CN114390925A - 治疗具有肾脏和/或尿路异常的受试者的肾病 - Google Patents

Abstract

本文尤其提供用于治疗具有肾脏和/或尿路先天性的异常的受试者的慢性肾病的方法、细胞群和组合物。

Description

治疗具有肾脏和/或尿路异常的受试者的肾病

发明领域

本发明尤其涉及用于治疗患有肾病的受试者的方法、组合物和细胞群。

发明背景

肾脏异常，如肾脏和尿路先天性异常(CAKUT)和/或获得性异常，可导致肾病，包括慢性和终末期肾病。CAKUT约占产前期确认的所有异常的20％至30％。参见Queisser-Luftet al.(2002)Malformations in newborn:results based on 30,940infants andfetuses from the Mainz congenital birth defect monitoring system(1990-1998).2002；266(3):163，其全部内容通过引用并入本文。

发明简述

本文尤其提供用于治疗具有肾和/或尿路先天性异常的受试者的肾病的方法、细胞群和组合物。

一方面，本文提供了治疗患有慢性肾病(CKD)的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)由肾细胞群分泌的囊泡；和/或(iii)包含肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体，其中所述受试者具有肾脏和/或尿路的异常。

在实施方案中，所述受试者具有肾脏异常。在实施方案中，所述受试者具有尿路的异常。在实施方案中，所述受试者具有肾脏和尿路的异常。在实施方案中，异常是在出生前获得的。在实施方案中，异常是在出生后获得的。在实施方案中，异常是先天性异常。在实施方案中，受试者具有肾脏先天性异常。在实施方案中，受试者具有尿路先天性异常。在实施方案中，受试者具有肾脏和尿路先天性异常。如本文所用，“先天性”异常是出生时或出生前存在的异常。在实施方案中，先天性异常在出生后恶化或引起额外的异常。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括以下，基本上由以下组成、或由以下组成：向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)由肾细胞群分泌的一种或多种产物；和/或(iii)包含肾细胞群和至少一种其他细胞群的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)由肾细胞群分泌的一种或多种产物(如，囊泡)；和/或(iii)包含肾细胞群和至少一种其他细胞群(如，非肾细胞群)的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)由肾细胞群分泌的囊泡；和/或(iii)包含肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)由肾细胞群分泌的囊泡；和/或(iii)包含肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含生物活性肾细胞群。在实施方案中，所述组合物还包含由肾细胞群分泌的囊泡。在实施方案中，所述组合物还包含含有肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的由肾细胞群分泌的囊泡。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体。

一方面，本文提供了生物活性肾细胞群及其用于治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的用途。

一方面，本文提供了由生物活性肾细胞群分泌的产物(如，囊泡)及其用于治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的用途。

一方面，本文提供了包含生物活性肾细胞群的球状体及其用于治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的用途。

附图简述

图1是显示REACT治疗前和REACT治疗后的估算肾小球滤过率(eGFR)的图。

图2是显示REACT治疗前和REACT治疗后的血清肌酐的图。

图3是REACT产品递送系统的照片。

图4是REACT运输容器的照片。

图5是研究设计流程图。

图6是整个NKA制造工艺的非限制性实例的流程图。

图7A至D是提供图6中描绘的非限制性实施例工艺的进一步细节的流程图。

图8是显示在接受REACT治疗的由CAKUT引起的肾病的患者中通过eGFR测量的肾功能改善的图；星号显示在CAKUT影响之前患者的初始肾功能；灰色实线(相对于注射-1至0个月绘制)，REACT注射前通过eGFR测量的患者肾功能下降；黑色虚线(相对于注射0至3个月绘制)，REACT注射后患者的eGFR。

图9是显示在接受REACT治疗由CAKUT引起的肾病的患者中通过白蛋白-肌酐比率测量的肾功能改善的图。

发明详述

在此参考了本发明所涵盖的某些实施方案和实施例。尽管将结合示例性实施方案来描述本发明，但是应当理解，它们并不旨在将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在涵盖所有可包括在由权利要求限定的本发明范围内的替代、修改和等同物。本领域技术人员将认识到与本文所述的那些相似或等效的许多方法和材料，其可用于本发明的实践中。本发明决不限于所述的方法和材料。

在整个公开内容中引用的所有参考文献均通过引用以其整体明确并入本文。如果并入的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾，包括但不限于定义的术语、术语用法、描述的技术等，则以本申请为准。

除非另有定义，本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本领域技术人员将认识到许多与本文所述的那些相似或等效的方法和材料，它们可用于本发明的实践中。事实上，本发明决不限于所述的方法和材料。

如本文所用，术语“约”在数值或范围的上下文中是指所引用或要求保护的数值或范围的±10％，除非上下文需要更有限的范围。

本文说明书和权利要求书中，诸如“至少一个”或“一个或多个”的短语可出现在元素或特征的组合列表之后。术语“和/或”也可出现在两个或更多元素或特征的列表中。除非与其所使用的上下文另有隐含或明确矛盾，这样的短语旨在表示单独列出的任何元件或特征或任何所述列举的元件或特征与任何其他列举的元件或特征的组合。例如，短语“A和B中的至少一个”；“A和B中的一个或多个”；“A和/或B”分别表示“A单独、B单独或A和B一起”。类似的解释也适用于包含三个或更多项目的列表。例如，短语“A、B和C中的至少一个”，“A、B和C中的一个或多个”，“A、B和/或C”分别旨在表示“单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、或A和B和C一起”。此外，以上和权利要求书中使用的术语“基于”旨在表示“至少部分基于”，使得未列举的特征或元素也是允许的。

应当理解，在提供参数范围的情况下，本发明还提供该范围内的所有整数及其十分位。例如，“0.2至5mg”是公开0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg等直至并包括5.0mg。

与“包含”、“含有”或“特征在于”同义的过渡性术语“包括”是包容性或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由……组成”排除了权利要求书中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为特定材料或步骤“以及那些不会对要求保护的发明的基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤”。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数参考，除非上下文另有明确规定。

如本文所用，“治疗”包括如疾病进展的抑制、消退或停滞。治疗还包括预防或改善病症的任何症状。如本文所用，“抑制”受试者的疾病进展或疾病并发症是指预防或减少受试者的疾病进展和/或疾病并发症。

如本文所用，与病症相关的“症状”包括与病症相关的任何临床或实验室表现，并且不限于受试者的感觉或观察。

如本文所用，当指治疗剂的量时，“有效的”是指以本公开的方式使用时足以产生期望的治疗反应而没有与合理收益/风险比相称的过度不良副作用(如，毒性、刺激或过敏反应)的药剂的量。

如本文所用，术语“生物活性肾细胞”或“BRC”是指施用于受试者的肾脏时具有一种或多种以下特性的肾细胞：减少(如，减缓或停止)慢性肾病或其症状的恶化或进展的能力，增强肾功能的能力，影响(改善)肾内稳态的能力，以及促进肾组织或肾脏的愈合、修复和/或再生的能力。在实施方案中，这些细胞可包括功能性肾小管细胞(如，基于改善肌酐排泄和蛋白保留)、肾小球细胞(如，基于改善蛋白保留)、血管细胞和皮髓质分界的其他细胞。在实施方案中，BRC获自从肾组织中分离和扩增的肾细胞。在实施方案中，BRC获自使用选择生物活性细胞的方法从肾组织中分离和扩增的肾细胞。在实施方案中，BRC对肾脏具有再生作用。在实施方案中，BRC包括选定的肾细胞(SRC)、基本上由选定的肾细胞(SRC)组成、或由选定的肾细胞(SRC)组成。在实施方案中，BRC是SRC。

在实施方案中，SRC是获自从合适的肾组织来源分离和扩增的肾细胞的细胞，其中与起始肾细胞群相比，SRC包含较大百分比的一种或多种细胞类型并且缺乏或具有较低百分比的一种或多种其他细胞类型。在实施方案中，与起始肾细胞群相比，SRC包含增加比例的BRC。在实施方案中，SRC群是分离的肾细胞群，其富含用于治疗肾病的特定生物活性成分和/或细胞类型和/或耗尽特定的无活性和/或非期望的成分或细胞类型，即，提供肾功能的稳定和/或改善和/或再生。与起始群相比，SRC提供了更优的治疗和再生结果。在实施方案中，SRC通过肾活检从患者的肾皮质组织获得。在实施方案中，SRC基于其一种或多种标志物的表达来选择(如，通过荧光激活细胞分选或“FACS”)。在实施方案中，基于细胞类型的一种或多种标志物表达，SRC耗尽一种或多种细胞类型(如，通过荧光激活细胞分选或“FACS”)。在实施方案中，SRC选自生物活性肾细胞群。在实施方案中，SRC通过扩增的肾细胞的密度梯度分离来选择。在实施方案中，SRC通过跨密度边界、屏障或界面离心分离或单步不连续梯度分离扩增的肾细胞来选择。在实施方案中，SRC通过连续或不连续密度梯度分离已在低氧条件下培养的扩增的肾细胞来选择。在实施方案中，SRC通过密度梯度分离已在低氧条件下培养至少约8、12、16、20或24小时的扩增的肾细胞来选择。在实施方案中，SRC通过跨密度边界、屏障或界面离心分离已在低氧条件下培养的扩增的肾细胞来选择。在实施方案中，SRC通过跨密度边界、屏障或界面离心(如，单步不连续密度梯度分离)分离已在低氧条件下培养至少约8、12、16、20或24小时的扩增的肾细胞来选择。在实施方案中，SRC主要由肾小管细胞组成。在实施方案中，其他实质(如，血管)和基质(如，集合管)细胞可存在于SRC中。在实施方案中，SRC群中少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是血管细胞。在实施方案中，SRC群中少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是集合管细胞。在实施方案中，SRC群中少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是血管或集合管细胞。

术语“球状体”是指培养以允许3维生长而不是作为单层生长的细胞聚集体或集合体。注意，术语“球状体”并不意味着聚集体是几何球体。在实施方案中，聚集体可以是具有明确形态的高度有组织的，或者聚集体可以是无组织的团块。在实施方案中，球状体可包括单一细胞类型或多于一种细胞类型。在实施方案中，细胞可以是原代分离物，或永久细胞系，或两者的组合。在实施方案中，球状体(如，细胞聚集体或类器官)在旋转瓶中形成。在实施方案中，球状体(如，细胞聚集体或类器官)在3维基质中形成。

术语“天然器官”应当指活体受试者的器官。在实施方案中，受试者可能是健康的或不健康的。在实施方案中，不健康的受试者可能患有与该特定器官相关的疾病。

术语“天然肾脏”应当指活体受试者的肾脏。在实施方案中，受试者可能是健康的或不健康的。在实施方案中，不健康的受试者可能患有肾病。在实施方案中，不健康的受试者可能具有肾脏和/或尿路的异常。

本文提供对天然器官(如，肾脏)提供益处的细胞类型和细胞群(如，SRC)。在实施方案中，益处包括停止或减缓慢性肾病的进展(如，一种或多种症状的恶化)。在实施方案中，益处包括再生作用，如慢性肾病症状的减轻和/或天然肾功能的改善。在实施方案中，益处包括但不限于降低对天然器官的损伤程度，或改善、恢复或稳定天然器官功能或结构。肾损伤可以是如纤维化、炎症、肾小球肥大、萎缩等形式。

在实施方案中，富集的细胞群或制品是源自起始器官细胞群(如，来自肾脏的未分级的异质细胞群)的细胞群，其包含特定细胞类型的百分比大于起始群中该细胞类型的百分比。例如，起始肾细胞群可针对第一、第二、第三、第四、第五等感兴趣的细胞类型富集。

如本文所用，术语“低氧”培养条件是指细胞在培养系统中的可用氧气水平相对于在大气氧气水平(约21％)下培养细胞的标准培养条件降低的培养条件。非低氧条件在本文中被称为正常或常氧培养条件。

本文包括包含生物材料和一种或多种细胞类型的组合物。在实施方案中，生物材料是天然或合成生物相容性材料，其适合于以活的状态引入支持细胞的活组织中。天然生物材料是由生命系统制备或源自生命系统的材料。合成生物材料是不是由生命系统制备或不是源自生命系统的材料。在实施方案中，本文公开的生物材料可以是天然和合成生物相容性材料的组合。如本文所用，生物材料包括(但不限于)，如聚合物基质和支架。本领域普通技术人员将理解，生物材料可以各种形式配置，如多孔泡沫、凝胶、液体、珠粒、固体，并且可包括一种或多种天然或合成生物相容性材料。在实施方案中，生物材料是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。在实施方案中，生物材料是能够变成液体的水凝胶。

本文使用的术语“肾病”包括与任何阶段或程度的急性或慢性肾病(如，急性或慢性肾功能衰竭)相关的疾病，其导致肾脏执行血液过滤功能和消除血液中多余的液体、电解质和废物的能力降低或丧失。在实施方案中，肾病还包括内分泌功能障碍，如贫血(促红细胞生成素缺乏)和矿物质失衡(维生素D缺乏)。在实施方案中，肾病可起源于肾脏或可继发于多种病症，包括(但不限于)肾脏和尿路的先天性异常(CAKUT)、膀胱输尿管反流、心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫病或肝病。在实施方案中，肾病可以是在肾脏急性损伤后发生的慢性肾功能衰竭的病症。例如，缺血和/或接触毒物对肾脏的损伤可能导致急性肾功能衰竭；急性肾损伤后的不完全恢复可能导致慢性肾功能衰竭的发展。

在实施方案中，术语“治疗”可指肾病、贫血、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的治疗性治疗和/或预防或防止性措施，其中目的是逆转、预防或减缓(减轻)目标病症。需要治疗的人包括那些已患有肾病、贫血、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人以及那些容易患有肾病、贫血、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人或那些应预防肾病、贫血、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人。在实施方案中，需要治疗的受试者包括肾脏和/或尿路先天性异常。如本文所用，术语“治疗”包括肾功能的稳定和/或改善。

本文包括包含沉积在由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料构成的支架或基质表面之上或之中的一种或多种细胞类型(如，诸如SEC的细胞群)的构建体或制剂。在实施方案中，一个或多个细胞群可被涂覆、沉积、嵌入、附着、接种或包埋于由一种或多种合成或天然存在的生物相容性生物材料、聚合物、蛋白或肽组成的生物材料中。在实施方案中，一种或多种细胞群可在体外或体内与生物材料或支架或基质组合。在实施方案中，可选择用于产生构建体或制剂的一种或多种生物材料以引导、促进或允许构建体的细胞成分与内源性宿主组织的分散和/或整合，或引导、促进或允许构建体或制剂的细胞成分的存活、移植、耐受性或功能性能。

术语“新肾增强剂(Neo-Kidney Augment,NKA)”是指生物活性细胞制剂，其是由在由基于明胶的水凝胶组成的生物材料中配制的自体同源SRC组成的可注射产品。术语“高级细胞疗法(Advance Cell Therapy,ACT)”是指用NKA治疗。

在实施方案中，受试者是活体动物。在实施方案中，受试者是哺乳动物，如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、小鼠、大鼠或豚鼠。在实施方案中，受试者是灵长类动物，如人、黑猩猩、猩猩、猴子或狒狒。在实施方案中，受试者是人。在实施方案中，受试者是符合治疗的患者，其正在经历或已经历肾病的一种或多种体征、症状或其他指标。这类受试者包括但不限于新诊断或先前诊断并且现在正在经历复发或恶化，或处于肾病风险中的受试者，无论其原因如何。在实施方案中，受试者可能先前已治疗过肾病，或未这样治疗过。在实施方案中，受试者具有肾脏和/或尿路先天性异常。在实施方案中，受试者是具有肾脏和尿路先天性异常的人。在实施方案中，受试者正在经历或已经经历器官相关疾病的一种或多种体征、症状或其他指标，如肾病、贫血或促红细胞生成素(EPO)缺乏症。在实施方案中，受试者没有糖尿病。在实施方案中，受试者没有I型糖尿病。在实施方案中，受试者没有II型糖尿病。

肾脏和尿路先天性异常(CAKUT)包括各种解剖学范围的疾病家族，包括肾脏异常以及膀胱和尿路的异常。在实施方案中，术语“CAKUT”是指一种先天性异常(如，涉及具有CAKUT的受试者时)。在实施方案中，术语CAKUT是指一种以上的先天性异常(如，涉及具有CAKUT的受试者时)。在实施方案中，具有CAKUT的受试者具有肾脏、膀胱和/或尿道的一种或多种异常。在实施方案中，具有CAKUT的受试者的一个或两个肾脏有异常。在实施方案中，具有CAKUT的受试者的尿道有异常。在实施方案中，CAKUT由基因突变或异常引起。在实施方案中，CAKUT由环境因素引起。在实施方案中，患有CAKUT的受试者具有膀胱异常。与CAKUT相关的非限制性描述提供于Ristoska-Bojkovska(2017)Pril(Makedon Akad Nauk Umet OddMed Nauki)38(1):59-62；和Rodriguez(2014)Fetal Pediatr Pathol.33(5-6):293-320，其各自的全部内容通过引用并入本文。在实施方案中，具有CAKUT的受试者未患有糖尿病。在实施方案中，具有CAKUT的受试者未患有I型糖尿病。在实施方案中，具有CAKUT的受试者未患有II型糖尿病。

CAKUT约占产前期确定的所有异常的20％至30％。参见Queisser-Luft et al.(2002)Malformations innewborn:results based on 30,940infants and fetuses fromthe Mainz congenital birth defect monitoring system(1990-1998).Spranger JArch Gynecol Obstet.2002；266(3):163，其全部内容通过引用并入本文。在实施方案中，缺陷可以是双侧或单侧的，并且不同的缺陷常常共存于个体儿童中。

在实施方案中，CAKUT代表由于肾实质畸形、肾迁移的异常或发育中的集合系统的异常的异常胚胎性肾发育导致的范围广泛的病症。在实施方案中，CAKUT代表范围广泛的病症并且是异常肾发育过程的结果。在实施方案中，肾实质畸形导致正常肾单位发育失败，如肾发育不良、类风湿性关节炎(RA)、肾小管发生不良和某些类型的肾消耗病中所见。不受任何科学理论的束缚，利用分子遗传学的研究已证明肾畸形由编码信号传导和转录因子的基因的缺陷引起。在实施方案中，环境因素，如产前接触致畸剂，也可能破坏肾形态发生导致CAKUT。在实施方案中，异常包括肾的异常胚胎迁移，如肾异位(如，盆腔肾)和融合异常(如，马蹄肾)。在实施方案中，发育中的尿液集合系统的异常，如重复集合系统、后尿道瓣膜和肾盂输尿管连接部梗阻中所见，可能导致CKD/ESRD。肾发育不良可能是单侧或双侧的，且每1000名新生儿中发生2至4例。双侧肾发育不良的男女比例为1.3:1，单侧发育不良的男女比例为1.9:1。

因为CAKUT在30％至50％的儿童终末期肾病(ESRD)病例中起致病作用(Seikalyet al.2003Chronic renal insufficiency inchildren:the 2001Annual ReportPediatr Nephrol.18(8):796)，在实施方案中，重要的是诊断这些异常并开始治疗以使肾损伤最小化、预防或延迟ESRD的发作并提供支持性护理以避免ESRD的并发症。具有畸形包括减少肾脏数量或大小的患者最有可能具有较差的肾脏预后(Sanna-Cherchi etal.2009Renal outcome in patients with congenital anomalies of the kidney andurinary tract.Kidney Int.76(5):528)。在实施方案中，到30岁时，大多数患者将进行透析。

与具有单侧或双侧肾发育不良、多囊肾或马蹄肾患者相比，具有单个肾或具有后尿道瓣膜相关的肾发育不良患者的透析风险显著更高。在实施方案中，与更良性形式的CAKUT相比，单个肾的亚临床缺陷可能是预后较差的原因。在实施方案中并且不受任何科学理论的限制，具有单个肾的儿童处于长期CKD的风险中，这被认为是由于肾小球高滤过引起。在实施方案中，约三分之一的患者可具有肾损伤的证据，界定为蛋白尿(如，尿蛋白-肌酐比率>0.2mg/mg[2岁以上儿童>22.6mg/mmol])、高血压(如，血压≥年龄、性别和身高的第95个百分位)、基于血清肌酐和Schwartz方程估算的肌酐清除率升高，或使用肾脏保护药物(如，血管紧张素转换酶抑制剂)。

在实施方案中，肾发育不良可在常规产前筛查期间或出生后在畸形婴儿中进行肾超声检查时发现。在实施方案中，双侧发育不良很可能比单侧发育不良更早被诊断，尤其是如果出现羊水过少。在实施方案中，肾超声特征包括由于肾实质组织异常、皮髓质分化差和实质囊肿引起的回声增强。

在实施方案中，具有双侧发育不良的婴儿在出生时可能具有受损的肾功能，并且随后可能发生进行性肾衰竭。在实施方案中，相关的泌尿学结果包括肾盂、肾盏(如，先天性肾积水)和输尿管的异常，例如重复集合系统巨输尿管症、输尿管狭窄和膀胱输尿管反流[VUR]。在实施方案中，结果是，症状表现可能由于与这些泌尿系统异常相关的并发症而出现，包括尿路感染(UTI)、血尿、发烧和腹痛。

在实施方案中，由于肾发育不良与集合系统异常的频繁关联，可考虑对伴有或不伴有UTI的肾发育不良患者进行排尿期膀胱尿道造影。在实施方案中，如果在正常对侧肾脏中存在相关的泌尿系统异常(如，VUR)，具有单侧肾发育不良的儿童可能处于增加复发性UTI导致长期肾瘢痕形成后遗症的风险。在实施方案中，DMSA放射性核素扫描可提供关于每个肾脏的不同功能的进一步信息。在实施方案中，多囊性发育不良肾(MCDK)通常没有活的功能性肾组织，因此没有可检测的肾血流量或肾功能。然而，在实施方案中，可能存在节段性发育不良的罕见变异。在实施方案中，成像研究可用于界定基线肾功能和未来肾损伤的风险以及再生正常功能肾实质的能力。

术语“样品”或“患者样品”或“生物样品”通常应包括获自受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其他来源的任何生物样品。该术语包括组织活检，如，例如肾活检。该术语包括培养的细胞，如，例如培养的哺乳动物肾细胞。从哺乳动物获得组织活检和培养细胞的方法是本领域公知的。在实施方案中，样品可获自哺乳动物受试者的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿液、骨髓、粘膜、组织等。

术语“对照样品”是指阴性或阳性对照样品，其中预期阴性或阳性结果有助于关联测试样品中的结果。在实施方案中，合适的对照样品包括但不限于已知表现出正常肾功能的指标特征的样品、获自已知没有肾病的受试者的样品和获自已知患有肾病的受试者的样品。在实施方案中，对照样品可以是在通过本文提供的方法治疗之前获自受试者的样品。在实施方案中，对照样品可以是获自已知患有任何类型或阶段的肾病的受试者的测试样品，以及获自已知没有任何类型或阶段的肾病的受试者的样品。在实施方案中，对照样品可以是正常健康的匹配对照。本领域技术人员将了解适合使用的其他对照样品。

