，将所述SRC重悬于足够的明胶溶液中以达到100x106个细胞/ml的SRC浓度。
在某些实施方案中，方法进一步包括快速冷却所述SRC/明胶溶液以稳定化所述生物材料，使得所述SRC在贮存时将保持悬浮于所述凝胶中。
在某些实施方案中，在2-8℃的温度范围贮存所述配制剂。
在某些实施方案中，该方法包括添加细胞存活力剂。在某些实施方案中，所述细胞存活力剂包括选自下组的试剂：抗氧化剂、氧载体、生长因子、细胞稳定化因子、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子和伤口愈合因子。
在某些实施方案中，细胞存活力剂选自下组：人血浆、人血小板裂解物、牛胎血浆或牛垂体提取物。
一方面，本文提供了治疗受试者中的肾疾病的方法，该方法包括将本文公开的配制剂、组合物或细胞群体注射入受试者中。在某些实施方案中，经由18至30号针头注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于20号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于21号的针头注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于22号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于23号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于24号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于25号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于26号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于27号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于28号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由小于29号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约20号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约21号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约22号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约23号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约24号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约25号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约26号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约27号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约28号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。在某些实施方案中，经由约29号的针注射用于细胞群体的配制剂，组合物。
一方面，本公开内容涉及可注射配制剂，其包含温度敏感性细胞稳定化生物材料和包含生物活性肾细胞群体(BRC)的组合物。在某些实施方案中，可注射配制剂的生物活性肾细胞群体是跨越密度边界、屏障或界面分离扩增肾细胞(例如，单步不连续密度梯度分离)之后获得的分离选定的肾细胞(SRC)群体。在实施方案中，SRC可以表现出大于约1.04g/mL的浮力密度。在实施方案中，SRC可以表现出大于约1.0419g/mL的浮力密度。在实施方案中，SRC可以表现出大于约1.045g/mL的浮力密度。在某些实施方案中，可注射配制剂的BRC或SRC包含与起始肾细胞群体相比更大百分比的一个或多个细胞群体并且缺乏或缺少一个或多个其它细胞群体。在某些实施方案中，BRC或SRC可以是肾小管肾细胞富集。BRC或SRC可以表现出指示肾小管肾细胞的细胞形态和/或可以通过一种或多种肾小管上皮细胞标志物的表型表达为特征。在一个具体的实施方案中，一种或多种肾小管上皮细胞标志物包括CK18和/或GGT1。
在某些实施方案中，可注射配制剂的BRC或SRC可以表现出指示存活的且有代谢活性的肾细胞的细胞生长动力学。在某些实施方案中，BRC或SRC以一种或多种存活力和/或功能性标志物的表型表达为特征。在一个具体的实施方案中，一个或多个存活力和/或功能性标志物包括VEGF和/或KIM-1。在可注射配制剂的某些实施方案中，通过基因表达序型分析或酶促活性的测量进一步建立BRC或SRC功能性。测量的酶促活性可以针对LAP和/或GGT。在一些实施方案中，可注射配制剂的BRC或SRC衍生自自体或同种异体肾样品。在一些其它实施方案中，BRC或SRC衍生自非自体肾样品。可以通过肾活组织检查获得样品。
在一些实施方案中，可注射配制剂的温度敏感性细胞稳定化生物材料在约8℃以下维持基本上固体状态，在约环境温度以上维持基本上液体状态。在某些实施方案中，生物材料可以包含约8℃和约环境温度以上之间的固体至液体过渡状态。基本上固体状态可以是凝胶状态。在某些实施方案中，生物材料包括基于明胶的水凝胶。明胶可以以约0.5％至约1％(w/v)存在于配制剂中。在具体的实施方案中，明胶以约0.8％至约0.9％(w/v)存在于配制剂中。
在一个或多个实施方案中，可注射配制剂的生物活性细胞基本上均匀地分散在整个细胞稳定化生物材料的体积中。在一些实施方案中，可注射配制剂进一步包含细胞存活力剂。细胞存活力剂可以包括选自下组的试剂：抗氧化剂、氧载体、生长因子、细胞稳定化因子、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子和伤口愈合因子。在具体的实施方案中，细胞存活力剂可以选自下组：人血浆、人血小板裂解物、牛胎血浆或牛垂体提取物。在某些实施方案中，可注射配制剂包含含有约0.88％(w/v)明胶的生物材料和包含生物活性肾细胞群体(BRC)的组合物，其中BRC包含肾小管肾细胞的富集群体且具有大于约1.04g/mL的密度。在某些实施方案中，可注射配制剂包含含有约0.88％(w/v)的明胶的生物材料和包含生物活性肾细胞群体(BRC)的组合物，其中所述BRC包含肾小管肾细胞的富集群体且具有大于约1.0419g/mL或约1.045g/mL的密度。
另一方面，本公开内容涉及用于制备包含温度敏感性细胞稳定化生物材料和生物活性肾细胞混合物的可注射配制剂的方法，所述方法包括以下步骤：i)从供体/接受者获得肾皮质组织；ii)通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，并使用标准细胞培养技术扩增所述肾细胞；iii)通过跨越密度边界、屏障或界面离心使收获的肾细胞进行分离以获得选定的肾细胞(SRC)；并且iv)用基于明胶的水凝胶生物材料重建生物活性细胞。在一些实施方案中，选定的肾细胞可以包含肾小管肾细胞的的富集群体且具有大于约1.04g/mL的密度。选定的肾细胞可以包含肾小管肾细胞的富集群体且具有大于约1.0419g/mL或约1.045g/mL的密度。在某些实施方案中，通过在跨越密度边界、屏障或界面离心进行分离之前将收获的肾细胞暴露于低氧培养条件。
在某些实施方案中，用于制备可注射配制剂的方法进一步包括在细胞扩增期间监测肾细胞的细胞形态。选定的肾细胞表现出指示肾小管肾细胞的细胞形态。在某些实施方案中，方法包括在每次细胞传代时监测肾细胞的细胞生长动力学。在又一个实施方案中，方法包括使用用于评估代谢活性的试剂监测肾细胞计数和存活力。在一些实施方案中，方法包括对所述肾细胞监测一种或多种存活力和/或功能性标志物的表型表达。一种或多种存活力和/或功能性标志物可以包含VEGF和/或KIM-1。在其它实施方案中，该方法包括对所述肾细胞监测一种或多种肾小管上皮细胞标志物的表型表达。一种或多种肾小管上皮细胞标志物可以包含CK18和/或GGT1。该方法还可以包括通过基因表达序型分析或酶促活性测量来监测肾细胞功能。测量的酶促活性可以包括LAP和/或GGT活性。
在一些实施方案中，用于制备可注射配制剂的方法中的肾细胞衍生自自体或同种异体肾样品。在某些实施方案中，肾细胞衍生自非自体肾样品。可以通过肾活组织检查获得肾样品。
在某些实施方案中，将用于制备可注射配制剂的方法中的SRC重悬于26-30℃的液化明胶溶液中。可以将SRC重悬于足够的明胶溶液中以达到100x106个细胞/ml的SRC浓度。在某些实施方案中，方法包括快速冷却SRC/明胶溶液以稳定化生物材料，使得SRC在贮存时将保持悬浮于凝胶中。配制剂可以在2-8℃的温度范围贮存。
在又一个实施方案中，用于制备可注射配制剂的方法包括添加细胞存活力剂。细胞存活力剂可以是选自下组的试剂：抗氧化剂、氧载体、生长因子、细胞稳定化因子、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子和伤口愈合因子。在某些实施方案中，细胞存活力剂选自下组：人血浆、人血小板裂解物、牛胎血浆或牛垂体提取物。
下面公开了其它方面和实施方案。预期本文公开的每个实施方案可应用于每个其它公开的实施方案。因此，本文描述的各种元件的所有组合都在本公开内容的范围内。
附图简述
图1：培养中的人肾细胞形态。
图2：通过跨越密度边界的离心进行的SRC显带。
图3：用于明胶化的明胶溶液温度曲线。
图4：NKA胶凝期间的旋转时间。
图5：人SRC群体中肾细胞标志物的表达。
图6：人SRC的酶促活性。
图7：在冷温度的3天保持时间内的SRC沉降。
图8：使用共聚焦显微术得到的NKA中的SRC分布。
图9：跨越注射器的NKA取样
图10：跨越注射器的NKA中的总活细胞分布。
图11：配制后NKA中的SRC分散。
图12：3天保持后跨越注射器的NKA中的SRC分散。
图13：冷藏时通过锥虫蓝得到的NKA存活力的稳定性。
图14：冷藏时通过CK18得到的NKA表型的稳定性。
图15：冷藏时通过GGT1得到的NKA表型的稳定性。
图16：冷藏时通过PrestoBlue代谢得到的NKA的稳定性。
图17：冷藏时通过VEGF得到的NKA功能的稳定性。
图18：递送套管与NKA的相容性。
图19：NKA递送和植入的显示。
图20：整个NKA生产过程的非限制性示例的流程图。
图21A-D：提供图20中描绘的非限制性示例过程的进一步细节的流程图。
发明详述
现在将详细提及本发明的某些实施方案。尽管将结合实施方案描述本公开内容的各方面，但是应当理解，它们并不旨在将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可以包括在由权利要求书限定的本发明的范围内的所有替代、修改和等同方案。本领域技术人员将认识到许多与本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料，它们可用于实施本发明。本发明决不限于所描述的方法和材料。
整个公开内容中引用的所有参考文献均通过引用明确地完整并入本文。若并入的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则应以本申请为准。
1.定义
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Principles of Tissue Engineering,第3版(R Lanza,RLanger,&J Vacanti编),2007为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。本领域技术人员将认识到许多与本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料，其可用于实施本发明。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
当在本说明书和权利要求书中使用时，词语“包含”和“包括”旨在规定所陈述的特征、整数、组分或步骤的存在，但它们不排除一个或多个其它特征、整数、组分、步骤或它们的组的存在或添加。
如本文所用，术语“细胞群体”是指通过直接从合适的组织来源(通常从哺乳动物)中分离获得的许多细胞。例如，细胞群体可以包括肾细胞群体及其混合物。分离的细胞群体可随后在体外培养。本领域普通技术人员将理解用于分离和培养供本公开内容使用的细胞群体的各种方法以及适合于本公开内容使用的细胞群体中的各种细胞。细胞群体可以是从器官或组织，例如肾衍生的未分级的异质细胞群体或富集的同质的细胞群体。例如，异质细胞群体可以从组织活组织检查或整个器官组织中分离。或者，异源细胞群体可以衍生自哺乳动物细胞的体外培养物，从组织活组织检查或整个器官组织建立。未分级的异质细胞群体也可以称为非富集的细胞群体。在某些实施方案中，细胞群体包含生物活性细胞。与未分级的异质细胞群体相比，同质细胞群体包含更大比例的相同类型的细胞，它们共享共同表型或具有相似物理特性。例如，可以从异质肾细胞群体中分离，提取或富集同质细胞群体。在某些实施方案中，通过跨越密度边界、屏障或界面离心分离异质细胞悬浮液来以细胞级分形式获得同质细胞群体。在某些实施方案中，使用异质细胞悬浮液的连续或不连续(单步或多步)密度梯度分离以细胞级份形式获得同质细胞群体。在某些实施方案中，将源自肾的同质或异质细胞群体与源自肾以外的组织或器官(没有进一步限制)的同质或异质细胞群体混合。
如本文所用，术语“生物活性的”是指“拥有生物学活性”，例如药理或治疗活性。在某些实施方案中，生物活性是增强肾功能和/或对肾稳态的影响。在某些实施方案中，生物学活性是但不限于止痛；抗病毒；抗炎；抗肿瘤；免疫刺激；免疫调节；增强细胞存活力、抗氧化、氧载体、细胞募集、细胞附着、免疫抑制、血管生成、伤口愈合活性、宿主干细胞或祖细胞动员、细胞增殖、刺激细胞迁移至损伤部位、改善细胞和组织纤维化、干扰上皮-间充质信号传导级联、细胞因子、生长因子、蛋白质、核酸、外来体、微泡或其任何组合的分泌。
如本文所用，术语“生物活性肾细胞”或“BRC”是指当施用于受试者的肾中时具有以下一种或多种性质的肾细胞：减轻(例如减慢或停止)慢性肾疾病或其症状的恶化或进展的能力、增强肾功能的能力、影响(改善)肾稳态的能力和促进肾组织或肾的愈合、修复和/或再生的能力。在实施方案中，这些细胞可以包括功能性肾小管细胞(例如，基于肌酸酐排泄和蛋白质保留的改善)、肾小球细胞(例如，基于蛋白质保留的改善)、血管细胞和皮质肾小管交界的其它细胞。在实施方案中，从来自肾组织的肾细胞的分离和扩增获得BRC。在实施方案中，使用选择生物活性细胞的方法从来自肾组织的肾细胞的分离和扩增获得BRC。在实施方案中，BRC对肾具有再生作用。在实施方案中，BRC包含选定的肾细胞(SRC)，基本上由选定的肾细胞(SRC)组成或由选定的肾细胞(SRC)组成。在实施方案中，BRC是SRC。
在实施方案中，SRC是从来自合适的肾组织来源的肾细胞的分离和扩增获得的细胞，其中与起始肾细胞群体相比，SRC包含更高百分比的一种或多种细胞类型并且缺乏一种或多种其它细胞类型或具有更低百分比的一种或多种其它细胞类型。在实施方案中，与起始肾细胞群体相比，SRC含有增加比例的BRC。在实施方案中，SRC群体是富集了特定生物活性成分和/或细胞类型和/或消减了特定的非活性和/或不希望的成分或细胞类型的肾细胞的分离群体，用于治疗肾疾病，即提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。与起始群体相比，SRC提供卓越的治疗和再生结果。在实施方案中，经由肾活组织检查从患者的肾皮质组织获得SRC。在实施方案中，SRC基于它们的一种或多种标志物的表达来选择(例如，通过荧光激活细胞分选或“FACS”)。在实施方案中，基于细胞类型上的一种或多种标志物的表达来对SRC消减(例如，通过荧光激活细胞分选或“FACS”)一种或多种细胞类型。在实施方案中，从生物活性肾细胞群体选择SRC。在实施方案中，通过扩增的肾细胞的密度梯度分离来选择SRC。在实施方案中，通过跨越密度边界、屏障或界面的离心或单步不连续步骤梯度分离分离扩增的肾细胞来选择SRC。在实施方案中，通过对已经在低氧条件下培养的扩增肾细胞进行连续或不连续密度梯度分离来选择SRC。在实施方案中，通过已经在低氧条件下培养至少约8、12、16、20或24小时的扩增肾细胞的密度梯度分离来选择SRC。在实施方案中，通过已经在低氧条件下培养的扩增肾细胞的跨越密度边界、屏障或界面的离心分离来选择SRC。在实施方案中，通过跨越密度边界、屏障或界面(例如单步不连续密度梯度分离)的离心分离已经在低氧条件下培养至少约8、12、16、20或24小时的扩增肾细胞来选择SRC。在实施方案中，SRC主要由肾小管细胞组成。在实施方案中，SRC中可以存在其它实质细胞(例如，血管)和基质细胞(例如，收集导管)。在实施方案中，SRC群体中小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是血管细胞。在实施方案中，SRC群体中小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是收集导管细胞。在实施方案中，SRC群体中小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是血管或收集导管细胞。
术语“天然器官”应指活体受试者的器官。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可以患有与该特定器官相关的疾病。
术语“天然肾”应指活体受试者的肾。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可以患有肾疾病。
术语“再生效果”应指为诸如肾的天然器官提供益处的效果。效果可包括但不限于对天然器官的损失程度降低或天然器官功能的改善、恢复或稳定化。肾损伤可以是纤维化、炎症、肾小球肥大等形式，并且与受试者的天然器官有关的疾病有关。
如本文所用，术语“混合物”是指自未分级的异质细胞群体衍生的两个或更多个分离的富集的细胞群体的组合。根据某些实施方案，本公开内容的细胞群体是肾细胞群体。在替代实施方案中，细胞群体可以是肾细胞群体和非肾细胞群体的混合物，包括但不限于间充质干细胞和内皮祖细胞。
“富集的”细胞群体或制品是指自起始器官细胞群体(例如，未分离的异质细胞群体)衍生的细胞群体，其包含的特定细胞类型的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。例如，起始肾细胞群体可以富集感兴趣的第一、第二、第三、第四、第五等细胞群体。如本文所用，术语“细胞群体”、“细胞制备”和“细胞表型”可互换使用。
如本文所用，术语“低氧”培养条件是指相对于细胞在大气氧水平下(约21％)进行培养的标准培养条件，使细胞在培养系统中的可用氧水平降低的培养条件。非低氧条件在本文中称为正常或常氧培养条件。
如本文所用，术语“氧可微调”是指细胞基于可用于细胞的氧量来调节基因表达(向上或向下)的能力。
如本文所用，术语“生物材料”是指天然或合成的生物相容性材料，其适合于引入到支持处于存活状态的选定生物活性细胞的活组织中。天然生物材料是由活系统制备或源自活系统的材料。合成生物材料是不由活系统制备或不直接源自活系统的材料，而是通过本领域普通技术人员公知的特定化学程序和方案合成或构成。本文公开的生物材料可以是天然和合成生物相容性材料的组合。如本文所用，生物材料包括例如聚合物基质和支架。本领域普通技术人员将理解，生物材料可以配置成各种形式，例如，作为多孔泡沫、凝胶、液体、珠、固体，并且可以包括一种或多种天然或合成的生物相容性材料。在某些实施方案中，生物材料是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
如本文所用，生物材料包括例如衍生自人或动物起源的现有肾的胞外基质，其中天然细胞群体已经经由施加洗涤剂和/或本领域普通技术人员已知的其它化学试剂而消除。在某些实施方案中，生物材料是溶液的液体形式，其能够变成水凝胶，并且通过应用本领域技术人员已知的三维生物打印方法而在具有或不具有某些细胞群体的情况下分层。在某些实施方案中，生物材料配置为模拟脱细胞化肾的三维分形构造。
术语“改良释放”或等同术语“受控释放”、“延迟释放”或“缓慢释放”是指在对个体施用后随时间或超过一个时间点释放活性剂如生物活性细胞的配制剂。可以根据配制剂在期望的时间范围内(例如几分钟、几小时、几天、几周或更长时间)发生的活性剂的改良释放与标准配制剂形成对比，在标准配制剂中基本上整个剂量单位在施用后立即可用。对于组织工程和再生医学应用，优选的改良释放配制剂在局部施用(例如，将活性剂直接施用于实体器官)后的多个时间点提供活性剂的释放。例如，生物活性细胞的改良释放配制剂将在施用时立即提供细胞的初始释放，并在稍后的时间提供细胞的第二次释放。活性剂的第二次释放的时间延迟可以是初始施用后的几分钟、几小时或几天。通常，延迟释放的时间段对应于活性剂的生物材料载体失去其结构完整性所花费的时间段。活性剂的延迟释放一旦此类完整性开始降解就开始，并到完整性完全失效时完成。本领域普通技术人员将理解其它合适的释放机制。
术语“构建体”或“配制剂”是指沉积在由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料构成的支架或基质表面上或表面中的一种或多种细胞群体。一种或多种细胞群体可以用生物材料包被，在生物材料上沉积，在生物材料中包埋，附着于生物材料，在生物材料中接种或俘获，所述生物材料由一种或多种合成或天然存在的生物相容性生物材料、聚合物、蛋白质或肽构成。在某些实施方案中，天然存在的生物材料是人或动物起源的脱细胞化的肾。在某些实施方案中，已经通过三维生物打印对生物材料进行了结构工程化改造。一种或多种细胞群体可以在体外或体内与生物材料或支架或基质组合。可以选择用于产生构建体或配制剂的一种或多种生物材料以指导，有利于或允许构建体的细胞组分的分散和/或与内源宿主组织的整合，或指导，有利于或允许构建体或配制剂的细胞组分的存活、植入、耐受性或功能性能。在某些实施方案中，选择用于形成支架/生物材料的一种或多种生物相容性材料以引导，有利于或允许其上沉积的至少一种细胞群体的多细胞三维构造的形成。在某些实施方案中，生物材料指导限定的三维细胞聚集体或类器官的组装，所述三维细胞聚集体或类器官重演天然肾组织的各个方面，包括但不限于构造极性。在某些实施方案中，生物材料指导限定的管状结构的组装，该管状结构重演包括腔在内的天然肾组织的各个方面。在某些实施方案中，生物材料促进或有利于蛋白质、核酸和膜结合囊泡从其中沉积的细胞群体中的分泌。通常，还可以选择用于产生构建体的一种或多种生物材料，以模拟或重演代表这些细胞群体来源的初始生物环境的天然肾或肾实质内特定三维构造或环境生态位的各方面。认为这些细胞群体来源的初始生物生态位的再创建进一步促进或有利于细胞存活力和效力。
术语“细胞聚集体”或“球状体”指与作为单层生长相反经培养以允许3D生长的细胞的聚集体或装配体。注意术语“球状体”并不意味着聚集体是几何球体。聚集体可以是高度构造的，具有良好限定的形态和极性，或者它可以是未构造的块；它可以包括单一细胞类型或超过一种细胞类型。细胞可以是原代隔离群，或永久细胞系，或两者的组合。此定义中包括类器官和器官型培养物。在某些实施方案中，球状体(例如，细胞聚集体或类器官)在旋转瓶中形成。在某些实施方案中，球状体(例如，细胞聚集体或类器官)在3维基质中形成。
术语“环境温度”是指本公开内容的配制剂将被施用于受试者的温度。通常，环境温度是温度受控环境的温度。环境温度范围为约18℃至约30℃。在某些实施方案中，环境温度为约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃。
术语“水凝胶”在本文中用于指当有机聚合物(天然或合成)通过共价键、离子键或氢键交联以创建三维开放晶格结构而形成的物质，该结构捕获水分子以形成凝胶。可以用来形成水凝胶的材料的例子包括离子交联的多糖如藻酸盐、聚膦嗪和聚丙烯酸酯，或嵌段共聚物如PluronicsTM或TetronicsTM，通过温度或pH交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。本文所用的水凝胶优选是可生物降解的基于明胶的水凝胶。