本文尤其提供了用于治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者(如，具有CAKUT的受试者)的慢性肾病的方法和组合物。

一方面，本文提供了治疗患有慢性肾病的受试者的肾病的方法，该方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)由肾细胞群分泌的囊泡；和/或(iii)包含肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体，其中受试者具有肾脏和/或尿路的异常。在实施方案中，受试者具有肾脏的异常。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)肾细胞群分泌的一种或多种产物；和/或(iii)包含肾细胞群和至少一种其他细胞群的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)肾细胞群分泌的一种或多种产物(如，囊泡)；和/或(iii)包含肾细胞群和至少一种其他细胞群(如，非肾细胞群)的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)由肾细胞群分泌的囊泡；或(iii)包含肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的(i)生物活性肾细胞群；(ii)由肾细胞群分泌的囊泡；和(iii)包含肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含生物活性肾细胞群的组合物。在实施方案中，组合物还包含由肾细胞群分泌的囊泡。在实施方案中，组合物还包含含有肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体。

一方面，本文提供了治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的由肾细胞群分泌的囊泡。

一方面，本文提供了治疗患有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体。

一方面，本文提供了生物活性肾细胞群及其用于治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的用途。

一方面，本文提供了由生物活性肾细胞群分泌的产物(如，囊泡)及其用于治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的用途。

一方面，本文提供了包含生物活性肾细胞群的球状体及其用于治疗具有肾脏和/或尿路的异常的受试者的肾病的用途。

在实施方案中，受试者具有尿路的异常。在实施方案中，受试者具有肾脏和尿路的异常。在实施方案中，异常是在出生前获得的。在实施方案中，异常是在出生后获得的。在实施方案中，异常是先天性异常。在实施方案中，受试者具有肾脏先天性异常。在实施方案中，受试者具有尿路先天性异常。在实施方案中，受试者具有肾脏和尿路先天性异常。在实施方案中，先天性异常在出生后恶化或引起额外的异常。在实施方案中，受试者的一个肾脏具有异常。在实施方案中，受试者在每个肾脏中具有一种或多种异常。在实施方案中，受试者具有尿路的异常，其中异常在尿道中。在实施方案中，受试者具有尿路的异常，其中异常在膀胱中。在实施方案中，受试者具有尿路的异常，其中异常在输尿管中。在实施方案中，异常在出生时就存在，但直到出生后才表现或显示症状。

在实施方案中，肾病是CKD。在实施方案中，受试者患有来自肾脏和尿路的异常(如，先天性)的CKD。

在实施方案中，异常包括先天性异常。在实施方案中，受试者具有CAKUT。

在实施方案中，异常是形态异常。在实施方案中，受试者具有异常发育的肾脏。

在实施方案中，受试者患有或曾经患有原发性膀胱输尿管反流、反流性肾病、肾瘢痕形成或肾发育不良。在实施方案中，受试者患有或曾经患有反流性肾病。在实施方案中，受试者患有或曾经患有肾瘢痕形成。在实施方案中，受试者患有或曾经患有肾发育不良。

在实施方案中，受试者易受尿路感染。在实施方案中，受试者已具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次尿路感染。

在实施方案中，受试者患有高血压或蛋白尿。

在实施方案中，受试者已具有抗反流后手术。

在实施方案中，受试者具有小于90mL/min/1.73m²的肾小球滤过率(GFR)、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。在实施方案中，受试者具有小于80mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有小于70mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有小于60mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有小于50mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有小于40mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有小于30mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有至少10mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有至少15mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有至少20mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有至少30mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，受试者具有10、15、20、25或30mL/min/1.73m²至50、60、70、80或90mL/min/1.73m²的GFR。在实施方案中，GFR是估算GFR(eGFR)。在实施方案中，受试者具有微量白蛋白尿。在实施方案中，受试者具有大量白蛋白尿。

在实施方案中，受试者小于18岁。在实施方案中，受试者小于60岁。在实施方案中，受试者小于50岁。在实施方案中，受试者小于40岁。在实施方案中，受试者小于35岁。在实施方案中，受试者小于30岁。在实施方案中，受试者小于25岁。在实施方案中，受试者小于20岁。在实施方案中，受试者为1至16岁。在实施方案中，受试者为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10至20、25、30、35或40岁。

在实施方案中，受试者为20、25、30、35或40至50、55、65、70、75、80、85、90、95或100岁。在实施方案中，受试者至少50岁。在实施方案中，受试者至少55岁。在实施方案中，受试者至少60岁。在实施方案中，受试者至少65岁。在实施方案中，受试者至少70岁。

在实施方案中，受试者具有肾实质畸形。

在实施方案中，受试者具有输尿管重复、肾盂输尿管连接部梗阻、肾发不发生(agenesis)、膀胱输尿管反流、肾发育不良(dysplasia)、肾发育不全(hypoplasia)、肾发育不全不良(hypodysplasia)、先天性肾积水、马蹄肾、后尿道瓣膜和梅干腹综合征、阻塞性肾发育不良，或无运动性纤毛病(nonmotile ciliopathy)。

在实施方案中，异常由遗传因素引起或与遗传因素相关。在实施方案中，CAKUT由遗传因素引起或与遗传因素相关。在实施方案中，异常由非遗传因素引起或与非遗传因素相关。在实施方案中，CAKUT由非遗传因素引起或与非遗传因素相关。在实施方案中，非遗传因素是环境因素。

在实施方案中，受试者具有输尿管重复、肾盂输尿管连接部梗阻、肾不发生、膀胱输尿管反流、肾发育不全不良、先天性肾积水、马蹄肾、后尿道瓣膜和梅干腹综合征、阻塞性肾发育不良或无运动性纤毛病。在实施方案中，受试者具有输尿管重复。在实施方案中，受试者具有肾盂输尿管连接部梗阻。在实施方案中，受试者具有肾不发生。在实施方案中，受试者具有膀胱输尿管反流。在实施方案中，受试者具有肾发育不全不良。在实施方案中，受试者具有先天性肾积水。在实施方案中，受试者具有马蹄肾。在实施方案中，受试者具有后尿道瓣膜和梅干腹综合征。在实施方案中，受试者具有阻塞性肾发育不良。在实施方案中，受试者具有无运动性纤毛病。在实施方案中，CAKUT已经由遗传因素引起或已经与遗传因素相关。

在实施方案中，异常包括Alagille综合征、Apert综合征、Bardet-Biedl综合征、Beckwith-Wiedemann综合征、腮-耳-肾综合征(Branchio-Oto-Renal syndrome,BOR)、短指发育不良(Campomelic dysplasia)、Cenani-Lenz综合征、DiGeorge综合征、Fraser综合征、甲状旁腺功能减退性感音神经性耳聋和肾异常(hypoparathyroidism sensorineuraldeafness and renal anomalies,HDR)、Kallmann综合征、乳腺-尺骨综合征、MeckelGruber综合征、肾消耗病(nephronophthisis)、Okihiro综合征、Pallister-Hall综合征、肾缺损综合征(Renal coloboma syndrome)、发育不全(hypoplasia)、发育不良(dysplasia)、肾发育不良(renal dysplasia)、囊性发育不良(cystic dysplasia)、非囊性发育不良(non-cystic dysplasia)、VUR囊性发育不良(VUR Cystic dysplasia)、肾发育不全(renalhypoplasia)、孤立性囊性肾发育不全(isolated cystic renal hypoplasia)、孤立性非囊性肾发育不全(isolated non-cystic renal hypoplasia)、孤立性肾小管发生不良(isolated renal tubular dysgenesis)、Rubinstein-Taybi综合征、Simpson-GolabiBehmel综合征、Townes-Brock综合征、Zellweger综合征、Smith-Lemli-Opitz综合征、肾积水(hydronephrosis)、骨髓发育不良(medullary dysplasia)、单侧/双侧不发生/发育不良(unilateral/bilateral agenesis/dysplasia)、集合系统异常(collecting systemanomalies)、不发生(agenesis)、肾盂输尿管连接部梗阻(UPJO)不发生(ureteropelvicjunction obstruction(UPJO)agenesis)、发育不良不发生(dysplasia agenesis)、单侧不发生(unilateral agenesis)、VUR、旋转不良(malrotation)、交叉融合异位(cross-fusedectopia)、VUR发育不良(VUR Dysplasia)、丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶(DSTYK)双重突变(a dual Serine/Threonine And Tyrosine Protein Kinase mutation)、与UPJO相关的DSTYK突变(DSTYK mutation associated with UPJO)、肾小管发生不良、囊肿和/或不发育(tubular dysgenesis,cysts,and/or aplasia)。

在实施方案中，肾病是慢性肾病。在实施方案中，慢性肾病是I、II、III、IV或V期肾病。在实施方案中，慢性肾病是I期肾病。在实施方案中，慢性肾病是II期肾病。在实施方案中，慢性肾病是III期肾病。在实施方案中，慢性肾病是IV期肾病。在实施方案中，慢性肾病是V期肾病。在实施方案中，受试者接受透析每周至少1、2或3次。

在实施方案中，将生物活性肾细胞群作为本文所述制剂的一部分施用于天然器官。在实施方案中，将生物活性肾细胞群的分泌产物作为本文所述制剂的一部分施用于天然器官。在实施方案中，细胞来源于施用受试者的天然器官或来自非靶标天然器官的来源。

在实施方案中，肾细胞群的细胞呈球状体形式。在实施方案中，向受试者施用包含生物活性肾细胞的球状体。在实施方案中，球状体包含至少一种非肾细胞类型或细胞群。

在实施方案中，受试者患有通过微量白蛋白尿测量的肾病，其界定为尿白蛋白-肌酐比率(UACR)≥30mg/g或24小时尿液收集物中尿白蛋白排出≥30mg/天。

在实施方案中，患者的肾功能由于治疗而改善。患者肾功能的改善可能是患者肾功能的稳定，也可能是改善肾功能的肾功能变化。在实施方案中，改善的肾功能通过估算肾小球滤过率(eGFR)的下降速率降低、稳定或增加来显示。在通过eGFR增加表明肾功能改善的实施方案中，eGFR增加可以是相对于患者基线eGFR增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、或至少25％。在这样的实施方案中，患者的基线eGFR可以是第一次治疗前患者的eGFR，如可以是在施用第一剂治疗之前至多3个月、2个月、1个月、3周、2周、10天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天确定的患者的eGFR。患者的基线eGFR增加可在施用第一剂治疗后1至6个月、或2至6个月、或3至6个月、或4至6个月、或5至6个月、或1至5个月或1至4个月，或1至3个月，或2至5个月，或2至4个月，或3至4个月，或2至3个月，或2个月，或3个月，或4个月，或5个月或6个月内实现。患者的基线eGFR增加不需要处于恒定水平或至恒定程度，即，患者不需要保持相对基线相同的增加初始水平进行治疗以“改善”肾功能。一旦实现，患者的基线eGFR增加可能会下降，但前提是患者的eGFR相对于患者的基线eGFR仍然增加。一旦实现，患者基线eGFR的增加也可能会进一步增加，或可能会保持与相对基线的增加初始水平相同的水平相对基线增加。患者相对基线的eGFR增加可持续至少12个月、12个月、至少18个月、18个月、至少24个月、24个月、至少30个月、30个月、至少36个月、36个月、至少42个月、42个月、至少48个月、48个月、至少54个月、54个月、至少60个月、60个月、至少66个月、66个月、至少72个月、72个月、至少78个月、78个月的时间段或患者余生。

在实施方案中，改善的肾功能通过患者中白蛋白-肌酐比率(ACR)的降低来证实。在通过患者的ACR降低表明肾功能改善的实施方案中，降低可以是相对于患者的基线ACR的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、或至少90％。可选择地，ACR的降低可使得如果患者的基线ACR适度增加，如30mg/g至300mg/g，则ACR的降低可减少患者的ACR至轻度到正常范围的水平，如小于30mg/g。可选择地，ACR的降低可使得如果患者的基线ACR剧烈增加，如大于300mg/g，则ACR的降低可减少患者的ACR至适度增加的水平，如30mg/g至300mg/g，或轻度增加至正常的水平，如小于30mg/g。在这样的实施方案中，患者的基线ACR可以是在第一剂治疗之前患者的ACR，如，可以是在施用第一剂治疗之前至多3个月、2个月、1个月、3周、2周、10天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天确定的患者的ACR。患者基线ACR的降低可在施用第一剂治疗之后1至6个月、或2至6个月、或3至6个月、或4至6个月、或5至6个月、或1至5个月、或1至4个月、或1至3个月、或2至5个月、或2至4个月、或3至4个月、或2至3个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月内实现。患者基线ACR的降低不需要处于恒定水平或恒定程度，即，患者不需要保持相对基线相同的降低初始水平进行治疗以“改善”肾功能。一旦实现，患者的基线ACR降低可能会增加，但前提是患者的ACR相对于患者的基线ACR仍然降低。一旦实现，患者的基线ACR降低也可能会进一步降低，或可能会保持与相对基线的降低初始水平相同的水平相对基线降低。患者相对基线的ACR降低可持续至少12个月、12个月、至少18个月、18个月、至少24个月、24个月、至少30个月、30个月、至少36个月、36个月、至少42个月、42个月、至少48个月、48个月、至少54个月、54个月、至少60个月、60个月、至少66个月、66个月、至少72个月、72个月、至少78个月、78个月的时间段或患者余生。

在实施方案中，改善的肾功能通过总血清肌酐的降低或血清肌酐(sCr)的增加速率或相当的量度(如，胱抑素-C、菊粉或肾小球滤过的其他量度)来表明。在实施方案中，改善的肾功能通过提高肾皮质厚度来表明。在实施方案中，改善的肾功能可通过结构和功能改变来表明。在实施方案中，改善的肾脏大小和/或结构通过肾脏成像来确定。在实施方案中，肾脏成像方法是超声、MRI或肾闪烁扫描术。在实施方案中，改善的肾功能优于肾结构或功能的先前状态。

在实施方案中，可通过肾功能的各种指标来观测如本文所提供的受试者的肾病的有效治疗。在实施方案中，肾功能指标包括但不限于血清白蛋白水平、白蛋白与球蛋白比率(A/G比率)、血清磷水平、血清钠水平、肾脏大小(可通过超声测量)、血清钙水平、磷:钙比率、血清钾水平、蛋白尿、尿肌酐水平、血清肌酐水平、血氮尿素(BUN)水平、胆固醇水平、甘油三酯水平和肾小球滤过率(GFR)。在实施方案中，总体健康的若干指标包括但不限于体重增加或减少、存活率、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)和身体耐力表现。

在实施方案中，用生物活性肾细胞制剂的有效治疗通过肾功能的一种或多种指标的稳定来证实。在实施方案中，肾功能的稳定通过与未经本文提供的方法治疗的受试者的相同指标相比，观测到通过本文提供的方法治疗的受试者的指标发生变化来表明。在实施方案中，肾功能的稳定可通过与治疗前同一受试者的相同指标相比，通过本文提供的方法治疗的受试者的指标变化的观测来表明。在实施方案中，第一指标的变化可以是值的增加或减少。在实施方案中，本文提供的治疗可包括使受试者的血清肌酐水平稳定，其中与未通过本文提供的方法治疗的具有类似疾病状态的受试者相比，在受试者中观测到的BUN水平较低。在实施方案中，治疗可包括使受试者的血清肌酐水平稳定，其中与未通过本文提供的方法治疗的具有类似疾病状态的受试者相比，在受试者中观测到的血清肌酐水平较低。在实施方案中，一种或多种上述肾功能指标的稳定是用选定的肾细胞制剂治疗的结果。

本领域普通技术人员将理解，可测量本文所述或本领域已知的一种或多种其他指标来确定受试者肾病的有效治疗。

在实施方案中，用生物活性肾细胞制剂的有效治疗通过肾功能的一种或多种指标的改善来证实。在实施方案中，生物活性肾细胞群提供改善的血清肌酐水平。在实施方案中，生物活性肾细胞群提供改善的血清中的蛋白保留。在实施方案中，生物活性肾细胞群提供改善的血清胆固醇和/或甘油三酯水平。在实施方案中，生物活性肾细胞群提供改善的维生素D水平。在实施方案中，生物活性肾细胞群提供与非富集细胞群相比改善的磷:钙比率。在实施方案中，与未富集的细胞群相比，生物活性肾细胞群提供改善的血红蛋白水平。在实施方案中，与未富集的细胞群相比，生物活性肾细胞群提供改善的血清肌酐水平。在实施方案中，一种或多种上述肾功能指标的改善是用选定的肾细胞制剂治疗的结果。

本文包括在有需要的受试者中再生天然肾脏的方法。在实施方案中，该方法包括向受试者施用或植入本文所述的生物活性细胞群、制剂或构建体的步骤。在实施方案中，再生的天然肾脏可通过许多指标来表征，包括但不限于天然肾功能或能力的发展、天然肾功能或能力的改善以及天然肾脏中某些标志物的表达。在实施方案中，可基于上述肾功能的各种指标来观测发展或改善的功能或能力。在实施方案中，再生肾通过一种或多种干细胞标志物的差异表达来表征。在实施方案中，干细胞标志物可以是以下中的一种或多种：SRY(性别决定区Y)-框2(Sox2)；未分化胚胎细胞转录因子(UTF1)；来自小鼠的节点同源物(NODAL)；Prominin1(PROM1)或CD133(CD133)；CD24；及其任何组合(参见Ilagan etal.PCT/US2011/036347，通过引用整体并入，还参见Genheimer et al.,2012.Molecularcharacterization of the regenerative response induced by intrarenaltransplantation of selected renal cells in a rodent model of chronic kidneydisease.Cells Tissue Organs 196:374-384，通过引用以其整体并入)。在实施方案中，与对照相比，干细胞标志物的表达上调。

在实施方案中，效果可由细胞本身和/或由细胞分泌的产物提供。在实施方案中，将从细胞分泌的产物施用于受试者。在实施方案中，产物从细胞(如，产生它的细胞)中分离。在实施方案中，产物是如本文所述的囊泡。在实施方案中，囊泡(如，外泌体)已从产生它的肾细胞群中分离。在实施方案中，囊泡可包括以下一种或多种：旁分泌因子、内分泌因子、近分泌因子、微囊泡、外泌体和RNA。分泌产物还可包括不在微囊泡内的产物，包括但不限于旁分泌因子、内分泌因子、近分泌因子和RNA。在实施方案中，分泌产物可以是源自肾细胞的囊泡的一部分。在实施方案中，囊泡是分泌囊泡。在实施方案中，分泌囊泡是外泌体、微囊泡、核外颗粒体、膜颗粒、外泌体样囊泡、或凋亡囊泡。在实施方案中，分泌囊泡是外泌体。在实施方案中，分泌囊泡是微囊泡。在实施方案中，分泌囊泡含有或包含一种或多种细胞组分。在实施方案中，组分可以是以下中的一种或多种：膜脂、RNA、蛋白、代谢物、胞质组分、以及它们的任何组合。在实施方案中，分泌囊泡包含一种或多种miRNA。在实施方案中，一种或多种miRNA包括本文公开的RNA(如，miRNA)分子中的一种或任何组合。在实施方案中，囊泡包含抑制纤溶酶原激活抑制剂-1(PAI-1)和/或TGFβ1的miRNA。在实施方案中，分泌产物包含旁分泌和/或近分泌因子，如α-1微球蛋白、β-2-微球蛋白、钙结合蛋白、凝聚素、结缔组织生长因子、胱抑素-C、谷胱甘肽-S-转移酶α、肾损伤分子-1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、骨桥素、三叶因子3、tam-horsfall尿糖蛋白、金属蛋白酶1组织抑制剂、血管内皮生长因子、纤连蛋白、白介素6、或单核细胞趋化蛋白1。

在实施方案中，效果可由细胞本身和/或细胞分泌的产物提供。在实施方案中，再生效果可通过以下中的一种或多种来表征：减少上皮-间充质转化(这可能是通过减弱TGF-β信号传导)；减少肾纤维化；减少肾脏炎症；天然肾脏中干细胞标志物的差异表达；植入细胞和/或天然细胞迁移至肾损伤部位，如肾小管损伤，肾损伤(如，肾小管损伤)部位处植入细胞的移植；肾功能的一种或多种指标的稳定(如本文所述)；与肾发生相关的S状体/逗点状体的从头形成、肾小管或肾单位的从头形成、红细胞稳态的恢复(如本文所述)；及其任何组合(还参见Basu et al.,2011.Functional evaluation of primary renal cell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissue engineering.CellTransplantation 20:1771-90；Bruce et al.,2015.Selected renal cells modulatedisease progression in rodent models of chronic kidney disease via NF-κB andTGF-β1pathways.Regenerative Medicine 10:815-839，其各自全部内容通过引用并入本文)。

在实施方案中，除了组织活检或作为组织活检的替代，接受治疗的受试者的再生结果可通过检查体液(如，尿液)来评估。已发现从源自受试者的尿液来源获得的微囊泡含有某些成分，包括但不限于最终源自肾细胞群的特定蛋白和miRNA。在实施方案中，这些成分可包括参与干细胞复制和分化、细胞凋亡、炎症和免疫调节的因子。在实施方案中，微囊泡相关miRNA/蛋白表达模式的时程分析允许持续监测接受本文所述细胞群或构建体的受试者的肾脏内的再生结果。

还提供了评估肾病患者是否对治疗制剂的治疗响应的方法。在实施方案中，该方法可包括相比或相对于对照样品中的囊泡的量，确定或检测获自用治疗剂治疗的肾病患者的测试样品中囊泡或腔内含物或其内容物的量的步骤，其中与对照样品中的囊泡或腔内容物的量相比，测试样品中囊泡或其一种或多种腔内容物的量更高或更低表明受治疗患者对治疗剂治疗的响应性。

在实施方案中，这些肾源性囊泡和/或肾源性囊泡的腔内容物也可流入受试者的尿液中，并且可分析用作指示再生结果或治疗功效的生物标志物。在实施方案中，非侵入性预后方法可包括在施用或植入本文所述的细胞群、组合物、制剂或构建体之前和/或之后从受试者获得尿样的步骤。可使用标准技术从尿样中分离囊泡和其他分泌产物，包括但不限于离心以去除不需要的碎片((Zhou et al.2008.Kidney Int.74(5):613-621；Skog etal.，美国公开专利申请号20110053157，其各自通过引用以其整体并入本文)。

在实施方案中，囊泡可包括以下一种或多种：旁分泌因子、内分泌因子、近分泌因子、微囊泡、外泌体和RNA。分泌产物还可包括不在微囊泡内的产物，包括但不限于旁分泌因子、内分泌因子、近分泌因子和RNA。