术语“新肾增强剂(NKA)”是指生物活性细胞配制剂，其是由在基于明胶的水凝胶组成的生物材料中配制的自体选定的肾细胞(SRC)组成的可注射产品。
如本文所用，术语“肾疾病”是指与急性或慢性肾衰竭的任何阶段或程度有关的疾病，所述肾衰竭导致肾进行血液过滤功能以及从血液中消除过多的液体、电解质和废物的能力丧失。肾疾病还可以包括内分泌功能障碍，例如贫血(促红细胞生成素缺乏)和矿物质失衡(维生素D缺乏)。肾疾病可以起源于肾或可以继发于多种病况，包括(但不限于)心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝病。肾疾病可以是对肾的急性损伤后发展的慢性肾衰竭的状况。例如，缺血和/或暴露于有毒物质对肾的伤害可以导致急性肾衰竭；急性肾损伤后恢复不完全可以导致慢性肾衰竭的发展。
术语“治疗”是指针对肾疾病、肾小管运输缺陷或肾小球过滤缺陷的治疗以及预防或防范措施两者，其中目的是逆转，预防或减慢(减轻)目标病症。需要治疗的对象包括已经患有肾疾病、肾小管运输缺陷或肾小球过滤缺陷的对象，以及容易患有肾疾病、肾小管运输缺陷或肾小球过滤缺陷的对象或要预防肾疾病、肾小管运输缺陷或肾小球过滤缺陷的对象。如本文所用，术语“治疗”包括肾功能的稳定化和/或改善。
如本文所用，术语“体内接触”是指由富集的细胞群体分泌的产物与天然器官之间的体内直接接触。例如，由富集的肾细胞群体(或含有肾细胞/肾细胞级份的混合物或构建体)分泌的产物可以在体内接触天然肾。体内直接接触可以是自然界中的旁分泌、内分泌或邻分泌。分泌的产物可以是本文所述的不同产物的异质群体。
术语“受试者”应指正在经历或已经经历了肾疾病的一种或多种体征、症状或其它适应症的任何单一个人受试者，包括符合治疗条件的患者。此类受试者包括但不限于新诊断或先前诊断并且现在正经历复现或复发或有肾疾病的风险(无论原因)的受试者。该受试者可以先前已经接受过肾疾病的治疗，或者未如此治疗。
术语“患者”是指期望得到治疗的任何单一动物，更优选地是哺乳动物(包括非人动物，诸如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊和非人灵长类)。最优选地，本文的患者是人。
术语“样品”或“患者样品”或“生物样品”通常应指从受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其它来源获得的任何生物样品。该术语包括组织活组织检查，诸如例如肾活组织检查。该术语包括培养的细胞，诸如例如培养的哺乳动物肾细胞。从哺乳动物获得组织活组织检查和培养细胞的方法是本领域中公知的。若单独使用术语“样品”，则它仍应意味着“样品”是“生物样品”或“患者样品”，即术语可以互换使用。术语“测试样品”是指来自已经通过本公开内容的方法治疗的受试者。测试样品可以源自哺乳动物受试者中的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿液、骨髓、粘膜、组织等。
术语“对照”或“对照样品”是指阴性或阳性对照，其中预期阴性或阳性结果有助于关联测试样品中的结果。适用于本公开内容的对照包括但不限于已知表现出正常肾功能的特征性指标的样品、获自已知未患有肾疾病的受试者的样品和获自已知患有肾疾病的受试者的样品。另外，对照可以是在通过本公开内容的方法治疗之前从受试者获得的样品。另外的合适的对照可以是从已知患有任何类型或阶段的肾疾病的受试者获得的测试样品，以及从已知没有任何类型或阶段的肾疾病的受试者获得的样品。对照可以是正常健康匹配的对照。本领域技术人员将理解适用于本公开内容的其它对照。
“再生预后”、“再生性预后”或“再生的预后”通常是指对本文所述的细胞群体、混合物或构建体的施用或植入的可能的再生过程或结果的预期或预测。对于再生预后，可以通过以下一种或多种告知预期或预测：植入或施用后功能器官(例如肾)的改善、植入或施用后功能性肾的形成、植入或施用后改善的肾功能或能力的形成和植入或施用后天然肾的某些标志物表达。
“再生器官”是指植入或施用如本文所述的细胞群体、混合物或构建体后的天然器官。再生器官通过各种指标表征，包括但不限于天然器官中的功能或能力的形成、天然器官中的功能或能力的改善、与疾病有关的某些标志物和生理指标的改善和天然器官中的某些标志物的表达。本领域普通技术人员将理解，其它指标可适用于表征再生器官。
“再生肾”是指植入或施用如本文所述的细胞群体、混合物或构建体后的天然肾。再生肾通过各种指标表征，包括但不限于天然肾中的功能或能力的形成、天然肾中的功能或能力的改善、与肾疾病有关的某些标志物和生理指标的改善和天然肾中的某些标志物的表达。本领域普通技术人员将理解，其它指标可适用于表征再生肾。
2.细胞群体
在某些实施方案中，本公开内容的配制剂可以含有分离的异质的肾细胞群体和/或其混合物，其富集了特定的生物活性组分或细胞类型和/或消减了特定的无活性或不期望的组分或细胞类型以用于肾疾病的治疗，即提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生，例如如先前记载于Presnell等人U.S.8,318,484和Ilagan等人PCT/US2011/036347，其全部内容通过引用并入本文。配制剂可以含有分离的肾细胞级分，所述肾细胞级分与健康个体相比缺乏细胞成分，但保留治疗特性，即提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。本文所述的细胞群体、细胞级分和/或细胞混合物可衍生自健康个体、患有肾疾病的个体或本文所述的受试者。
本公开内容提供了本文所述的适用于各种生物活性细胞群体的配制剂，所述生物活性细胞群体包括但不限于分离的细胞群体、细胞级份、混合物、富集的细胞群体、细胞聚集体、类器官、小管和其它三维组织样结构及其任意组合。在某些实施方案中，生物活性细胞群体是生物活性肾细胞。在某些实施方案中，生物活性细胞群体是补充有内皮细胞的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，生物活性细胞群体是补充有间充质、内皮或上皮谱系的干细胞或祖细胞的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，生物活性细胞群体是补充有衍生自脂肪基质血管级份的细胞的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，仅将衍生自生物活性细胞群体的分泌产物掺入最终构建体中。此类分泌产物可以包括但不限于外来体、miRNA、分泌性细胞因子和生长因子、胞外囊泡、脂质和条件化培养基。
生物活性细胞群体
在实施方案中，本文提供的治疗组合物或配制剂包含富集特定生物活性组分或细胞类型和/或消减特定无活性或不期望的组分或细胞类型的分离的异质肾细胞群体。在实施方案中，此类组合物和配制剂用于治疗肾疾病，例如，提供肾功能和/或结构的稳定化和/或改善和/或再生。在实施方案中，组合物含有分离的肾细胞级分，其与健康个体相比缺乏细胞成分但仍保留治疗性质，例如提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。在实施方案中，本文所述的细胞群体可衍生自健康个体、患有肾疾病的个体或本文所述的受试者。
本文包括选定的肾细胞群体的治疗组合物，其要施用于受试者的靶器官或组织。在实施方案中，生物活性选定的肾细胞群体通常是指在施用于受试者时潜在具有治疗特性的细胞群体。在实施方案中，在对有需要的受试者施用后，生物活性肾细胞群体可以在受试者中提供肾功能的稳定化和/或改善和/或修复和/或再生。在实施方案中，治疗性质可包括修复或再生效果。
在实施方案中，肾细胞群体是衍生自肾的未分级的异质细胞群体或富集的同质细胞群体。在实施方案中，异质细胞群体是从组织活组织检查或整个器官组织分离的。在实施方案中，肾细胞群体衍生自哺乳动物细胞的体外培养物，从组织活组织检查或整个器官组织建立。在实施方案中，肾细胞群体包含异质肾细胞群体的亚级份或亚群，富集了生物活性成分(例如，生物活性肾细胞)并且消减了无活性或不期望的成分或细胞。
在实施方案中，肾细胞群体表达GGT和细胞角蛋白。在实施方案中，GGT具有大于约10％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％的表达水平。在实施方案中，GGT是GGT-1。在实施方案中，肾细胞群体的细胞表达GGT-1、细胞角蛋白、VEGF和KIM-1。在实施方案中，肾细胞群体中大于18％的细胞表达GGT-1。在实施方案中，肾细胞群体中大于80％的细胞表达细胞角蛋白。在实施方案中，细胞角蛋白选自CK8、CK18、CK19及其组合。在实施方案中，细胞角蛋白是CK8、CK18、CK19、CK8/CK18、CK8/CK19、CK18/CK19或CK8/CK18/CK19，其中“/”是指与其相邻的细胞角蛋白的组合。在实施方案中，细胞角蛋白具有大于约80％、约85％、约90％或约95％的表达水平。在实施方案中，肾细胞群体中大于80％的细胞表达细胞角蛋白。在实施方案中，肾细胞群体表达AQP2。在实施方案中，小于40％的细胞表达AQP2。在实施方案中，肾细胞群体中至少3％的细胞表达AQP2。
在实施方案中，细胞群体内大于18％的细胞表达GGT-1，并且细胞群体内大于80％的细胞表达细胞角蛋白。在实施方案中，细胞角蛋白是CK18。在实施方案中，细胞群体中4.5％至81.2％的细胞表达GGT-1，细胞群体中3.0％至53.7％的细胞表达AQP2，并且细胞群体内81.1％至99.7％的细胞表达CK18。在实施方案中，肾细胞群体包含表达选自下组的生物标志物的任何组合的一种或多种的细胞：AQP1、AQP2、AQP4、钙结合蛋白、钙调理蛋白、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31(PECAM-1)、CD54(ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8、CK18、CK19，CK8、CK18和CK19的组合、连接蛋白43、吞饮受体(Cubilin)、CXCR4(融合素)、DBA、E-钙粘蛋白(CD324)、EPO(促红细胞生成素)GGT1、GLEPP1(肾小球上皮蛋白1)、肝球蛋白、Itgbl(整联蛋白01)、KIM-1(肾损伤分子-1)、T1M-1(含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白的分子)、MAP-2(微管相关蛋白2)、兆蛋白(Megalin)、N-钙粘蛋白、肾病蛋白(肾病蛋白)、NKCC(Na-K-Cl-共转运蛋白)、OAT-1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白、泛钙粘蛋白、PCLP1(足糖萼蛋白样1分子)、Podocin、SMA(平滑肌alpha-肌动蛋白)、Synaptopodin、THP(tamm-horsfall蛋白)、Vinientin和alpha GST-1(alpha谷胱甘肽S-转移酶)。
在实施方案中，与起始群体，例如肾组织活组织检查或其原代培养中的细胞群体相比，肾细胞群体是上皮细胞富集的(例如，肾细胞群体包含比起始群体多至少约5％、10％、15％、20％或25％的上皮细胞)。在实施方案中，与起始群体，例如肾组织活组织检查或其原代培养物中的细胞群体相比，肾细胞群体是肾小管细胞富集的(例如，肾细胞群体包括比起始群体多至少约5％、10％、15％、20％或25％的肾小管细胞)。在实施方案中，肾小管细胞包含近端肾小管细胞。在实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更小比例的远端肾小管细胞、收集导管细胞、内分泌细胞、血管细胞或祖细胞样细胞。在实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更小比例的远端肾小管细胞。在实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更少比例的收集导管细胞。在实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更少比例的内分泌细胞。在实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更少比例的血管细胞。在实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更少比例的祖细胞样细胞。在实施方案中，当与非富集的群体(例如起始肾细胞群体)相比时，肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的产生EPO的细胞、肾小球细胞和血管细胞。在实施方案中，当与非富集的群体相比时，肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的产生EPO的细胞和血管细胞。在实施方案中，当与非富集的群体相比时，肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的肾小球细胞和血管细胞。
在实施方案中，肾细胞群体的细胞表达透明质酸(HA)。在实施方案中，HA的大小范围为约5kDa至约20000kDa。在实施方案中，HA具有5kDa、60kDa、800kDa和/或3000kDa的分子量。在实施方案中，肾细胞群体通过透明质酸合酶-2(HAS-2)的表达来合成高分子量HA和/或刺激高分子量HA的合成，特别在肾内植入后。在实施方案中，通过HAS-2的作用，肾细胞群体的细胞在体外和/或体内表达HA的更高分子量。在实施方案中，通过HAS-2的作用，肾细胞群体的细胞在体外和体内表达HA的更高分子量。在实施方案中，HA的更高分子量是具有至少100kDa的分子量的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约800kDa至约3500kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约800kDa至约3000kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少800kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少3,000kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有约800kDa的分子量的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约3000kDa的HA。在实施方案中，HAS-2合成分子量为2x105至2x106 Da的HA。在实施方案中，较小的HA种类是通过降解透明质酸酶的作用形成的。在实施方案中，HA的较高分子量种类是分子量范围为约200kDa至约2000kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是分子量范围为约200kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约2000kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少200kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少2000kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少5000kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少10000kDa的HA。HA的较高分子量种类是具有分子量至少15000kDa的HA。在实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约20000kDa的HA。
在实施方案中，群体包含能够受体介导的白蛋白转运的细胞。
在实施方案中，肾细胞群体的细胞是低氧耐受的。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合的一种或多种的细胞类型：兆蛋白、cubicin、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白-2。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：兆蛋白、cubicin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节蛋白4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换蛋白)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)，醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和卡配因(Calpain)-8(Capn8)。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：兆蛋白、cubicin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节蛋白4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换蛋白)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)，醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和卡配因(Calpain)-8(Capn8)和水通道蛋白-4(Aqp4)。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下组合的一种或多种的细胞类型：水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD域的离子转运调节蛋白2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)成员3(Slc17a3)、溶质载体家族3成员1(Slc3a1)、紧密连接蛋白(claudin)2(Cldn2)，Napsin A天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2(易化葡萄糖转运蛋白)成员2(Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基CoA合成酶中链家族成员2(Acsm2)/谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1,6-双磷酸酶1(Fbp1)、丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(Agxt2)、血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和Podocin(Podn)。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146、Podocin(Podn)和肾病蛋白(Neph)、趋化因子(CXC基序)受体4(Cxcr4)、内皮素受体B型(Ednrb)、胶原蛋白V型alpha 2(Col5a2)、钙粘蛋白5(Cdh5)、纤溶酶原激活剂，组织(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、分泌蛋白、酸性富含半胱氨酸(ostectectin)(Sparc)、丝甘蛋白聚糖(serglycin)(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制剂3(Timp3)、Wilms肿瘤1(Wt1)、无翼型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号传导调节剂4(Rgs4)、促红细胞生成素(EPO)。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、Podocin、肾病蛋白、EPO、CK7、CK8/18/19。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：Podocin(Podn)和肾病蛋白(Neph)。
在实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a和EPO。
在实施方案中，可以通过多种方法来分析样品或细胞群体中各种生物标志物的存在(例如表达)和/或水平/量，所述方法中的许多是本领域已知的并且是熟练技术人员理解的，包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、Western印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、生化酶促活性测定法、原位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链式反应(“PCR”)，包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其它扩增类型检测方法，诸如例如分支DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达序型分析和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及可以通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的极其多种测定法中的任何一种。评估基因和基因产物状态的方案的非限制性实例包括Northern印迹法、Southern印迹法、免疫印迹法和PCR分析。在实施方案中，也可以使用多路复用的免疫测定法，例如可从Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery获得的免疫测定法。在实施方案中，可以通过多种方法来分析样品或细胞群体中各种生物标志物的存在(例如表达)和/或水平/量，所述方法中的许多是本领域已知的并且是熟练术人员理解的，包括但不限于“组学(-omics)”平台，例如全基因组转录组学、蛋白质组学、分泌组学、脂质组学、phospatomics、外来体组学等，其中高通量方法与计算生物学和生物信息学技术偶联以阐明由所考虑的细胞群体表达或不表达的基因、miRNA、蛋白质、分泌性蛋白质、脂质等的完整生物学签名。
在实施方案中，检测肾细胞群体中两种或更多种生物标志物的存在的方法包括在允许抗体与其关联配体(即生物标志物)结合的条件下将样品与针对生物标志物的抗体接触，并检测结合抗体的存在，例如，通过检测抗体与生物标志物之间是否形成复合物。在实施方案中，一种或多种生物标志物的存在的检测通过免疫组织化学进行。如本文所用，术语“检测”涵盖定量和/或定性检测。
在实施方案中，用一种或多种允许检测本文中公开的生物标志物的试剂鉴定肾细胞群体，所述生物标志物诸如AQP1、AQP2、AQP4、钙结合蛋白、钙调理蛋白、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31(PECAM-1)、CD54(ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8/18、CK8/18/19、连接蛋白43、吞饮受体、CXCR4(融合素)、DBA、E-钙粘蛋白(CD324)、EPO(促红细胞生成素)、GGT1、GLEPP1(肾小球上皮蛋白1)、肝球蛋白、Itgbl(整联蛋白01)、KIM-1(肾损伤分子-1)、T1M-1(含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白的分子)、MAP-2(微管相关蛋白2)、兆蛋白、N-钙粘蛋白、肾病蛋白(肾病蛋白)、NKCC(Na-K-Cl-共转运蛋白)、OAT-1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白、泛钙粘蛋白、PCLP1(足糖萼蛋白样1分子)、Podocin、SMA(平滑肌alpha-肌动蛋白)、Synaptopodin、THP(tamm-horsfall蛋白)、Vinientin和αGST-1(alpha谷胱甘肽S-转移酶)。在实施方案中，通过单克隆或多克隆抗体检测生物标志物。