在实施方案中，分泌产物可以是源自肾细胞的囊泡的一部分。在实施方案中，囊泡是分泌囊泡。在实施方案中，分泌囊泡是外泌体、微囊泡、核外颗粒体、膜颗粒、外泌体样囊泡、或凋亡囊泡。在实施方案中，分泌囊泡是外来体。在实施方案中，分泌囊泡是微囊泡。在实施方案中，分泌囊泡含有或包含一种或多种细胞组分。在实施方案中，组分可以是以下中的一种或多种：膜脂、RNA、蛋白、代谢物、胞质组分、以及它们的任何组合。在实施方案中，分泌囊泡包含一种或多种微RNA。在实施方案中，一种或多种miRNA包括以下中的一种或任何组合：miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124和miR-151。在实施方案中，一种或多种miRNA包括以下中的一种或任何组合：let-7a-1；let-7a-2；let-7a-3；let-7b；let-7c；let-7d；let-7e；let-7f-1；let-7f-2；let-7g；let-7i；mir-1-1；mir-1-2；mir-7-1；mir-7-2；mir-7-3；mir-9-1；mir-9-2；mir-9-3；mir-10a；mir-10b；mir-15a；mir-15b；mir-16-1；mir-16-2；mir-17；mir-18a；mir-18b；mir-19a；mir-19b-1；mir-19b-2；mir-20a；mir-20b；mir-21；mir-22；mir-23a；mir-23b；mir-23c；mir-24-1；mir-24-2；mir-25；mir-26a-1；mir-26a-2；mir-26b；mir-27a；mir-27b；mir-28；mir-29a；mir-29b-1；mir-29b-2；mir-29c；mir-30a；mir-30b；mir-30c-1；mir-30c-2；mir-30d；mir-30e；mir-31；mir-32；mir-33a；mir-33b；mir-34a；mir-34b；mir-34c；mir-92a-1；mir-92a-2；mir-92b；mir-93；mir-95；mir-96；mir-98；mir-99a mir-99b；mir-100；mir-101-1；mir-101-2；mir-103-1；mir-103-1-as；mir-103-2；mir-103-2-as；mir-105-1；mir-105-2；mir-106a；mir-106b；mir-107；mir-122；mir-124-1；mir-124-2；mir-124-3；mir-125a；mir-125b-1；mir-125b-2；mir-126；mir-127；mir-128-1；mir-128-2；mir-129-1；mir-129-2；mir-130a；mir-130b；mir-132；mir-132；mir-133a-1；mir-133a-2；mir-133b；mir-134；mir-135a-1；mir-135a-2；mir-135b；mir-136MI101351120；mir-137；mir-138-1；mir-138-2；mir-139；mir-140；mir-141；mir-142；mir-143；mir-144；mir-145；mir-146a；mir-146b；mir-147；mir-147b；mir-148a；mir-148b；mir-149；mir-150；mir-151；mir-152；mir-153-1；mir-153-2；mir-154；mir-155；mir-181a-1；mir-181a-2；mir-181b-1；mir-181b-2；mir-181c；mir-181d；mir-182；mir-183；mir-184；mir-185；mir-186；mir-187；mir-188；mir-190；mir-190b；mir-191；mir-192；mir-193a；mir-193b；mir-194-1；mir-194-2；mir-195；mir-196a-1；mir-196a-2；mir-196b；mir-197；mir-198；mir-199a-1；mir-199a-2；mir-199b；mir-200a；mir-200b；mir-200c；mir-202；mir-203；mir-204；mir-205；mir-206；mir-208a；mir-208b；mir-210；mir-211；mir-212；mir-214；mir-215；mir-216a；mir-216b；mir-217；mir-218-1；mir-218-2；mir-219-1；mir-219-2；mir-221；mir-222；mir-223；mir-224；mir-296；mir-297；mir-298；mir-299；mir-300；mir-301a；mir-301b；mir-302a；mir-302b；mir-302c；mir-302d；mir-302e；mir-302f；mir-320a；mir-320b-1；mir-320b-2；mir-320c-1；mir-320c-2；mir-320d-1；mir-320d-2；mir-320e；mir-323；mir-323b；mir-324；mir-325；mir-326；mir-328；mir-329-1；mir-329-2；mir-330；mir-331；mir-335；mir-337；mir-338；mir-339；mir-340；mir-342；mir-345；mir-346；mir-361；mir-362；mir-363；mir-365-1；mir-365-2；mir-367；mir-369；mir-370；mir-37；mir-372；mir-373；mir-374a；mir-374b；mir-374c；mir-375；mir-376a-1；mir-376a-2；mir-376b；mir-376c；mir-377；mir-378；mir-378b；mir-378c；mir-379；mir-380；mir-381；mir-382；mir-383；mir-384；mir-409；mir-410；mir-411；mir-412；mir-421；mir-422a；mir-423；mir-424；mir-425；mir-429；mir-431；mir-432；mir-433；mir-448；mir-449a；mir-449b；mir-449c；mir-450a-1；mir-450a-2；mir-450b；mir-451；mir-452；mir-454；mir-455；mir-466；mir-483；mir-484；mir-485；mir-486；mir-487a；mir-487b；mir-488；mir-489；mir-490；mir-491；mir-492；mir-493；mir-494；mir-495；mir-496；mir-497；mir-498；mir-499；mir-500a；mir-500b；mir-501；mir-502；mir-503；mir-504；mir-505；mir-506；mir-507；mir-508；mir-509-1；mir-509-2；mir-509-3；mir-510；mir-511-1；mir-511-2；mir-512-1；mir-512-2；mir-513a-1；mir-513a-2；mir-513b；mir-513c；mir-514-1；mir-514-2；mir-514-3；mir-514b；mir-515-1；mir-515-2；mir-516a-1；mir-516a-2；mir-516b-1；mir-516b-2；mir-517a；mir-517b；mir-517c；mir-518a-1；mir-518a-2；mir-518b；mir-518c；mir-518d；mir-518e；mir-518f；mir-519a-1；mir-519a-2；mir-519b；mir-519c；mir-519d；mir-519e；mir-520a；mir-520b；mir-520c；mir-520d；mir-520e；mir-520f；mir-520g；mir-520h；mir-521-1；mir-521-2；mir-522；mir-523；mir-524；mir-525；mir-526a-1；mir-526a-2；mir-526b；mir-527；mir-532；mir-539；mir-541；mir-542；mir-543；mir-544；mir-544b；mir-545；mir-548a-1；mir-548a-2；mir-548a-3；mir-548ah-1；mir-548ah-2；mir-548b；mir-548c；mir-548d-1；mir-548d-2；mir-548e；mir-548f-1；mir-548f-2；mir-548f-3；mir-548f-4；mir-548f-5；mir-548g；mir-548h-1；mir-548h-2；mir-548h-3；mir-548h-4；mir-548i-1；mir-548i-2；mir-548i-3；mir-548i-4；mir-548j；mir-548k；mir-5481；mir-548m；mir-548n；mir-548o；mir-548p；mir-548s；mir-548t；mir-548u；mir-548v；mir-548w；mir-548x；mir-548y；mir-548z；mir-549；mir-550a-1；mir-550a-2；mir-550b-1；mir-550b-2；mir-551a；mir-551b；mir-552；mir-553；mir-554；mir-555；mir-556；mir-557；mir-558；mir-559；mir-561；mir-562；mir-563；mir-564；mir-566；mir-567；mir-568；mir-569；mir-570；mir-571；mir-572；mir-573；mir-574；mir-575；mir-576；mir-577；mir-578；mir-579；mir-580；mir-581；mir-582；mir-583；mir-584；mir-585；mir-586；mir-587；mir-588；mir-589；mir-590；mir-591；mir-592；mir-593；mir-595；mir-596；mir-597；mir-598；mir-599；mir-600；mir-601；mir-602；mir-603；mir-604；mir-605；mir-606；mir-607；mir-608；mir-609；mir-610；mir-611；mir-612；mir-613；mir-614；mir-615；mir-616；mir-617；mir-618；mir-619；mir-620；mir-621；mir-622；mir-623；mir-624；mir-625；mir-626；mir-627；mir-628；mir-629；mir-630；mir-631；mir-632；mir-633；mir-634；mir-635；mir-636；mir-637；mir-638；mir-639；mir-640；mir-641；mir-642a；mir-642b；mir-643；mir-644；mir-645；mir-646；mir-647；mir-648；mir-649；mir-650；mir-651；mir-652；mir-653；mir-654；mir-655；mir-656；mir-657；mir-658；mir-659；mir-660；mir-661；mir-662；mir-663；mir-663b；mir-664；mir-665；mir-668；mir-670；mir-671；mir-675；mir-676；mir-708；mir-711；mir-718；mir-720；mir-744；mir-758；mir-759；mir-760；mir-761；mir-762；mir-764；mir-765；mir-766；mir-767；mir-769；mir-770；mir-802；mir-873；mir-874；mir-875；mir-876；mir-877；mir-885；mir-887；mir-888；mir-889；mir-890；mir-891a；mir-891b；mir-892a；mir-892b；mir-920；mir-921；mir-922；mir-924；mir-933；mir-934；mir-935；mir-936；mir-937；mir-938；mir-939；mir-940；mir-941-1；mir-941-2；mir-941-3；mir-941-4；mir-942；mir-942；mir-943；mir-944；mir-1178；mir-1179；mir-1180；mir-1181；mir-1182；mir-1183；mir-1184-1；mir-1184-2；mir-1184-3；mir-1185-1；mir-1185-2；mir-1193；mir-1197；mir-1200；mir-1202；mir-1203；mir-1204；mir-1205；mir-1206；mir-1207；mir-1208；mir-1224；mir-1225；mir-1226；mir-1227；mir-1228；mir-1229；mir-1231；mir-1233-1；mir-1233-2；mir-1234；mir-1236；mir-1237；mir-1238；mir-1243；mir-1244-1；mir-1244-2；mir-1244-3；mir-1245；mir-1246；mir-1247；mir-1248；mir-1249；mir-1250；mir-1251；mir-1252；mir-1253；mir-1254；mir-1255a；mir-1255b-1；mir-1255b-2；mir-1256；mir-1257；mir-1258；mir-1260；mir-1260b；mir-1261；mir-1262；mir-1263；mir-1264；mir-1265；mir-1266；mir-1267；mir-1268；mir-1269；mir-1270-1；mir-1270-2；mir-1271；mir-1272；mir-1273；mir-1273c；mir-1273d；mir-1273e；mir-1274a；mir-1274b；mir-1275；mir-1276；mir-1277；mir-1278；mir-1279；mir-1280；mir-1281；mir-1282；mir-1283-1；mir-1283-2；mir-1284；mir-1285-1；mir-1285-2；mir-1286；mir-1287；mir-1288；mir-1289-1；mir-1289-2；mir-1290；mir-1291；mir-1292；mir-1293；mir-1294；mir-1295；mir-1296；mir-1297；mir-1298；mir-1299；mir-1301；mir-1302-1；mir-1302-10；mir-1302-11；mir-1302-2；mir-1302-3；mir-1302-4；mir-1302-5；mir-1302-6；mir-1302-7；mir-1302-8；mir-1302-9；mir-1303；mir-1304；mir-1305；mir-1306；mir-1307；mir-1321；mir-1322；mir-1323；mir-1324；mir-1468；mir-1469；mir-1470；mir-1471；mir-1537；mir-1538；mir-1539；mir-1825；mir-1827；mir-1908；mir-1909；mir-1910；mir-1911；mir-1912；mir-1913；mir-1914；mir-1915；mir-1972-1；mir-1972-2；mir-1973；mir-1976；mir-2052；mir-2053；mir-2054；mir-2110；mir-2113；mir-2114；mir-2115；mir-2116；mir-2117；mir-2276；mir-2277；mir-2278；mir-2355；mir-2861；mir-2909；mir-3065；mir-3074；mir-3115；mir-3116-1；mir-3116-2；mir-3117；mir-3118-1；mir-3118-2；mir-3118-3；mir-3118-4；mir-3118-5；mir-3118-6；mir-3119-1;mir-3119-2；mir-3120；mir-3121；mir-3122；mir-3123；mir-3124；mir-3125；mir-3126；mir-3127；mir-3128；mir-3129；mir-3130-1；mir-3130-2；mir-3131；mir-3132；mir-3133；mir-3134；mir-3135；mir-3136；mir-3137；mir-3138；mir-3139；mir-3140；mir-3141；mir-3142；mir-3143；mir-3144；mir-3145；mir-3146；mir-3147；mir-3148；mir-3149；mir-3150；mir-3151；mir-3152；mir-3153；mir-3154；mir-3155；mir-3156-1；mir-3156-2；mir-3156-3；mir-3157；mir-3158-1；mir-3158-2；mir-3159；mir-3160-1；mir-3160-2；mir-3161；mir-3162；mir-3163；mir-3164；mir-3165；mir-3166；mir-3167；mir-3168；mir-3169；mir-3170；mir-3171；mir-3173；mir-3174；mir-3175；mir-3176；mir-3177；mir-3178；mir-3179-1；mir-3179-2；mir-3179-3；mir-3180-1；mir-3180-2；mir-3180-3；mir-3180-4；mir-3180-5；mir-3181；mir-3182；mir-3183；mir-3184；mir-3185；mir-3186；mir-3187；mir-3188；mir-3189；mir-3190；mir-3191；mir-3192；mir-3193；mir-3194；mir-3195；mir-3196；mir-3197；mir-3198；mir-3199-1；mir-3199-2；mir-3200；mir-3201；mir-3202-1；mir-3202-2；mir-3605；mir-3606；mir-3607；mir-3609；mir-3610；mir-3611；mir-3612；mir-3613；mir-3614；mir-3615；mir-3616；mir-3617；mir-3618；mir-3619；mir-3620；mir-3621；mir-3622a；mir-3622b；mir-3646；mir-3647；mir-3648；mir-3649；mir-3650；mir-3651；mir-3652；mir-3653；mir-3654；mir-3655；mir-3656mir-3657；mir-3658；mir-3659；mir-3660；mir-3661；mir-3662；mir-3663；mir-3664；mir-3665；mir-3666；mir-3667；mir-3668；mir-3669；mir-3670；mir-3670；mir-3671；mir-3671；mir-3673；mir-3673；mir-3675；mir-3675；mir-3676；mir-3663；mir-3677；mir-3678；mir-3679；mir-3680；mir-3681；mir-3682；mir-3683；mir-3684；mir-3685；mir-3686；mir-3687；mir-3688；mir-3689a；mir-3689b；mir-3690；mir-3691；mir-3692；mir-3713；mir-3714；mir-3907；mir-3908；mir-3909；mir-3910-1；mir-3910-2；mir-3911；mir-3912；mir-3913-1；mir-3913-2；mir-3914-1；mir-3914-2；mir-3915；mir-3916；mir-3917；mir-3918；mir-3919；mir-3920；mir-3921；mir-3922；mir-3923；mir-3924；mir-3925；mir-3926-1；mir-3926-2；mir-3927；mir-3928；mir-3929；mir-3934；mir-3935；mir-3936；mir-3937；mir-3938；mir-3939；mir-3940；mir-3941；mir-3942；mir-3943；mir-3944；mir-3945；mir-4251；mir-4252；mir-4253；mir-4254；mir-4255；mir-4256；mir-4257；mir-4258；mir-4259；mir-4260；mir-4261；mir-4262；mir-4263；mir-4264；mir-4265；mir-4266；mir-4267；mir-4268；mir-4269；mir-4270；mir-4271；mir-4272；mir-4273；mir-4274；mir-4275；mir-4276；mir-4277；mir-4278；mir-4279；mir-4280；mir-4281；mir-4282；mir-4283-1；mir-4283-2；mir-4284；mir-4285；mir-4286；mir-4287；mir-4288；mir-4289；mir-4290；mir-4291；mir-4292；mir-4293；mir-4294；mir-4295；mir-4296；mir-4297；mir-4298；mir-4299；mir-4300；mir-4301；mir-4302；mir-4303；mir-4304；mir-4305；mir-4306；mir-4307；mir-4308；mir-4309；mir-4310；mir-4311；mir-4312；mir-4313；mir-4314；mir-4315-1；mir-4315-2；mir-4316；mir-4317；mir-4318；mir-4319；mir-4320；mir-4321；mir-4322；mir-4323；mir-4324；mir-4325；mir-4326；mir-4327；mir-4328；mir-4329；mir-4329；以及mir-4330。

在实施方案中，miRNA包括以下中的任何一种或两种或多种：miR-21；miR-23a；miR-30c；MiR-1224；miR-23b；miR-92a；miR100；miR-125b-5p；miR-195；miR-10a-5p；及其任何组合。在实施方案中，miRNA包括以下中的任何一种或两种或多种：miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124、miR-151、及其任何组合。在实施方案中，miRNA包括以下中的任何一种或两种或多种：miR-24、miR-195、miR-871、miR-30b-5p、miR-19b、miR-99a、miR-429、let-7f、miR-200a、miR-324-5p、miR-10a-5p、及其任何组合。在实施方案中，miRNA的组合可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种单个miRNA。

在实施方案中，分泌产物包含减弱NFkB信号传导通路的化合物。

在实施方案中，分泌产物包含旁分泌因子。在实施方案中，旁分泌因子是由细胞合成的分子，其可小距离扩散以诱导或影响相邻细胞的变化，即旁分泌相互作用。在实施方案中，可扩散分子被称为旁分泌因子。在实施方案中，近分泌因子是促进通过细胞膜的寡糖、脂质或蛋白组分传递的细胞间通讯的分子，并且会影响发出(emitting)细胞或紧邻细胞。在实施方案中，近分泌信号通常涉及参与的两个细胞之间的物理接触。

在实施方案中，囊泡包含抑制纤溶酶原激活抑制剂-1(PAI-1)和/或TGFβ1的miRNA。

在实施方案中，分泌产物包含旁分泌和/或近分泌因子，如α-1微球蛋白、β-2-微球蛋白、钙结合蛋白、凝聚素、结缔组织生长因子、胱抑素-C、谷胱甘肽-S-转移酶α、肾损伤分子-1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、骨桥蛋白、三叶因子3、tam-horsfall尿糖蛋白、金属蛋白酶1组织抑制剂、血管内皮生长因子、纤连蛋白、白介素6或单核细胞趋化蛋白1。

在实施方案中，可通过红细胞生成和/或肾功能的各种指标来观测通过本文公开的方法对受试者的肾病的有效治疗。在实施方案中，红细胞稳态指标包括但不限于血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HB)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、红细胞计数(RBC)、网织红细胞数目、网织红细胞百分比、平均红细胞体积(MCV)、以及红细胞分布宽度(RDW)。在实施方案中，肾功能指标包括但不限于血清白蛋白、白蛋白-球蛋白比率(A/G比率)、血清磷、血清钠、肾脏大小(可通过超声测量)、血清钙、磷:钙比率、血清钾、蛋白尿、尿肌酐、血清肌酐、血氮尿素(BUN)、胆固醇水平、甘油三酯水平和肾小球滤过率(GFR)。此外，总体健康的若干指标包括但不限于体重增加或减少、存活率、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)和身体耐力性能。

在实施方案中，用生物活性肾细胞制剂的有效治疗通过肾功能的一种或多种指标的稳定来证实。在实施方案中，肾功能的稳定通过观测到通过本文提供的方法治疗的受试者的指标与未经本公开方法治疗的受试者的相同指标相比发生变化来表明。在实施方案中，肾功能的稳定可通过观测用本文方法治疗的受试者的指标与治疗前同一受试者的相同指标相比的变化来表明。在实施方案中，第一指标的变化可以是值的增加或减少。在实施方案中，本公开提供的治疗可包括受试者的血尿素氮(BUN)水平的稳定，其中与未接受本公开方法治疗的具有类似疾病状态的受试者相比，在受试者中观测到BUN水平更低。在实施方案中，治疗可包括受试者的血清肌酐水平的稳定，其中与未通过本公开方法治疗的具有类似疾病状态的受试者相比，在受试者中观测到血清肌酐水平更低。在实施方案中，治疗可包括受试者的血细胞比容(HCT)水平的稳定，其中与未通过本公开的方法治疗的具有类似疾病状态的受试者相比，在受试者中观测到HCT水平更高。在实施方案中，治疗可包括受试者的红细胞(RBC)水平的稳定，其中与未通过本公开方法治疗的具有类似疾病状态的受试者相比，在受试者中观测到RBC水平更高。在实施方案中，可测量本文所述或本领域已知的一种或多种其他指标来确定受试者的肾病的有效治疗。

在实施方案中，再生天然肾脏可通过许多指标来表征，包括但不限于天然肾功能或能力的发展、天然肾功能或能力的改善、以及天然肾脏中某些标志物的表达。在实施方案中，可基于本文所述的红细胞稳态和肾功能的各种指标来观测发展或改善的功能或能力。在实施方案中，再生肾脏通过一种或多种干细胞标志物的差异表达来表征。在实施方案中，干细胞标志物可以是以下中的一种或多种：Sox2；UTF1；NODAL；PROM1或CD133；CD24；及其任何组合(参见Ilagan et al.，PCT/US2011/036347，通过引用整体并入本文)。在实施方案中，与对照相比，干细胞标志物的表达上调。

在实施方案中，本文所述的细胞群，包括富集的细胞群和/或其混合物，以及包含它们的构建体，可用于为天然肾脏提供再生效果。在实施方案中，效果可由细胞本身和/或细胞分泌的产物提供。在实施方案中，再生效果可通过以下中的一种或多种来表征：上皮-间充质转化的减少(这可能是通过减弱TGF-β信号传导)；肾纤维化的减少；肾脏炎症的减少；天然肾脏中干细胞标志物的差异表达；植入细胞和/或天然细胞迁移至肾损伤(如，肾小管损伤)部位，植入细胞在肾损伤(如，肾小管损伤)部位处的移植；肾功能的一种或多种指标的稳定(如本文所述)；红细胞稳态的恢复(如本文所述)；及其任何组合。

在实施方案中，本文提供的治疗组合物或制剂包含分离的异质肾细胞群，其富含特定的生物活性组分或细胞类型和/或耗尽特定的无活性或不需要的组分或细胞类型。在实施方案中，将这类组合物和制剂用于治疗肾病，如，提供肾功能和/或结构的稳定和/或改善和/或再生。在实施方案中，组合物包含与健康个体相比缺乏细胞组分但仍保留治疗特性(如，提供肾功能的稳定性和/或改善和/或再生)的分离的肾细胞级分。在实施方案中，本文所述的细胞群可源自健康个体、患有肾病的个体或本文所述的受试者。

本文包括待施用于受试者的靶器官或组织的选定的肾细胞群的治疗组合物。在实施方案中，生物活性选定的肾细胞群通常是指在施用于受试者后可能具有治疗特性的细胞群。在实施方案中，在向有需要的受试者施用后，生物活性肾细胞群可在受试者中提供肾功能的稳定和/或改善和/或修复和/或再生。在实施方案中，治疗特性可包括修复或再生效果。

在实施方案中，肾细胞群是未分级的异质细胞群或源自肾脏的富集同质细胞群。在实施方案中，异质细胞群从组织活检或从整个器官组织分离。在实施方案中，肾细胞群源自哺乳动物细胞的体外培养物，从组织活检或整个器官组织建立。在实施方案中，肾细胞群包含异质肾细胞群的亚级分或亚群，富含生物活性成分(如，生物活性肾细胞)并且去除无活性或不需要的组分或细胞。