在实施方案中，细胞来源与意图的靶器官或组织相同。在实施方案中，BRC或SRC可以源自肾，以用于要向肾施用的配制剂中。在实施方案中，细胞群体衍生自肾活组织检查。在实施方案中，细胞群体衍生自整个肾组织。在实施方案中，细胞群体衍生自哺乳动物肾细胞的体外培养物，从肾活组织检查或整个肾组织建立。
在实施方案中，BRC或SRC包含生物活性肾细胞的异质混合物或级分。在实施方案中，BRC或SRC可以衍生自来自健康个体的肾细胞级分或本身是来自健康个体的肾细胞级分。在实施方案中，本文包括从非健康个体获得的肾细胞群体或级分，其当与健康个体的肾细胞群体相比时(例如，在肾或其活组织检查中)可以缺乏某些细胞类型。在实施方案中，本文提供了与健康个体相比缺乏细胞类型的治疗活性细胞群体。在实施方案中，从自体细胞群体分离并扩增细胞群体。
在一些实施方案中，经由肾活组织检查从患者肾皮质组织中分离和扩增肾细胞获得SRC。在实施方案中，通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，使用标准细胞培养技术扩增，并且通过跨越密度边界、屏障或界面的离心从扩增的肾细胞中选择。在实施方案中，通过酶促消化从肾组织分离肾细胞，使用标准细胞培养技术扩增，并通过连续或不连续的单步或多步密度梯度离心从扩增的肾细胞中选择。在实施方案中，SRC主要由在其再生潜能上已知的肾上皮细胞构成。在实施方案中，其它实质细胞(血管)和基质细胞可存在于自体SRC群体中。
在实施方案中，从通过酶促消化从肾组织分离的肾细胞获得生物活性肾细胞，并使用标准细胞培养技术扩增。在实施方案中，细胞培养基设计为扩增具有再生能力的生物活性肾细胞。在实施方案中，细胞培养基不含任何重组或纯化的分化因子。在实施方案中，在低氧条件下培养肾细胞的扩增异质混合物，以进一步富集具有再生能力的细胞组合物。不希望受到理论的束缚，这可能是由于以下一种或多种现象引起的：1)低氧培养期间特定细胞成分的选择性存活、死亡或增殖；2)响应低氧培养的细胞粒度和/或大小的变化，从而在密度梯度分离期间或在跨越密度边界、屏障或界面的离心期间实现浮力密度和随后定位的变化；和3)响应低氧培养期，细胞基因/蛋白质表达的变化，从而导致分离和扩增群体内细胞的差异特征。
在实施方案中，在富集能够进行肾再生的细胞的培养条件下，从肾组织(例如，从活组织检查组织获得的组织)中分离和扩增肾细胞获得生物活性肾细胞群体。
在实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查组织获得的组织)的肾细胞传代1、2、3、4、5或更多次，以产生扩增的生物活性肾细胞(例如，富集能够肾再生的细胞的细胞群体)。在实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代1次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代2次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代3次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代4次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代5次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，传代细胞消减了非生物活性肾细胞的细胞群体。在实施方案中，传代细胞消减了至少一种细胞类型的细胞群体。在实施方案中，传代细胞消减了具有大于1.095g/ml密度的细胞的细胞群体。在实施方案中，传代细胞消减了低粒度的小细胞的细胞群体。在实施方案中，传代细胞消减了比红细胞小的细胞的细胞群体。在实施方案中，传代细胞消减了具有小于6μm的直径的细胞的细胞群体。在实施方案中，传代细胞消减了具有小于2μm的直径的细胞的细胞群体。在实施方案中，传代细胞消减了具有比红细胞低的粒度的细胞的细胞群体。在实施方案中，在1次或多次传代后，细胞群体的存活力增加。在实施方案中，当通过荧光激活细胞分选(FAC)，例如使用细胞出现的散点图的X-Y轴分析细胞时，使用小细胞和低粒度的描述。
在实施方案中，扩增的生物活性肾细胞在缺氧条件下培养至少约6、9、10、12或24小时但小于48小时，或6至9小时，或6至48小时，或约12至约15小时，或约8小时，或约12小时，或约24小时，或约36小时，或约48小时。在实施方案中，基于密度选择在低氧条件下培养的细胞。在实施方案中，生物活性肾细胞群体是在扩增的肾细胞的连续或不连续(单步或多步)密度梯度分离之后(例如，在低氧条件下传代和/或培养之后)获得的选定的肾细胞(SRC)群体。在实施方案中，生物活性肾细胞群体是通过跨越密度边界、屏障或界面的离心分离扩增的肾细胞后(例如，在低氧条件下传代和/或培养后)获得的选定的肾细胞(SRC)群体。在实施方案中，低氧培养条件是下述的培养条件，其中相对于细胞在大气氧水平(约21％)下培养的标准培养条件，使细胞经受培养系统中的可用氧水平降低。在实施方案中，在低氧培养条件下培养的细胞在约5％至约15％、或约5％至约10％、或约2％至约5％、或约2％至约7％、或约2％或约3％、或约4％、或约5％的氧水平培养。在实施方案中，SRC表现出大于约1.0419g/mL的浮力密度。在实施方案中，SRC表现出大于约1.04g/mL的浮力密度。在实施方案中，SRC表现出大于约1.045g/mL的浮力密度。在实施方案中，与起始肾细胞群体相比，BRC或SRC含有更大百分比的一个或多个细胞群体，并且缺乏或缺少一个或多个其它细胞群体。
在实施方案中，可以对扩增的生物活性肾细胞进行密度梯度分离以获得SRC。在实施方案中，使用连续或不连续的单步或多步密度梯度离心，基于细胞浮力密度来分离收获的肾细胞群体。在实施方案中，可以通过跨越密度边界、屏障或界面的离心来分离扩增的生物活性肾细胞以获得SRC。在实施方案中，使用跨越密度边界或界面的离心来基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。在实施方案中，通过部分使用OPTIPREP(Axis-Shield)介质产生SRC，所述介质包含60％(w/v)的非离子碘化化合物碘克沙醇的水溶液。然而，本领域技术人员将认识到其它介质、密度梯度(连续或不连续)、密度边界、屏障、界面或其它手段，例如，使用本领域已知的细胞表面标志物进行免疫分离，包括用于分离本文所述的细胞群体的必要特征可用于获得生物活性肾细胞。在实施方案中，离心后收集表现出大于约1.04g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在实施方案中，排除并弃去维持浮力密度小于1.04g/mL的细胞。在实施方案中，离心后收集表现出浮力密度大于约1.0419g/mL的细胞级分作为独特的团粒。在实施方案中，排除并弃去维持小于1.0419g/mL的浮力密度的细胞。在实施方案中，离心后收集表现出大于约1.045g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在实施方案中，排除并弃去维持小于1.045g/mL的浮力密度的细胞。
在实施方案中，细胞浮力密度用于获得SRC群体和/或确定肾细胞群体是否为生物活性肾细胞群体。在实施方案中，细胞浮力密度用于分离生物活性肾细胞。在实施方案中，通过跨越单步OptiPrep(7％碘克沙醇；OptiMEM中60％(w/v))密度界面(单步不连续密度梯度)的离心确定细胞浮力密度。Optiprep是水中的碘克沙醇的60％w/v溶液。当在示例性密度界面或单步不连续密度梯度中使用时，将Optiprep用OptiMEM(细胞培养基础培养基)稀释以形成7％碘克沙醇的终溶液(在水和OptiMEM中)。OptiMEM的配方是Eagle基本必需培养基的改良，用HEPES和碳酸氢钠缓冲，并补充有次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺或GLUTAMAX、微量元素和生长因子。蛋白质水平是最小的(15μg/mL)，胰岛素和转铁蛋白是唯一的蛋白质补充剂。以降低的浓度包含酚红作为pH指标。在实施方案中，在使用之前可以用2-巯基乙醇补充OptiMEM。
在实施方案中，制备OptiPrep溶液并在使用前测量指示期望密度的折射率(R.I.1.3456+/-0.0004)。在实施方案中，肾细胞在溶液的顶部上分层。在实施方案中，将密度界面或单步不连续密度梯度在室温在离心管(例如50ml锥形管)或细胞处理器(例如COBE2991)中以800g离心20分钟(无制动)。在实施方案中，离心后收集表现出大于约1.04g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在实施方案中，排除并弃去维持浮力密度小于1.04g/mL的细胞。在实施方案中，离心后收集表现出大于约1.0419g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在实施方案中，排除并弃去维持小于1.0419g/mL的浮力密度的细胞。在实施方案中，离心后收集表现出大于约1.045g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在实施方案中，排除并弃去维持小于1.045g/mL的浮力密度的细胞。在实施方案中，在评估细胞密度或基于密度的选择之前，将细胞培养直至它们至少融合50％，并在37℃的5％CO2环境中在设置2％氧气的低氧培养箱中温育过夜(例如，至少约8或12小时)。
在实施方案中，将从肾样品获得的细胞扩增，然后进行处理(例如通过缺氧和离心分离)以提供SRC群体。在实施方案中，使用本文所述的试剂和程序产生SRC群体。在实施方案中，测试来自SRC群体的细胞样品的存活力，之后将群体的细胞施用于受试者。在实施方案中，测试来自SRC群体的细胞样品的本文公开的一种或多种标志物的表达，之后将群体的细胞施用于受试者。
用于制备SRC的组合物和方法的非限制性实例在美国专利申请公开号2017/0281684A1中公开，其全部内容通过引用并入本文。
在实施方案中，BRC或SRC衍生自天然自体或同种异体肾样品。在实施方案中，BRC或SRC衍生自非自体肾样品。在实施方案中，可以通过肾活组织检查获得样品。
在实施方案中，肾细胞分离和扩增提供了包含肾上皮细胞和基质细胞的肾细胞类型的混合物。在实施方案中，通过对扩增的肾细胞进行连续或不连续的密度梯度分离获得SRC。在实施方案中，在密度梯度分离的SRC群体中的原代细胞类型是肾小管上皮表型的。在实施方案中，通过跨越密度边界、屏障或界面的离心分离扩增的肾细胞来获得SRC。在实施方案中，SRC群体中跨越密度边界/屏障/界面分离的原代细胞类型是肾小管上皮表型的。在实施方案中，使用多管法(multi-pronged approach)评估获自扩增的肾细胞的SRC的特征。在实施方案中，在肾细胞扩增过程期间监测细胞形态、生长动力学和细胞存活力。在实施方案中，SRC浮力密度和存活力以在密度梯度介质上或通过密度梯度介质离心和锥虫蓝排除法表征。在实施方案中，通过流式细胞术表征SRC表型，并且通过VEGF和KIM-1的表达证明SRC功能。在实施方案中，还可以通过测量肾近端小管中发现的两种特异性酶GGT(γ-谷氨酰转肽酶)和LAP(亮氨酸氨肽酶)的活性来评估SRC(预配制剂)的细胞功能。
在实施方案中，可以利用有助于经由密度介质(大小和粒度)分离细胞亚群的细胞特征，经由流式细胞术分离细胞亚群(前向散射＝经由流式细胞术反映大小，而侧向散射＝粒度的反映)。在实施方案中，密度梯度或分离介质应对目的特定细胞具有低毒性。在实施方案中，尽管密度介质对目标特定细胞应具有低毒性，但本发明涵盖了在目标细胞的选择过程中起作用的介质的使用。在实施方案中，并且不希望受到理论束缚，似乎由包含碘克沙醇的介质回收的本文公开的细胞群体是碘克沙醇抗性的，因为在加载和回收步骤之间存在可察觉的细胞损失，提示了在密度梯度或密度边界、密度、屏障或密度界面的条件下对碘克沙醇的暴露导致某些细胞的消除。在实施方案中，在碘克沙醇密度梯度或密度界面分离之后出现的细胞对碘克沙醇和/或密度梯度或界面暴露的任何不利影响是有抗性的。在实施方案中，将包含轻度至中度肾毒素的造影剂用于分离和/或选择细胞群体，例如SRC群体。在实施方案中，SRC是碘克沙醇抗性的。在实施方案中，密度介质不应与人血浆中的蛋白质结合或不利地影响目的细胞的关键功能。
在实施方案中，已经使用荧光激活细胞分选(FACS)使细胞群体富集和/或消减了一种或多种肾细胞类型。在实施方案中，可以使用BD FACSAriaTM或等同物富集和/或消减了肾细胞类型。在实施方案中，可以使用FACSAria IIITM或等同物富集和/或消减肾细胞类型。
在实施方案中，已经使用磁性细胞分选对细胞群体富集和/或消除了一种或多种肾细胞类型。在实施方案中，可以使用Miltenyi 系统或等同物富集和/或消减了一种或多种肾细胞类型。
在实施方案中，肾细胞群体已经进行了三维培养。在实施方案中，培养细胞群体的方法是经由连续灌注。在实施方案中，当与静态培养的细胞群体相比时，经由三维培养和连续灌注培养的细胞群体表明更大的细胞性和互连性。在实施方案中，当与此类细胞群体的静态培养物相比时，经由三维培养和连续灌注培养的细胞群体表明更大的EPO表达，以及肾小管相关基因例如E-钙粘蛋白的增强表达。在实施方案中，当与静态培养的细胞群体相比时，经由连续灌注培养的细胞群体表明更高水平的葡萄糖和谷氨酰胺消耗。
在实施方案中，可以使用低的或低氧的氧条件制备本文提供的细胞群体的方法中。在实施方案中，可以在无需低氧条件化的步骤的情况下使用制备细胞群体的方法。在实施方案中，可以使用常氧条件。
在实施方案中，已经从肾组织分离和/或培养肾细胞群体。本文公开了用于分开和分离肾细胞组分的方法的非限制性实例，例如将用于治疗用途的配制剂中的富集细胞群体，包括治疗肾疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管运输缺乏和肾小球过滤缺陷。在实施方案中，从新鲜消化的，即机械或酶促消化的肾组织，或从哺乳动物肾细胞的异质体外培养物中分离细胞群体。
在实施方案中，肾细胞群体包含产生EPO的肾细胞。在实施方案中，受试者患有贫血和/或EPO缺乏。在实施方案中，产生EPO的肾细胞群体以EPO表达和对氧气的生物响应性为特征，使得培养系统的氧张力降低导致EPO表达的诱导。在实施方案中，产生EPO的细胞群体是产生EPO的细胞富集的。在实施方案中，与在可用氧的正常大气(约21％)水平下培养的细胞群体相比，在细胞经受培养系统中的可用氧水平降低的条件下培养细胞群体时，诱导EPO表达。在实施方案中，相对于在正常氧气条件下培养的产生EPO的细胞，在较低氧气条件下培养的产生EPO的细胞表达更高水平的EPO。通常，在可用氧气水平降低的细胞培养(也称为低氧培养条件)意味着相对于在可用氧的正常大气水平(也称为正常或常氧培养条件)的细胞培养，氧气减少的水平降低。在实施方案中，低氧细胞培养条件包括在约小于1％的氧气，约小于2％的氧气，约小于3％的氧气，约小于4％的氧气或约小于5％的氧气下培养细胞。在实施方案中，正常或常氧培养条件包括在约10％氧气，约12％氧气，约13％氧气，约14％氧气，约15％氧气，约16％氧气，约17％氧气，约18％氧气，约19％氧气，约20％氧气或约21％氧气下培养细胞。
在实施方案中，获得EPO的诱导或表达增加，并且可以通过在约小于5％的可用氧下培养细胞并将EPO表达水平与在大气(约21％)的氧气下培养的细胞进行比较来观察。在实施方案中，通过包括第一培养阶段和第二培养阶段的方法在能够表达EPO的细胞培养物中获得EPO的诱导，在所述第一培养阶段中将细胞培养物在大气氧(约21％)下培养一段时间，在所述第二培养阶段中可用氧降低并且在约小于5％可用氧下培养相同细胞。在实施方案中，响应于低氧条件的EPO表达由HIF1α调节。在实施方案中，本领域已知的其它氧气操作培养条件可以用于本文所述的细胞。
在实施方案中，配制剂含有以对灌注条件的生物响应性(例如，EPO表达)为特征的产生EPO的哺乳动物细胞的富集群体。在实施方案中，灌注条件包括瞬时、间歇或连续的流体流动(灌注)。在实施方案中，当以下述方式将培养细胞的培养基间歇地或连续地循环或搅动，使得动力通过流动传递给细胞时，EPO的表达是机械诱导的。在实施方案中，以如下方式培养经受瞬时、间歇或连续流体流动的细胞，使得它们以三维结构存在于材料中或之上，该材料为此类三维结构形成提供构架和/或空间。在实施方案中，将细胞培养在多孔珠上，并通过摇动平台、轨道运行平台或旋转瓶进行间歇或连续的流体流动。在实施方案中，将细胞在三维支架上培养并置于装置中，通过所述装置，支架是固定的，并且流体有方向地流过或穿过支架。本领域普通技术人员将理解，本领域已知的其它灌注培养条件可以用于本文所述的细胞。
在实施方案中，细胞群体衍生自肾活组织检查。在实施方案中，细胞群体衍生自整个肾组织。在实施方案中，细胞群体衍生自哺乳动物肾细胞的体外培养物，自肾活组织检查或整个肾组织建立。在实施方案中，肾细胞群体是SRC群体。在实施方案中，细胞群体是未分级的细胞群体，在本文中也称为非富集的细胞群体。
本文包括包含多种活性剂(例如，除了肾细胞之外)的组合物。合适的活性剂的非限制性实例包括但不限于细胞聚集体、无细胞生物材料、来自生物活性细胞的分泌产物、大分子和小分子治疗剂及其组合。例如，一种类型的生物活性细胞可以与具有或不具有治疗分子或另一种类型的生物活性细胞的基于生物材料的微载体组合。在实施方案中，未附着的细胞可以与无细胞颗粒组合。
在实施方案中，肾细胞群体的细胞在球状体内。在实施方案中，肾细胞群体为球状体形式。在实施方案中，将包含生物活性肾细胞的球状体施用于受试者。在实施方案中，球状体包含至少一种非肾细胞类型或细胞群体。在实施方案中，在方法中生成球状体，所述方法包括：(i)组合生物活性肾细胞群体和非肾细胞群体，并且(ii)在包含旋转瓶的3维培养系统中培养生物活性肾细胞群体和非肾细胞群体，直到形成球状体。
在实施方案中，非肾细胞群体包括内皮细胞群体或内皮祖细胞群体。在实施方案中，生物活性细胞群体是内皮细胞群体。在实施方案中，内皮细胞群体是细胞系。在实施方案中，内皮细胞群体包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在实施方案中，非肾细胞群体是间充质干细胞群体。在实施方案中，非肾细胞群体是造血、乳腺、肠、胎盘、肺、骨髓、血液、脐带、内皮、牙髓、脂肪、神经、嗅觉、神经嵴或睾丸起源的干细胞群体。在实施方案中，非肾细胞群体是脂肪来源的祖细胞群体。在实施方案中，细胞群体是异种的、同基因的、同种异体的、自体的或其组合。在实施方案中，以0.1:9.9至9.9:0.1的比率培养生物活性肾细胞群体和非肾细胞群体。在实施方案中，以约1:1的比率培养生物活性肾细胞群体和非肾细胞群体。在实施方案中，将肾细胞群体和生物活性细胞群体悬浮于生长培养基中。
扩增的生物活性肾细胞可以进一步经受连续或不连续的密度介质分离以获得SRC。具体而言，连续或不连续的单步或多步密度梯度离心用于基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中，可以通过跨越密度边界、屏障或界面的离心使扩增的生物活性肾细胞进一步分离以获得SRC。具体而言，基于细胞浮力密度，使用跨越密度边界、屏障或界面的离心来分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中，通过部分使用OPTIPREP(Axis-Shield)介质产生SRC，所述介质包含水中的非离子碘化化合物碘克沙醇的60％溶液。然而，本领域技术人员将认识到，可以根据本公开内容使用任何密度梯度介质，不限于特定介质或其它手段，例如使用本领域已知的细胞表面标志物进行免疫学分离，包括用于分离本公开内容的细胞群体的必要特征。例如，Percoll或蔗糖可用于形成密度梯度或密度边界。在某些实施方案中，离心后收集表现出大于约1.04g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持浮力密度小于1.04g/mL的细胞。在某些实施方案中，在离心分离后收集表现出浮力密度大于约1.0419g/mL的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持浮力密度小于1.0419g/mL的细胞。在某些实施方案中，在离心分离后收集表现出浮力密度大于约1.045g/mL的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并丢弃维持浮力密度小于1.045g/mL的细胞。
本公开内容的治疗性组合物及其配制剂可包含分离的异质肾细胞群体和/或其混合物，其富集了特定的生物活性组分或细胞类型和/或消减了特定的无活性或不期望的组分或细胞类型，用于肾疾病的治疗，即提供肾功能和/或结构的稳定化和/或改善和/或再生，例如先前记载于Presnell等人U.S.8,318,484和Ilagan等人PCT/US2011/036347，其全部内容通过引用并入本文。组合物可以含有分离的肾细胞部分，其与健康个体相比缺乏细胞成分但仍保留治疗性质，即提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。本文所述的细胞群体、细胞级分和/或细胞混合物可衍生自健康个体、患有肾疾病的个体或本文所述的受试者。
本公开内容考虑了要施用至有需要的受试者中的靶器官或组织的选定的肾细胞群体的治疗组合物。生物活性选定的肾细胞群体通常是指在施用于有需要的受试者时潜在地具有治疗特性的细胞群体。例如，在施用于有需要的受试者时，生物活性肾细胞群体可以在受试者中提供肾功能的稳定化和/或改善和/或修复和/或再生。治疗性质可包括再生效应。
在某些实施方案中，细胞的来源与意图的靶器官或组织相同。例如，BRC和/或SRC可以源自肾，以用于要向肾施用的配制剂中。在某些实施方案中，细胞群体衍生自肾活组织检查。在某些实施方案中，细胞群体衍生自整个肾组织。在另一个实施方案中，细胞群体衍生自哺乳动物肾细胞的体外培养物，从肾活组织检查或整个肾组织建立。在某些实施方案中，BRC和/或SRC包括生物活性肾细胞的异质混合物或级分。BRC和/或SRC可以衍生自来自健康个体的肾细胞级份，或者本身是来自健康个体的肾细胞级份。另外，本公开内容提供了从不健康个体获得的肾细胞级分，当与健康个体的相应肾细胞级分相比时，所述肾细胞级分可缺乏某些细胞成分，但仍保留治疗特性。本公开内容还提供了与健康个体相比缺乏细胞成分的治疗活性细胞群体，在某些实施方案中，所述细胞群体可以从各种疾病状态的自体来源分离并扩增。
在某些实施方案中，通过肾活组织检查从患者肾皮质组织中分离和扩增肾细胞获得SRC。通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，使用标准细胞培养技术进行扩增，并且通过跨越密度边界、屏障或界面离心扩增的肾细胞进行选择。在该实施方案中，SRC主要由肾小管上皮细胞组成，所述肾小管上皮细胞在其再生潜力上是已知的(BonventreJV.Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acuterenal failure.J Am Soc Nephrol.2003；14(Suppl.1):S55–61；Humphreys BD,CzerniakS,DiRocco DP,等人Repair of injured proximal tubule does not involvespecialized progenitors.PNAS.2011；108:9226–31；Humphreys BD,Valerius MT,Kobayashi A,等人Intrinsic epithelial cells repair the kidney afterinjury.Cell Stem Cell.2008；2:284–91)。自体SRC群体中可存在其它实质(血管)和基质细胞。在某些实施方案中，通过连续或不连续的单步或多步梯度离心来选择肾细胞。
如本文所述，本公开内容部分基于令人惊讶的发现，即异质肾细胞群体的某些亚级份(富集了生物活性成分并且消减了无活性或不期望的成分)提供了优于起始群体的治疗和再生结果。
肾细胞的分离和扩增提供了包括肾小管上皮细胞和基质细胞的肾细胞类型的混合物。如上所述，通过跨越密度边界、屏障或界面的离心分离扩增的肾细胞获得SRC。分离的SRC群体中的主要细胞类型为肾小管上皮表型的。使用多管法评估从扩增的肾细胞获得的SRC的特征。在肾细胞扩增过程期间监测细胞形态、生长动力学和细胞活力。通过密度界面和锥虫蓝排除表征SRC的浮力密度和存活力。通过流式细胞术表征SRC表型，并通过VEGF和KIM-1的表达证明SRC功能。
本领域普通技术人员将理解，本领域已知的其它分离和培养方法可以用于本文所述的细胞。本领域普通技术人员还将理解，生物活性细胞群体可以衍生自除上文具体列出的那些来源以外的来源，包括但不限于除肾以外的组织和器官、体液和脂肪。
SRC表型
在某些实施方案中，通过使用流式细胞术对肾细胞标志物的表达分析来监测细胞表型。细胞的表型分析基于对所分析细胞类型具有特异性的抗原性标志物的使用。流式细胞术分析提供了样品群体中表达分析的抗原性标志物的细胞的定量测量。
文献中已经报道了多种标志物可用于肾细胞的表型表征：(i)细胞角蛋白；(ii)转运膜蛋白(水通道蛋白和吞饮受体)；(iii)细胞结合分子(粘附蛋白、凝集素和其它蛋白质)；(iv)代谢酶(谷胱甘肽和γ-谷氨酰转肽酶(GGT))。(表1)由于在衍生自全肾消化液的培养物中发现的大多数细胞是上皮和内皮细胞，所检查的标志物集中于通常与这两组相关的蛋白质的表达。
用于SRC表征的表型标志物
抗原性标志物 反应性
CK8/18/19 表皮细胞，近端和远端肾小管
CK8 表皮细胞，近端肾小管
CK18 表皮细胞，近端肾小管
CK19 表皮细胞，收集导管，远端肾小管
CK7 表皮细胞，收集导管，远端肾小管
CXCR4 表皮细胞，远端和近端肾小管
E-钙粘蛋白 表皮细胞，远端肾小管
吞饮受体 表皮细胞，近端肾小管
水通道蛋白1 表皮细胞，近端肾小管，薄壁段降支
GGT1 胎儿和成人肾细胞，近端肾小管
水通道蛋白2 肾收集导管细胞，远端肾小管
DBA 肾收集导管细胞，远端肾小管
CD31 肾(大鼠)的内皮细胞
CD146 肾(狗，人)的内皮细胞
表2提供了SRC群体中表型的选定的标志物、范围和均值百分比数值和其选择的原理。
选择用于SRC的表型分析的标志物
Figure BDA0002288862140000341
细胞功能
SRC主动分泌可以通过条件化培养基分析检测的蛋白质。通过细胞代谢PrestoBlue以及分泌VEGF(血管内皮生长因子)和KIM-1(肾损伤分子-1)的能力来评估细胞功能。
表3显示了来自肾细胞和SRC培养物的条件培养基中存在的VEGF和KIM-1的量。将肾细胞培养至接近汇合。测试过夜暴露于肾细胞培养物的条件化培养基的VEGF和KIM-1。
表3.人肾细胞和SRC的VEGF和KIM-1产生
Figure BDA0002288862140000342
SRC酶促活性
也可以通过测量肾近端小管中发现的两种特异性酶GGT(γ-谷氨酰转肽酶)和LAP(亮氨酸氨肽酶)的活性来评估SRC(预配制)的细胞功能。
尽管本文描述了选定的肾细胞组合物，但是本公开内容考虑了包含多种其它活性剂的组合物，所述活性剂包括来源于肾以外的组织和器官的细胞和细胞混合物。其它合适的活性剂包括但不限于细胞聚集体和类器官、无细胞生物材料、来自生物活性细胞的分泌产物、大分子和小分子治疗剂及其组合。例如，一种类型的生物活性细胞可以与具有或不具有治疗性分子或另一种类型的生物活性细胞的基于生物材料的微载体组合。在某些实施方案中，未附着的细胞可以与无细胞颗粒组合。
细胞聚集体
另一方面，本公开内容的配制剂含有细胞聚集体或球状体。在某些实施方案中，细胞聚集体包含本文所述的生物活性细胞群体。在某些实施方案中，细胞聚集体包含生物活性肾细胞，诸如例如肾细胞混合物、富集的肾细胞群体和肾细胞级分的组合和肾细胞与间充质干细胞、内皮祖细胞、衍生自脂肪的基质血管级份的细胞或其它任何非肾细胞群体(非限制性)的混合物。
在某些实施方案中，本公开内容的生物活性肾细胞可以以3D形式培养，如本文进一步描述。在一些实施方案中，术语“类器官”是指具有重演天然肾的各方面的表型和/或功能的细胞积累。在一些实施方案中，类器官包括通常在体内在给定组织中发现的多种谱系的混合细胞群体。在一些实施方案中，本公开内容的类器官通过任何手段在体外形成，由此本公开内容的细胞形成聚集体，其继而可以形成球状体、类器官或其组合。在一些实施方案中，此类聚集体、球状体或类器官具有与特定器官一致的结构。在一些实施方案中，此类聚集体、球状体或类器官体表达表面标志物，其通常由特定器官的细胞表达。在一些实施方案中，此类聚集体、球状体或类器官产生典型由特定器官的细胞表达的化合物或材料。在某些实施方案中，本公开内容的细胞可以在天然基底，例如明胶上培养。在某些实施方案中，本公开内容的细胞可以在合成基底，例如PLGA上培养。
3.生物材料
多种生物材料可以与活性剂组合以提供本公开内容的治疗配制剂。生物材料可以为任何合适的形状(例如，珠)或形式(例如，液体，凝胶等)。如Bertram等人美国公开申请20070276507(通过引用整体并入本文)所述，可以将聚合物基体或支架成形为任意数目的期望构造，以满足任意数目的整体系统、几何形状或空间限制。在一些实施方案中，生物材料为液体悬浮液的形式。在某些实施方案中，本公开内容的基质或支架可以是三维的并且成形为符合器官或组织结构的尺寸和形状。例如，在聚合物支架用于治疗肾疾病、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的用途中，可以使用三维(3-D)基质来重演天然肾组织结构和组织的各个方面或全部以及肾实质的。
可以使用多种不同形状的3-D支架。自然地，可以将聚合物基质成形为不同的尺寸和形状，以适应不同体格的患者。聚合物基质还可以以其它方式成形以适应患者的特殊需要。在某些实施方案中，聚合物基质或支架可以是生物相容的多孔聚合物支架。支架可由多种合成或天然存在的材料形成，包括但不限于开孔聚乳酸(open-cell polylactic acid)纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚醛(phenolic)、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟烯烃，聚酰亚胺，聚烯烃，聚恶二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯基、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、尿素甲醛(urea-formaldehyde)、胶原蛋白、明胶、藻酸盐、层粘连蛋白、纤连蛋白、丝、弹性蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或共聚物或物理物质其混合物。支架构造的范围可以为软的多孔支架至刚性形状保持的多孔支架。在某些实施方案中，支架配置为能够成为水凝胶的液体溶液，例如高于熔化温度的水凝胶。
在某些实施方案中，支架衍生自人或动物起源的现有肾或其它器官，其中通过应用对本领域普通技术人员已知的洗涤剂和/或其它化学试剂和/或其它已知的酶促和/或物理方法消除了天然细胞群体。在该实施方案中，来源器官的天然三维结构与所有相关的胞外基质组分一起保留在其天然的生物活性背景中。在某些实施方案中，支架是衍生自人或动物肾或其它器官的胞外基质。在某些实施方案中，通过应用三维生物打印方法将配置组装成组织样结构。在某些实施方案中，该构造是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
水凝胶可以由多种聚合物材料形成，并且可用于多种生物医学应用中。水凝胶在物理上可以描述为亲水性聚合物的三维网络。根据水凝胶的类型，它们包含不同百分比的水，但完全不溶于水。尽管水含量高，但由于存在亲水性残基，水凝胶仍能够额外结合大量液体。水凝胶在不改变其凝胶状结构的情况下广泛膨胀。水凝胶的基本物理特征可以根据所使用的聚合物的性质和用于施用水凝胶的装置进行具体修改。
水凝胶材料优选不引起炎症应答。可用于形成水凝胶的其它材料的例子包括(a)改性藻酸盐，(b)通过暴露于单价阳离子而胶凝的多糖(例如结冷胶和角叉菜胶)，(c)多糖(例如透明质酸)，其是很粘的液体，或者是触变的，并通过缓慢的结构演变形成凝胶，(d)明胶或胶原蛋白，以及(e)聚合水凝胶前体(例如，聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白质)。美国专利US 6,224,893 B1提供了适用于生产根据本发明的水凝胶的各种聚合物以及此类聚合物的化学性质的详细描述。
在一个具体的实施方案中，用于配制本公开内容的生物材料的水凝胶是基于明胶的。明胶是一种衍生自胶原蛋白的无毒、可生物降解且水溶性的蛋白质，所述胶原蛋白是间充质组织胞外基质(ECM)的主要成分。胶原蛋白是动物体内各种结缔组织中细胞外空间的主要结构蛋白。作为结缔组织的主要成分，它是哺乳动物中最丰富的蛋白质，占全身蛋白质含量的25％至35％。取决于矿化的程度，胶原组织可以是刚性的(骨)，顺应性的(肌腱)，或具有从刚性至顺应性的梯度(软骨)。伸长的原纤维形式的胶原蛋白主要存在于肌腱、韧带和皮肤等纤维组织中。它在角膜、软骨、骨骼、血管、肠、椎间盘和牙齿中的牙本质中也是丰富的。在肌肉组织中，它充当肌内膜的主要成分。胶原蛋白占肌肉组织的1-2％，并且占强壮的腱肌肉重量的6％。胶原蛋白遍布人体的许多地方存在。但是，人体中超过90％的胶原蛋白是I型。
迄今为止，已经鉴定和描述了28种胶原蛋白。根据它们形成的结构，它们可以分为几类：原纤维(I、II、III、V、XI型)。非原纤维FACIT(具有中断三重螺旋的原纤维相关胶原蛋白)(IX、XII、XIV、XVI、XIX型)。短链(VIII，X型)。基底膜(IV型)。Multiplexin(具有中断的多个三重螺旋域)(XV、XVIII型)。MACIT(具有中断三重螺旋的膜相关胶原蛋白)(XIII，XVII型)。其它(VI，VII型)。五个最常见的类型是：I型：皮肤、腱、血管连接、器官、骨(骨有机部分的主要组分)。II型：软骨(软骨的主要胶原成分)III型：网状(网状纤维的主要成分)，通常与I型一起发现。IV型：形成基底层，基底膜的上皮分泌层。V型：细胞表面。毛发和胎盘。
明胶保留包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列在内的信息信号，其促进细胞粘附、增殖和干细胞分化。明胶的特征性质是它表现出上临界溶液温度行为(UpperCritical Solution Temperature behavior,UCST)。高于40℃的特定温度阈值，明胶可通过形成柔性随机的单个卷而溶于水中。冷却后，发生氢键键合和范德华相互作用，从而形成三重螺旋。这些胶原蛋白样的三重螺旋作用为连接区，因此触发了溶胶-凝胶转变(sol-geltransition)。明胶广泛用于制药和医疗应用。
在某些实施方案中，用于配制本文中的可注射细胞组合物的水凝胶基于猪明胶，其可源自猪皮并且可购自例如Nitta Gelatin NA Inc(NC,USA)或Gelita USA Inc.(IA,USA)。明胶可以溶解在例如Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中以形成热响应性水凝胶，该凝胶可以在不同的温度下胶凝和液化。在某些实施方案中，用于配制本文的可注射细胞组合物的水凝胶基于使用本领域普通技术人员已知的方法表达和纯化的重组人或动物明胶。在某些实施方案中，在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达包含I型alpha I人胶原蛋白的全部或部分cDNA的表达载体。其它表达载体系统和生物体是本领域普通技术人员已知的。在一个具体的实施方案中，本公开内容的基于明胶的水凝胶在室温(22-28℃)及以上为液体，并且当冷却至冷藏温度(2-8℃)时为凝胶。
本领域普通技术人员将理解，本领域已知的其它类型的合成或天然存在的材料可以用于形成如本文所述的支架。
在某些实施方案中，根据本发明使用的生物材料包括水凝胶形式的透明质酸(HA)，其包含大小范围为5.1kDA->2x 105kDa的HA分子。HA可促进相关生物活性细胞群体的分支形态发生和三维自构造。在某些实施方案中，根据本公开使用的生物材料包含多孔泡沫形式的透明质酸，还含有大小范围为5.1kDA->2x 105kDa的HA分子。在某些实施方案中，水凝胶衍生自肾或包含源自肾或任何其它组织或器官(非限制性)的胞外基质。在又一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料包括基于聚乳酸(PLA)的泡沫，其具有开孔结构且约50微米至约300微米的孔径。
温度敏感性生物材料
本文所述的生物材料还可以设计或适应于响应某些外部条件，例如在体外或体内。在某些实施方案中，生物材料是温度敏感性(例如，体外或体内)。在某些实施方案中，生物材料适合于响应对酶促降解的暴露(例如，体外或体内)。如本文所述，可以微调生物材料对外部条件的响应。可以通过调节配制剂中生物材料的百分比来改变配制剂的温度敏感性。例如，可以调节溶液中明胶的百分比以调节最终配制剂(例如，液体，凝胶，珠等)中明胶的温度敏感性。或者，可以将生物材料化学交联以提供对酶促降解的更大抗性。例如，碳二亚胺交联剂可用于使明胶珠化学交联，从而提供降低的对内源酶的易感性。
一方面，本文所述的配制剂掺入了生物材料，所述生物材料具有为要施用于受试者的活性剂(例如生物活性肾细胞)创造有利环境的特性。在某些实施方案中，配制剂包含第一生物材料，该第一生物材料从活性剂与生物材料一起配制的时间到施用于受试者的时间点提供了有利的环境。在另一个实施方案中，有利的环境涉及在施用于受试者之前相对于液体中的细胞在基本上固体状态中悬浮生物活性细胞的优点(如本文所述)。在某些实施方案中，第一生物材料是温度敏感性生物材料。温度敏感性生物材料可具有(i)在约8℃以下为基本上固体状态，和(ii)在环境温度以上为基本上液体状态。在某些实施方案中，环境温度为约室温。
在某些实施方案中，生物材料是温度敏感性生物材料，其可以根据温度维持至少两个不同的相或状态。生物材料能够在第一温度下维持第一状态，在第二温度下维持第二状态，和/或在第三温度下维持第三状态。第一、第二或第三状态可以是基本上固体状态、基本上液体状态或基本上半固体状态或半液体状态。在某些实施方案中，生物材料在第一温度下具有第一状态并且在第二温度下具有第二状态，其中第一温度低于第二温度。
在另一个实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约8℃以下为基本上固体状态。在某些实施方案中，于1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、或约8℃维持基本上固体状态。在某些实施方案中，基本上固体状态具有凝胶形式。在某些实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在环境温度以上温度为基本上液体状态。在某些实施方案中，于约25℃、约25.5℃,约26℃、约26.5℃,约27℃,约27.5℃,约28℃,约28.5℃,约29℃、约29.5℃、约30℃,约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃维持基本上液体状态。在某些实施方案中，环境温度约为室温。
在某些实施方案中，温度敏感生物材料的状态在约环境温度或以下的温度下为基本上固体状态。在某些实施方案中，环境温度为约室温。在某些实施方案中，于约17℃、约16℃、约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、或约1℃维持基本上固体状态。在某些实施方案中，基本上固体状态具有珠的形式。在某些实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约37℃以上为基本上液体状态。在另一个实施方案中，在约37℃、约38℃、约39℃或约40℃维持基本上固体状态。
温度敏感性生物材料可以以溶液的形式，以固体的形式，以珠的形式或以本文所述和/或本领域普通技术人员已知的其它合适形式提供。本文所述的细胞群体和配制剂可以用温度敏感性生物材料包被，在温度敏感性生物材料上沉积，在温度敏感性生物材料中包埋，附着于温度敏感性生物材料，在温度敏感性生物材料中接种，悬浮或俘获。在某些实施方案中，本文所述的细胞群体可以在与温度敏感性生物材料复合之前组装为三维细胞聚集体或类器官或三维管状结构，或者可以在与温度敏感性生物材料复合时照这样组装。或者，温度敏感性生物材料可以在没有任何细胞的情况下提供，诸如例如以间隔珠的形式提供。在该实施方案中，温度敏感生物材料以纯粹的被动作用发挥功能，以在靶器官内创建用于再生生物活性的空间，例如，血管生成或宿主细胞群体的浸润和迁移。
在某些实施方案中，温度敏感性生物材料具有在第一状态和第二状态之间的过渡状态。在某些实施方案中，过渡状态是在约8℃的温度和约环境温度之间的固体至液体过渡状态。在某些实施方案中，环境温度为约室温。在另一个实施方案中，固体至液体过渡状态在约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、和约18℃的一个或多个温度发生。
温度敏感性生物材料在给定温度具有某种粘度，以厘泊(cP)测量。在某些实施方案中，生物材料在25℃具有约1cP至约5cP、约1.1cP至约4.5cP、约1.2cP至约4cP、约1.3cP至约3.5cP、约1.4cP至约3.5cP、约1.5cP至约3cP、约1.55cP至约2.5cP、或约1.6cP至约2cP的粘度。在某些实施方案中，生物材料在37℃具有约1.0cP至约1.15cP的粘度。在37℃的粘度可以为约1.0cP、约1.01cP、约1.02cP、约1.03cP、约1.04cP、约1.05cP、约1.06cP、约1.07cP、约1.08cP、约1.09cP、约1.10cP、约1.11cP、约1.12cP、约1.13cP、约1.14cP、或约1.15cP。在另一个实施方案中，生物材料是明胶溶液。明胶在溶液中以约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％或约1％(w/v)存在。在一个实例中，生物材料是PBS中的0.75％(w/v)明胶溶液。在某些实施方案中，0.75％(w/v)溶液在25℃具有约1.6cP至约2cP的粘度。在某些实施方案中，0.75％(w/v)溶液在37℃下具有约2cP的粘度。在某些实施方案中，0.75％(w/v)溶液在37℃下具有约1.07cP至约1.08cP的粘度。明胶溶液可以在PBS、DMEM或其它合适的溶剂中提供。
在另一方面，配制剂含有与第二生物材料组合的生物活性细胞，所述第二生物材料从配制时间到施用于受试者后的时间点为组合的细胞提供有利的环境。在某些实施方案中，由第二生物材料提供的有利环境涉及在生物材料中施用细胞的优点，该生物材料保持结构完整性，直至对受试者施用的点以及在施用之后持续一段时间。在某些实施方案中，植入后第二生物材料的结构完整性为数分钟、数小时、数天或数周。在某些实施方案中，结构完整性小于1个月、小于1周、小于1天或小于1小时。相对短期的结构完整性提供了配制剂，该配制剂可以在受控处理、放置或分散的情况下将活性剂和生物材料递送到组织或器官中的目标位置，而不是掺入元件与接受其放置的组织或器官的相互作用的阻碍或屏障。
在某些实施方案中，第二生物材料是温度敏感性生物材料，其与第一生物材料具有不同的敏感性。第二生物材料可具有(i)在约环境温度以下为基本上固体状态，和(ii)在约37℃以上为基本上液体状态。在某些实施方案中，环境温度为约室温。
在某些实施方案中，第二生物材料是交联珠。如本文所述，取决于交联程度，交联珠可以具有可微调的体内停留时间。在某些实施方案中，交联珠包含生物活性细胞，并且如本文所述对酶促降解具有抗性。本公开内容的配制剂可包括与生物活性剂，例如生物活性细胞组合的第一生物材料，具有或不具有与生物活性剂，例如生物活性细胞组合的第二生物材料。在配制剂包括第二生物材料的情况下，它可以是温度敏感珠和/或交联珠。
在另一方面，本公开内容提供了含有生物材料的配制剂，所述生物材料在约几分钟、几小时或几天的一段时间内降解。这与大量专注于固体材料的植入的工作形成对比，所述固体材料然后在数天、数周或数月内缓慢降解。在某些实施方案中，生物材料具有以下特征中的一个或多个：生物相容性、生物降解性/生物可吸收性、在植入受试者之前和期间基本上固体状态、在植入之后结构完整性(基本上固体状态)的丧失和支持细胞存活力和增殖的细胞相容性环境。生物材料在植入期间保持植入颗粒间隔开的能力增强了天然组织的向内生长。生物材料还促进了固体配制剂的植入。由于固体单元的插入有助于防止递送的材料在植入期间分散在组织内，生物材料提供了本文描述的配制剂的定位。对于基于细胞的配制剂，与悬浮于流体中的细胞相比，固体生物材料还改善了贴壁依赖性细胞的稳定性和存活力。然而，结构完整性的短持续时间意味着植入后不久，生物材料不对组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供明显的障碍。
一方面，本公开内容提供了含有生物材料的配制剂，所述生物材料以基本上固体的形式植入，然后在植入体内后液化/融化或丧失结构完整性。这与大量专注于材料的用途的工作形成对比，所述材料可以以液体形式注射，然后在体内固化。
生物相容性珠
在另一方面，配制剂包括本文所述的温度敏感性生物材料和含有生物材料的生物相容性珠的群体。在某些实施方案中，珠是交联的。交联可使用本领域普通技术人员已知的任何合适的交联剂来实现，诸如例如碳二亚胺；醛(例如糠醛、丙烯醛、甲醛、戊二醛、甘油醛)，基于琥珀酰亚胺的交联剂{双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、戊二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS2G)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)}；环氧化物(乙二醇二缩水甘油醚，1,4丁二醇二缩水甘油醚)；糖类(葡萄糖和醛糖)；磺酸和对甲苯磺酸；羰基二咪唑；京尼平；亚胺；酮；叠氮膦酸二苯酯(DDPA)；对苯二酰氯；六水合硝酸铈(III)；微生物转谷氨酰胺酶；和过氧化氢。本领域普通技术人员将理解根据本公开内容使用的其它合适的交联剂和交联方法。
在某些实施方案中，珠是碳二亚胺交联珠。碳二亚胺交联珠可以与选自下组的碳二亚胺交联：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)，DCC-N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIPC)。预计用较低浓度的EDC处理的珠具有更多数目的游离伯胺，而用高浓度的交联剂处理的样品将使大多数伯胺参与酰胺键。在335nm处可通过分光光度法检测到的伯胺和苦基磺酸之间的共价键形成的橙色强度与样品中存在的伯胺数目成正比。将样品中存在的每毫克蛋白质标准化后，可以观察到存在的游离胺数目与用于交联的EDC初始浓度之间呈反相关。该结果指示不同的珠交联，这取决于反应中所用的碳二亚胺的量。通常，与未交联珠相比，交联珠表现出减少的游离伯胺数目。
与非交联的生物相容性珠相比，交联珠对酶促降解具有降低的易感性，从而为珠提供了可微调的体内停留时间。例如，交联珠对内源酶如胶原酶具有抗性。提供交联珠是递送系统的一部分，其促进以下一种或多种：(a)将附着的细胞递送至期望的部位，并为天然组织和血管供应的再生和向内生长创造空间；(b)能够在该部位持续足够长的时间，以使细胞能够建立，运行，重塑其微环境并分泌其自身的胞外基质(ECM)；(c)促进移植细胞与周围组织的整合；(d)以基本上固体状态形式植入细胞的能力；(e)短期结构完整性，其不对组织的向内生长、新生血管发生或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供重大的障碍；(f)以基本上固体的形式定位体内递送，从而防止细胞在植入期间在组织内分散；(g)与悬浮于流体中的细胞相比贴壁依赖性细胞的稳定性和活力得到改善；(h)当1)以基本上固体的形式(例如，附着于珠)，和2)以基本上液体的形式(例如，悬浮于流体中)递送细胞时的双相释放概况；i)这些生物活性细胞群体来源的三维生物生态位或肾实质的重演或模仿。