在实施方案中，肾细胞群表达GGT和细胞角蛋白。在实施方案中，GGT的表达水平大于约10％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、或约60％。在实施方案中，GGT是GGT-1。在实施方案中，肾细胞群的细胞表达GGT-1、细胞角蛋白、VEGF和KIM-1。在实施方案中，肾细胞群中多于18％的细胞表达GGT-1。在实施方案中，肾细胞群中多于80％的细胞表达细胞角蛋白。在实施方案中，细胞角蛋白选自CK8、CK18、CK19及其组合。在实施方案中，细胞角蛋白是CK8、CK18、CK19、CK8/CK18、CK8/CK19、CK18/CK19或CK8/CK18/CK19，其中“/”是指与其相邻的细胞角蛋白的组合。在实施方案中，细胞角蛋白的表达水平大于约80％、约85％、约90％或约95％。在实施方案中，肾细胞群中多于80％的细胞表达细胞角蛋白。在实施方案中，肾细胞群表达AQP2。在实施方案中，少于40％的细胞表达AQP2。在实施方案中，肾细胞群中至少3％的细胞表达AQP2。

在实施方案中，细胞群中多于18％的细胞表达GGT-1并且细胞群中多于80％的细胞表达细胞角蛋白。在实施方案中，细胞角蛋白是CK18。在实施方案中，细胞群中4.5％至81.2％的细胞表达GGT-1，细胞群中3.0％至53.7％的细胞表达AQP2，并且细胞群中81.1％至99.7％的细胞表达CK18。

在实施方案中，肾细胞群包含表达选自以下的标志物中的一种或多种的任意组合：AQP1，AQP2，AQP4，钙结合蛋白，钙调蛋白，CD117，CD133，CD146，CD24，CD31(PECAM-1)，CD54(ICAM-1)，CD73，CK18，CK19，CK7，CK8，CK8，CK18，CK19，CK8、CK18和CK19的组合，联接蛋白43，Cubilin，CXCR4(融合素)，DBA，E-钙粘蛋白(CD324)，EPO(促红细胞生成素)GGT1，GLEPP1(肾小球上皮蛋白1)，结合球蛋白，Itgbl(整合素01)，KIM-1(肾损伤分子-1)，T1M-1(T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白的分子)，MAP-2(微管-相关蛋白2)，Megalin，N-钙粘蛋白，Nephrin，NKCC(Na-K-Cl-协同转运蛋白)，OAT-1(有机阴离子转运蛋白1)，骨桥蛋白，Pan-钙粘蛋白，PCLP1(足细胞标志蛋白样1分子)，Podocin，SMA(平滑肌α-肌动蛋白)，Synaptopodin，THP(tamm-horsfall蛋白)，Vinientin，以及αGST-1(α谷胱甘肽S-转移酶)。

在实施方案中，与起始群(如，肾组织活检的细胞群或其原代培养物)相比，肾细胞群富含上皮细胞(如，肾细胞群体包含比起始群更多至少约5％、10％、15％、20％或25％的上皮细胞)。在实施方案中，与起始群(如，肾组织活检的细胞群或其原代培养物)相比，肾细胞群富含肾小管细胞(如，肾细胞群包含比起始群更多至少约5％、10％、15％、20％或25％的肾小管细胞)。在实施方案中，肾小管细胞包括近端肾小管细胞。在实施方案中，与起始群相比，肾细胞群具有更小比例的远端肾小管细胞、集合管细胞、内分泌细胞、血管细胞或祖细胞样细胞。在实施方案中，与起始群相比，肾细胞群具有更小比例的远端肾小管细胞。在实施方案中，与起始群相比，肾细胞群具有更小比例的集合管细胞。在实施方案中，与起始群相比，肾细胞群具有更小比例的内分泌细胞。在实施方案中，与起始群相比，肾细胞群具有更小比例的血管细胞。在实施方案中，与起始群相比，肾细胞群具有更小比例的祖细胞样细胞。在实施方案中，与未富集的群体(如，起始肾细胞群)相比时，肾细胞群具有更大比例的肾小管细胞和更小比例的EPO产生细胞和血管细胞。在实施方案中，与未富集的群体相比时，肾细胞群具有更大比例的肾小管细胞和更小比例的EPO产生细胞和血管细胞。在实施方案中，与未富集的群体相比时，肾细胞群具有更大比例的肾小球细胞和更小比例的肾小球细胞和血管细胞。

在实施方案中，肾细胞群的细胞表达透明质酸(HA)。在实施方案中，HA的大小范围为约5kDa至约20000kDa。在实施方案中，HA的分子量为5kDa、60kDa、800kDa和/或3,000kDa。在实施方案中，肾细胞群通过透明质酸合成酶-2(HAS-2)的表达合成和/或刺激高分子量HA的合成，尤其是在肾内植入之后。在实施方案中，肾细胞群的细胞通过HAS-2的作用在体外和/或体内表达更高分子量的HA种类。在实施方案中，肾细胞群的细胞通过HAS-2的作用在体外和体内表达更高分子量的HA种类。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有至少100kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有约800kDa至约3,500kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有约800kDa至约3,000kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有至少800kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有至少3,000kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有约800kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有约3,000kDa的分子量的HA。在实施方案中，HAS-2合成具有2x10⁵至2x10⁶Da的分子量的HA。在实施方案中，较小的HA种类通过降解透明质酸酶的作用形成。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有约200kDa至约2000kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有约200kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有约2000kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有至少200kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有至少2000kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有至少5000kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有至少10000kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有至少15000kDa的分子量的HA。在实施方案中，较高分子量的HA种类是具有约20000kDa的分子量的HA。

在实施方案中，该群体包含能够进行受体介导的白蛋白转运的细胞。

在实施方案中，肾细胞群的细胞是耐缺氧的。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下任意组合中的一种或多种的细胞类型：megalin、cubilin、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、水通道蛋白-1(Aquaporin-1)和水通道蛋白-2(Aquaporin-1)。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下一种或多种任意组合的细胞类型：megalin、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS致癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(Fxyd4))、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)、成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下任意组合中的一种或多种的细胞类型：megalin、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad))、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS致癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员81(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)、钙蛋白酶-8(Capn8)和水通道蛋白-4(Aqp4)。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下任意组合中的一种或多种的细胞类型：水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD结构域的离子转运调节剂2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)成员3(Slc17a3)、溶质载体家族3成员1(Slc3a1)、密蛋白2(Cldn2)、napsin A天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2(促进葡萄糖转运蛋白)成员2(Slc2a2)、丙氨酰(膜))氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基辅酶A合成酶中链家族成员2(Acsm2)、谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1,6-双磷酸酶1(Fbp1)、丙氨酸转氨酶2(Agxt2)、血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和podocin(Podn)。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下任意组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146、Podocin(Podn)和肾素(Neph)、趋化因子(CXC)受体4(Cxcr4)、B型内皮素受体(Ednrb)、胶原V型α2(Col5a2)、钙粘蛋白5(Cdh5)、组织型纤溶酶原激活剂(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(骨连接素)(Sparc)、丝甘蛋白聚糖(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制剂3(Timp3)、Wilms肿瘤1(Wt1)、无翅型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号调节剂4(Rgs4)、促红细胞生成素(EPO)。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下任意组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、podocin、nephrin、EPO、CK7、CK8/18/19。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下任意组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下任意组合中的一种或多种的细胞类型：Podocin(Podn)和Nephrin(Neph)。

在实施方案中，肾细胞群包含一种或多种表达以下任意组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a和EPO。

在实施方案中，样品或细胞群中各种生物标志物的存在(如，表达)和/或水平/量可通过多种方法进行分析，其中许多是本领域已知且技术人员所理解的，包括但不限于：免疫组织化学(“IHC”)、蛋白印迹分析、免疫沉淀、分子结合分析、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、Mass ARRAY、蛋白质组学、生化酶活性分析、原位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链反应(“PCR”)包括实时定量PCR(“qRT-PCR”)和其他扩增类型检测方法(如，例如分支DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达谱和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及可通过蛋白、基因和/或组织芯片进行分析的各种检测中的任何一种。用于评估基因状态和基因产物的方案的非限制性实例包括Northern印迹、Southern印迹、免疫印迹和PCR分析。在实施方案中，还可使用多重免疫测定，如可从Rules Based Medicine获得的那些，或还可使用Meso Scale Discovery。在实施方案中，样品或细胞群中各种生物标志物的存在(如，表达)和/或水平/量可通过多种方法进行分析，其中许多是本领域已知且技术人员所理解的，包括但不限于“-组学(-omics)”平台，例如全基因组转录组学、蛋白质组学、分泌组学、脂质组学、磷酸化组学、外泌体组学等，其中高通量方法与计算生物学和生物信息学技术相结合，以阐明考虑的细胞群表达和不表达的基因、miRNA、蛋白、分泌蛋白、脂质等的完整生物学特征。

在实施方案中，检测肾细胞群中两种或多种生物标志物的存在的方法包括在允许抗体与其同源配体(即，生物标志物)结合的条件下，使样品与带有生物标志物的抗体接触，并检测结合抗体的存在，例如，通过检测抗体和生物标志物之间是否形成复合物。在实施方案中，检测一种或多种生物标志物的存在通过免疫组织化学进行。如本文所用，术语“检测”包括定量和/或定性检测。

在实施方案中，用允许检测本文公开的生物标志物的一种或多种试剂识别肾细胞群，例如AQP1、AQP2、AQP4、钙结合蛋白、钙调蛋白、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31(PECAM-1)、CD54(ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8/18、CK8/18/19、联接蛋白43、Cubilin、CXCR4(融合素)、DBA、E-钙粘蛋白(CD324)、EPO(促红细胞生成素)、GGT1、GLEPP1(肾小球上皮蛋白1)、结合球蛋白、Itgbl(整合素p)、KIM-1(肾损伤分子-1)、T1M-1(T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白的分子)、MAP-2(微管-相关蛋白2)、Megalin、N-钙粘蛋白、肾小球蛋白、NKCC(Na-K-Cl-协同转运蛋白)、OAT-1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白、泛钙粘蛋白、PCLP1(podocalyxin样1分子)，Podocin、SMA(平滑肌α-肌动蛋白)、Synaptopodin、THP(tamm-horsfall蛋白)、波形蛋白、以及αGST-1(α谷胱甘肽5-转移酶)。在实施方案中，生物标志物通过单克隆或多克隆抗体检测。

在实施方案中，细胞来源与预定的靶器官或组织相同。在实施方案中，BRC或SRC可来源于肾脏以在待施用于肾脏的制剂中使用。在实施方案中，细胞群源自肾活检。在实施方案中，细胞群源自整个肾脏组织。在实施方案中，细胞群源自哺乳动物肾细胞的体外培养物，由肾活检或整个肾脏组织建立。

在实施方案中，BRC或SRC包括生物活性肾细胞的异质混合物或级分。在实施方案中，BRC或SRC可源自健康个体的肾细胞级分或是来自健康个体的肾细胞级分本身。在实施方案中，本文包括从不健康个体获得的肾细胞群或级分，当与健康个体的肾细胞群相比时，其可能缺乏某些细胞类型(如，在肾脏或其活检中)。在实施方案中，本文提供的是与健康个体相比缺乏某些细胞类型的治疗活性细胞群。在实施方案中，细胞群从自体细胞群中分离和扩增。

在实施方案中，SRC是通过肾活检获自从患者的肾皮层组织中分离和扩增的肾细胞。在实施方案中，肾细胞通过酶消化从肾组织分离，使用标准细胞培养技术扩增，并通过跨密度边界、屏障或界面离心从扩增的肾细胞中选择。在实施方案中，肾细胞通过酶消化从肾组织分离，使用标准细胞培养技术扩增，并通过连续或不连续单步或多步密度梯度离心从扩增的肾细胞中选择。在实施方案中，SRC主要由以其再生潜力而闻名的肾上皮细胞组成。在实施方案中，其他实质(血管)和基质细胞可存在于自体SRC群中。

在实施方案中，生物活性肾细胞通过酶消化从肾组织分离的肾细胞获得并使用标准细胞培养技术扩增。在实施方案中，细胞培养基被设计为扩增具有再生能力的生物活性肾细胞。在实施方案中，细胞培养基不含任何重组或纯化的分化因子。在实施方案中，在低氧条件下培养扩增的肾细胞异质混合物以进一步富集具有再生能力的细胞组分。不希望受理论束缚，这可能是由于以下一种或多种现象：1)在低氧培养期间特定细胞组分的选择性存活、死亡或增殖；2)响应于低氧培养的细胞粒度和/或大小的改变，从而在密度梯度分离期间或在跨密度边界、屏障或界面离心期间影响浮力密度和随后定位的改变；以及3)响应于低氧培养期间的细胞基因/蛋白表达的改变，从而导致分离和扩增群体内细胞的不同特征。

在实施方案中，生物活性肾细胞群是在富含能够肾再生的细胞的培养条件下获自从肾组织(如，从活检获得的组织)分离和扩增的肾细胞。

在实施方案中，来自肾组织(如，从活检获得的组织)的肾细胞传代1、2、3、4、5或更多次以产生扩增的生物活性肾细胞(如，富集了能够肾再生的细胞的细胞群)。在实施方案中，来自肾组织(如，从活检获得的组织)的肾细胞传代1次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，来自肾组织(如，从活检获得的组织)的肾细胞传代2次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，来自肾组织(如，从活检获得的组织)的肾细胞传代3次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，来自肾组织(如，从活检获得的组织)的肾细胞传代4次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，来自肾组织(如，从活检获得的组织)的肾细胞传代5次以产生扩增的生物活性肾细胞。在实施方案中，传代细胞减少了非生物活性肾细胞的细胞群。在实施方案中，传代细胞减少了至少一种细胞类型的细胞群。在实施方案中，传代细胞减少了具有密度大于1.095g/ml的细胞的细胞群。在实施方案中，传代细胞减少了低粒度小细胞的细胞群。在实施方案中，传代细胞减少了比红细胞更小的细胞群。在实施方案中，传代细胞减少了具有直径小于6μm的细胞的细胞群。在实施方案中，传代细胞减少了具有直径小于2μm的细胞的细胞群。在实施方案中，传代细胞减少了具有比红细胞更低粒度的细胞的细胞群。在实施方案中，1次或多次传代后细胞群的活力增加。在实施方案中，当通过荧光激活细胞分选(FAC)分析细胞时，使用小细胞和低粒度的描述，例如，使用细胞出现位置的散点图的X-Y轴。

在实施方案中，扩增的生物活性肾细胞在低氧条件下生长至少约6、9、10、12或24小时，但少于48小时，或6至9小时，或6至48小时，或约12至约15小时，或约8小时，或约12小时，或约24小时，或约36小时，或约48小时。在实施方案中，基于密度选择在低氧条件下生长的细胞。在实施方案中，生物活性肾细胞群是在连续或不连续(单步或多步)密度梯度分离扩增的肾细胞(如，在低氧条件下传代和/或培养)后获得的选定的肾细胞(SRC)群。在实施方案中，生物活性肾细胞群是在通过跨密度边界、屏障或界面离心分离扩增的肾细胞(如，在低氧条件下传代和/或培养)后获得的选定的肾细胞(SRC)群。在实施方案中，低氧培养条件是这样的培养条件，其中细胞在培养系统中的可用氧气水平相对于在大气氧气水平(约21％)下培养细胞的标准培养条件降低。在实施方案中，在低氧培养条件下培养的细胞在约5％至约15％、或约5％至约10％、或约2％至约5％、或约2％至约7％的氧气水平下培养，或约2％或约3％、或约4％、或约5％的氧气水平下培养。在实施方案中，SRC显示浮力密度大于约1.0419g/mL。在实施方案中，SRC显示浮力密度大于约1.04g/mL。在实施方案中，SRC显示浮力密度大于约1.045g/mL。在实施方案中，与起始肾细胞群相比，BRC或SRC包含更大百分比的一种或多种细胞群并且缺少或缺乏一种或多种其他细胞群。

在实施方案中，扩增的生物活性肾细胞可进行密度梯度分离获得SRC。在实施方案中，基于细胞浮力密度将连续或不连续单步或多步密度梯度离心用于分离收获的肾细胞群。在实施方案中，可通过跨密度边界、屏障或界面离心来分离扩增的生物活性肾细胞获得SRC。在实施方案中，基于细胞浮力密度将跨密度边界或界面离心用于分离收获的肾细胞群。在实施方案中，SRC通过部分使用OPTIPREP(Axis-Shield)分离液产生，其包含60％(w/v)非离子碘化化合物碘克沙醇水溶液。然而，本领域技术人员将认识到，可将其他介质、密度梯度(连续或不连续)、密度边界、屏障、界面或其他方法用于获得生物活性肾细胞，例如，使用本领域已知的细胞表面标志物的免疫分离，其包括分离本文所述细胞群所需的特征。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.04g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.04g/mL的细胞排除并丢弃。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.0419g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.0419g/mL的细胞排除并丢弃。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.045g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.045g/mL的细胞排除并丢弃。

在实施方案中，细胞浮力密度用于获得SRC群和/或确定肾细胞群是否是生物活性肾细胞群。在实施方案中，细胞浮力密度用于分离生物活性肾细胞。在实施方案中，细胞浮力密度通过跨单步OptiPrep(7％碘克沙醇；OptiMEM中60％(w/v))密度界面(单步不连续密度梯度)离心来确定。Optiprep是60％w/v碘克沙醇水溶液。当用于示例性密度界面或单步不连续密度梯度时，Optiprep用OptiMEM(细胞培养基础培养基)稀释以形成7％碘克沙醇(在水和OptiMEM中)的最终溶液。OptiMEM的配方是改良的Eagle's最低必需培养基，用HEPES和碳酸氢钠缓冲，并补充有次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺或GLUTAMAX、微量元素和生长因子。蛋白水平最低(15μg/mL)，其中胰岛素和转铁蛋白是唯一的蛋白补充剂。酚红作为pH指示剂以降低的浓度包含在内。在实施方案中，OptiMEM可在使用前补充2-巯基乙醇。

在实施方案中，在使用前，制备OptiPrep溶液并测量指示期望密度的折射率(R.I.1.3456+/-0.0004)。在实施方案中，肾细胞在溶液顶部分层。在实施方案中，在离心管(如，50ml圆锥管)或细胞处理器(如，COBE2991)中于室温(无制动)以800g离心密度界面或单步不连续密度梯度20分钟。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.04g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.04g/mL的细胞排除并丢弃。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.0419g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.0419g/mL的细胞排除并丢弃。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.045g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.045g/mL的细胞排除并丢弃。在实施方案中，在评估细胞密度或基于密度选择之前，将细胞培养直至它们至少50％汇合并在设置为5％CO₂环境中2％氧气的低氧培养箱中于37℃温育过夜(如，至少约8或12小时)。

在实施方案中，将获自肾脏样品的细胞扩增然后处理(如，通过低氧和离心分离)以提供SRC群。在实施方案中，使用本文所述的试剂和程序产生SRC群。在实施方案中，在将群体的细胞施用于受试者之前，测试来自SRC群的细胞样品的活力。在实施方案中，在将群体的细胞施用于受试者之前，测试来自SRC群的细胞样品的一种或多种本文公开的标志物的表达。

美国专利申请公开号2017/0281684A1中公开了用于制备SRC的组合物和方法的非限制性实例，其全部内容通过引用并入本文。

在实施方案中，BRC或SRC源自天然自体或同种异体肾脏样品。在实施方案中，BRC或SRC源自非自体肾脏样品。在实施方案中，样品可通过肾活检获得。

在实施方案中，肾细胞分离和扩增提供包括肾上皮细胞和基质细胞的肾细胞类型的混合物。在实施方案中，SRC通过连续或不连续密度梯度分离扩增的肾细胞获得。在实施方案中，密度梯度分离的SRC群中的主要细胞类型是管状上皮表型。在实施方案中，SRC通过跨密度边界、屏障或界面离心分离扩增的肾细胞获得。在实施方案中，跨密度边界/屏障/界面分离的SRC群中的主要细胞类型是管状上皮表型。在实施方案中，使用多管齐下的方法评估从扩增的肾细胞获得的SRC的特征。在实施方案中，在肾细胞扩增过程中监测细胞形态、生长动力学和细胞活力。在实施方案中，SRC浮力密度和活力通过密度梯度介质离心或通过密度梯度介质离心和台盼蓝排除来表征。在实施方案中，SRC表型通过流式细胞术来表征，并且SRC功能通过VEGF和KIM-1的表达来证实。在实施方案中，配制前SRC的细胞功能也可通过测量两种特定酶的活性来评估；存在于肾近端小管中的GGT(γ-谷氨酰转肽酶)和LAP(亮氨酸氨肽酶)。

在实施方案中，可利用有助于通过密度介质分离细胞亚群的细胞特征(大小和颗粒度)通过流式细胞术(前向散射＝通过流式细胞术反映大小，侧向散射＝反映颗粒度)分离细胞亚群。在实施方案中，密度梯度或分离介质应当对感兴趣的特定细胞具有低毒性。在实施方案中，虽然密度介质应当对感兴趣的特定细胞具有低毒性，但本公开考虑使用在感兴趣细胞的选择过程中起作用的介质。在实施方案中，且不希望受理论束缚，似乎通过包含碘克沙醇的介质回收本文公开的细胞群是碘克沙醇抗性的，因为在加载和回收步骤之间存在明显的细胞损失，这表明在密度梯度或密度边界、密度屏障或密度界面的条件下接触碘克沙醇导致消除某些细胞。在实施方案中，在碘克沙醇密度梯度或密度界面分离之后出现的细胞抵抗碘克沙醇和/或密度梯度或界面暴露的任何不利影响。在实施方案中，包含轻度至中度肾毒素的造影剂用于分离和/或选择细胞群，如SRC群。在实施方案中，SRC是碘克沙醇抗性的。在实施方案中，密度介质不应与人血浆中的蛋白结合或不利地影响感兴趣细胞的关键功能。

在实施方案中，细胞群使用荧光激活细胞分选(FACS)来富集和/或减少一种或多种肾细胞类型。在实施方案中，可使用BD FACSAria^TM或等效物来富集和/或减少肾细胞类型。在实施方案中，可使用FACSAria III^TM或等效物来富集和/或减少肾细胞类型。

在实施方案中，细胞群已使用磁性细胞分选富集和/或减少一种或多种肾细胞类型。在实施方案中，一种或多种肾细胞类型可使用Miltenyi

系统或等效物来富集和/或减少。

在实施方案中，肾细胞群已进行三维培养。在实施方案中，培养细胞群的方法是通过连续灌注。在实施方案中，与静态培养的细胞群相比，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群显示更多的细胞性和互连性。在实施方案中，与此类细胞群的静态培养物相比，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群显示更高的EPO表达，以及增强的肾小管相关基因如E-钙粘蛋白的表达。在实施方案中，与静态培养的细胞群相比，通过连续灌注培养的细胞群显示更高水平的葡萄糖和谷氨酰胺消耗。

在实施方案中，低氧或缺氧条件可用于制备本文提供的细胞群的方法。在实施方案中，可使用制备细胞群的方法而无需低氧调节步骤。在实施方案中，可使用常氧条件。

在实施方案中，肾细胞群已从肾组织分离和/或培养。本文公开了用于分离和隔离肾细胞组分(如，富集的细胞群)的方法的非限制性实例，其将在用于治疗应用的制剂中使用，包括治疗肾病、贫血、EPO缺乏症、肾小管转运缺乏症、以及肾小球滤过缺陷。在实施方案中，细胞群分离自新鲜消化(即，机械或酶消化)的肾组织或哺乳动物肾细胞的异质体外培养物。