在某些实施方案中，本公开内容提供了含有明胶的交联珠。非交联的明胶珠不适合生物活性细胞配制剂，因为它们迅速失去完整性并且细胞从注射部位消散。相反，高度交联的明胶珠可以在注射部位持续太长时间，并可以阻碍新生ECM分泌、细胞整合、血管生成和组织再生。本公开内容允许微调交联珠的体内停留时间。为了调整生物材料的生物降解性，使用了碳二亚胺的不同交联剂浓度，而所有样品的总反应条件保持恒定。例如，可以通过将交联剂的浓度从约0变化到约1M来微调碳二亚胺交联珠的酶促易感性。在一些实施方案中，浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。交联剂浓度也可以是约0.15M、约0.2M、约0.25M、约0.3M、约0.35M、约0.4M、约0.45M、约0.5M、约0.55M、约0.6M、约0.65M、约0.7M、约0.75M、约0.8M、约0.85M、约0.9M、约0.95M、或约1M。在某些实施方案中，交联剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在某些实施方案中，EDC交联珠是明胶珠。可以根据交联剂的浓度微调珠的降解％。在某些实施方案中，可以将明胶珠与除明胶以外的珠或微粒(例如但不限于海藻酸盐或HA)混合以额外地促进被递送的生物活性细胞群体的效力。
交联珠可以具有有利于生物活性细胞群体的接种、附着或包囊的某些特征。例如，珠可以具有多孔表面和/或可以是基本上中空的。孔的存在提供了增加的细胞附着表面，与无孔或光滑的表面相比，允许附着更大数目的细胞。另外，孔结构可以支持宿主组织与多孔珠的整合，从而支持新生组织的形成。珠具有可以拟合到对应于一般颗粒分布模式的Weibull图的大小分布。在某些实施方案中，交联珠具有小于约120μm、约115μm、约110μm、约109μm、约108μm、约107μm、约106μm、约105μm、约104μm、约103μm、约102μm、约101μm、约100μm、约99μm、约98μm、约97μm、约96μm、约95μm、约94μm、约93μm、约92μm、约91μm、或约90μm的平均直径。交联珠的特性根据铸造工艺而变化。例如，使用下述工艺来提供具有上述特征的珠，在所述工艺中使用空气流雾化液体明胶溶液并将其用薄层色谱试剂喷雾器(ACEGlassware)喷雾到液氮中的。本领域技术人员将认识到，调节铸造工艺的参数提供了调整珠的不同特性，例如不同大小分布的机会。在某些实施方案中，珠的微观形貌、表面和内部特性可以进一步修饰以促进细胞附着。
在配制之前，使用细胞培养技术在体外评估交联珠的细胞相容性，其中将珠与对应于最终生物活性细胞配制剂的细胞一起培养。例如，在制备生物活性肾细胞配制剂之前，先将珠与原代肾细胞一起培养，然后使用活/死细胞测定法来确认细胞相容性。除细胞存活力之外，用于测量细胞代谢活性、某些关键细胞因子、生长因子和外来体的分泌以及某些关键蛋白质和核酸标志物，包括与功能性生物活性肾细胞群体相关的miRNA的表达的特定功能测试是本领域普通技术人员公知的，并且在与交联珠一起配制时还可用于确认细胞效力。
在某些配制剂中，以溶液体积的约5％(w/w)至约15％(w/w)在溶液中将生物相容性交联珠与温度敏感生物材料组合。交联珠可以以溶液体积的约5％(w/w)、约5.5％(w/w)、约6％(w/w)、约6.5％(w/w)、约7％(w/w)、约7.5％(w/w)、约8％(w/w)、约8.5％(w/w)、约9％(w/w)、约9.5％(w/w)、约10％(w/w)、约10.5％(w/w)、约11％(w/w)、约11.5％(w/w)、约12％(w/w)、约12.5％(w/w)、约13％(w/w)、约13.5％(w/w)、约14％(w/w)、约14.5％(w/w)、或约15％(w/w)存在。
另一方面，本公开内容提供了包含生物材料的配制剂，所述生物材料在约几分钟、几小时或几天的一段时间内降解。这与专注于植入固体材料的大量工作形成对比，所述固体材料然后在数天、数周或数月内缓慢降解。
另一方面，本公开内容提供了具有生物相容性交联珠的配制剂，所述生物相容性的交联珠接种有与递送基质一起的生物活性细胞。在某些实施方案中，递送基质具有以下特征中的一个或多个：生物相容性、生物降解性/生物再吸收性、在植入受试者之前和期间的基本上固体状态、在植入之后结构完整性(基本上固体状态)的丧失以及支持细胞存活力的细胞相容性环境。递送基质在植入期间保持植入的颗粒(例如，交联珠)间隔开来的能力增强天然组织的向内生长。若不存在递送基质，则在植入期间细胞化珠的压实可以导致没有足够的空间供足够的组织向内生长。递送基质促进固体配制剂的植入。另外，结构完整性的短持续时间意味着植入后不久，基质不对组织向内生长、新生血管发生或所递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供重大的屏障。由于固体单元的插入有助于防止递送的材料在植入期间分散在组织内，因此递送基质提供了本文所述配制剂的定位。在某些实施方案中，如本文所述的递送基质的应用有助于防止在递送至肾实质中时通过排尿而快速损失植入的细胞。对于基于细胞的配制剂，与悬浮于流体中的细胞相比，固体递送基质改善了贴壁依赖性细胞的稳定性和存活力。
在某些实施方案中，递送基质是未接种细胞的生物相容性珠的群体。在某些实施方案中，未接种的珠分散在各个细胞接种的珠之中和之间。未接种的珠在移植之前和之后立即作用为经细胞接种的珠之间的“间隔珠”。间隔珠含有在第一温度下具有基本上固体状态并且在第二温度下具有基本上液体状态的温度敏感生物材料，其中第一温度低于第二温度。例如，间隔珠含有在约环境温度以下基本上固体状态并且在约37℃基本上液体状态的生物材料，诸如本文所述的生物材料。在某些实施方案中，环境温度为约室温。在某些实施方案中，生物材料是明胶溶液。明胶溶液以约4％，约4.5％，约5％，约5.5％，约6％，约6.5％，约7％，约7.5％，约8％，约8.5％，约9％，约9.5％，约10％，约10.5％或约11％(w/v)存在。明胶溶液可以在PBS、细胞培养基(例如，DMEM)或另一种合适的溶剂中提供。在某些实施方案中，生物材料是透明质酸。在某些实施方案中，生物材料是衍生自人或动物肾的脱细胞化的胞外基质，其可以进一步重构为水凝胶。
一方面，本公开内容提供了包含生物材料的配制剂，所述生物材料以基本上固体的形式(例如间隔珠)植入，然后在植入体内后液化/熔化或以其它方式丧失结构完整性。这与专注于使用下述材料的大量工作形成对比，所述材料可以以液体注射，然后在体内固化。
间隔珠的温度敏感性可以在配制之前在体外评估。间隔珠可以标记并与未标记的非温度敏感珠混合。然后将该混合物在37℃下温育以观察物理转变的变化。随时间观察到标记的温度敏感性珠在较高温度下的形状损失。例如，温度敏感性明胶珠可以用阿尔辛蓝染料制成以充当物理转变的标志物。将蓝色明胶珠与交联珠(白色)混合，加载到导管中，然后挤出并在37℃的1X PBS(pH 7.4)中温育。在不同的时间点以显微镜观察蓝色明胶珠的形状损失。30分钟后可见蓝色明胶珠的物理状态变化，随着延长的温育时间变得更加明显。由于材料的粘性，珠不完全消散。
改良释放配制剂
一方面，本发明的配制剂以改良释放配制剂提供。通常，改良释放特征在于施用后第一活性剂的初始释放，然后第二活性剂的至少一个另外的随后释放。第一和第二活性剂可以相同或它们可以不同。在某些实施方案中，配制剂通过同一配制剂中的多种组分提供改良释放。在某些实施方案中，改良释放配制剂含有作为第一组分的一部分的活性剂，其允许活性剂在整个配制剂体积中自由移动，从而允许在施用后在靶部位处立即释放。第一组分可以是具有基本上液相和基本上固相的温度敏感性生物材料，其中在施用时第一组分处于基本上液相。在某些实施方案中，活性剂为基本上液相，使得其在配制剂的整个体积中基本上是自由移动的，因此在施用后立即释放至靶部位。
在某些实施方案中，改良释放配制剂具有作为第二组分的一部分的活性剂，其中活性剂附着于第二组分，在第二组分上沉积，用第二组分包被，在第二组分中包埋，接种于第二组分上或在第二组分中俘获，所述第二组分在施用于靶部位之前和之后持续存在。第二组分含有活性剂能够与之缔合的结构元件，从而在施用时防止活性剂立即从第二组分释放。例如，第二组分以基本上固体的形式提供，例如生物相容的珠，其可以被交联以防止或延迟体内酶促降解。在某些实施方案中，基本上固相的活性剂在施用之前和之后在配制剂内保持其结构完整性，因此在施用后它不会立即将活性剂释放到靶部位。本文已经描述了用于改良释放配制剂的合适载体，但是本领域普通技术人员将理解适合用于本公开内容的其它载体。
在某些实施方案中，配制剂提供递送的元件(包括细胞、纳米颗粒、治疗性分子等)的初始快速递送/释放，接着随后延迟释放元件。可溶的且作为源自肾或其它细胞群体的分泌性生物活性产物的外来体、miRNA和其它生物活性核酸或蛋白质分子的初始快速递送/释放。本领域普通技术人员理解与再生生物活性有关的其它分子或治疗剂。本公开内容的配制剂可以设计用于此类双相释放概况，其中要递送的药剂以未附着形式(例如，溶液中的细胞)和附着形式(例如，细胞与珠或另一种合适的载体一起)提供。初次施用时，未阻碍的药剂被立即提供到递送部位，而受阻碍的药剂的释放被延迟直到载体(例如珠)的结构完整性失效，此时先前附着的药剂被释放。如下所讨论，本领域普通技术人员将理解其它合适的释放机制。
释放的时间延迟可根据活性剂的性质进行调节。例如，在生物活性细胞配制剂中释放的时间延迟可以为约数秒、数分钟、数小时或数天。在某些情况下，约数周的延迟可以是合适的。对于其它活性剂，例如小分子或大分子，在配制剂中释放的时间延迟可以为约数秒、数分钟、数小时、数天、数周或数月。该配制剂还可能包含提供不同延时释放概况的不同生物材料。例如，具有第一活性剂的第一生物材料可以具有第一释放时间，并且具有第二活性剂的第二生物材料可以具有第二释放时间。第一和第二活性剂可以相同或不同。
如本文所讨论的，延迟释放的时间段通常可以对应于生物材料的结构完整性丧失的时间段。然而，本领域普通技术人员将理解延迟释放的其它机制。例如，活性剂可以随时间连续释放，而与任何特定生物材料的降解时间无关，例如药物从聚合物基质中的扩散。另外，生物活性细胞可以从含有生物材料和生物活性细胞的配制剂迁移到天然组织。在某些实施方案中，生物活性细胞从生物材料例如珠迁移到天然组织。在一个实施方案中，生物活性细胞从生物材料迁移到天然组织并诱导与再生生物活性有关的生长因子、细胞因子、外来体、miRNA和其它核酸和蛋白质的分泌。在某些实施方案中，外来体和其它胞外囊泡以及miRNA、其它生物活性核酸和蛋白质从生物材料中迁移出来。在又一个实施方案中，生物活性细胞从生物材料迁移至天然组织并介导宿主干细胞和祖细胞的动员，然后所述宿主干细胞和祖细胞向损伤或疾病位置迁移或归巢。
可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。通过在配制剂中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射配制剂的延长吸收。制备此类配制剂的许多方法已获得专利或是本领域技术人员通常已知的。参见例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。适用于多肽剂的控释或延迟释放的其它方法描述于例如美国专利号6,306,406和6,346,274，以及例如美国专利申请号US20020182254和US20020051808。
4.生物活性细胞配制剂
本文所述的生物活性细胞配制剂包含由上述生物材料制成的可植入构建体，其具有本文所述的生物活性肾细胞，用于治疗有需要的受试者的肾疾病。在某些实施方案中，构建体由生物相容性材料或生物材料、支架或基质制成，所述生物相容性材料或生物材料、支架或基质包含一种或多种合成或天然存在的生物相容的材料和通过附着和/或俘获在支架表面上沉积或支架表面中包埋的本文中所述的一种或多种细胞群体或细胞混合物。在某些实施方案中，构建体由以下制成：生物材料和用生物材料组分包被，在生物材料组分上沉积，在生物材料组分中沉积，附着于生物材料组分，在生物材料组分中俘获，在生物材料组分中包埋，接种或与生物材料组分组合的本文中所述的一种或多种细胞群体或细胞混合物。本文所述的任何细胞群，包括富集的细胞群体或其混合物可以与基质结合使用以形成构建体。在某些实施方案中，生物活性细胞制剂由生物相容性材料或生物材料和本文所述的SRC群体制成。在某些实施方案中，生物活性细胞制剂由生物相容性材料或生物材料和SRC细胞群体与另一种细胞群体的混合物制成，所述另一种细胞群体可以包括但不限于内皮祖细胞、间充质干细胞和衍生自脂肪基质血管级份的细胞。
新肾增强剂描述和组成
在某些实施方案中，生物活性细胞配制剂是新肾增强剂(NKA)，其是由在生物材料(基于明胶的水凝胶)中配制的自体选定的肾细胞(SRC)构成的可注射产品。一方面，如下获得自体SRC：通过肾活组织检查从患者的肾皮质组织中分离和扩增肾细胞，并通过跨越密度边界、屏障或界面的离心扩增的肾细胞进行选择。在某些实施方案中，如下获得自体SRC：通过肾活组织检查从患者的肾皮质组织中分离和扩增肾细胞，以及在连续或不连续的单步或多步密度梯度中选择扩增的肾细胞。SRC主要由肾小管上皮细胞组成，所述肾小管上皮细胞在其再生潜力上是公知的(Humphreys等人(2008)Intrinsic epithelial cells repairthe kidney after injury.Cell Stem Cell.2(3):284-91)。其它实质(血管)和基质(收集管)细胞可以稀疏存在于自体SRC群体中。在临床前研究中，将SRC注射到受体肾中可显著改善动物存活率、尿液浓度和过滤功能。然而，SRC具有有限的货架期和稳定性。在基于明胶的水凝胶生物材料中的SRC配制剂可以提供增强的细胞稳定性，从而延长产品的货架期，在将NKA转运和递送至肾皮质用于临床效用期间改善NKA的稳定性。
另一方面，通过首先使用临床护理标准肾活组织检查程序从供体/接受者获得肾皮质组织来生产NKA。通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，并使用标准细胞培养技术进行扩增。细胞培养基设计用于扩增原代肾细胞，并且不含任何分化因子。使收获的肾细胞跨越密度边界或界面或密度梯度进行分离以获得SRC。
温度敏感性配制剂
本公开内容的一方面还提供了一种由生物材料制成的配制剂，该生物材料被设计或适于响应如本文所述的外部条件。因此，构建体中生物活性细胞群体与生物材料的关联的性质将根据外部条件而改变。例如，细胞群体与温度敏感性生物材料的关联会随温度而变化。在某些实施方案中，构建体包含生物活性肾细胞群体和生物材料，所述生物材料在约8℃以下具有基本上固体状态和在约环境温度以上具有基本上液体状态，其中细胞群体在约8℃以下悬浮于生物材料中。然而，细胞群体在约环境温度以上基本上可以在整个生物材料的体积中自由移动。与流体中的细胞相比，使细胞群体在较低的温度下悬浮于基本上固相中为细胞，例如贴壁依赖性细胞提供了稳定性优势。此外，使细胞悬浮于基本上固体状态中提供了以下一项或多项益处：i)防止细胞沉降，ii)允许细胞以悬浮状态维持锚定于生物材料；iii)使细胞在整个生物材料的体积中保持更均匀分散；iv)防止细胞聚集体的形成；和v)在配制剂的贮存和运输期间为细胞提供更好的保护。可以保留此类特征直至向受试者施用的配制剂是有利的，至少是因为配制剂中细胞的整体健康将是更好的并且将施用更均匀一致的细胞剂量。
在一个优选的实施方案中，用于将SRC配制成NKA的基于明胶的水凝胶生物材料是溶于缓冲液中以形成热响应性水凝胶的猪明胶。此水凝胶在室温呈流体，但在冷却至冷藏温度(2-8℃)时胶凝。用水凝胶配制SRC，以获得NKA。NKA通过冷却胶凝，并在冷藏温度(2-8℃)下运送到诊所。NKA具有3天的货架期。在临床现场，将产品加热到室温后，之后注入患者的肾中。使用适合通过经皮或腹腔镜程序递送NKA的针和注射器将NKA植入肾皮质中。在某些实施方案中，水凝胶衍生自明胶或重组起源的另一种胞外基质蛋白。在某些实施方案中，水凝胶衍生自源自肾或另一组织或器官的胞外基质。在某些实施方案中，水凝胶衍生自重组胞外基质蛋白。在某些实施方案中，水凝胶包含衍生自重组胶原的明胶(即重组明胶)。
生产过程
在某些实施方案中，生物活性细胞配制剂的生产过程被设计为在从患者活组织检查到产品植入物的约四个周内递送产品。患者与患者之间固有的组织变异性给以固定的植入日程表递送产品提出了挑战。扩增的肾细胞按常规在细胞扩增期间进行冷冻保存，以在细胞扩增中适应此种患者依赖性变化。若需要另一种治疗(例如，由于患者疾病，不可预见的过程事件等导致的延迟)，并且需要根据需要生产多剂以进行再植入，则冷冻保存的肾细胞提供持续的细胞来源。
对于生物活性细胞配制剂包含生物材料(基于明胶的水凝胶)中配制的自体同质细胞的实施方案，最终的组合物可以是在具有Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)的明胶溶液中每mL约20x106个细胞至每mL约200x106个细胞。在一些实施方案中，每mL产品的细胞数目为约20x106个细胞/mL、约40x106个细胞/mL、约60x106个细胞/mL、约100x106个细胞/mL、约120x106个细胞/mL、约140x106个细胞/mL、约160x106个细胞/mL、约180x106个细胞/mL、或约200x106个细胞/mL。在一些实施方案中，明胶在溶液中以约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％或约1％(w/v)存在。在一个实例中，生物材料是DPBS中的0.88％(w/v)明胶溶液。
在一个优选的实施方案中，NKA在无菌的一次性10mL注射器中呈现。从NKA的浓度100x106 SRC/mL和3.0x106 SRC/g肾重量的目标剂量(通过MRI估算)计算最终体积。剂量也可以由外科医生在注射时根据患者的肾重量来确定。
此种开发NKA的方法是基于活性生物成分SRC的广泛科学评估(Bruce等人(2011)Exposure of Cultured Human Renal Cells Induces Mediators of cell migrationand attachment and facilitates the repair of tubular cell monolayers invitro.Experimental Biology,Washington,DC,于www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Bruce-EB2011-podium_com pressed_Final-AB.pdf可得；Ilagan等人(2010a)Exosomes derived from primary renal cells contain microRNAs that canpotentially drive therapeutically-relevant outcomes in models of chronickidney disease.TERMIS Conference,Orlando,FL；Ilagan等人(2010b)Secreted Factorsfrom Bioactive Kidney Cells Attenuate NF-kappa-B.TERMIS Conference,Orlando,FL于www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Ilagan-2010-TERMIS-poster-FINAL.pdf得到；Ilagan等人(2009)Characterization of primary adult canine renalcells(CRC)in a three-dimensional(3D)culture system permissive for ex vivonephrogenesis.KIDSTEM Conference,Liverpool,England,UK；Kelley等人(2012)APopulation of Selected Renal Cells Augments Renal Function and ExtendsSurvival in the ZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy.CellTransplant 22(6),1023-1039；Kelley等人(2011)Intra-renal Transplantation ofBioactive Renal Cells Preserves Renal Functions and Extends Survival in theZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy.ADA Conference,San Diego,CA,于www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/ADA-2011-rwk_Tengion-FI NAL.pdf得到；Kelley等人(2010a)A tubular cell-enriched subpopulation of primary renalcells improves survival and augments kidney function in a rodent model ofchronic kidney disease.Am J Physiol Renal Physiol.299(5),F1026-1039；Kelley等人(2010b)Bioactive Renal Cells Augment Kidney Function In a Rodent Model OfChronic Kidney Disease.ISCT Conference,Philadelphia,PA于www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2010-ISCT-podium-F INAL.pdf可得到；Kelley等人(2008)Enhanced renal cell function in dynamic3D culture system.KIDSTEMConference,Liverpool,England,UK available at www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2008-KIDSTEM-pos ter-SEP2008_v1.pdf；Kelley等人(2010c)Bioactive Renal Cells Augment Renal Function in the ZSF1 model of DiabeticNephropathy.TERMIS Conference,Orlando,FL于www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2010-TERMIS-FINA L.pdf可得到；Presnell等人(2010)Isolation,Characterization,and Expansion(ICE)methods for Defined PrimaryRenal Cell Populations from Rodent,Canine,and Human Normal and DiseasedKidneys.Tissue Engineering Part C Methods.17(3):261-273；Presnell等人(2009)Isolation and characterization of bioresponsive renal cells from human andlarge mammal with chronic renal failure.Experimental Biology,New Orleans,LA于www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Presnell-EB-poster-APR2009.pdf可得到；Wallace等人(2010)Quantitative Ex Vivo Characterization of Human RenalCell Population Dynamics via High-Content Image-Based Analysis(HCA).ISCTConference,Philadelphia,PA于www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Wallace-2010-ISCT-podium-FINAL.pdf可得到；Yamaleyeva等人(2010)Primary HumanKidney Cell Cultures Containing Erythropoietin-Producing Cells Improve RenalInjury.TERMIS Conference,Orlando,FL.)。在某些实施方案中，SRC是天然参与肾修复和再生的自体同质细胞群体。在一系列的非临床药理学、生理学和力学生物学研究中，定义了SRC的特征，并证明了通过增强肾结构和功能来延迟CKD进展的能力(Presnell等人WO/2010/056328和Ilagan等人PCT/US2011/036347)。
可以为配制剂选择细胞总数，并且可以调节配制剂的体积以达到合适的剂量。在一些实施方案中，配制剂可含针对受试者的细胞剂量，该剂量是单剂量或单剂量加上另外的剂量。在某些实施方案中，可以通过如本文所述的构建体提供剂量。本文所述的生物活性肾细胞群体或肾细胞群体的混合物的治疗有效量的范围可以从受试者安全接收的最大细胞数目至治疗肾疾病，例如稳定化、降低的下降速率、或一种或多种肾功能的改善必需的最小细胞数目。
本文所述的生物活性肾细胞群体或其混合物的治疗有效量也可以悬浮于药学上可接受的载体或赋形剂中。此类载体包括但不限于基础培养基加上1％的血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、胶原蛋白、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纤维素及其组合。配制剂应适合于施用方式。
根据常规程序将生物活性肾细胞配制剂或其混合物或组合物配制成适于对人施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用、动脉内施用或在肾囊内施用的组合物例如是无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含局部麻醉剂以减轻注射部位的任何疼痛。通常，成分在密闭容器中，例如指示活性剂量的安瓿中以单位剂型单独提供或混合在一起提供，例如作为冷冻保存的浓缩物。当组合物通过输注施用时，其可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以便可以在施用之前将成分混合。
药学上可接受的载体部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法决定。因此，存在极其多种合适的药物组合物配制剂(参见，例如Alfonso R Gennaro(ed),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,formerly Remington'sPharmaceutical Sciences第20版,Lippincott,Williams&Wilkins,2003，通过引用完整并入本文)。通常将药物组合物配制成无菌的基本上等张的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。
细胞存活力剂
一方面，生物活性细胞配制剂进一步包含细胞存活力剂。在某些实施方案中，细胞存活力剂选自下组：抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子、基质金属蛋白酶、伤口愈合因子和从生物活性细胞分泌的产物。
抗氧化剂的特征在于抑制其它分子的氧化的能力。抗氧化剂包括但不限于以下一种或多种：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷-2-羧酸类胡萝卜素、类黄酮、异黄酮、泛醌、谷胱甘肽、硫辛酸、超氧化物歧化酶、抗坏血酸、维生素E、维生素A、混合类胡萝卜素(例如，beta胡萝卜素、alpha胡萝卜素、gamma胡萝卜素、叶黄素、八氩茄红素(Phytopene)，六氢番茄红素(phytofluene)和虾青素)、硒、辅酶Q10、吲哚-3-甲醇、原花色素、白藜芦醇、槲皮素、儿茶素、水杨酸、姜黄素、胆红素、草酸、植酸、硫辛酸、香草酸、多酚、阿魏酸、茶黄素及其衍生物。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的抗氧化剂。
氧载体是特征在于能够携带和释放氧气的试剂。它们包括但不限于全氟化碳和含有全氟化碳的药物。合适的基于全氟化碳的氧载体包括但不限于全氟辛基溴(C8F17Br)；perfluorodichorotane(C8F16C12)；全氟癸基溴；perfluobron；全氟萘烷；perfluorotripopylamine；全氟甲基环哌啶；(全氟萘烷和perfluorotripopylamine)；
Figure BDA0002288862140000542
(全氟萘烷和全氟甲基环哌啶)；(全氟癸基溴和perfluobron)；OcycyteTM(全氟(叔丁基环己烷))。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的基于全氟化碳的氧载体。
免疫调节因子包括但不限于骨桥蛋白、FAS配体因子、白介素、转化生长因子beta、血小板衍生生长因子、簇蛋白、转铁蛋白、作用后调节因子(regulated upon action)、正常T细胞表达因子(normal T-cell expressed)、分泌蛋白(RANTES)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(Pai-1)、肿瘤坏死因子alpha(TNF-alpha)、白介素6(IL-6)、alpha-1微球蛋白和beta-2-微球蛋白。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的免疫调节因子。
抗炎剂或免疫抑制剂(如下所述)也可以是配制剂的一部分。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的抗氧化剂。
细胞募集因子包括但不限于单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和CXCL-1。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的细胞募集因子。
细胞附着因子包括但不限于纤连蛋白、前胶原、胶原蛋白、ICAM-1、结缔组织生长因子、层粘连蛋白、蛋白聚糖、特定的细胞粘附肽，例如RGD和YSIGR。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的细胞附着因子。
血管生成因子包括但不限于血管内皮生长因子F(VEGF)和血管生成素2(ANG-2)。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的血管生成因子。
基质金属蛋白酶包括但不限于基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)以及组织抑制剂和金属蛋白酶-1(TIMP-1)。
伤口愈合因子包括但不限于角质形成细胞生长因子1(KGF-1)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、钙结合蛋白、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)、三叶因子3(trefoilfactor 3)。本领域普通技术人员将理解可以在本公开内容的某些实施方案中使用其它合适的伤口愈合因子。
本文所述的生物活性细胞的分泌产物也可以作为细胞存活力剂添加到生物活性细胞配制剂中。
源自人或动物来源的体液、组织或器官的组合物(包括但不限于人血浆/人血小板裂解物、牛胎血浆或牛垂体提取物)也可以作为细胞存活力试剂添加到生物活性细胞配制剂中。
本领域普通技术人员将理解，存在沉积细胞群体或以其它方式组合细胞群体与生物材料以形成构建体的几种合适的方法。
5.使用方法
一方面，本公开内容的构建体和配制剂适用于本文所述的使用方法。在某些实施方案中，可以施用本公开内容的配制剂以治疗疾病。例如，可以将生物活性细胞作为本文所述配制剂的一部分施用于天然器官。在某些实施方案中，生物活性细胞可源自作为施用对象的天然器官或源自非靶天然器官的来源。
在某些实施方案中，本公开内容提供了用如本文所述的含有生物活性肾细胞群体的配制剂在有需要的受试者中治疗肾疾病的方法。在某些实施方案中，治疗配制剂含有选定的肾细胞群体或其混合物。在实施方案中，配制剂适合于施用于需要改善的肾功能的受试者。
另一方面，可以经由各种肾功能指标来观察通过本公开内容的方法对受试者的肾疾病的有效治疗。在某些实施方案中，肾功能的指标包括但不限于血清白蛋白、白蛋白与球蛋白比率(A/G比)、血清磷、血清钠、肾大小(可通过超声测量)、血清钙、磷:钙比率、血清钾、蛋白尿、尿肌酸酐、血清肌酸酐、血尿素氮(BUN)、胆固醇水平、甘油三酯水平和肾小球滤过率(GFR)。此外，一般健康状况的几个指标包括但不限于体重增加或减少、存活、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)和身体耐力表现。
在另一方面，通过肾功能的一种或多种指标的稳定化证明了用生物活性肾细胞配制剂的有效治疗。通过观察与尚未通过本公开内容的方法治疗的受试者中的相同指示相比通过本公开内容的方法治疗的受试者中的指标变化来证明肾功能的稳定化。或者，可以通过观察与治疗之前的相同受试者中的相同指标相比通过本公开内容的方法治疗的受试者中的指标变化来证明肾功能的稳定化。第一指标的变化可以是值的增加或减少。在某些实施方案中，本公开内容提供的治疗可以包括使受试者中的血液尿素氮(BUN)水平稳定化，其中与尚未通过本公开内容的方法治疗的具有相似疾病状态的受试者相比，在受试者中观察到的BUN水平更低。在另一个实施方案中，治疗可以包括使受试者中的血清肌酸酐水平稳定化，其中与尚未通过本公开内容的方法治疗的具有相似疾病状态的受试者相比，在受试者中观察到的血清肌酸酐水平更低。在某些实施方案中，一种或多种上述肾功能指标的稳定化是用选定的肾细胞配制剂治疗的结果。
本领域普通技术人员将理解，可以测量本文所述或本领域已知的一种或多种其它指标以确定受试者中肾疾病的有效治疗。
在另一方面，通过一种或多种肾功能指标的改善证明了用生物活性肾细胞配制剂的有效治疗。在某些实施方案中，生物活性肾细胞群体提供了改善水平的血清血尿素氮(BUN)。在某些实施方案中，生物活性肾细胞群体提供了血清中蛋白质的改善的保留。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，生物活性肾细胞群体提供了改善的血清白蛋白水平。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，生物活性肾细胞群体提供了改善的A:G比率。在某些实施方案中，生物活性肾细胞群体提供了改善的血清胆固醇和/或甘油三酯水平。在某些实施方案中，生物活性肾细胞群体提供了改善水平的维生素D水平。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，生物活性肾细胞群体提供了改善的磷:钙比率。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，生物活性肾细胞群体提供了改善的血红蛋白水平。在另一个实施方案中，与非富集的细胞群体相比，生物活性肾细胞群体提供了改善的血清肌酸酐水平。在又一个实施方案中，与非富集的细胞群体相比，生物活性肾细胞群体提供了改善的血细胞比容水平。在某些实施方案中，一种或多种上述肾功能指标的改善是用选定的肾细胞配制剂治疗的结果。
在另一方面，本公开内容提供了用于在有需要的受试者中再生天然肾的方法中的配制剂。在某些实施方案中，方法包括向受试者施用或植入本文所述的生物活性细胞群体、混合物或构建体的步骤。再生的天然肾可以通过许多指标来表征，包括但不限于天然肾中的功能或能力的形成、天然肾中的功能或能力的改善和天然肾中某些标志物的表达。在某些实施方案中，可以基于上文所述的肾功能的各种指标观察到形成或改善的功能或能力。在某些实施方案中，再生的肾通过一种或多种干细胞标志物的差异表达表征。干细胞标志物可以是以下一种或多种：SRY(性别决定区域Y)-框2(Sox2)；未分化的胚胎细胞转录因子(UTF1)；小鼠的结同源物(Nodal Homolog from Mouse)(NODAL)；Prominin 1(PROM1)或CD133(CD133)；CD24；及其任何组合(参见Ilagan等人的PCT/US2011/036347，其通过引用完整并入本文)，也参见Genheimer et al.,2012.Molecular characterization of theregenerative response induced by intrarenal transplantation of selected renalcells in a rodent model of chronic kidney disease.Cells Tissue Organs 196:374-384，通过引用完整并入。在某些实施方案中，与对照相比，干细胞标志物的表达是上调的。
一方面，本文提供了治疗受试者中的肾疾病的方法，该方法包括将本文公开的配制剂、组合物或细胞群体注射入受试者中。在某些实施方案中，通过18至30号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于20号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于21号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于22号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于23号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于24号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于25号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于26号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于27号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于28号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于29号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约20号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约21号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。
在某些实施方案中，通过约22号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约23号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约24号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约25号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约26号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约27号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约28号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约29号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。
在某些实施方案中，针的内径小于0.84mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.61mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.51mm。在一些实施例中，针的内径小于0.41mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.33mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.25mm。针的内径小于0.20mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.15mm。在某些实施方案中，针的外径小于1.27mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.91mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.81mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.71mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.64mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.51mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.41mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.30mm。在某些实施方案中，针具有下表中的大小之一：
Figure BDA0002288862140000581
分泌产物
在某些实施方案中，效果可以由细胞本身和/或由细胞分泌的产物提供。再生效果可以通过以下一种或多种表征：上皮-间质转化的减少(其可以经由TGF-β信号传导的减弱)；肾纤维化的减少；肾炎症的减少；天然肾中干细胞标志物的差异表达；移植的细胞和/或天然细胞向肾损伤，例如肾小管损伤的部位的迁移；移植的细胞在肾损伤的部位，例如肾小管损伤的植入；肾功能的一种或多种指标的稳定化(如本文所述)；与肾发生有关的S形状体/弧形形状体的从头形成，肾小管或肾单位的从头形成、红系稳态的恢复(如本文所述)；及其任何组合(还请参见Basu等人，2011.Functional evaluation of primary renalcell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissueengineering.Cell Transplantation 20:1771-90；Bruce et al.,2015.Selected renalcells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney diseasevia NF-κB and TGF-β1pathways.Regenerative Medicine 10:815-839，每篇的全部内容通过引用并入本文)。
作为组织活组织检查的替代方法，可以从体液，例如尿液的检查来评估接受治疗的受试者中的再生结果。已经发现获自受试者来源的尿源的微囊泡包含某些组分，包括但不限于特定蛋白质和miRNA，其最终衍生自通过用本公开的细胞群体治疗而受到影响的肾细胞群体。这些成分可以包括但不限于牵涉干细胞复制和分化、凋亡、炎症和免疫调节、纤维化、上皮-间质转化、TGF-β信号传导和PAI-1信号传导的因素。微囊泡相关miRNA/蛋白表达模式允许连续监测接受本公开内容的细胞群体、混合物或构建体的受试者的肾内的再生结果。
在某些实施方案中，本公开内容提供了评估肾疾病(KD)患者是否响应用治疗配制剂的治疗的方法。该方法可以包括以下步骤：相比于或相对于衍生自用治疗剂治疗前的相同患者的对照样品中的囊泡量，测定或检测从用治疗剂治疗的KD患者获得的测试样品中的囊泡或它们的腔内容物的量，其中与对照样品中的囊泡或它们的腔内容物的量相比测试样品中更高或更低的囊泡或它们的腔内容物的量指示治疗的患者对用治疗剂的治疗的响应性。
这些肾源性囊泡和/或肾源性囊泡的腔内容物也可以脱落到受试者的尿液中，并且可以分析指示再生结果或治疗功效的生物标志物。非侵入性预后方法可包括在施用或植入本文所述的细胞群体、混合物或构建体之前和/或之后从受试者获得尿液样品的步骤。可以使用标准技术从尿液样品中分离出囊泡和其它分泌产物，所述技术包括但不限于离心以除去不需要的碎片(Zhou et al.2008.Kidney Int.74(5):613-621；Skog et al.美国公布专利申请号20110053157，每篇通过引用整体并入本文)，沉淀以从尿液中分离外来体，聚合酶链反应和核酸测序以鉴定特定核酸，以及质谱法和/或2D凝胶电泳以鉴定与再生结果相关的特定蛋白质。
认为前述书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。应当理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变型，并且认为此类修改和变型在如所附权利要求书限定的本发明的范围内。提供以下实施例仅用于说明性目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文中示出和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得明显，并且落入所附权利要求书的范围内。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和文献参考文献均通过引用完整并入本文。
实施例
实施例1：NKA配制剂组分
1.细胞成分和材料
SRC构成NKA的生物活性成分。SRC主要包含肾小管上皮细胞，所述肾小管上皮细胞在其再生潜力上是公知的。自体SRC群体中可以存在其它实质(血管)、间充质、内皮和基质(收集管)细胞。
从使用收集肾组织核心的标准临床护理肾活组织检查程序获得的肾皮质组织制备SRC。通过酶促消化从肾组织中分离出肾细胞，并使用标准细胞培养技术进行扩增。通过在显微镜下肉眼观察培养物来评估细胞以验证肾细胞形态。由于细胞聚簇在一起，培养物特征上表现出紧密的底板或鹅卵石外观(图1)。通过跨越密度边界或密度界面或单步不连续密度梯度分开分离且扩展的细胞来获得SRC。
使用跨越密度边界或界面的离心，基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。在OptiPrep(OptiMEM中的7％的碘克沙醇；60％(w/v))溶液上分离肾细胞悬浮液。离心后以独特团粒收集表现出浮力密度大于约1.0419g/mL的细胞级分(图2)。排除并弃去含有小于1.0419g/mL的浮力密度的细胞。
将SRC团粒重悬于DPBS中。可以通过洗涤步骤最小化最终产品中残留的OptiPrep、FBS、培养基和辅助材料的残留。
2.生物材料成分及辅助材料
使用以下生物材料成分和辅助材料将SRC配制为NKA：
1.猪明胶-用于制备热响应水凝胶。
2.Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)-用于溶解猪明胶。缓冲液可以替换为人血浆或人血小板裂解物或与人血浆或人血小板裂解物混合。
生物材料制备
生物材料是由DPBS中的猪明胶构成的明胶溶液。将明胶溶解于DPBS或人血浆/人血小板裂解物或两者的混合物中至规定浓度，以形成热响应性水凝胶的明胶溶液。将明胶溶液通过0.1μm滤器进行过滤灭菌，然后冷藏或冷冻保存成一次性等分试样，以备配制。