在实施方案中，肾细胞群包含产生EPO的肾细胞。在实施方案中，受试者患有贫血症和/或EPO缺乏症。在实施方案中，通过EPO表达和对氧气的生物响应性表征的产生EPO的肾细胞群，使得培养系统的氧张力降低，导致诱导EPO表达。在实施方案中，产生EPO的细胞群富含产生EPO的细胞。在实施方案中，与在正常大气可用氧气水平(约21％)下培养的细胞群相比，细胞群在培养系统中可用氧气水平降低的条件下培养时，诱导EPO表达。在实施方案中，在低氧气条件下培养的产生EPO的细胞相对于在正常氧气条件下培养的产生EPO的细胞表达更高水平的EPO。通常，在可用氧气水平降低(又被称为低氧培养条件)下培养细胞意味着降低的氧气水平是相对于在可用氧气的正常大气水平(又被称为正常或常氧培养条件)下培养细胞的降低。在实施方案中，低氧细胞培养条件包括在约低于1％氧气、约低于2％氧气、约低于3％氧气、约低于4％氧气、或约低于5％氧气下培养细胞。在实施方案中，正常或常氧培养条件包括在约10％氧气、约12％氧气、约13％氧气、约14％氧气、约15％氧气、约16％氧气、约17％氧气、约18％氧气、约19％氧气、约20％氧气、或约21％氧气下培养细胞。

在实施方案中，诱导或增加EPO表达通过在约低于5％可用氧气下培养细胞获得，并将EPO表达水平与在大气氧气(约21％)下培养的细胞进行比较来观测。在实施方案中，诱导EPO通过包括第一培养阶段和第二培养阶段的方法在能够表达EPO的细胞培养物中获得，其中在第一培养阶段，细胞培养物在大气氧气(约21％)下培养一段时间，在第二培养阶段，可用氧气水平降低，相同的细胞在约低于5％可用氧气下培养。在实施方案中，响应于低氧条件的EPO表达受HIF1α调节。在实施方案中，本领域已知的其他氧气操作培养条件可用于本文所述的细胞。

在实施方案中，制剂包含以对灌注条件的生物响应性为特征(如，EPO表达)的富含产生EPO的哺乳动物的细胞群。在实施方案中，灌注条件包括瞬时、间歇或连续流体流动(灌注)。在实施方案中，以通过流动动态力传递至细胞的方式间歇或连续循环或搅拌培养细胞的培养基时，EPO表达是机械诱导的。在实施方案中，经受瞬时、间歇或连续流体流动的细胞以它们作为三维结构存在于为此类三维结构形成提供框架和/或空间的材料之中或之上的方式培养。在实施方案中，细胞在多孔珠上培养并通过摇动平台、旋转平台或转瓶进行间歇或连续的流体流动。在实施方案中，细胞在三维支架上培养并置于固定支架的装置中，流体定向流过或穿过支架。本领域普通技术人员将理解，可将本领域已知的其他灌注培养条件用于本文所述的细胞。

在实施方案中，细胞群源自肾活检。在实施方案中，细胞群源自整个肾组织。在实施方案中，细胞群源自哺乳动物肾细胞的体外培养物，该培养物由肾活检或整个肾组织建立。在实施方案中，肾细胞群是SRC群。在实施方案中，细胞群是未分级的细胞群，在本文中又被称为非富集细胞群。

在本文中包括包含多种活性剂(如，除肾细胞外)的组合物。合适的活性剂的非限制性实例包括但不限于细胞聚集体、非细胞生物材料、来自生物活性细胞的分泌产物、大分子和小分子治疗剂，以及它们的组合。例如，一种类型的生物活性细胞可与基于生物材料的微载体结合，带有或不带有治疗分子或另一种类型的生物活性细胞。在实施方案中，未附着的细胞可与非细胞颗粒结合。

在实施方案中，肾细胞群的细胞在球状体内。在实施方案中，肾细胞群呈球状体的形式。在实施方案中，将包含生物活性肾细胞的球状体施用于受试者。在实施方案中，球状体包含至少一种非肾细胞类型或细胞群。在实施方案中，球状体由包括以下的方法产生：(i)使生物活性肾细胞群和非肾细胞群结合，和(ii)在三维培养系统包括转瓶中培养生物活性肾细胞群和非肾细胞群，直到球状体形成。

在实施方案中，非肾细胞群包括内皮细胞群或内皮祖细胞群。在实施方案中，生物活性细胞群是内皮细胞群。在实施方案中，内皮细胞群是一种细胞系。在实施方案中，内皮细胞群包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在实施方案中，非肾细胞群是间充质干细胞群。在实施方案中，非肾细胞群是造血、乳腺、肠、胎盘、肺、骨髓、血液、脐带、内皮、牙髓、脂肪、神经、嗅觉、神经嵴或睾丸来源的干细胞群。在实施方案中，非肾细胞群是脂肪来源的祖细胞群。在实施方案中，细胞群是异种的、同基因的、同种异体的、自体的或其组合。在实施方案中，生物活性肾细胞群和非肾细胞群以0.1:9.9至9.9:0.1的比例培养。在实施方案中，生物活性肾细胞群和非肾细胞群以约1:1的比例培养。在实施方案中，肾细胞群和生物活性细胞群悬浮于生长培养基中。

扩增的生物活性肾细胞可进一步进行连续或不连续密度介质分离获得SRC。具体地，基于细胞浮力密度连续或不连续单步或多步密度梯度离心用于分离收获的肾细胞群。在实施方案中，扩增的生物活性肾细胞可通过跨密度边界、屏障或界面离心进一步进行分离获得SRC。具体地，基于细胞浮力密度将跨密度边界、屏障或界面离心用于分离收获的肾细胞群。在实施方案中，通过部分地使用OPTIPREP(Axis-Shield)分离液产生SRC，其包含60％非离子碘化化合物碘克沙醇水溶液。然而，本领域技术人员将认识到，任何密度梯度介质不限于特定介质或其他方式，例如可使用利用本领域已知的细胞表面标志物的免疫分离，其包括用于分离本发明所涵盖的细胞群所需的特征。例如，可将Percoll或蔗糖用于形成密度梯度或密度边界。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.04g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.04g/mL的细胞排除并丢弃。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.0419g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.0419g/mL的细胞排除并丢弃。在实施方案中，在离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.045g/mL的细胞级分。在实施方案中，将保持浮力密度小于1.045g/mL的细胞排除并丢弃。

治疗组合物及其制剂可包含分离的异质肾细胞群和/或其混合物，富含特定生物活性成分或细胞类型和/或减少特定无活性或不需要的成分或细胞类型以用于治疗肾病，即提供肾功能和/或结构的稳定和/或改善和/或再生，例如之前Presnell et al.U.S.8,318,484和Ilagan Ilagan et al.z PCT/US2011/036347中所述，其全部内容通过引用并入本文。组合物可包含与健康个体相比缺乏细胞组分但仍保留治疗特性(即，提供肾功能的稳定性和/或改善和/或再生)的分离的肾细胞级分。本文所述的细胞群、细胞级分和/或细胞混合物可源自本文所述的健康个体、患有肾病的个体或受试者。

本公开考虑待施用于有需要的受试者的靶器官或组织的选定的肾细胞群的治疗组合物。选定的生物活性肾细胞群通常是指施用于受试者后可能具有治疗特性的细胞群。例如，施用于有需要的受试者后，生物活性肾细胞群可在受试者中提供肾功能的稳定和/或改善和/或修复和/或再生。治疗特性可包括再生作用。

在实施方案中，细胞来源与预定的靶器官或组织相同。例如，BRC和/或SRC可来源于肾脏以用于施用至肾脏的制剂中。在实施方案中，细胞群源自肾活检。在实施方案中，细胞群源自整个肾组织。在另一个其他实施方案中，细胞群源自哺乳动物肾细胞的体外培养物，该培养物由肾活检或整个肾组织建立。在实施方案中，BRC和/或SRC包括生物活性肾细胞的异质混合物或级分。BRC和/或SRC可源自来自健康个体的肾细胞级分或是来自健康个体的肾细胞级分本身。此外，本公开提供了从不健康个体获得的肾细胞级分，与健康个体的相应肾细胞级分相比，其可能缺乏某些细胞成分但仍保留治疗特性。本公开还提供了与健康个体相比缺乏细胞组分的治疗活性细胞群。在实施方案中，该细胞群可从各种疾病状态的自体来源分离和扩增。

在实施方案中，SRC获自通过肾活检从患者的肾皮质组织中分离和扩增的肾细胞。肾细胞从通过酶消化的肾组织分离，使用标准细胞培养技术扩增，并通过跨密度边界、屏障或界面离心扩增的肾细胞来选择。在该实施方案中，SRC主要由已知具有再生潜力的肾小管上皮细胞组成(Bonventre JV.Dedifferentiation and proliferation of survivingepithelial cells in acute renal failure.J Am Soc Nephrol.2003；14(Suppl.1):S55–61；Humphreys BD,Czerniak S,DiRocco DP,et al.Repair of injured proximaltubule does not involve specialized progenitors.PNAS.2011；108:9226–31；Humphreys BD,Valerius MT,Kobayashi A,et al.Intrinsic epithelial cells repairthe kidney after injury.Cell Stem Cell.2008；2:284–91)。其他实质(血管)和基质细胞可能存在于自体SRC群中。在实施方案中，通过连续或不连续单步或多步梯度离心来选择肾细胞。

如本文所述，本发明部分基于以下令人惊讶的发现：异质肾细胞群的某些亚级分富含生物活性成分并减少非活性或不需要的成分，提供比起始群更优越的治疗和再生结果。

肾细胞分离和扩增提供了肾细胞类型混合物，包括肾小管上皮细胞和基质细胞。如上所述，SRC获自通过跨密度边界、屏障或界面离心分离扩增的肾细胞。分离的SRC群中的主要细胞类型是管状上皮表型。使用多管齐下的方法评估获自扩增的肾细胞的SRC的特征。在肾细胞扩增过程中监测细胞形态、生长动力学和细胞活力。SRC浮力密度和活力通过密度界面和台盼蓝排除来表征。SRC表型通过流式细胞术表征，SRC功能通过VEGF和KIM-1的表达来证实。

本领域普通技术人员将理解，可将本领域已知的其他分离和培养方法用于本文所述的细胞。本领域的普通技术人员还将理解，生物活性细胞群可源自上面具体列出的那些以外的来源，包括但不限于除肾脏、体液和脂肪之外的组织和器官。

在实施方案中，各种生物材料中的一种或多种可与活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群的球状体)组合以提供治疗制剂。在实施方案中，生物材料可以是任何合适的形状(如，珠粒)或形式(如，液体、凝胶等)。聚合物基质形式的合适生物材料的非限制性实例描述于Bertram et al.的美国公开申请20070276507(通过引用以其整体并入本文)。在实施方案中，聚合物基质可以是由多种合成或天然存在的材料形成的生物相容性材料，包括但不限于开孔聚乳酸

纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚醛、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚氰芳基醚、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚恶二唑、聚苯醚、硫化物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅胶、脲醛、胶原、明胶、海藻酸盐、层粘连蛋白、纤连蛋白、丝、弹性蛋白、海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、或其共聚物或物理混合物。在实施方案中，生物材料是水凝胶。支架配置的范围可从柔软的多孔支架至刚性的形状保持的多孔支架。在实施方案中，支架配置为能够变成水凝胶的液体溶液，例如高于熔融温度的水凝胶。

在实施方案中，支架源自现有的肾脏或人或动物来源的其他器官，其中天然细胞群已通过应用洗涤剂和/或其他化学试剂和/或本领域普通技术人员已知的其他酶促和/或物理方法消除。在这样的实施方案中，来源器官的天然三维结构与所有相关的细胞外基质成分在其天然的生物活性环境中一起保留。在实施方案中，支架是源自人或动物肾脏或其他器官的细胞外基质。在实施方案中，通过应用三维生物打印方法将配置组装成组织样结构。在实施方案中，配置是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。

水凝胶可由多种聚合物材料形成并可用于多种生物医学应用。水凝胶在物理上可描述为亲水聚合物的三维网络。取决于水凝胶的类型，它们含有不同百分比的水，但不完全溶于水。尽管含水量高，但由于存在亲水性残基，水凝胶能够额外结合大量液体。水凝胶大量膨胀而不改变其凝胶状结构。水凝胶大量膨胀而不改变其凝胶状结构。水凝胶的基本物理特性可根据所用聚合物的特性和用于施用水凝胶的装置进行特定改变。

在实施方案中，当有机聚合物(如，天然或合成的)通过共价键、离子键或氢键交联以产生捕获水分子形成凝胶的三维开放晶格结构时，形成水凝胶。在实施方案中，用于形成水凝胶的材料包括多糖如海藻酸盐，聚膦嗪和聚丙烯酸酯，其为张力交联的或嵌段共聚物，如Pluronics^TM或Tetronics^TM，分别通过温度或pH值交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。在实施方案中，水凝胶包含明胶(如，水凝胶是可生物降解的基于明胶的水凝胶)。

在实施方案中，水凝胶材料不会引起炎症反应。可用于形成水凝胶的其他材料的非限制性实例包括(a)改性海藻酸盐，(b)通过暴露于单价阳离子而凝胶化的多糖(如，结冷胶(gellan gum)和角叉菜胶)，(c)多糖(如，透明质酸)，其是非常粘稠的液体或是触变的并随时间通过结构的缓慢演变形成凝胶，(d)明胶或胶原，以及(e)聚合物水凝胶前体(如，聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白)。美国专利号6,224,893B1提供了各种聚合物的详细描述以及这些聚合物的化学性质，其适用于根据本文所述的某些实施方案制备水凝胶。

在实施方案中，用于配制生物材料的水凝胶是基于明胶的。明胶是源于胶原的无毒、可生物降解和水溶性的蛋白，其为间充质组织细胞外基质(ECM)的主要成分。明胶保留信息信号，包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，其促进细胞粘附、增殖和干细胞分化。明胶的典型特性在于其表现出上临界溶解温度行为(UCST)。在实施方案中，高于40℃的特定温度阈值，明胶可通过形成柔性随机单线圈而溶解在水中。冷却后，发生氢键和范德华相互作用，导致形成三螺旋。在实施方案中，这些胶原样三螺旋充当连接区,并因此触发溶液-凝胶(sol-gel)转变。明胶广泛用于制药和医疗应用。

胶原是动物体内各种结缔组织细胞外空间的主要结构蛋白。作为结缔组织的主要成分，它是哺乳动物中含量最多的蛋白，占全身蛋白含量的25％至35％。根据矿化程度，胶原组织可能是刚性(骨)、顺应性(肌腱)，或具有从刚性至顺应性的渐变(软骨)。呈细长纤维形式的胶原主要存在于诸如肌腱、韧带和皮肤等的纤维组织中。它还富含于角膜、软骨、骨骼、血管、肠道、椎间盘和牙齿中的牙本质中。在肌肉组织中，它作为肌内膜的主要成分。胶原组成肌肉组织的1％至2％，占强壮肌腱重量的6％。胶原存在于整个身体的许多地方。然而，人体内超过90％的胶原为I型。

迄今为止，已鉴定和描述了28种类型的胶原。它们可根据其形成的结构分为几类：原纤维(I型、II型、III型、V型、XI型)。非原纤维FACIT(具有中断三螺旋的原纤维相关胶原)(IX型、XII型、XIV型、XVI型、XIX型)。短链(VIII型、X型)。基底膜(IV型)。Multiplexin(具有中断的多重三螺旋结构域)(XV型、XVIII型)。MACIT(具有中断三螺旋的膜相关胶原)(XIII型、XVII型)。其他(VI型、VII型)。五种最常见的类型是：I型：皮肤、肌腱、血管结扎、器官、骨骼(骨骼有机部分的主要成分)。II型：软骨(软骨的主要胶原成分)。III型：网状(网状纤维的主要成分)，常见于I型旁边。IV型：形成基底层，基底膜的上皮分泌层。V型：细胞表面、毛发和胎盘。

明胶保留了信息信号，包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，其促进细胞粘附、增殖和干细胞分化。明胶的典型特性是它表现出上临界溶解温度行为(UCST)。高于40℃的特定温度阈值，明胶可通过形成柔性随机单线圈而溶解在水中。冷却后，发生氢键和范德华相互作用，导致形成三螺旋。这些胶原样三螺旋充当连接区，从而触发溶液-凝胶转变。明胶广泛用于制药和医疗应用。

在实施方案中，用于配制本文可注射细胞组合物的水凝胶基于猪明胶，其可以源自猪皮且可从如Nitta Gelatin NA Inc(NC,USA)或Gelita USA Inc.(IA，USA)商购。可将明胶溶解在Dulbecco's磷酸盐缓冲液(DPBS)中以形成热响应水凝胶，其可在不同温度下凝胶化和液化。在实施方案中，用于配制本文可注射细胞组合物的水凝胶基于使用本领域普通技术人员已知的方法表达和纯化的重组人或动物明胶。在实施方案中，包含I型αI人胶原的全部或部分cDNA的表达载体在酵母毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达。其他表达载体系统和生物体是本领域普通技术人员已知的。在特定实施方案中，基于明胶的水凝胶可以是在室温(22-28℃)及室温以上为液体且在冷却至冷藏温度(2-8℃)时凝胶化的水凝胶。

在实施方案中，用于将SRC配制成NKA的基于明胶的水凝胶生物材料是溶解在缓冲液中以形成热响应水凝胶的猪明胶。在实施方案中，该水凝胶在室温下是液体，但在冷却至冷藏温度(2-8℃)时凝胶化。SRC与水凝胶一起配制获得NKA。在实施方案中，NKA通过冷却凝胶化并在冷藏温度(2-8℃)下运送至诊所。在实施方案中，NKA具有3天的保质期。在实施方案中，在临床站点，在注射至患者肾脏之前将产品温热到室温。在实施方案中，使用适于通过经皮或腹腔镜手术递送NKA的针头和注射器将NKA植入肾皮质。在实施方案中，水凝胶源自明胶或重组来源的另一种细胞外基质蛋白。在实施方案中，水凝胶来源于源自肾脏或另一组织或器官的细胞外基质。在实施方案中，水凝胶源自重组细胞外基质蛋白。在实施方案中，水凝胶包含源自重组胶原的明胶(即，重组明胶)。

在实施方案中，支架或生物材料特性可使细胞能够附着于支架或生物材料并与之相互作用，和/或可提供在其中包埋细胞的多孔空间。在实施方案中，多孔支架或生物材料允许将一种或多种细胞群添加或沉积在构造为多孔支架的生物材料上(如，通过细胞附着)和/或支架孔内(如，通过包埋细胞)。在实施方案中，支架或生物材料允许或促进支架内细胞:细胞和/或细胞:生物材料相互作用以形成如本文所述的构建体。

在实施方案中，生物材料由水凝胶形式的透明质酸(HA)组成，包含大小为5.1kDA至>2x10⁶kDa的HA分子。在实施方案中，生物材料由多孔泡沫形式的透明质酸组成，还包含大小为5.1kDA至>2x10⁶kDa范围内的HA分子。在实施方案中，生物材料由基于聚乳酸(PLA)的泡沫组成，具有开孔结构和约50微米至约300微米的孔径。在实施方案中，肾细胞群通过透明质酸合成酶-2(HAS-2)直接提供和/或刺激高分子量透明质酸的合成，尤其是在肾内植入后。

在实施方案中，本文所述生物材料响应于某些外部条件，如在体外或体内。在实施方案中，生物材料是温度敏感的(如，在体外或体内)。在实施方案中，生物材料响应于暴露于酶促降解(如，在体外或体内)。在实施方案中，生物材料对外部条件的响应可如本文所述进行精确调整。在实施方案中，所述制剂的温度敏感性可通过调节制剂中生物材料的百分比而变化。例如，可调节溶液中明胶的百分比以调节最终制剂(如，液体、凝胶、珠粒等)中明胶的温度敏感性。在实施方案中，明胶溶液可在PBS、DMEM或其他合适的溶剂中提供。在实施方案中，生物材料可被化学交联以提供更强的抗酶促降解能力。例如，可将碳化二亚胺交联剂用于化学交联明胶珠，从而降低对内源性酶的敏感性。

在实施方案中，生物材料对外部条件的响应涉及生物材料失去结构完整性。尽管本文提供了温度敏感性和抗酶促降解能力，但在不同生物材料中存在其他机制，通过这些机制可能发生失去材料完整性。这些机制可包括但不限于热力学(如，相变，例如熔化、扩散(如，离子交联剂从生物材料扩散到周围组织中))、化学、酶促、pH(如，pH-敏感脂质体)、超声波和光不稳定(光穿透)。在实施方案中，生物材料失去结构完整性的确切机制会有所不同，但通常在植入时或植入后触发该机制。

在实施方案中，本文所述制剂并入待施用于受试者具有为活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)创造有利环境的特性的生物材料。在实施方案中，制剂包含第一生物材料，其提供从活性剂与生物材料一起配制的时间直到施用于受试者的时间点的有利环境。在实施方案中，相比在施用于受试者之前的流体(如本文所述)，有利环境涉及具有以基本呈固态悬浮的一种或多种活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)的优势。在实施方案中，第一生物材料是温度敏感性生物材料。在实施方案中，温度敏感性生物材料可具有(i)在约8℃或以下基本呈固态，和(ii)在环境温度或以上基本呈液态。在实施方案中，环境温度是指施用组合物时的温度。在实施方案中，环境温度是温度受控的环境的温度。在实施方案中，环境温度约为室温。在实施方案中，环境温度范围为约18℃至约30℃。在实施方案中，环境温度为约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、或约30℃。在实施方案中，本文所述的一种或多种活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)可被涂覆、沉积、嵌入、附着、接种、悬浮或包埋于温度敏感性生物材料中。

在实施方案中，一种或多种活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)均匀分散在整个使细胞稳定的生物材料体积中。

在实施方案中，制剂是可注射制剂，其包含一种或多种活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)和使细胞稳定的温度敏感性生物材料，该生物材料保持(i)在8℃或以下基本呈固态，和(ii)在环境温度或以上基本呈液态，其中生物材料包含水凝胶，其中生物材料在-8℃至环境温度或以上为固态至液态过渡阶段；并且其中一种或多种活性剂悬浮并分散于整个使细胞稳定的生物材料中。在实施方案中，环境温度范围为18℃至30℃。在实施方案中，生物材料在37℃时为液态。在实施方案中，基本呈固态是凝胶态。在实施方案中，水凝胶包含明胶。在实施方案中，明胶以0.5％至1％(w/v)存在于制剂中。在实施方案中，明胶以0.75％(w/v)存在于制剂中。

在实施方案中，制剂还包含抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、免疫抑制剂、血管生成因子或伤口愈合因子。