生物材料的关键特性是它是一种热响应性水凝胶，因此它可以在不同的温度下胶凝和液化。在NKA配制剂中使用的明胶溶液在室温(22-28℃)和以上为液体，并在冷却至冷藏温度(2-8℃)时胶凝。
明胶溶液浓度
对范围为0.5-1.0％的明胶浓度测试胶凝性能——在冷藏温度形成凝胶(倒置时无流动)和在室温变成流体(倒置时自由流动)的能力。表4显示了不同浓度的明胶溶液的胶凝特性。
表4–不同浓度的明胶溶液的胶凝特性
Figure BDA0002288862140000611
由于用0.63％及以上的明胶溶液配制的NKA能够始终满足验收标准，因此NKA配制剂的明胶浓度选择为0.88±0.12％的范围。然而，应注意的是，包含浓度范围为约0.63％至约1％的明胶的配制剂也是合适的。
3.NKA配制剂
用明胶溶液(一种基于明胶的热响应水凝胶)将SRC配制成NKA。基于明胶的热响应水凝胶提供改善的细胞的稳定性，从而延长产品的保质期，以及在SRC转运和递送至肾皮质中以用于临床效用期间的稳定性。配制剂开发评估了明胶溶液的组成、浓度和稳定性。
使用锥虫蓝染料排除法对洗涤的SRC进行计数。从冷贮存中取出明胶溶液，并提供温热至26-30℃液化。将包含所需数目细胞的一定体积的SRC悬浮液离心，然后重悬于液化明胶溶液中，以进行最后的洗涤步骤。将该悬浮液离心，并将SRC团粒重悬于足够的明胶溶液中，以在配制的NKA中获得100x106个细胞/mL的所得SRC浓度。
NKA填充和胶凝
将NKA产品无菌填充到注射器中。在填充过程持续时间进行动态空气采样，包括活和非活采样。将NKA包装旋转至少2个小时，以使细胞保持悬浮状态，期间冷却至2-8℃，以形成最终的胶凝NKA。发生胶凝需要快速冷却，以使细胞不在明胶溶液中沉积。将注射器中的明胶溶液置于冷藏条件下时进行监测。如图3所示，观察到温度急剧下降。1小时后，温度通常下降到最终温度4.4℃的0.3℃之内。
明胶溶液的冷却开始胶凝过程，但是需要有限的时间才能使形成的凝胶稳定化，以使SRC在贮存时仍保持悬浮于凝胶中。将含有配制的NKA的注射器旋转过夜或1.25小时，并且然后直立放置过夜。随后，除去内容物，并在产物的四个不同区段中测量细胞浓度。分析指示这四个区段之间没有差异，因此一旦NKA在低温下旋转至少1.25小时，就不会发生可测量的细胞沉降(图4)。
实施例2：NKA和组分的表征
NKA及其组分SRC和生物材料已使用本节中描述的分析技术进行了表征。
SRC的表征
已经出于释放测试目的表征了SRC，并且出于定性(qualification)目的在延长培养中表征。此外，已经对SRC测试了其它特征，所述特征可用于信息和开发目的，并且可以有助于将来建立效力测定法。
SRC特征
肾细胞分离和扩增提供了包括肾小管上皮细胞和基质细胞的肾细胞类型的混合物。通过扩增肾细胞的单步不连续密度梯度分离或跨越密度边界/密度界面的离心获得SRC。密度分离的SRC群体中的原代细胞类型是上皮表型的。采取多管法来建立从扩增的肾细胞获得的SRC的特征。在肾细胞扩增过程中监测细胞形态、生长动力学和细胞存活力。通过使用跨越密度界面的离心来建立SRC浮力密度。通过锥虫蓝染料排除法测量细胞计数和存活力。通过流式细胞仪表征SRC表型。通过PrestoBlue的代谢以及VEGF和KIM-1的产生证明了活细胞和SRC功能的存在。
对用于生产用于临床研究的NKA的SRC测试以下关键特征：
·SRC计数和存活力
·SRC表型
·SRC功能
SRC计数和存活力
通过锥虫蓝染料排除法测量细胞计数和存活力。
SRC表型
通过使用流式细胞术对肾细胞标志物进行表达分析来监测细胞表型。细胞的表型分析基于对所分析细胞类型特异性的抗原标志物的使用。流式细胞术分析提供了样品群体中表达分析的抗原标志物的细胞的定量测量。
文献中已经报道了多种标志物可用于肾细胞的表型表征：(i)细胞角蛋白；(ii)转运膜蛋白(水通道蛋白和吞饮受体)；(iii)细胞结合分子(粘附素、凝集素等)；和(iv)代谢酶(谷胱甘肽)。由于在衍生自全肾消化物的培养物中发现的大多数细胞是上皮细胞和内皮细胞，因此所检查的标志物集中于这两组特异性的蛋白质的表达。
细胞角蛋白是由许多类型的上皮细胞不同程度表达的中间丝蛋白家族。上皮细胞表达的细胞角蛋白子集取决于上皮的类型。例如，细胞角蛋白7、8、18和19均由肾和剩余泌尿生殖道以及消化道和呼吸道的正常简单上皮表达。组合的这些细胞角蛋白负责上皮细胞的结构完整性。此种组合代表酸性(I型)和碱性(II型)角蛋白家族两者，并且在肾细胞中大量表达(Oosterwijk et al.(1990)Expression of intermediate-sized filaments indeveloping and adult human kidney and in renal cell carcinoma.J HistochemCytochem,38(3),
385-392)。
水通道蛋白是转运膜蛋白，其允许水进入和流出细胞，而阻止离子和其它溶质的通过。文献中描述了13种水通道蛋白，其中6种在肾中发现(Nielsen et al.(2002)Aquaporins in the kidney:from molecules to medicine.Physiol Rev,82(1),205-244)。水通道蛋白2通过在水流动中施加严格控制，造成肾收集管上皮细胞的质膜对水具有高渗透性，从而使水向渗透梯度方向流动(Bedford et al.(2003)Aquaporin expressionin normal human kidney and in renal disease.J Am Soc Nephrol,14(10),2581-2587；Takata et al.(2008)Localization and trafficking of aquaporin 2in thekidney.Histochem Cell Biol,130(2),197-209；Tamma et al.(2007)Hypotonicityinduces aquaporin-2internalization and cytosol-to-membrane translocation ofICln in renal cells.Endocrinology,148(3),1118-1130)。水通道蛋白1是近端肾小管特征性的(Baer et al.(2006)Differentiation status of human renal proximal anddistal tubular epithelial cells in vitro:Differential expression ofcharacteristic markers.Cells Tissues Organs,184(1),16-22；Nielsen et al.(2002)Aquaporins in the kidney:from molecules to medicine.Physiol Rev,82(1),205-244)。
吞饮受体是转运膜受体蛋白。当它与蛋白兆蛋白共定位时，它们一起促进了与吞饮受体结合的配体(如白蛋白)的内在化。吞饮受体位于肠和肾的上皮内(Christensen&Birn(2001)Megalin and cubilin:synergistic endocytic receptors in renalproximal tubule.Am J Physiol Renal Physiol,280(4),F562-573)。
CXCR4是一种转运膜蛋白，其充当SDF1的趋化因子受体。配体结合后，细胞内钙水平增加，并且MAPK1/MAPK3激活是增加的。CXCR4在肾中组成性表达，并在肾发育和肾小管生成中起重要作用(Ueland et al.(2009).A novel role for the chemokine receptorCxcr4 in kidney morphogenesis:an in vitro study.Dev Dyn,238(5),1083-1091)。此外，CXCR4是SDF1配体结合的受体。SDF1/CXCR4轴在内皮祖细胞和间充质干细胞向损伤部位的迁移和归巢中起着至关重要的作用(Stem-cell approaches for kidney repair:choosing the right cells.(Sagrinati et al.Trends Mol Med.2008；14(7):277-85)。
钙粘蛋白是钙依赖性细胞粘附蛋白。它们分为四类，E-钙粘蛋白存在于上皮组织中，并参与调节活动性和增殖。E-钙粘蛋白是一种跨膜糖蛋白，已发现其位于构成肾远端小管的上皮细胞的粘附素连接中(Prozialeck et al.(2004)Differential expression ofE-cadherin,N-cadherin and beta-catenin in proximal and distal segments of therat nephron.BMC Physiol,4,10；Shen et al.(2005)Kidney-specific cadherin,aspecific marker for the distal portion of the nephron and related renalneoplasms.Mod Pathol,18(7),933-940)。
DBA(二花扁豆(Dolichos biflorus)凝集素)是一种在肾收集管结构表面上携带的α-N-乙酰基半乳糖胺结合凝集素(细胞结合蛋白)，并且被视为并用作形成肾收集管和远端小管的通用标志物(Michael et al.(2007)The lectin Dolichos biflorusagglutinin is a sensitive indicator of branching morphogenetic activity inthe developing mouse metanephric collecting duct system.J Anat210(1),89-97；Lazzeri et al.(2007)Regenerative potential of embryonic renal multipotentprogenitors in acute renal failure.J Am Soc Nephrol 18(12),3128-3138)。
CD31(也称为血小板内皮细胞粘附分子，PECAM-1)是一种细胞粘附蛋白，其通过免疫细胞和内皮细胞的特定群体表达。在内皮细胞中，此蛋白质集中在细胞边界处(DeLisseret al.(1997)Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.Am JPathol,151(3),671-677)。CD146参与与肌动蛋白细胞骨架相关的细胞间连接处内皮细胞的细胞粘附和粘聚力。CD146由血管内皮和平滑肌强烈表达，目前被用作内皮细胞谱系的标志物(Malyszko et al.(2004)Adiponectin is related to CD146,a novel marker ofendothelial cell activation/injury in chronic renal failure and peritoneallydialyzed patients.J Clin Endocrinol Metab,89(9),4620-4627)，并且是CD31的犬等同物。
gamma-谷氨酰转肽酶(GGT)是一种代谢酶，其催化谷胱甘肽的gamma-谷氨酰基部分转移至可以为氨基酸、肽或水的受体以形成谷氨酸。该酶在谷胱甘肽的合成和降解以及氨基酸跨细胞膜的转移中也起作用。GGT存在于许多组织的细胞膜中，包括肾的近端小管细胞(Horiuchi et al.(1978)Gamma-glutamyl transpeptidase:sidedness of its activesite on renal brush-border membrane.Eur J Biochem,87(3),429-437；Pretlow etal.(1987).Enzymatic histochemistry of mouse kidney in plastic.J HistochemCytochem,35(4),483-487；Welbourne&Matthews(1999)Glutamate transport and renalfunction.Am J Physiol,277(4Pt 2),F501-505)。表5提供了通过流式细胞术检测到的表达这些标志物的特定类型的肾细胞的列表。
表5–用于SRC表征的表型标志物
Figure BDA0002288862140000651
图5显示了在SRC群体中这些标志物的定量表达，绘制为群体中每种表型的百分比值。CK8/18/19是跨物种检测到的最一致表达的肾细胞蛋白。GGT1和水通道蛋白-1(AQP1)始终表达但水平不同。还以中等水平观察到DBA、水通道蛋白2(AQP2)、E-钙粘蛋白(CAD)、CK7和CXCR4，尽管可变性更大，并且CD31/146和吞饮受体的表达最低。基于已发表的数据(Kelley et al.(2012)A Population of Selected Renal Cells Augments RenalFunction and Extends Survival in the ZSF1 model of Progressive DiabeticNephropathy.Cell Transplant 22(6),1023-1039；Kelley et al.(2010a)A tubularcell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival andaugments kidney function in a rodent model of chronic kidney disease.Am JPhysiol Renal Physiol.299(5),F1026-1039)和我们未发表的工作(图5)，我们选择了CK18和GGT1作为标志物，其将在NKA生产期间用于SRC的常规表型分析。AQP2表达也是表型分析的有用标志物，但表达是可变的，因此将对AQP2表达进行监测，以供参考。表6提供了SRC中表型表达的选定标志物、范围和平均百分比值以及其选择原理。
表6-选择用于SRC表型分析的标志物
Figure BDA0002288862140000662
*基于浮力密度，预计收集管上皮细胞在SRC中较低。
细胞功能
SRC主动分泌可以通过条件化培养基分析检测的蛋白质。细胞功能通过细胞代谢PrestoBlue并分泌VEGF(血管内皮生长因子)和KIM-1(肾损伤分子-1)的能力来评估。
存活的功能性细胞在NKA中可以通过它们代谢PrestoBlue的能力监测。PrestoBlue细胞存活力试剂是一种改良的基于刃天青的测定试剂，其是一种细胞可渗透的非荧光蓝色染料。进入足够存活以增殖的细胞后，染料经由涉及脱氢酶的天然细胞过程还原为亮红色荧光团，其可以通过荧光或吸光度进行测量。
生物分子VEGF和KIM-1代表了从那些被提议为肾损伤和功能的敏感和特异性分析非临床生物标志物中的分子选择(Sistare et al.(2010)Towards consensus practicesto qualify safety biomarkers for use in early drug development.NatBiotechnol,28(5),446-454；Warnock&Peck(2010)A roadmap for biomarkerqualification.Nat Biotechnol,28(5),444-445)。在体内，这两种标志物均指示肾小管功能、损伤和/或修复，并且在体外是肾小管上皮细胞培养物的公认特征。KIM-1是一种锚定于肾近端小管细胞膜中的胞外蛋白，其用来识别和吞噬在损伤和细胞更新期间脱落的凋亡细胞。肾细胞组成性表达的VEGF是关键的血管生成和促存活因子，其促进细胞分裂、迁移、内皮细胞存活和血管发芽。SRC已经表征为组成性表达VEGF mRNA(表8)并主动产生蛋白质(表7)。这些蛋白质可以在暴露于肾细胞和SRC的培养基中检测到。表7显示了在条件培养基中存在的来自肾细胞和SRC培养物的VEGF和KIM-1量。将肾细胞培养至近汇合。对过夜暴露于肾细胞培养物和SRC的条件化培养基测试了VEGF和KIM-1。
表7-人肾细胞和SRC产生VEGF和KIM-1
Figure BDA0002288862140000672
阐明其它SRC特性
已经通过基因表达序型分析和细胞酶促活性的测定表征SRC。
基因表达概况
通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)研究了从人肾细胞培养物中分离的SRC的基因表达概况，包括水通道蛋白2、E-钙粘蛋白、cubulin、VEGF和CD31，也对它们进行了蛋白质生产测试。表14中的基因型标志物代表了预期可以在肾细胞培养物中发现的细胞群体。NCAD、吞饮受体和CYP2R1是肾小管上皮细胞的标志物，AQP2和ECAD是收集管和远端小管的标志物。Podocin和肾病蛋白是足细胞的标志物。VEGF和CD31是内皮标志物。VEGF和EPO是氧响应基因，相关mRNA存在于多种不同的组织和细胞类型中。
使用的基因探针获自TaqMan。以70-90％汇合度收获传代2人肾细胞。遵循从动物细胞中纯化总RNA的方案使用Qiagen的RNeasy Plus Mini Kit，从细胞中纯化RNA。遵循生产商的说明，使用Invitrogen的VILOTMcDNA合成试剂盒，从相当于1.4μg的RNA体积中生成cDNA。表8显示了相对于未分级的肾细胞，SRC群体的平均qPCR数据(n＝3)。
结果提示了存在肾小管上皮细胞群体，如通过NCAD、吞饮受体和CYP2R1的表达水平相对较高证明。远端收集管小管和远端小管标志物AQP2和ECAD相对较低，而CD31(内皮标志物)甚至更低(表8)。
表8-人SRC的基因表达分析
Figure BDA0002288862140000682
Figure BDA0002288862140000691
已经根据早期的基因型评估选择了表型和功能标记。VEGF基因表达水平高而水通道蛋白2基因表达水平低，这与蛋白质分析数据一致(表6和表7)。
SRC酶促活性
也可以通过测量肾近端小管中找到的两种特异性酶GGT(γ-谷氨酰转肽酶)和LAP(亮氨酸氨肽酶)的活性来评估SRC(预配制)的细胞功能(Chung et al.(1982)Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximaltubule functions in a hormonally defined medium.J Cell Biol,95(1),118-126)。测量细胞中这些酶活性的方法是利用溶液中的一种酶特异性底物，其在添加到表达活性酶的细胞中后被切割，释放出生色产物(Nachlas et al.(1960)Improvement in thehistochemical localization of leucine aminopeptidase with a new substrate,L-leucyl-4-methoxy-2-naphthylamide.J Biophys Biochem Cytol,7(),261-264；Tate&Meister(1974)Stimulation of the hydrolytic activity and decrease of thetranspeptidase activity of gamma-glutamyl transpeptidase by maleate；identityof a rat kidney maleate-stimulated glutaminase and gamma-glutamyltranspeptidase.Proc Natl Acad Sci U S A,71(9),3329-3333)。测量暴露于细胞的溶液的吸光度，并且相对于由活性酶产生的切割产物的量。用于GGT的底物是L-谷氨酸γ-对硝基苯胺(L-glutamic acidγ-p-nitroanalide)盐酸盐，并且用于LAP的底物是L-亮氨酸对硝基苯胺(L-leucine p-nitroanalide)。图6显示了从人供体产生的6个SRC样品中的LAP和GGT活性。进行LAP和GGT测定法仅供参考。该测定法需要较长的细胞培养持续时间，因此无法进行产物释放。
SRC表征概要：
·在细胞扩增期间通过将培养物的观察结果与图像库中的图像进行比较来监测细胞的形态。
·在每次细胞传代时监测细胞生长动力学。预期细胞生长因患者而异。
·通过锥虫蓝染料排除法和PrestoBlue代谢监测SRC计数和存活力。
·通过CK18、GGT1的表型表达表征SRC。出于信息目的监测AQP2表达。
·PrestoBlue的代谢以及VEGF和KIM-1的产生用作存活且功能性SRC的存在的标志物。
·可以通过基因表达序型分析用LAP和GGT的酶促活性测量进一步阐明SRC功能。
生物材料的表征
NKA(明胶溶液)中使用的生物材料通过两个关键参数进行表征：
浓度：明胶溶液的浓度通过使用分光光度计在280nm处的吸光度来测量。从吸光度对浓度的校准曲线测定明胶浓度。
倒置测试：倒置测试提供了明胶溶液在2-8℃的温度形成和维持凝胶的能力，以及凝胶在室温液化(流动)的能力的视觉评估。
其它生物材料特征的阐明
可以对NKA中使用的生物材料进一步表征流变性质和粘度。
流变性质
可通过使用Couette Cell型流变仪在4℃，然后在25℃测量生物材料的流变特性。在每个温度将样品平衡至少30分钟。在较低温度下可接受的储能模量(G’>10)反映了溶液在NKA运输和运输温度2-8℃形成并维持凝胶的能力。在较高温度下可接受的损耗模量(G”＜10)反映了凝胶在室温下液化的能力，如NKA的递送和植入所需要的。
粘度
使用锥板粘度计在37℃和200-300s-1的剪切速率下测量生物材料的粘度。可以通过18-27号针有效递送粘度范围为1.05-1.35cP的溶液。
NKA的表征
NKA由在生物材料(基于明胶的水凝胶)中配制的自体SRC构成。在基于明胶的水凝胶生物材料中的SRC配制剂提供增强的细胞的稳定性，从而延长产品的货架期，并在SRC转运和递送至肾皮质以用于临床效果期间改善NKA的稳定性。
通过PrestoBlue的代谢，CK18、GGT1和AQP2的表型表达以及VEGF和KIM-1的产生对NKA表征活细胞的存在、SRC表型和细胞功能。上面的SRC表征部分中提供了详细信息。
我们进行了实验以证明用从人肾供体获得的SRC生成并用明胶配制的NKA在贮存和运输期间维持注射器内细胞的均匀分布而不聚集，从而确保释放后和注射时最终NKA产品中细胞的改善的稳定性。以下各节中提供了NKA中SRC分布和聚集的结果。下面提供了NKA在冷藏时的稳定性的详细信息。
NKA中的SRC分布
通过定性观察细胞沉降，使用共聚焦显微术对活/死存活力进行成像以及使用锥虫蓝染料排除法测量活细胞分布来建立NKA中的SRC分布。
定性观察细胞沉降
视觉观察配制的NKA中的SRC沉降，并且与仅悬浮于DPBS中的SRC进行比较。在保持期间，悬浮于DPBS中的SRC从悬浮液中沉降出来。在DPBS中含有0.88％明胶的SRC的NKA配制剂能够防止细胞在冷温度贮存3天内在注射器中沉积(图7)。
使用共聚焦显微术对生/死存活力进行成像
使用共聚焦显微术(BD Pathway 855)对配制的NKA内的SRC分布进行成像。将NKA(用明胶配制的SRC)排出到玻璃腔载玻片上，并用荧光活(绿色)/死(红色)染料染色。图8显示了在明胶内分布的活SRC(绿色)的代表性图像。
跨越NRC注射器的SRC分布
使用锥虫蓝染色法测量跨越配制的NKA注射器的SRC分布。使用标准程序在注射器中制备NKA。在冷温度保持3天并且温热到室温后，如图9所示，从注射器中将NKA分为四个级份排出。对每个级份进行计数并确定总活细胞分布和平均存活力。
注射器中SRC分布的测量
使用锥虫蓝染料排除法在排出的级份中计数SRC。图10显示了在选定的级份处的总活细胞计数，其显示了在沉积时沿着注射器的筒的分布模式。SRC在整个注射器中均匀分布。
NKA中的SRC聚合
在相差显微术下使用Leica LAS图像软件评估NKA中的SRC聚集。在配制时以及在冷温度下保持3天后评估细胞聚集。图11显示了刚配制后的SRC的Leica图像(10X)。在悬浮于0.88％明胶中的SRC的NKA配制剂中未观察到细胞聚集。图12显示了从NKA采集的样品的相衬图像(10X)(级分1-4)。在3天保持期后，在整个注射器上没有观察到细胞聚集。