在实施方案中，制剂还包含抗氧化剂。在实施方案中，抗氧化剂是6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸。在实施方案中，6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸以50μM至150μM存在。在实施方案中，6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸以100μM存在。

在实施方案中，制剂还包含氧载体。在实施方案中，氧载体是全氟化碳。

在实施方案中，制剂还包含免疫调节因子。

在实施方案中，制剂还包含免疫抑制剂。

在实施方案中，制剂包含0.75％(w/v)明胶和100μM 6-羟基-2,5,7,8-四甲苯并二氢吡喃-2-羧酸。

在实施方案中，制剂还包含含有生物材料的生物相容性珠粒。在实施方案中，珠粒是交联的。在实施方案中，与非交联的生物相容性珠粒相比，交联珠粒对酶促降解的敏感性降低。在实施方案中，交联珠粒是碳二亚胺交联珠粒。在实施方案中，碳化二亚胺选自1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、DCC-N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、和N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC))。在实施方案中，碳二亚胺是1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在实施方案中，与非交联珠粒相比，交联珠粒包含减少数量的游离伯胺。在实施方案中，游离伯胺的数量可用分光光度法在355nm检测。在实施方案中，珠粒用活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)接种。在实施方案中，制剂还包含额外的生物相容性珠粒，其包含温度敏感性生物材料，该生物材料保持(i)在环境温度或以下基本呈固态，和(ii)在37℃或以上基本呈液态。在实施方案中，生物材料包括在环境温度至37℃呈固液过渡状态。在实施方案中，基本呈固态是凝胶态。在实施方案中，生物材料包括水凝胶。在实施方案中，水凝胶包括明胶。在实施方案中，珠粒包含5％(w/v)至10％(w/v)的明胶。在实施方案中，其他生物相容性珠粒是间隔珠粒。在实施方案中，间隔珠粒不接种活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)。

在实施方案中，制剂包含或进一步包含肾细胞群分泌的产物。在实施方案中，产物包含旁分泌因子。在实施方案中，产物包含内分泌因子。在实施方案中，产物包含近分泌因子。在实施方案中，产物包含囊泡。在实施方案中，囊泡包含微囊泡。在实施方案中，囊泡包含外泌体。

在实施方案中，囊泡包含选自旁分泌因子、内分泌因子、近分泌因子和RNA的分泌产物。在实施方案中，RNA是miRNA。在实施方案中，囊泡包含抑制纤溶酶原激活抑制剂-1(PAI-1)和/或TGFβ1的miRNA。

在实施方案中，包含旁分泌和/或近分泌因子的分泌产物，例如α-1微球蛋白、β-2-微球蛋白、钙结合蛋白、凝聚素、结缔组织生长因子、胱抑素-C、谷胱甘肽-S-转移酶α、肾损伤分子1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、骨桥蛋白、三叶因子3、tam-horsfall尿糖蛋白、金属蛋白酶1组织抑制剂、血管内皮生长因子、纤连蛋白、白介素6、或单核细胞趋化蛋白1。

本公开还包括含有生物材料的制剂，其按数秒、数分钟、数小时或数天的量级在一段时间内降解。这与集中于植入固体材料然后在数天、数周或数月内缓慢降解的大量体内作用形成对比。在实施方案中，生物材料具有以下特征中的一种或多种：生物相容性、生物可降解/生物可吸收性、植入受试者之前和期间基本呈固态、植入后失去结构完整性(基本呈固态)以及支持细胞活力的细胞相容性环境。在实施方案中，生物材料在植入期间保持植入颗粒间隔开的能力增强了天然组织向内生长。在实施方案中，生物材料还促进固体制剂的植入。在实施方案中，生物材料提供本文所述制剂的定位，因为固体单元的插入有助于防止递送的材料在植入期间分散在组织内。在实施方案中，对于基于细胞的制剂，与悬浮在流体中的细胞相比，固体生物材料还提高了锚定依赖性细胞的稳定性和活力。在实施方案中，结构完整性的短持续时间意味着在植入后不久，生物材料不会为组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供明显的屏障。

在实施方案中，构建体包括这样的生物材料，其被配置为适合于包埋和/或附着混合物的三维(3D)多孔生物材料。在实施方案中，构建体包括这样的生物材料，其被配置为适合于嵌入、附着、悬浮或包被哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶。在实施方案中，构建体包括这样的生物材料，其被配置为包含水凝胶形式的主要为高分子量种类的透明质酸(HA)。在实施方案中，构建体包括这样的生物材料，其包含泡沫形式的主要为高分子量种类的透明质酸。在实施方案中，构建体包括这样的生物材料，其包含具有约50微米至约300微米的孔的基于聚乳酸的泡沫。在实施方案中，构建体包括一种或多种细胞群，其可源自需要改善肾功能的受试者自体的肾脏样品。在实施方案中，样品是肾活检。在实施方案中，受试者患有肾病。在实施方案中，细胞群源自非自体的肾脏样品。在实施方案中，构建体提供增强的肾功能。在实施方案中，构建体提供肾再生。在实施方案中，构建体提供红细胞稳态。

在实施方案中，制剂包含与第二生物材料组合的生物活性细胞，所述第二生物材料为组合的细胞从配制时直至施用于受试者之后的某个时间点提供有利的环境。在实施方案中，由第二生物材料提供的有利环境涉及直至施用于受试者之时和施用之后的一段时间内保持结构完整性的生物材料中施用细胞的优势。在实施方案中，植入后第二生物材料的结构完整性为数分钟、数小时、数天、或数周。在实施方案中，结构完整性不到一个月、不到一周、不到一天、或不到一小时。在实施方案中，相对短期的结构完整性提供了这样的制剂，其可利用受控的操作、放置或分散将活性剂和生物材料递送至组织或器官中的目标位置，而不会妨碍或阻碍并入元素与其放置的组织或器官的相互作用。

在实施方案中，第二生物材料是具有与第一生物材料不同敏感性的温度敏感性生物材料。第二生物材料可具有(i)在约环境温度或以下基本呈固态，和(ii)在约37℃或以上基本呈液态。在实施方案中，环境温度约为室温。

在实施方案中，第二生物材料是交联珠粒。在实施方案中，如本文所述，取决于交联程度，交联珠粒可具有精确可调的体内停留时间。在实施方案中，交联珠粒包含如本文所述的生物活性细胞且对酶促降解具有抗性。

在实施方案中，本公开的制剂可包括与活性剂(如，生物活性细胞)组合的第一生物材料，带有或不带有与活性剂(如，生物活性细胞)组合的第二生物材料。在制剂包括第二生物材料的实施方案中，其可以是温度敏感性珠粒和/或交联珠粒。

在实施方案中，本文所述的生物活性细胞制剂和/或构建体可作为生物活性细胞制剂施用。在实施方案中，制剂包括细胞和一种或多种生物材料，该生物材料为本文所述的生物活性细胞制剂和/或构建体提供稳定性。在实施方案中，生物材料是温度敏感性生物材料，其可根据温度保持至少两种不同的相或状态。在实施方案中，生物材料能够在第一温度时保持第一状态，在第二温度时保持第二状态和/或在第三温度时保持第三状态。在实施方案中，第一、第二或第三状态可基本呈固态、基本呈液态或基本呈半固态或半液态。在实施方案中，生物材料在第一温度时具有第一状态且在第二温度时具有第二状态，其中第一温度低于第二温度。

在实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约8℃或更低的温度时基本呈固态。在实施方案中，在约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃或约8℃保持基本呈固态。在实施方案中，基本呈固态具有凝胶的形式。在实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在环境温度或更高温度时基本呈液态。在实施方案中，在约25℃、约25.5℃、约26℃、约26.5℃、约27℃、约27.5℃、约28℃、约28.5℃、约29℃、约29.5℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃时保持基本呈液态。在实施方案中，环境温度约为室温。

在实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在环境温度周围或更低的温度时基本呈固态。在实施方案中，环境温度约为室温。在实施方案中，在约17℃、约16℃、约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃或约1℃时保持基本呈固态。在实施方案中，基本呈固态具有珠粒的形式。在实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约37℃或以上的温度时基本呈液态。在实施方案中，在约37℃、约38℃、约39℃或约40℃保持基本呈固态。

在实施方案中，温度敏感性生物材料可以溶液的形式、珠粒的形式或本文所述的和/或本领域普通技术人员已知的其他合适的形式提供。在实施方案中，本文所述的细胞群和制剂可被涂覆、沉积、嵌入、附着、接种、悬浮或包埋于温度敏感性生物材料中。在实施方案中，可在没有任何细胞的情况下提供温度敏感性生物材料，例如以间隔珠粒的形式。

在实施方案中，温度敏感性生物材料具有第一状态和第二状态之间的过渡状态。在实施方案中，过渡状态为在约8℃至约环境温度的温度之间的固液过渡状态。在实施方案中，环境温度约为室温。在实施方案中，在约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃和约18℃的一个或多个温度时出现固液过渡状态。

在实施方案中，温度敏感性生物材料具有在给定温度下以厘泊(cP)测量的某个粘度。在实施方案中，生物材料在25℃时具有约1cP至约5cP、约1.1cP至约4.5cP、约1.2cP至约4cP、约1.3cP至约3.5cP、约1.4cP至约3.5cP、约1.5cP至约3cP、约1.55cP至约2.5cP、或约1.6cP至约2cP的粘度。在实施方案中，生物材料在37℃时具有约1.0cP至约1.15cP的粘度。37℃时的粘度可为约1.0cP、约1.01cP、约1.02cP、约1.03cP、约1.04cP、约1.05cP、约1.06cP、约1.07cP、约1.08cP、约1.10cP、约1.11cP、约1.12cP、约1.13cP、约1.14cP、或约1.15cP。在实施方案中，生物材料是明胶溶液。在实施方案中，明胶以约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、或约1％(w/v)存在于溶液中。在实施方案中，生物材料是在PBS中的0.75％(w/v)明胶溶液。在实施方案中，0.75％(w/v)溶液在25℃时具有约1.6cP至约2cP的粘度。在实施方案中，0.75％(w/v)溶液在37℃时具有约1.07cP至约1.08cP的粘度。在实施方案中，明胶溶液可在PBS、DMEM或其他合适的溶剂中提供。

在实施方案中，生物活性细胞制剂还包括细胞活力试剂。在实施方案中，细胞活力试剂选自抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子、基质金属蛋白酶、伤口愈合因子、以及生物活性细胞分泌的产物。

在实施方案中，抗氧化剂以抑制其他分子氧化的能力为特征。抗氧化剂包括但不限于以下中的一种或多种：6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸

类胡萝卜素、类黄酮、异黄酮、泛醌、谷胱甘肽、硫辛酸、超氧化物歧化酶、抗坏血酸、维生素E、维生素A、混合类胡萝卜素(如，β胡萝卜素、α胡萝卜素、γ胡萝卜素、叶黄素、phytopene、六氢番茄红素和虾青素)、硒、辅酶Q10、吲哚-3-甲醇、原花青素、白藜芦醇、槲皮素、儿茶素、水杨酸、姜黄素、胆红素、草酸、植酸、硫辛酸、香草酸、多酚、阿魏酸、茶黄素及其衍生物。本领域普通技术人员将理解用于本公开的其他合适的抗氧化剂。

在实施方案中，氧载体是以携带和释放氧的能力为特征的试剂。它们包括但不限于全氟碳化物和含有全氟碳化物的药物。合适的基于全氟碳化物的氧载体包括但不限于全氟溴辛烷(C8F17Br)；全氟二氯代烷(C8F16C12)；全氟溴癸烷；全氟溴烷(perfluobron)；全氟萘烷；全氟三丙胺(perfluorotripopylamine)；全氟甲基环哌啶(perfluoromethylcyclopiperidine)；Fluosol.RTM.(全氟萘烷&全氟三丙胺)；

(全氟萘烷和全氟甲基环哌啶)；

(全氟溴癸烷和全氟溴烷)；Ocyte^TM(全氟(叔丁基环己烷))。本领域普通技术人员将理解用于本公开的其他合适的基于全氟碳化物的氧载体。

免疫调节因子包括但不限于骨桥蛋白、FAS配体因子、白介素、转化生长因子β、血小板衍生生长因子、凝聚素、转铁蛋白、调节激活正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)、纤溶酶原激活抑制剂-1(Pai-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、α-1微球蛋白和β-2-微球蛋白。本领域普通技术人员将理解用于本公开的其他合适的免疫调节因子。

在实施方案中，抗炎剂或免疫抑制剂也可以是制剂的一部分。本领域普通技术人员将理解用于本制剂和/或治疗的其他合适的抗氧化剂。

细胞募集因子包括但不限于单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和CXCL-1。本领域普通技术人员将理解用于本制剂和/或治疗的其他合适的细胞募集因子。

细胞附着因子包括但不限于纤连蛋白、前胶原、胶原、ICAM-1、结缔组织生长因子、层粘连蛋白、蛋白聚糖、特异性细胞粘附肽，如RGD和YSIGR。本领域普通技术人员将理解用于本制剂和/或治疗的其他合适的细胞附着因子。

血管生成因子包括但不限于血管内皮生长因子F(VEGF)和血管生成素-2(ANG-2)。本领域普通技术人员将理解用于本公开的某些实施方案的其他合适的血管生成因子。

基质金属蛋白酶包括但不限于基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、以及金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)。

伤口愈合因子包括但不限于角化细胞生长因子1(KGF-1)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、钙结合蛋白、凝聚素、胱抑素C、三叶因子3。本领域普通技术人员将理解用于本制剂和/或治疗的其他合适的伤口愈合因子。

本公开还提供了包含可植入构建体的生物活性细胞制剂，该构建体包含生物材料和用于治疗肾病的生物活性肾细胞。在实施方案中，构建体由生物相容性材料或生物材料、支架或基质组成，其由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料和通过附着和/或包埋沉积或嵌入支架表面的一种或多种本文所述细胞群组成。在实施方案中，构建体由生物材料和一种或多种本文所述细胞群组成，所述细胞群用生物材料组分涂覆、沉积在生物材料组分上、沉积于生物材料组分中、附着于生物材料组分、包埋在生物材料组分中、嵌入生物材料组分中、接种生物材料组分、或与生物材料组分组合。本文所述的任何细胞群，包括富集的细胞群(如，SRC)，可与基质组合使用以形成构建体。在实施方案中，生物活性细胞制剂由生物相容性材料或生物材料和本文所述SRC群组成。

在实施方案中，生物活性细胞制剂是新肾增强剂(NKA)，其是由在生物材料(基于明胶的水凝胶)中配制的自体同源的选定的肾细胞(SRC)组成的可注射产品。在实施方案中，自体同源SRC获自通过肾活检从患者肾皮质组织分离和扩增的肾细胞，并通过跨密度边界、屏障或界面分离扩增的肾细胞(如，单步不连续密度梯度分离)来选择。在实施方案中，自体SRC获自通过肾活检从患者肾皮质组织分离和扩增的肾细胞，并在连续或不连续单步或多步密度梯度上选择扩增的肾细胞。在实施方案中，SRC主要由众所周知具有再生潜力的肾上皮细胞组成(Humphreys et al.(2008)Intrinsic epithelial cells repair thekidney after injury.Cell Stem Cell.2(3):284-91)。在实施方案中，将SRC注射至受体肾中导致动物存活、尿液浓度和过滤功能的显著改善。在实施方案中，SRC具有有限的保质期和稳定性。在实施方案中，在基于明胶的水凝胶生物材料中配制SRC提供增强的细胞稳定性，从而延长产品保质期，提高NKA在运送过程中以及将NKA递送至肾皮质进行临床应用的稳定性。

在实施方案中，NKA通过使用临床护理标准肾活检程序从供体首次获得肾皮质组织来制造。在实施方案中，供体是待治疗的受试者。在实施方案中，肾细胞通过酶消化从肾组织分离并使用标准细胞培养技术扩增。在实施方案中，用于扩增原代肾细胞的细胞培养基不含任何分化因子。在实施方案中，收获的肾细胞进行跨密度边界或界面分离或密度梯度分离获得SRC。

在实施方案中，制剂包含被设计或适合于响应本文所述外部条件的生物材料。因此，生物活性细胞群与构建体中的生物材料的结合性质因外部条件而改变。在实施方案中，细胞群与温度敏感性生物材料的结合随温度变化。在实施方案中，构建体包含生物活性肾细胞群和在约8℃或更低时基本呈固态并且在约环境温度或以上时基本呈液态的生物材料，其中细胞群在约8℃或更低时悬浮于生物材料中。在实施方案中，细胞群在约环境温度或以上时在整个生物材料体积中基本自由移动。在实施方案中，与流体中的细胞相比，在较低温度时具有基本呈固态悬浮的细胞群为细胞(如，锚定依赖性细胞)提供了稳定性优势。在实施方案中，具有基本呈固态悬浮的细胞提供了一种或多种以下益处：i)防止细胞沉降，ii)允许细胞以悬浮状态保持锚定于生物材料；iii)使细胞在整个生物材料体积中保持更均匀的分散；iv)防止细胞聚集体的形成；以及v)在制剂的储存和运送过程中为细胞提供更好的保护。在向受试者施用之前可保留这些特征的制剂是有利的，至少因为制剂中细胞的整体健康将更好，并将施用更均匀且一致的细胞剂量。

在实施方案中，生物活性细胞制剂的制造过程被设计为从患者活检至产品植入约四周内递送产品。在实施方案中，患者与患者之间的组织变化性对以固定植入时间表递送产品提出了挑战。在实施方案中，在细胞扩增期间冷冻保存扩增的肾细胞以适应在细胞扩增中这种患者依赖性变化。在实施方案中，冷冻保存的肾细胞在需要另一种治疗的情况下(如，由于患者疾病、不可预见的过程事件等而延迟)提供持续的细胞来源并按需要制造用于再植入的多剂量。

在实施方案中，生物活性细胞组合物由配制在生物材料(基于明胶的水凝胶)中的自体同源细胞组成。在实施方案中，该组合物在明胶的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS)溶液中包含约20x10⁶个细胞/mL至约200x10⁶个细胞/mL。在实施方案中，每毫升产品的细胞数目为约20x10⁶个细胞/mL、约40x10⁶个细胞/mL、约60x10⁶个细胞/mL、约100x10⁶个细胞/mL、约120x10⁶个细胞/mL、约140x10⁶个细胞/mL、约160x10⁶个细胞/mL、约180x10⁶个细胞/mL、或约200x10⁶个细胞/mL。在实施方案中，明胶以约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、或约1％(w/v)存在于溶液中。在实施方案中，生物材料为DPBS中的0.88％(w/v)明胶溶液。在实施方案中，可注射制剂包含含有约0.88％(w/v)明胶的生物材料和含有生物活性肾细胞群(BRC)的组合物，其中BRC包含富集的管状肾细胞群且密度大于约1.04g/mL。在实施方案中，可注射制剂包含含有约0.88％(w/v)明胶的生物材料和含有生物活性肾细胞群(BRC)的组合物，其中BRC包含富集的管状肾细胞群且密度大于约1.0419g/mL或约1.045g/mL。

在实施方案中，NKA存在于无菌的一次性10mL注射器中。在实施方案中，最终体积由NKA浓度为100x10⁶ SRC/mL和目标剂量为3.0x10⁶ SRC/g肾重量计算。在实施方案中，肾重量是通过MRI估算的重量。在实施方案中，治疗剂量在注射时基于患者的肾重量(如，由医疗专业人员如外科医生)确定。在实施方案中，剂量为约2.5x10⁶ SRC/g肾重量至约3.5x10⁶SRC/g肾重量。

在实施方案中，可为制剂选择细胞总数目并且可调节制剂的体积以达到合适的治疗剂量。在实施方案中，该制剂可包含以单剂量或单剂量加额外剂量至受试者的细胞剂量。在实施方案中，可通过如本文所述的构建体来提供剂量。在实施方案中，本文所述的生物活性肾细胞群的治疗有效量可在受试者安全接受的最大细胞数目至治疗肾病(如，稳定、降低的下降速率或改善一种或多种肾功能)所需的最小细胞数目的范围。

在实施方案中，治疗有效量的本文所述的生物活性肾细胞群可悬浮于药学上可接受的载体或赋形剂中。这种载体包括但不限于基础培养基加1％血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、胶原、海藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纤维素及其组合。制剂应当适合施用方式。

在实施方案中，根据常规程序将生物活性肾细胞制剂或组合物配制成适合施用于人类的药物组合物。在实施方案中，用于静脉内施用、动脉内施用或在肾囊内施用的组合物，例如是无菌等渗水缓冲液的溶液。在实施方案中，组合物还可包括局部麻醉剂以改善注射部位的任何疼痛。在实施方案中，成分以单位剂型单独或混合在一起提供，例如作为在密闭容器如指示活性剂的量的安瓿瓶中冷藏保存的浓缩物。在实施方案中，当组合物通过输注施用时，可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。在通过注射施用组合物的实施方案中，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿瓶，以便可在施用前混合成分。

在实施方案中，药学上可接受的载体可部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，存在多种合适的药物组合物制剂(参见，例如，Alfonso R Gennaro(ed),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,formerlyRemington's Pharmaceutical Sciences 20th ed.,Lippincott,Williams&Wilkins,2003,通过引用以其整体并入本文)。在实施方案中，药物组合物通常被配制成无菌、基本上等渗并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。

在实施方案中，生物活性细胞制剂包括选自以下的细胞活力试剂：抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子、伤口愈合因子、以及生物活性细胞分泌的产物。

在实施方案中，来自本文所述的生物活性细胞的分泌产物也可作为细胞活力试剂添加到生物活性细胞制剂中。

在实施方案中，制剂包括本文所述的温度敏感性生物材料和含有生物材料的生物相容性珠粒的群体。在实施方案中，珠粒是交联的。可使用本领域普通技术人员已知的任何合适的交联剂实现交联，如，例如碳二亚胺；醛类(如，糠醛、丙烯醛、甲醛、戊二醛、甘油醛)、基于琥珀酰亚胺的交联剂{双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS3)、戊二酸二琥珀酰亚胺(DSG)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(BS2G)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST))；环氧化物(乙二醇二缩水甘油醚、1,4丁二醇二缩水甘油醚)；糖类(葡萄糖和醛糖)；磺酸和对甲苯磺酸；羰基二咪唑；京尼平(genipin)；亚胺类；酮类；叠氮磷酸二苯酯(DDPA)；对苯二甲酰氯；六水合硝酸铈(III)；微生物转谷氨酰胺酶；以及过氧化氢。本领域普通技术人员将理解用于本方法、制剂和/或治疗中的其他合适的交联剂和交联方法。

在实施方案中，珠粒是碳二亚胺-交联珠粒。在实施方案中，碳二亚胺交联珠粒可与选自1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、DCC—N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)的碳二亚胺交联。

在实施方案中，与非交联的生物相容性珠粒相比，交联珠粒对酶促降解的敏感性降低，从而提供具有可精确调节体内停留时间的珠粒。在实施方案中，交联珠粒对内源性酶(如，胶原酶)具有抗性。在实施方案中，提供交联珠粒是促进以下一项或多项的递送系统的一部分：(a)将附着的细胞递送至所需位点并为天然组织和血管供应的再生和向内生长创造空间；(b)具有在该部位持续足够长时间以允许细胞建立、发挥功能、重塑其微环境并分泌其自身细胞外基质(ECM)的能力；(c)促进移植细胞与周围组织的整合；(d)具有以基本固态的形式植入细胞的能力；(e)短期结构完整性，不会对组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供明显的屏障；(f)以基本固态的形式局部体内递送，从而防止细胞在植入过程中分散在组织内；(g)与悬浮在流体中的细胞相比，改善锚定依赖性细胞的稳定性和活力；以及(h)当细胞以i)基本呈固态(如，附着于珠粒)和ii)基本呈液态(如，悬浮于流体中)递送时的双相释放特征。

在实施方案中，本公开提供含有明胶的交联珠粒。在实施方案中，非交联明胶珠粒不适用于生物活性细胞制剂，因为它们迅速失去完整性并且细胞从注射部位消散。在实施方案中，高度交联的明胶珠粒可能在注射部位持续太长时间并且可能阻碍从头ECM分泌、细胞整合和组织再生。在实施方案中，本公开允许精确调整交联珠粒的体内停留时间。在实施方案中，为了定制生物材料的生物降解性，使用不同交联剂浓度的碳二亚胺，同时所有样品的总体反应条件保持恒定。在实施方案中，碳二亚胺交联珠粒的酶敏感性可通过将交联剂的浓度从约零改变至约1M来精确调节。在实施方案中，浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。交联剂浓度也可为约0.15M、约0.2M、约0.25M、约0.3M、约0.35M、约0.4M、约0.45M、约0.5M、约0.55M、约0.6M、约0.65M、约0.7M、约0.75M、约0.8M、约0.85M、约0.9M、约0.95M、或约1M。在另一个实施方案中，交联剂是1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在实施方案中，EDC-交联珠粒是明胶珠粒。

在实施方案中，交联珠粒可具有利于接种、附着或封装的某些特征。在实施方案中，珠粒可具有多孔表面和/或可以是基本上中空的。在实施方案中，与无孔或光滑表面相比，孔的存在提供了增加的细胞附着表面，允许更多数量的细胞附着。在实施方案中，孔结构可支持宿主组织与多孔珠粒的整合，从而支持从头组织形成。在实施方案中，珠粒具有与一般颗粒分布模式对应的威布尔(Weibull)图拟合的尺寸分布。在实施方案中，交联珠粒的平均直径小于约120μm、约115μm、约110μm、约109μm、约108μm、约107μm、约106μm、约105μm、约104μm、约103μm、约102μm、约101μm、约100μm、约99μm、约98μm、约97μm、约96μm、约95μm、约94μm、约93μm、约92μm、约91μm、或约90μm。在实施方案中，交联珠粒的特性因铸造工艺而变化。在实施方案中，将使用空气流将液体明胶溶液雾化并用薄层色谱试剂喷雾器(ACEGlassware)喷雾到液氮中的工艺用于提供具有上述特征的珠粒。本领域技术人员将理解，调节铸造工艺的参数提供定制珠粒的不同特性(如，不同尺寸分布)的机会。

在实施方案中，在使用细胞培养技术进行配制之前，在体外评估交联珠粒的细胞相容性，其中珠粒与对应于最终生物活性细胞制剂的细胞一起培养。在实施方案中，在制备生物活性肾细胞制剂之前将珠粒与原代肾细胞一起培养，并且使用活/死细胞测定来确认细胞相容性。在实施方案中，生物相容性交联珠粒与溶液中的温度敏感性生物材料在溶液中以溶液体积的约5％(w/w)至约15％(w/w)结合。在实施方案中，交联珠粒可以溶液体积的约5％(w/w)、约5.5％(w/w)、约6％(w/w)、约6.5％(w/w)、约7％(w/w)、约7.5％(w/w)、约8％(w/w)、约8.5％(w/w)、约9％(w/w)、约9.5％(w/w)、约10％(w/w)、约10.5％(w/w)、约11％(w/w)、约11.5％(w/w)、约12％(w/w)、约12.5％(w/w)/w)、约13％(w/w)、约13.5％(w/w)、约14％(w/w)、约14.5％(w/w)、或约15％(w/w)存在。

在实施方案中，本公开提供了包含生物材料的制剂，该生物材料以数分钟、数小时或数天为量级的一段时间内降解。这与集中于植入固体材料然后在数天、数周或数月内缓慢降解的大量体内作用形成对比。在实施方案中，生物材料具有以下特征中的一种或多种：生物相容性、生物降解性/生物可再吸收性、在植入受试者之前和期间基本呈固态、植入后失去结构完整性(基本呈固态)、以及支持细胞活力和增殖的细胞相容性环境。生物材料在植入过程中保持植入颗粒间隔开的能力增强了天然组织的向内生长。生物材料还有助于固体制剂的植入。生物材料提供本文所述制剂的定位，因为固体单元的插入有助于防止递送的材料在植入期间分散在组织内。对于基于细胞的制剂，与悬浮在流体中的细胞相比，固体生物材料还提高了锚定依赖性细胞的稳定性和活力。然而，结构完整性的持续时间短意味着在植入后不久，生物材料不会为组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供明显的屏障。

一方面，本公开提供了包含生物材料的制剂，其基本呈固态植入，然后在植入体内后液化/熔融或以其他方式失去结构完整性。这与集中于使用可作为液体注射然后在体内固化的材料的大量体内作用形成对比。

在实施方案中，本公开提供了具有接种生物活性细胞和递送基质的生物相容性交联珠粒的制剂。在实施方案中，递送基质具有以下特征中的一种或多种：生物相容性、生物可降解/生物可再吸收、在植入受试者之前和期间基本呈固态、植入后失去结构完整性(基本呈固态)、以及支持细胞活力的细胞相容性环境。在实施方案中，递送基质在植入期间保持植入颗粒(如，交联珠粒)间隔开的能力增强了天然组织向内生长。在实施方案中，如果不存在递送基质，则在植入过程中细胞化珠粒的压实会导致足够的组织向内生长的空间不足。在实施方案中，递送基质促进固体制剂的植入。此外，在实施方案中，结构完整性的短持续时间意味着在植入后不久，基质不会对组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供明显的屏障。在实施方案中，递送基质提供本文所述制剂的定位，因为固体单元的插入有助于防止递送的材料在植入期间分散在组织内。在实施方案中，对于基于细胞的制剂，与悬浮在流体中的细胞相比，固体递送基质提高了锚定依赖性细胞的稳定性和活力。

在实施方案中，递送基质是未接种细胞的生物相容性珠粒的群体。在实施方案中，未接种的珠粒分散遍及单个的接种细胞的珠粒及其之间。在实施方案中，未接种的珠粒在移植之前和移植之后立即充当接种细胞的珠粒之间的“间隔珠粒”。在实施方案中。间隔珠粒包含温度敏感性生物材料，其在第一温度时基本呈固态且在第二温度时基本呈液态，其中第一温度低于第二温度。在实施方案中，间隔珠粒包含在约环境温度或以下时基本呈固态且在约37℃时基本呈液态的生物材料，例如本文所述的生物材料。在实施方案中，环境温度约为室温。在实施方案中，生物材料是明胶溶液。在实施方案中，明胶溶液以约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、约10％、约10.5％、或约11％(w/v)存在。在实施方案中，明胶溶液可在PBS、细胞培养基(如，DMEM)或另一种合适的溶剂中提供。

在实施方案中，本公开提供包含生物材料的制剂，所述生物材料基本呈固态(如，间隔珠粒)植入，然后在植入体内后液化/熔融或以其他方式失去结构完整性。

在实施方案中，间隔珠粒的温度敏感性可在配制之前在体外评估。在实施方案中，间隔珠粒可被标记并与未标记的非温度敏感性珠粒混合。在实施方案中，然后将混合物于37℃温育以观测物理转变的变化。在实施方案中，观测到标记的温度敏感性珠粒在较高温度下形状随时间而损失。在实施方案中，温度敏感性明胶珠粒可用阿尔新蓝(Alcian blue)染料制作以用作物理转变的标志物。在实施方案中，将蓝色明胶珠与Cultispher S珠粒(白色)混合，装入导管，然后在IX PBS(pH7.4)中于37℃挤出并温育。在实施方案中，在不同时间点用显微镜观测蓝色明胶珠粒的形状损失。在实施方案中，蓝色明胶珠粒物理状态的变化在30分钟后可见，随着温育时间的延长变得更加明显。在实施方案中，由于材料的粘度，珠粒不会完全消散。

在实施方案中，本文所述的生物活性细胞制剂可用于制备用于注射至肾脏的基于肾细胞的制剂。然而，本领域普通技术人员将理解，该制剂将适用于许多其他类型的生物活性细胞群。例如，本公开考虑用于注射至任何实体器官或组织的生物活性细胞的制剂。

在实施方案中，本文所述的生物活性细胞制剂将包含一定数量的细胞。在实施方案中，制剂的细胞总数目为约10⁴、约10⁵、约10⁶、约10⁷、约10⁸、或约10⁹。在实施方案中，本文所述制剂的细胞剂量可基于靶器官或组织的估算质量或功能性质量计算。在实施方案中，生物活性细胞制剂包含对应于基于将成为制剂治疗受试者的宿主器官重量的细胞数目的剂量。在实施方案中，生物活性肾细胞制剂基于人肾脏约150克的平均重量。在实施方案中，每克(g)肾脏的细胞数目为约600个细胞/g至约7.0x10⁷个细胞/g。在实施方案中，每克肾脏的细胞数目为约600个细胞/g、约1000个细胞/g、约1500个细胞/g、约2000个细胞/g、约2500个细胞/g、约3000个细胞/g、约3500个细胞/g、约4000个细胞/g、约4500个细胞/g、约5000个细胞/g、约5500个细胞/g、约6000个细胞/g、约6500细胞/g、约7000个细胞/g、约7500个细胞/g、约8000个细胞/g、约8500个细胞/g、约9000个细胞/g、约9500个细胞/g、或约10,000个细胞/g。

在实施方案中，每克肾脏的细胞数目为约1.5x10⁴个细胞/g、约2.0x10⁴个细胞/g、约2.5x10⁴个细胞/g、约3.0x10⁴个细胞/g、约3.5x10⁴个细胞/g、约4.0x10⁴个细胞/g、约4.5x10⁴个细胞/g、约5.0x10⁴个细胞/g、约5.5x10⁴个细胞/g、约6.0x10⁴个细胞/g、约6.5x10⁴个细胞/g、约7.0x10⁴个细胞/g、约7.5x10⁴个细胞/g、约8.0x10⁴个细胞/g、约9.5x10⁴个细胞/g。

在实施方案中，每克肾脏的细胞数目为约1.0x10⁵个细胞/g、约1.5x10⁵个细胞/g、约2.0x10⁵个细胞/g、约2.5x10⁵个细胞/g、约3.0x10⁵个细胞/g、约3.5x10⁵个细胞/g、约4.0x10⁵个细胞/g、约4.5x10⁵个细胞/g、约5.0x10⁵个细胞/g、约5.5x10⁵个细胞/g、约6.0x10⁵个细胞/g、约6.5x10⁵个细胞/g、约7.0x10⁵个细胞/g、约7.5x10⁵个细胞/g、约8.0x10⁵个细胞/g、约8.5x10⁵个细胞/g、约9.0x10⁵个细胞/g、或约9.5x10⁵个细胞/g。

在实施方案中，每克肾脏的细胞数目为约1.0x10⁶个细胞/g、约1.5x10⁶个细胞/g、约2.0x10⁶个细胞/g、约2.5x10⁶个细胞/g、约3.0x10⁶个细胞/g、约3.5x10⁶个细胞/g、约4.0x10⁶个细胞/g、约4.5x10⁶个细胞/g、约5.0x10⁶个细胞/g、约5.5x10⁶个细胞/g、约6.0x10⁶个细胞/g、约6.5x10⁶个细胞/g、约7.0x10⁶个细胞/g、约7.5x10⁶个细胞/g、约8.0x10⁶cells/g约8.5x10⁶个细胞/g、约9.0x10⁶个细胞/g、约9.5x10⁶个细胞/g、1.0x10⁷个细胞/g、或约1.5x10⁷个细胞/g。

在实施方案中，可为制剂选择细胞总数目并且可调节制剂的体积以达到合适的剂量。

在实施方案中，制剂可包含以单剂量或单剂量加额外剂量至受试者的细胞剂量。在实施方案中，可通过如本文所述的构建体来提供剂量。在实施方案中，本文所述肾细胞群的治疗有效量可在受试者安全地接受治疗肾病的最大细胞数目至治疗肾病(如，稳定、降低的下降速率或改善一种或多种肾功能)所需的最小细胞数目的范围。

在实施方案中，治疗有效量的本文所述肾细胞群可悬浮在药学上可接受的载体或赋形剂中。这样的载体包括但不限于基础培养基加1％血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、胶原、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纤维素及其组合。制剂应当适合施用方式。

在实施方案中，本公开提供了包含肾细胞群的制剂在制造治疗受试者肾病的药物中的用途。在实施方案中，药物还包含重组多肽，如生长因子、趋化因子或细胞因子。在实施方案中，药物包含人肾脏衍生的细胞群。在实施方案中，用于制造药物的细胞可使用为本文所述方法提供的任何变体来分离、衍生或富集。

在实施方案中，本文公开的肾细胞制剂或组合物按照常规程序配制成适合施用于人类的药物组合物。在实施方案中，用于静脉内施用、动脉内施用或在肾囊内施用的组合物，例如是无菌等渗水缓冲液中的溶液。在实施方案中，组合物还可包括局部麻醉剂以改善注射部位的任何疼痛。在实施方案中，成分以单位剂型单独或混合在一起提供，例如作为在密闭容器如指示活性剂的量的安瓿瓶中的冷藏保存的浓缩物。在实施方案中，当组合物通过输注施用时，可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。在通过注射施用组合物的实施方案中，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿瓶，以便在施用前可混合成分。

在实施方案中，药学上可接受的载体部分取决于所施用的特定组合物，以及用于施用该组合物的特定方法。因此，有多种合适的药物组合物制剂(参见，例如，Alfonso RGennaro(ed),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,formerlyRemington's Pharmaceutical Sciences 20th ed.,Uppincott,Williams&Wilkins,2003,通过引用以其整体并入本文)。在实施方案中，药物组合物通常被配制成无菌的、基本等渗的且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。

在实施方案中，本公开制剂作为调节释放制剂提供。在实施方案中，调节释放的特征在于在施用时第一活性剂的最初释放，之后第二活性剂的至少一个额外的随后释放。在实施方案中，第一和第二活性剂可以相同或它们可以不同。在实施方案中，制剂通过同一制剂中的多个组分提供调节释放。在实施方案中，调节释放制剂包含活性剂作为第一组分的一部分，其允许活性剂在制剂的整个体积内自由移动，从而允许在施用后在靶部位立即释放。在实施方案中，第一组分可以是具有基本为液相和基本为固相的温度敏感性生物材料，其中第一组分在施用时基本为液相。在实施方案中，活性剂基本为液相，使得它基本上可自由地在整个制剂体积中移动，因而在施用后立即释放至靶部位。

在实施方案中，调节释放制剂具有作为第二组分的一部分的活性剂，其中活性剂附着、沉积、涂覆、嵌入、接种或包埋于第二组分中，其在施用至靶部位之前和之后持续存在。在实施方案中，第二组分包含活性剂能够与之结合的结构元件，从而防止在施用时活性剂从第二组分立即释放。在实施方案中，第二组分基本呈固态(如，生物相容性珠粒)提供，其可交联以防止或延迟体内酶促降解。在实施方案中，基本为固相的活性剂在施用之前和之后在制剂中保持其结构完整性，因此在施用后不会立即将活性剂释放至靶部位。用于调节释放制剂的合适载体已在本文中描述，但本领域普通技术人员将理解适用于本文的其他载体。

在实施方案中，制剂提供初始快速递送/释放递送元件，包括细胞、纳米颗粒、治疗分子等，之后是元素的稍后延迟释放。在实施方案中，本公开制剂可设计用于这样的双相释放特征，其中待递送的药剂以未附着形式(如，溶液中的细胞)和附着形式(如，细胞与珠粒或另一种合适的载体)提供。在实施方案中，在初始施用时，未受阻碍的药剂立即被提供至递送部位，而受阻碍的药剂的释放被延迟直到载体(如，珠粒)失去结构完整性，此时先前附着的试剂被释放。如本文所讨论的，本领域普通技术人员将理解其他合适的释放机制。

在实施方案中，可基于活性剂的性质调整释放的时间延迟。在实施方案中，生物活性细胞制剂中释放的时间延迟可以是数秒、数分钟、数小时或数天的量级。在实施方案中，数周量级的延迟可能是合适的。在实施方案中，对于其他活性剂，例如小分子或大分子，制剂中释放的时间延迟可以是数秒、数分钟、数小时、数天、数周或数月的量级。在实施方案中，制剂还可包含提供不同时间延迟释放特征的不同生物材料。在实施方案中，具有第一活性剂的第一生物材料可具有第一释放时间并且具有第二活性剂的第二生物材料可具有第二释放时间。在实施方案中，第一和第二活性剂可以相同或不同。

在实施方案中，延迟释放的时间段通常可对应于生物材料失去结构完整性的时间段。然而，本领域普通技术人员将理解延迟释放的其他机制。在实施方案中，活性剂可随时间持续释放，而与任何特定生物材料的降解时间无关，例如药物从聚合物基质中的扩散。在实施方案中，生物活性细胞可从含有生物材料和生物活性细胞的制剂迁移到天然组织。在实施方案中，生物活性细胞从生物材料(如，珠粒)迁移到天然组织。

在实施方案中，可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。在实施方案中，可通过在制剂中包括延迟吸收的试剂(如，单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射制剂的延长吸收。用于制备此类制剂的方法的许多非限制性实例已获得专利或为本领域技术人员公知。参见，例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。适用于控制或延长释放多肽试剂的方法的其他非限制性实例描述于例如美国专利号6,306,406和6,346,274，以及例如美国专利申请号US20020182254和US20020051808中，其全部都通过引用并入本文。

在实施方案中，本文提供的制剂单独施用。在实施方案中，本文提供的制剂与一种或多种其他活性组合物组合施用。在实施方案中，制剂适用于将并入的组织工程元件注射或植入实体器官内部以再生组织。在实施方案中，制剂用于将组织工程元件注射或植入中空器官的壁以再生组织。

本公开还提供了向受试者提供生物活性细胞制剂的方法。在实施方案中，生物活性细胞的来源可以是自体的、同种异体的、同源的(自体或同系的)及其任何组合。在实施方案中，在来源不是自体的情况下，该方法可包括施用免疫抑制剂(参见，例如美国专利号7,563,822)。免疫抑制药物的实例包括但不限于硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、咪唑立宾(mizoribine)、环孢素(ciclosporin)、他克莫司水合物(tacrolimus hydrate)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯苯扎利二钠(Iobenzarit disodium)、金诺芬(auranofin)、前列地尔(alprostadil)、盐酸胍立莫司(gusperimus)、biosynsorb、莫罗单抗(muromonab)、阿法西普(alefacept)、喷司他丁(pentostatin)、达克珠单抗(daclizumab)、西罗莫司(sirolimus)、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)、来氟米特(leflonomide)、巴利昔单抗(basiliximab)、阿法链道酶(dornase a)、bindarid、克拉屈滨(cladribine)、吡美莫司(pimecrolimus)、伊洛白介素(ilodecakin)、cedelizumab、依法利珠单抗(efalizumab)、依维莫司(everolimus)、阿尼莫司(anisperimus)、加维莫单抗(gavilimomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、氯法拉滨(clofarabine)、雷帕霉素(rapamycin)、西利珠单抗(siplizumab)、saireito、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114、IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、J-695、UP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4-1g、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、UP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG、以及AGI-1096(参见美国专利号7,563,822)。本领域普通技术人员将理解其他合适的免疫抑制剂药物。

在实施方案中，将至少一种活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)直接施用于预定受益的部位，例如，通过注射。在实施方案中，可通过用本文所述的生物活性细胞制剂以及从一种或多种富集的肾细胞群分泌的产物和/或包含其的混合物或构建体在体内接触天然肾脏来治疗受试者。在实施方案中，体内接触的步骤为天然肾脏提供再生作用。

基于本说明书，用于向受试者施用活性剂组合物(如，选定的肾细胞)的多种方式对于本领域技术人员将是显而易见的。这类方法包括将细胞注射至受试者的靶部位。

制剂的施用方式包括但不限于全身、肾内(如，实质)、静脉内或动脉内注射和直接注射至组织的预定活性部位。根据本文的某些实施方案使用的其他施用模式包括经由直接剖腹手术、经由直接腹腔镜检查、经腹或经皮的单次或多次注射。仍然根据实施方案使用的其他施用方式包括，例如逆行性输尿管肾盂输注。手术施用方法包括一步手术，例如但不限于部分肾切除术和结构植入术、部分肾切除术、部分肾盂切除术(pyelectomy)、网膜±腹膜血管化、多病灶活检针轨迹，锥形或锥体至圆柱体、以及肾极样置换，以及两步手术，包括例如，再植用类器官内部生物反应器。在实施方案中，含有不同活性剂的制剂通过相同途径同时递送。在实施方案中，活性剂通过本文所述的一种或多种方法同时或以时间控制的方式分别递送至特定位置，或经由特定方法递送。在实施方案中，将至少一种活性剂(如，肾细胞群、其产物或包含肾细胞群和一种或多种非肾细胞类型或群体的球状体)经皮注射至肾脏的肾皮质中。在实施方案中，将引导套管经皮插入并在将组合物注射至肾脏之前用于刺穿肾囊。

在实施方案中，可将腹腔镜或经皮技术用于进入肾脏以注射配制的BRC或SRC群。在实施方案中，使用腹腔镜手术技术允许直接可视化肾脏，从而可在注射期间发现任何出血或其他不良事件并立即解决。在实施方案中，使用经皮入路肾脏已应用了十多年，主要用于消融肾内肿块。在实施方案中，这些手术将电极或低温针插入肾脏的确定肿块中，并在消融病灶时保持接触(通常)10至20分钟。在实施方案中，为了注射治疗制剂，经皮器械既不太大也不太复杂，并且这种方法提供无手术(避免腹部穿刺伤口和胀气)和最少固定时间的安全优势。在实施方案中，进入轨迹可具有留在原位的止血生物可降解材料，以进一步减少任何大量出血的机会。