NKA表征概要：
·SRC的明胶配制剂使细胞能够在NKA的贮存和运输期间在NKA中保持悬浮并分布。明胶配制剂还确保注射期间NKA的均匀递送。
·悬浮于DPBS中的SRC仅在冷温度贮存3天期间沉积出来。
·SRC在配制后或者在其产品货架期3天期间贮存后不在NKA中聚集。
实施例3：稳定性测试
明胶溶液的稳定性
将制备的明胶溶液贮存在冰箱(2-8℃)或冷冻器(-20℃以下)中。将材料在冷温度(2-8℃)下保持长达8周或冷冻(-20℃以下)长达24周后，评估用于NKA配制剂的明胶溶液的稳定性。
滤器灭菌后，将明胶溶液等分到15mL管中，并保存在冰箱(2-8℃)或冷冻器(-20℃以下)中。在评估时，从冷贮存中取出一管明胶溶液，并置于26-30℃水浴中。在水浴中2小时后，若在倒置管时观察到明胶溶液“流动”，则认为溶液在液化能力上可接受。将管放回2-8℃的冷贮存，并次日进行观察。若明胶溶液在倒置时不流动，则认为该溶液在胶凝能力上可接受。在测试的时间范围内未观察到胶凝或液化的明显趋势。
另外，对于冷冻样品，使用锥板粘度计在37℃和150-250s-1的剪切速率测量液化明胶溶液的粘度。在测试的时间范围内，没有观察到明胶粘度的显著趋势。
作为制冷和冷冻贮存稳定性研究的一部分，对样品测试了无菌性(BacT/Alert)。冷藏8周和冷冻24周后，测试呈阴性(5天中无生长)。
NKA稳定性
还进行了实验以证明用人肾供体生成的NKA可以在冷温度(2-8℃)贮存。通过测量产品的存活力、表型表征和细胞功能来建立NKA的稳定性。
从来自四个肾组织样品的肾组织活组织检查中获得SRC，并使用标准程序制备NKA。生产结束后，将NKA在冷温度保持长达7天以评估货架期。在第1、2、3、4和7天取样以进行分析。
NKA中SRC存活力的稳定性
通过锥虫蓝染料排除法测量NKA中SRC的存活力。图13显示了在产品在生产后冷贮存长达7天后SRC存活力的稳定性。在冷贮存中，SRC的存活力保持高于70％(行业标准)至少4天。
NKA中SRC表型的稳定性
通过CK18和GGT1的表达来测量NKA中的SRC表型。图14和15显示了在产品已经在生产后在冷贮存中长达7天之后SRC表型的稳定性。在冷贮存中，通过CK18和GGT1得到的SRC表型保持高于释放标准至少4天。
NKA中SRC功能的稳定性
PrestoBlue代谢和VEGF的产生用作产品中SRC功能的测量。图16显示了生产后冷贮存长达7天后的PrestoBlue代谢。NKA中SRC代谢PrestoBlue的能力随着贮存时间而稳定下降，这对于没有营养的情况下贮存的细胞而言是预期性的。在冷贮存中的第3天，NKA代谢大于PrestoBlue初始值的50％，并符合提出的释放标准。基于NKA冷贮存时的SRC功能，估计3天的货架期。
图17显示了在产品在生产后冷贮存长达7天之后的VEGF产生。NKA中SRC表达VEGF的能力到第3天稳定(从第0天开始没有统计学差异)，并且随着进一步的贮存时间而下降，这对于没有营养的情况下贮存的细胞而言是预期性的。在冷贮存中的第3天，VEGF的生产符合提出的释放标准。基于NKA冷贮存期间的SRC功能的评估，估计3天的货架期。
基于贮存第3天时SRC存活力维持于≥70％，对NRC放置3天的货架期。在第3天，作为细胞功能测量的PrestoBlue代谢高于第0天初始值的50％。在没有营养物的情况下贮存的细胞中预期PrestoBlue代谢下降。
基于SRC存活力维持于70％的目标水平，可以在生产后将NKA在冷温度贮存3天，并维持符合释放规范的细胞表型和功能。
实施例4：NKA的递送和植入
NKA的目标是使用细胞递送系统注射到患者的肾皮质中。以下各节介绍了递送系统和注射程序中使用的组分。
NKA传送系统
NKA递送系统由与细胞递送相容的插管(针)和注射器构成。不同的供应商使用术语插管或针来描述细胞递送产品。对于该描述，术语套针、套管和针可互换使用。
NKA递送系统的主要组分是递送针/套管。表9列出了可在临床上有效递送NKA的递送套管的期望特征。此外，我们将使用与NKA相容的套管。
表9-NKA递送套管的功能
Figure BDA0002288862140000741
注射器材料符合USP VI级指南，并按照ISO 10993方法进行了测试，以评估生物相容性。注射器源自Merit Medical,Becton Dickinson或类似的满足生物相容性分类和产品相容性测试的供应商。递送针/套管购自Cook Medical,Bloomington,IN,InternationalMedical Development,Huntsville,UT,Innovative Med Inc.,Irvine CA或类似的满足生物相容性药物和产品相容性测试的供应商。在图18中显示了18-32号递送套管与NKA的产品相容性测试。在通过套管时的SRC存活力与18-26号插管的单独注射器的相同，证明这些插管与SRC相容。对于小于26号的针尺寸，SRC存活力似乎下降。
NKA植入
在准备植入时，就在注射到肾中前将NKA温热到室温以液化产品。
NKA的目标是通过与细胞递送相容的针/套管和注射器植入肾皮质。目的是通过肾囊的渗透引入NKA并沉积到肾皮质的多个部位中。最初，使用15-20号存取套针/套管刺穿肾囊，插入肾皮质约1cm(但不能进一步伸入肾中)。NKA将包含在注射器中，该注射器将连接到带钝头的内部细胞递送针或柔性套管(18-26号，如适用于存取套管)。在1期临床研究中，NKA通过18G递送针递送。提出的II期研究将使用18号或更小的针进行细胞递送。递送针将在存取套管内部穿行并前进到肾中，对所述肾施用NKA。NKA的注射速度为1-2mL/min。每次注射1-2分钟后，内部针将沿着皮层内的针道缩回至第二个注射部位；等等，直到针尖位于存取插管的末端或已注射整个细胞体积。此系统允许腹腔镜和经皮递送两者。在经皮递送下，使用直接的实时图像引导来进行存取插管/套针和递送针的放置。通过超声图像引导监测NKA的注射，以显现NKA沉积物的微气泡足迹。
图19中的示意图显示了使用与细胞递送和分配到实体器官相容的针将NKA注射入肾中的构思。将NKA直接递送到肾皮质中。患者中的NKA递送最初使用标准化的经皮或腹腔镜程序。
实施例5：生产SRC的方法和组合物的非限制性实施例
例5.1-溶液的制备
本实施例节提供了用于分离和表征异质肾细胞群体以及生产再生疗法产品的各种培养基配制剂和溶液的组成。
表10：培养基和溶液
Figure BDA0002288862140000751
Figure BDA0002288862140000761
对于所有细胞洗涤使用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。
实施例5.2-分离异质未分级的肾细胞群体
本实施例节显示了从人中分离未分级的(UNFX)异质肾细胞群体。进行初始组织离解以从人肾组织产生异质细胞悬浮液。
通过肾活组织检查得到的肾组织为异质肾细胞群体提供了来源。可以使用包括皮质、皮质髓质连接或髓质组织中的一种或多种的肾组织。优选使用皮质髓质连接组织。从CKD肾需要多次活组织检查核心(最小2个)，以避免疤痕组织。在计划植入最终的NKA之前约4周，临床研究者会在临床部位从患者获取肾组织。组织在实施例5.1的组织运输培养基中运输。
然后在处理用于细胞提取的组织之前，用实施例5.1的组织洗涤溶液洗涤组织以减少进入的生物负荷。
将肾组织切碎，称重并在实施例5.1的消化液中解离。将所得的细胞悬浮液在Dulbecco改良的Eagle培养基(D-MEM)+10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen,CarlsbadCalif.)中中和，洗涤，然后重悬于无血清，无补充剂的角质形成细胞培养基(KSFM)(Invitrogen)中。然后将细胞悬浮液在15％(w/v)的碘克沙醇(OptiPrepTM，Sigma)密度边界上离心以除去红细胞和碎片，然后在实施例5.1的肾细胞生长培养基中以每cm2 25,000个细胞的密度开始培养到组织培养处理过的聚苯乙烯烧瓶或培养皿。例如，可以在150ml 50:50的培养基中将细胞以25x106个细胞/瓶接种在T500 Nunc烧瓶中。
实施例5.3-分离的肾细胞群体的细胞扩增
肾细胞的扩增取决于所接受的组织量以及从进入组织中分离肾细胞的成功程度。若需要的话，可以冷冻保存分离的细胞(见下文)。肾细胞生长动力学因样品而异，这是由于从各个患者中分离出细胞固有的变异性。
开发出限定的细胞扩增过程，其适应源自进入组织表11的可变性的细胞恢复范围。肾细胞的扩增涉及使用限定细胞培养程序在肾细胞生长培养基表10中的密闭培养容器(例如，T瓶、Cell Factories、)中的连续传代。
开发出一种不含BPE的培养基用于人体临床试验，以消除与使用BPE相关的固有风险。在不含BPE的培养基中评估细胞生长、表型(CK18)和细胞功能(GGT和LAP酶促活性)，并与动物研究中使用的含BPE培养基进行比较。两种培养基中肾细胞的生长、表型和功能是相当的。(数据未显示)
表11从人肾活组织检查中的细胞回收
Figure BDA0002288862140000771
一旦在最初的T烧瓶中观察到细胞生长(第0代)，并且没有可见的污染迹象，就更换培养基并此后每2-4天更换一次(图21B)。通过在显微镜下视觉观察培养物来评估细胞以验证肾细胞形态。由于细胞聚集在一起，培养物在特征上表现出紧密的底板或鹅卵石外观。这些形态特征在扩展期间有所变化，并且可以不在每次传代时存在。使用在整个细胞扩增中使用的培养容器中各种汇合水平的细胞图像库，估计细胞培养汇合。
当培养容器是至少50％汇合时，通过胰蛋白酶处理使肾细胞传代(图21B)。将分离的细胞收集到含有肾细胞生长培养基的容器中，计数并计算细胞存活力。在每次细胞传代时，将细胞以500-4000个细胞/cm2接种于足够数目的培养容器中，以便将细胞数目扩展至配制NKA所需的数目(图21B)。将培养容器置在5％CO2环境中37℃培养箱中。如上所述，监测细胞形态和汇合，并且每2-4天更换组织培养基。表12列出了在从人供体的六次肾活组织检查的细胞分离和扩增期间观察到的人肾细胞的存活力。
表12培养的人肾细胞的细胞存活力
Figure BDA0002288862140000772
来自不同患者的组织的固有可变性导致培养物中不同的细胞产率。因此，严格定义细胞传代的时机或每次传代得到目标细胞数目所需的培养容器的数目和类型是不切实际的。通常，肾细胞经历2或3次传代；然而，培养的持续时间和细胞产率可以随细胞生长速率而变化。
用具有EDTA的0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)分离细胞以收获或传代。通过锥虫蓝排除法评估存活力，并使用血细胞计数器手动或自动Cellometer.RTM计数系统(NexcelomBioscience,Lawrence Mass.)进行计数。
实施例5.4培养细胞的冷冻保存
常规冷冻保存扩增的肾细胞，以适应各个患者的细胞生长的内在变异性，并按照预定的临床日常表递送产品。在需要另一个NKA(例如，由于患者疾病，不可预见的过程事件等导致的延迟)的情况下，冷冻保存的细胞还提供细胞的备用来源。建立了已被用于冷冻保存细胞并在融化后恢复存活的功能细胞的条件。
为了冷冻保存，将细胞悬浮于冷冻保存溶液中至终浓度约50x106个细胞/mL(参见实施例5.1)，并分配至小瓶中。将包含约50x106个细胞/mL的1ml小瓶放在控制速率冷冻器的冷冻室中，并以预先设定的速率冷冻。冷冻后，将细胞转移到液氮冷冻器中进行过程中贮存。
实施例5.5SRC细胞群体的制备
选定的肾细胞(SRC)可以从最终培养容器制备，所述最终培养容器从冷冻保存的细胞中生长或直接从扩增培养物中生长，取决于日程表(图21B)。
若使用冷冻保存的细胞，则将细胞融化并铺在组织培养皿上进行最后的扩增步骤。在最终的培养皿约为50-100％的情况下，汇合细胞已准备好加工以进行SRC分离。培养基更换和NKA的最终洗涤稀释最终产品中任何残留的冷冻保存液。
一旦最终的细胞培养容器达到了至少50％汇合，就将培养容器转移到在5％CO2环境中37℃的设定为2％氧气的低氧培养箱(图21C)并培养过夜。细胞可以在设置为2％氧气的氧气控制培养箱中保存长达48小时。暴露于更具生理相关性的低氧(2％)环境中改善细胞分离效率，并能够更好地检测低氧诱导的标志物，例如VEGF。
将细胞暴露于缺氧条件足够的时间(例如过夜至48小时)后，将细胞用含EDTA的0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)分离。通过锥虫蓝排除法评估存活力，并使用血细胞计数器手动或使用自动
Figure BDA0002288862140000791
计数系统(Nexcelom Bioscience,Lawrence Mass.)进行计数。用DPBS洗涤细胞一次，并在DPBS中重悬至约850x106个细胞/mL。
使用跨越密度边界/界面的离心，基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。通过在7％碘克沙醇溶液(OptiMEM中的OptiPrep；60％(w/v)；参见实施例5.1)上离心分离肾细胞悬浮液。
制备7％的OptiPrep密度界面溶液，并在使用前测量指示期望密度的折射率(R.I.1.3456+/-0.0004)。将收获的肾细胞分层在溶液的顶部。在室温(在不制动的情况下)在离心管或细胞处理器(例如COBE 2991)中将密度界面以800g离心20分钟。离心后以独特的团粒收集表现出大于约1.045g/mL的浮力密度的细胞级分。排除并弃去浮力密度小于1.045g/mL的细胞。
将SRC团粒重悬于DPBS中(图21C)。通过4次DPBS洗涤和1次明胶溶液步骤使最终产品中残留的OptiPrep、FBS、培养基和辅助材料的残留最小化。

Claims (49)

1.可注射配制剂，其包含：
a)温度敏感性细胞稳定化生物材料，和
b)生物活性肾细胞(BRC)群体，
其中所述温度敏感性细胞稳定化生物材料是水凝胶，所述水凝胶
(i)在约8℃以下维持基本上固体状态，其中所述基本上固体状态是凝胶状态，
(ii)在约环境温度以上维持基本上液体状态，并且
(iii)在约8℃和约环境温度以上之间具有固体至液体过渡状态，
其中所述水凝胶包含重组起源的胞外基质蛋白，衍生自源自肾或其它组织或器官的胞外基质，或包含明胶。
2.权利要求1的可注射配制剂，其中所述明胶衍生自I型alpha I胶原。
3.权利要求1的可注射配制剂，其中所述BRC群体用所述生物材料包被，在所述生物材料上沉积，在所述生物材料中嵌入，附着于所述生物材料，在所述生物材料中接种或包埋。
4.权利要求1的可注射配制剂，其中所述生物材料配置为多孔泡沫、凝胶、液体、珠或固体。
5.权利要求2的可注射配制剂，其中所述明胶衍生自猪I型，alpha I胶原蛋白或重组人I型，alpha I胶原蛋白。
6.权利要求1的可注射配制剂，其中所述BRC是选定的肾细胞(SRC)群体。
7.权利要求6的可注射配制剂，其中与起始肾细胞群体相比，所述BRC或SRC群体含有更大百分比的一个或多个细胞群体，并且缺乏或缺少一个或多个其它细胞群体。
8.权利要求7的可注射配制剂，其中所述BRC或SRC群体富含肾小管肾细胞。
9.权利要求8的可注射配制剂，其中所述BRC或SRC群体表现出指示肾小管肾细胞的细胞形态。
10.权利要求8的可注射配制剂，其中所述BRC或SRC群体以一种或多种肾小管上皮细胞标志物的表型表达为特征。
11.权利要求10的可注射配制剂，其中所述一种或多种肾小管上皮细胞标志物包括CK18和/或GGT1。
12.权利要求8的可注射配制剂，其中所述BRC或SRC群体表现出指示存活的且有代谢活性的肾细胞的细胞生长动力学。
13.权利要求12的可注射配制剂，其中所述BRC或SRC群体以一种或多种存活力和/或功能性标志物的表型表达为特征。
14.权利要求13的可注射配制剂，其中所述一种或多种存活力和/或功能性标志物包含VEGF和/或KIM-1。
15.权利要求12的可注射配制剂，其中所述BRC或SRC群体以LAP和/或GGT酶促活性为特征。
16.权利要求1的可注射配制剂，其中所述明胶在所述配制剂中以约0.5％至约1％(w/v)存在。
17.权利要求1的可注射配制剂，其中所述明胶在所述配制剂中以约0.8％至约0.9％(w/v)存在。
18.权利要求1的可注射配制剂，其还包含细胞存活力剂。
19.权利要求18的可注射配制剂，其中所述细胞存活力剂包括选自下组的试剂：抗氧化剂、氧载体、生长因子、细胞稳定化因子、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子和伤口愈合因子。
20.权利要求18的可注射配制剂，其中所述细胞存活力剂选自下组：人血浆、人血小板裂解物、牛胎血浆或牛垂体提取物。
21.可植入配制剂，其包含：
a)人或动物起源的脱细胞化肾或已经经由三维生物打印在结构上进行了工程化改造的细胞稳定化生物材料，和
b)生物活性肾细胞(BRC)群体。
22.权利要求1至21中任一项的配制剂，其进一步包含由肾细胞群体分泌的产物。
23.可注射配制剂，其包含：
a)包含约0.88％(w/v)明胶的生物材料，其中所述明胶衍生自I型，alpha I胶原，和
b)包含SRC群体的组合物，其中所述SRC群体包含肾小管肾细胞的富集群体且具有大于约1.04g/mL的密度。
24.用于制备包含温度敏感性细胞稳定化生物材料和生物活性肾细胞混合物的可注射配制剂的方法，所述方法包括以下步骤：i)从供体/接受者获得肾皮质组织；ii)通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，并使用标准细胞培养技术扩增所述肾细胞；iii)使收获的肾细胞跨越密度边界或密度界面或单步不连续梯度进行分离以获得SRC群体；iv)用基于明胶的水凝胶生物材料重建所述生物活性细胞，其中所述明胶衍生自I型alpha I胶原蛋白。
25.权利要求24的方法，其中所述选定的肾细胞包含肾小管肾细胞的富集群体并且具有大于约1.04g/mL密度。
26.权利要求24的方法，其中在跨越密度边界或密度界面或连续或不连续单步或多步密度梯度的分离之前将收获的肾细胞暴露于低氧培养条件。
27.权利要求24的方法，其中所述肾细胞富含肾小管肾细胞。
28.权利要求24的方法，其进一步包括在细胞扩增期间监测所述肾细胞的细胞形态。
29.权利要求28的方法，其中所述肾细胞表现出指示肾小管肾细胞的细胞形态。
30.权利要求24的方法，其进一步包括在每次细胞传代时监测所述肾细胞的细胞生长动力学。
31.权利要求30的方法，其进一步包括使用用于评估代谢活性的试剂来监测肾细胞计数和存活力。
32.权利要求24的方法，其进一步包括对所述肾细胞监测一种或多种存活力和/或功能性标志物的表型表达。
33.权利要求32的方法，其中所述一种或多种存活力和/或功能性标志物包括VEGF和/或KIM-1。
34.权利要求24的方法，其进一步包括对所述肾细胞监测一种或多种肾小管上皮细胞标志物的表型表达。
35.权利要求34的方法，其中所述一种或多种肾小管上皮细胞标志物包括CK18和/或GGT1。
36.权利要求24的方法，其进一步包括通过基因表达序型分析(gene expressionprofiling)或酶促活性的测量来监测肾细胞功能性。
37.权利要求36的方法，其中测量的酶促活性是针对LAP和/或GGT。
38.权利要求24的方法，其中所述肾细胞衍生自自体或同种异体肾样品。
39.权利要求24的方法，其中所述肾细胞衍生自非自体肾样品。
40.权利要求38的方法，其中通过肾活组织检查获得所述样品。
41.权利要求24的方法，其中将所述SRC重悬于26-30℃的液化明胶溶液中。
42.权利要求41的方法，其中将所述SRC重悬于足够的明胶溶液中以达到100x106个细胞/ml的SRC浓度。
43.权利要求24的方法，其进一步包括快速冷却所述SRC/明胶溶液以稳定化所述生物材料，使得所述SRC在贮存时将保持悬浮于所述凝胶中。
44.权利要求43的方法，其中在2-8℃的温度范围贮存所述配制剂。
45.权利要求42的方法，其进一步包括添加细胞存活力剂。
46.权利要求45的方法，其中所述细胞存活力剂包括选自下组的试剂：抗氧化剂、氧载体、生长因子、细胞稳定化因子、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子和伤口愈合因子。
47.权利要求45的方法，其中所述细胞存活力剂选自下组：人血浆、人血小板裂解物、牛胎血浆或牛垂体提取物。
48.治疗受试者中的肾疾病的方法，所述方法包括将权利要求1的配制剂注射入所述受试者中，其中经由18至30号针头注射所述配制剂。
49.权利要求48的方法，其中所述针具有约27号、约26号、约25号、约24号、约23号、约22号、约21号或约20号的直径。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020266168A1 (en) * 2019-05-02 2021-12-02 Prokidney Treatment of kidney disease in subjects with kidney and/or urinary tract anomalies
US20220333147A1 (en) * 2019-06-27 2022-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions related to printed cellular niches for preserving and controlling synthetic microbial consortia
KR102160587B1 (ko) * 2019-12-24 2020-09-28 주식회사 팡세 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물
IL295156A (en) * 2020-01-28 2022-09-01 Kidneycure Ltd Process for production of kidney cells and treatment
TWI779450B (zh) * 2021-01-04 2022-10-01 國立清華大學 去細胞的細胞外基質及其製備方法與用途
JP2023040935A (ja) * 2021-09-10 2023-03-23 日機装株式会社 腎細胞の保管方法及び輸送方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6479064B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
CN103298498A (zh) * 2010-11-10 2013-09-11 坦吉恩股份有限公司 用于器官增强的注射制剂
WO2014039429A1 (en) * 2012-09-04 2014-03-13 Anthrogenesis Corporation Methods of tissue generation
CN104937095A (zh) * 2012-10-24 2015-09-23 再生医学Tx有限责任公司 肾细胞群及其用途
CN106421917A (zh) * 2016-11-08 2017-02-22 华南生物医药研究院 制备用于软骨损伤修复的组合物的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6479064B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
CN103298498A (zh) * 2010-11-10 2013-09-11 坦吉恩股份有限公司 用于器官增强的注射制剂
WO2014039429A1 (en) * 2012-09-04 2014-03-13 Anthrogenesis Corporation Methods of tissue generation
CN104937095A (zh) * 2012-10-24 2015-09-23 再生医学Tx有限责任公司 肾细胞群及其用途
CN106421917A (zh) * 2016-11-08 2017-02-22 华南生物医药研究院 制备用于软骨损伤修复的组合物的方法

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