在实施方案中，将治疗制剂注射至肾皮质中。在实施方案中，重要的是将治疗制剂尽可能广泛地分布在肾皮质中。在实施方案中，通过以允许治疗制剂尽可能广泛地沉积在肾皮质中的角度进入肾皮质来实现在肾皮质中分布治疗制剂。在实施方案中，取决于个体患者特征，使用超声引导或利用轴向计算机断层扫描(CT)成像以纵向或横向入路对肾脏成像。在实施方案中，随着注射针/套管逐渐取出，注射会涉及多次沉积。在实施方案中，可将全部体积的治疗制剂沉积在单个或多个入口点。在实施方案中，可将最多两个进入点用于将全部体积的治疗制剂沉积至肾脏。在实施方案中，使用一个或多个进入点，如一个或两个入口点，将注射剂施用于一个肾脏。在实施方案中，注射在两个肾脏中进行，在每个肾脏中使用一个或多个进入点，如一个或两个入口点。在实施方案中，本文提供的组合物在给定时间段内多次施用于受试者，例如两次或更多次，其中每次施用是在前次施用后至少约1、2、3、4、5、6或12个月。在实施方案中，将SRC作为单一疗法施用于一个肾脏。在实施方案中，将BRC(如，SRC)作为单一疗法注射施用于两个肾脏。在实施方案中，BRC(如，SRC)以重复或多次注射施用于一个或两个肾脏。在实施方案中，第一次和第二次注射相隔至少3个月、相隔至少6个月或相隔至少1年施用。在实施方案中，BRC(如，SRC)超过2次注射施用。在实施方案中，组合物在特定时间段内以单次注射或多次注射施用。在实施方案中，组合物在一个肾脏中以最少一次注射施用。在实施方案中，组合物以两次或更多次注射施用。在实施方案中，第一次和第二次注射可在至多相隔3个月的任何时间、至多相隔6个月的任何时间或以一年间隔施用。在实施方案中，第二次注射在第一次注射后至多3年的任何时间施用。在实施方案中，组合物也可在一个或两个肾脏中以一次、两次或更多次注射施用。在实施方案中，将组合物施用于在接受NKA注射之前同时接受CKD标准护理治疗的受试者。在实施方案中，两次或更多次注射不会导致不良免疫作用。在实施方案中，将组合物注射至患者的一个肾脏。在实施方案中，将组合物注射至患者的两个肾脏。在实施方案中，单个或多个进入点可用于将组合物注射至患者的肾脏。在实施方案中，注射是进入肾实质。在实施方案中，患者在任何给定注射部位接受治疗剂量。在实施方案中，患者在任何给定注射部位接受1-9x10⁶SRC/g肾的剂量。

在实施方案中，使天然肾脏在体内与分泌产物接触的步骤可通过使用/施用含有来自细胞培养基(如，条件培养基)的分泌产物的群体的制剂和/或通过植入富集的细胞群和/或能够在体内分泌产物的构建体。在实施方案中，体内接触的步骤为天然肾脏提供再生作用。

基于本说明书，用于向受试者施用细胞和/或分泌产物的多种方法对于本领域技术人员将是显而易见的。在实施方案中，这类方法包括将细胞注射至受试者的靶部位。

在实施方案中，可将细胞和/或分泌的产物插入递送装置或媒介物中，这有助于通过注射或植入引入受试者。在实施方案中，递送媒介物可包括天然材料。在实施方案中，递送媒介物可包括合成材料。在实施方案中，递送媒介物提供模仿或适当地适合器官结构的结构。在实施方案中，递送媒介物本质上是流体样的。在实施方案中，这类递送装置可包括管，如导管，用于将细胞和流体注射至受体受试者体内。在实施方案中，管另外具有针头，如注射器，通过该针头可将细胞在期望位置引入受试者。在实施方案中，哺乳动物肾脏衍生细胞群被配制用于经由导管施用至血管中(其中术语“导管”旨在包括用于将物质递送至血管的各种管状系统中的任一种)。在实施方案中，细胞可插入或插至生物材料或支架，包括但不限于纺织品，如编织物、针织品、穗带、网状物和无纺布、穿孔膜、海绵和泡沫、以及珠粒，如固体或多孔珠、微粒、纳米颗粒等(如，Cultispher-S明胶珠粒,Sigma)。在实施方案中，可制备细胞进行多种不同形式的递送。在实施方案中，细胞可悬浮在溶液或凝胶中。在实施方案中，细胞可与药学上可接受的载体或稀释剂混合，其中细胞保持存活。在实施方案中，药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这种载体和稀释剂的使用是本领域公知的。在一些实施方案中，溶液是无菌流体，并且通常是等渗的。在实施方案中，溶液在制备和储存条件下是稳定的，并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等而防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。本领域技术人员将理解，用于递送细胞群和/或其混合物的递送媒介物可包括上述特征的组合。

一方面，本文提供了治疗受试者肾病的方法，该方法包括将本文公开的制剂、组合物或细胞群注射至受试者。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过18至30号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于20号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于21号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于22号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于23号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于24号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于25号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于26号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于27号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于28号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过小于29号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约20号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约21号的针头注射。

在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约22号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约23号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约24号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约25号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约26号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约27号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约28号的针头注射。在实施方案中，细胞群的制剂、组合物通过约29号的针头注射。

在实施方案中，针的内径小于0.84mm。在实施方案中，针的内径小于0.61mm。在实施方案中，针的内径小于0.51mm。在实施方案中，针的内径小于0.41mm。在实施方案中，针的内径小于0.33mm。在实施方案中，针的内径小于0.25mm。在实施方案中，针的内径小于0.20mm。在实施方案中，针的内径小于0.15mm。在实施方案中，针的外径小于1.27mm。在实施方案中，针的外径小于0.91mm。在实施方案中，针的外径小于0.81mm。在实施方案中，针的外径小于0.71mm。在实施方案中，针的外径小于0.64mm。在实施方案中，针的外径小于0.51mm。在实施方案中，针的外径小于0.41mm。在实施方案中，针的外径小于0.30mm。在某些实施方案中，针具有下表中的尺寸之一：

含有细胞的治疗产品的非限制性实例是新肾增强剂(NKA)。NKA包含作为生物活性成分的SRC(即同源、自体的选定的肾细胞)。不受任何科学理论的限制，该细胞群天然参与肾脏的修复和再生(Bruce et al.Regen Med.2015；10:815-39；Bruce etal.Experimental Biology Meeting,Washington,DC,2011；Genheimer et al.CellsTissues Organs.2012；196:374-84；Ilagan et al.TERMIS Conference,Orlando,FL,2010；Ilagan et al.TERMIS Conference,Orlando,FL,2010；Ilagan et al.KIDSTEMConference,Liverpool,UK,2009；Kelley et al.Cell Transplant.2013；22:1023-39；Kelley et al.ADA Conference,San Diego,CA,2011；Kelley et al.ISCT Conference,Philadelphia,PA,2010；Kelley et al.KIDSTEM Conference,Liverpool,UK,2008；Kelleyet al.TERMIS Conference,Orlando,FL,2010；Presnell et al.Tissue EngineeringPart C Methods.2010；17:261-73；Presnell et al.Experimental Biology Meeting,NewOrleans,LA,2009；Wallace et al.ISCT Conference,Philadelphia,PA,2010；Yamaleyevaet al.TERMIS Conference,Orlando,FL,2010)。在实施方案中，利用NKA的治疗性干预改善患有CKD和CAKUT的受试者的肾功能并延迟肾透析或移植的需要，这基于当前的护理标准对于ESRD是不可避免的。

NKA由获自每名个体受试者的肾活检的扩增的自体的选定的肾细胞(SRC)制备。在实施方案中，为了制造NKA，处理来自受试者的肾活检组织以扩增肾细胞并选择SRC。

在实施方案中，NKA存在于无菌的一次性注射器中。在实施方案中，SRC在基于明胶的水凝胶中以100×10⁶个细胞/mL的浓度配制，在10mL注射器中包装，并运送到临床站点供使用。在实施方案中，最终体积由NKA浓度为100x10⁶ SRC/mL和目标剂量为3.0x10⁶ SRC/g肾重量(通过如MRI估算)计算。在实施方案中，如文献中所述，通过不同方法获得的以毫升为单位的肾脏体积测量值是通过测量去除肾周脂肪的离体器官获得的以克为单位的干重测量值的约92-97％。在实施方案中，使用1g等于1mL的换算来计算NKA的剂量。在实施方案中，剂量在注射时基于患者的肾重量确定。在实施方案中，任何患者的最大体积为8.0mL；也就是说，如果任何受试者的左肾计算重量≥259g，则该受试者将接受8mL NKA。

扩增的肾细胞可在细胞扩增过程中冷冻保存，以适应细胞扩增中因患者而异的变化。冷冻保存的肾细胞提供持续的细胞来源，以制备多剂量的生物活性细胞制剂，用于再注射和需要另一种疗法的情况(如，由于患者疾病、不可预见的过程事件等而延迟)。

下面提供示例以促进对本发明更完整的理解。以下实施例说明了制备和实践本发明的示例性方式。然而，本发明的范围不限于这些实施例中公开的具体实施方案，这些实施例仅用于说明的目的，因为可利用替代方法来获得类似的结果。

实施例

实施例1-在患有来自先天性肾和尿路的异常(CAKUT)的慢性肾病患者中肾自体细胞疗法(REACT)的I期开放标签安全性、耐受性和早期疗效研究(REGEN-044)

方案概要

治疗产品

REACT由获自每名个体受试者的肾活检的扩增的自体的选定的肾细胞(SRC)制备。为了制造REACT，将每名登记受试者的肾活检组织送至Twin City Bio LLC，在那里扩增肾细胞并选择SRC。SRC在基于明胶的水凝胶中以100x10⁶个细胞/mL的浓度配制，在10mL注射器中包装，并运送到临床站点供使用。

研究目标

主要目标：本研究的主要目标是评估在一个受体肾脏中注射REACT的安全性。

主要终点：

-两次REACT注射后6个月内eGFR的变化

-注射后6个月内肾脏特定程序和/或产品相关不良事件(AE)的发生率

次要目标：本研究的次要目标是通过评估注射后24个月时段的肾脏特定不良事件来评估REACT施用的安全性和耐受性。

次要终点：

-注射后24个月的肾脏特定实验室评估

探索性目标：本研究的探索性目标设计为评估注射后24个月时段REACT对肾功能的影响。

探索性终点：

-肾脏结构和功能(包括eGFR、血清肌酐和蛋白尿)的临床诊断和实验室评估，以评估肾病进展速率的变化

-维生素D水平

-碘海醇成像

-血压控制

-肾脏体积的MRI评估

研究设计

多中心、前瞻性、开放标签、单组研究。所有受试者在活检后间隔3个月(+12周)用两次REACT注射治疗。

随机化

开放标签，非随机。

对照组

每名受试者作为他或她自己的对照；患者既往病史，其中必须包括最低6个月时段的肾功能观察，作为肾功能不全进展速率的对照。

样本量

至多15名患者用REACT治疗。由于这是I期安全性研究，因此未进行稳健的统计分析。因此，本研究建议的样本量是I期研究的典型量，从而允许在有限人群中鉴定安全性结果。

研究人群

年龄18至65岁龄的男性或女性患者，患有确定eGFR为14至50mL/min/1.73m²的由CAKUT引起的CKD。患者应当具有足够的历史临床数据(不少于三次eGFR测量值)来确定其个体的CKD进展速率。

入选标准：除非另有说明，受试者必须满足每个入选标准才能参与研究。除非另有说明，否则将在筛选访视时、肾活检之前和每次REACT注射之前评估入选标准。

1.患者为男性或女性，知情同意之日时为18至65岁龄。

2.除了CAKUT的记录史外，患者还有肾脏和/或尿路的异常的记录史。

3.患者已确诊为III/IV期CKD，不需要肾透析，REACT注射前的筛选访视时具有14至50mL/min/1.73m²的eGFR，包括端值。

4.受试者在筛选访视时、肾活检前和REACT注射前的血压低于140/90。注意BP不应明显低于115/70。

5.在筛选访视之前和前24个月内应至少间隔3个月获得至少3次eGFR或sCr测量，以确定CKD的进展速率。

6.在肾活检和REACT注射开始之前7天至之后7天期间，患者愿意并能够避免服用NSAID(包括阿司匹林)以及氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)或其他血小板抑制剂。

7.在肾活检和REACT注射开始之前7天至之后7天期间，患者愿意并能够避免食用鱼油和血小板聚集抑制剂，如双嘧达莫(dipryridamole)(即,潘生丁

)。

8.患者愿意并能够配合方案的各个方面。

9.患者愿意并能够提供签署的知情同意书。

排除标准：满足下列任何排除标准的受试者不符合参加研究的条件。除非另有说明，否则在筛选访视时、肾活检之前和每次REACT注射之前评估排除标准。

1.患者有肾移植史。

2.患者诊断为肾积水，SFU 4级或5级。

3.患者有未矫正的VUR 5级。

4.患者的皮质厚度用MRI测量小于5mm。

5.患者有已知的过敏或禁忌症，或对卡那霉素(kanamycin)或结构相似的氨基糖苷类抗生素有过严重全身反应。

6.患者对人血制品或动物源性材料(如，牛、猪)有过敏性或严重全身反应史或禁忌症。

7.患者有严重全身反应史或任何局部麻醉剂或镇静剂禁忌症。

8.患者在REACT注射6周内出现需要胃肠外抗生素治疗的临床上明显的感染。

9.患者在REACT注射之前的最后3个月内有急性肾损伤或经历肾功能迅速下降。

10.患者在REACT注射之前有以下任何情况：肾肿瘤、多囊肾病、会干扰REACT注射程序的解剖学异常、或尿路感染证据。

注意：如果肾脏仍然可进入并符合接受REACT注射的标准，则解剖学异常不是排除性的。

11.患者有III级或IV级心力衰竭(NYHA功能分类)

12.患者有FEV1/FVC≥70％。

13.患者在过去3年内有癌症史(不包括非黑素瘤皮肤癌和宫颈原位癌)。

14.如筛选访视时评估，患者患有临床意义的肝病(ALT或AST大于正常上限的3倍)。

15.如筛选访视时评估，患者乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)和/或人类免疫缺陷病毒(HIV)的活动性感染呈阳性。

16.患者在过去3年内有需要治疗的活动性结核(TB)史。

17.患者免疫功能低下或正在接受免疫抑制剂治疗，包括在REACT注射3个月内接受慢性肾小球肾炎治疗的个体。

注意：允许吸入性皮质类固醇和慢性低剂量皮质类固醇(每天少于或等于7.5mg)以及用于间歇性症状(如，哮喘)的短期应用皮质类固醇。

18.患者的预期寿命少于2年。

19.女性患者在研究过程中怀孕、哺乳(母乳喂养)或计划怀孕。或者，女性患者具有生育潜能且未使用高效的节育方法，包括禁欲。或者，女性患者不愿意在整个研究期间继续使用高效的节育方法。

20.患者有酗酒和/或药物滥用史，根据研究人员的判断，这会损害患者遵守方案的能力。

21.根据研究人员的判断，患者的健康状况会因参与研究而受到危害。

22.患者在REACT注射前3个月内使用过研究产品，而未获得医疗监测员的书面同意。

研究持续时间

REACT产品一可用就开始治疗，假设在接受第一次REACT注射之前间隔一个月，并假设在接受第二次注射之前间隔3个月，再加上最后一次注射后24个月的随访期，治疗持续时间为：

-28个月进行2次REACT注射系列

研究登记

至多15名受试者参与本研究。完成符合所有I/E标准的筛选程序的患者在活检之前直接登记进行研究。将在进行活检之前不符合所有标准的患者视为筛查失败。接受活检但因任何原因未注射的患者停止研究并可能被替换。一旦患者接受注射，患者即完成治疗，并尽一切努力确保患者完成所有随访。

研究计划

筛选：满足合格标准并提供书面知情同意书的受试者可进入研究。受试者应具有足够的历史临床数据，以便在与医疗监测员协商后提供CKD进展速率的合理估算。筛查程序包括全面体检、心电图和实验室评估(血液学、临床化学和尿液分析)。进行超声波以确认待活检和注射的肾脏的解剖特征。完成MRI或超声以确定肾脏大小和体积来确定剂量体积。

肾活检：在进行肾活检之前3天或更短的时间内，登记的受试者向诊所报告并接受中期体检以及ECG和肾MRI(如果在筛选访视期间或之后未完成)。还进行了实验室检查，包括肾功能、血红蛋白和女性妊娠试验。将符合所有入选和排除标准的合格受试者送入医院/临床研究中心进行肾活检。必须使用16号活检针采集至少2个1.5cm的组织核心，以便为制造REACT提供足够的材料。活检未出现并发症的受试者可根据站点常规做法当天出院。将每名个体受试者的肾活检组织送至Twin City Bio LLC。

REACT注射：在预定注射日期之前10至14天，受试者进行中期体检，以持续验证入选和排除标准。受试者还接受肾脏闪烁扫描(即，分肾功能扫描)以找出每个肾脏对总基线肾功能的贡献百分比。在预定REACT注射当天，符合条件的受试者进入医院/临床研究单位。在温热使水凝胶液化后，将REACT注射至先前使用经皮入路进行活检的同一个肾脏中。该程序将遵循标准化技术，例如用于通过射频或低温方法消融肾脏肿块。没有并发症的受试者可按照站点常规做法在当天出院。注射后第二天进行超声检查以检测可能的亚临床AE。受试者接受2次REACT注射，间隔3个月(+12周)。第一次和第二次注射发生在进行活检的同一个肾脏中。因此，本研究期间仅使用一个肾脏。

随访：受试者在第一次和第二次REACT注射后的第1、7、14、28(±3天)和第2个月(±7天)完成随访评估。根据第二次注射施用的时间(即，3个月[+12周])，受试者可能在第一次REACT注射后3个月和6个月接受评估。在最后一次REACT注射后，受试者在治疗后6、9、12、15、18、21和24个月内完成对安全性和有效性的长期随访评估。

安全监测：REACT注射后出血是参与本研究的受试者已知且可预见的风险。因此，站点的当地实验室在以下时间点测量血红蛋白：按照每个站点常规做法的程序a)之前，b)之后。

研究产品、剂量和施用方式

研究产品：REACT由获自每名个体受试者的肾活检的扩增的自体的选定的肾细胞制备。为了制造REACT，将来自每名登记受试者的活检组织送至Twin City Bio LLC，在该公司的设施中扩增肾细胞并选择SRC。SRC在基于明胶的水凝胶中以100x10⁶个细胞/mL的浓度配制，在10mL注射器中包装，然后运送至临床站点。

剂量：待施用的REACT体积由术前MRI体积3D评估或椭球公式(长度x宽度AP平面x宽度横切平面x0.62)确定。根据临床前数据，REACT的剂量为3x10⁶个细胞/g估算肾重量(gKW^est)。由于每毫升REACT的SRC浓度为100x10⁶个细胞/mL，每100克肾重量的施用体积为3.0mL。使用这种剂量范例，下表显示相对于估算肾重量待递送的SRC的剂量体积和数目。注射至经活检的肾脏的最大REACT体积为8.0mL。

受试者接受两次计划的REACT注射，以允许剂量探索并评估效果的持续时间。第一次和第二次注射发生在进行活检的同一个肾脏中。在某些情况下，受试者或研究人员可能会决定推迟或停止第二次REACT注射。例如，如果出现任何不利的安全风险，或肾功能迅速恶化，或发生不受控制的糖尿病或不受控制的高血压，或发生恶性肿瘤或并发感染，则不应施用第二次REACT注射。

施用方式：使用经皮入路将REACT注射至活检的肾脏中。经皮方法采用标准化技术(如，通过射频或低温方法消融肾脏肿块的技术)。

统计分析方法

统计分析本质上主要是描述性的，并且未计划对研究进行统计假设检验。除非另有说明，连续变量通过给出无缺失观测数目(n)、平均值、标准差、中值、最小值和最大值来总结。类别变量通过给出每个类别的频率计数和百分比来总结。

缩写：AE(不良事件)；ConMeds(伴随药物)；DMSB(数据安全和监测委员会)；ECG(心电图)；EOS(研究结束访视)；I/E(包含/排除)；KDQOL(肾病生活质量调查)；MRI(磁共振成像)；REACT(-肾脏增强)；PE(体检)。

注意：

**尽一切努力确保在第一次注射后3个月施用第二次REACT注射。

a.如果筛查评估在肾活检前60天的窗口期之外，则按照筛查(第6.1节)中的描述进行重新筛查。

b.由于第二次REACT注射发生在第一次注射后3个月(+12周)，可能不会安排3个月访视或6个月访视。

c.在未施用第二次REACT注射的情况下，受试者在最后一次REACT注射后12个月EOS访视时进行所有随访评估。

d.EOS访视发生在最后一次REACT注射后12个月，或研究者将受试者终止研究时(第8.4节)、或受试者自愿停止研究时(第5.4节)。

e.在进行任何特定研究程序(包括筛选访视中的那些)之前，必须签署知情同意书并注明日期。

f.PE和中间PE在第7.2.2节中描述。

g.生命体征包括心率、静息血压、呼吸频率和体温。(第7.2.1节)。

h.在整个程序中测量生命体征。

i.参阅表2，实验室评估的时间表。

j.在筛选访视时进行超声检查以确认受试者合格，确认待活检和注射的肾脏的解剖学特征，并获得基线回声读数。随后超声波监测回声。

k.在第0天和第1天住院病人肾活检后和在第0天和第1天住院病人REACT注射后进行超声检查，目的是监测可能的亚临床AE。

l.在肾活检前的第-1天筛选访视时进行无造影剂的MRI研究，以确定肾脏大小和体积。在第二次注射之前重复此MRI以确保合适的剂量计算。如果患者无法接受MRI或如果部位感觉超声足以进行测量，进行超声以确定肾脏大小来计算剂量。

m.在第一次REACT注射之前、最后一次REACT注射之前、最后一次REACT注射后的6个月访视和EOS访视时进行肾闪烁扫描。

n.根据研究参考手册中描述的程序操作和注射REACT制剂。

o.CT扫描可与超声结合用于REACT注射程序。

p.未出现并发症的受试者可按照站点常规做法当天出院。

缩写：APTT(活化部分凝血活酶时间)；FSH(促卵泡激素；HbA1c(糖化血红蛋白)；HIV(人类免疫缺陷病毒)；HBV(乙型肝炎病毒)；HCV(丙型肝炎病毒)；NGAL(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)；REACT(肾脏增强)；i PTH(甲状旁腺激素，完整)；PT-INR(凝血酶原时间-国际标准化比率)

注意：

*活检后第1天随访是可选的实验室工具包，按站点常规做法仅当患者入院并在医院过夜时使用。

**尽一切努力确保在第一次注射后3个月进行第二次REACT注射。

a.如果筛查评估在肾活检前60天的窗口期之外，则按照筛查(第6.1节)中的描述进行重新筛查。

b.由于第二次REACT注射发生在第一次注射后3个月(+12周)，可能不会安排3个月访视或6个月访视。

c.在未施用第二次REACT注射的情况下，受试者在最后一次REACT注射后12个月EOS访视时进行所有随访评估。

d.EOS访视发生在最后一次REACT注射后12个月，或研究人员将受试者终止研究时(第8.4节)、或受试者自愿停止研究时(第5.4节)。

e.诊所进行尿浸试纸妊娠试验。如果呈阳性，则由中心实验室进行确认测试。

f.经验证性FSH测试的绝经后妇女不必在整个研究过程中进行妊娠测试。

g.在第0天肾活检和REACT注射的前24小时内，血红蛋白水平按站点常规做法确认为>9g/dL。

h.在肾活检和REACT治疗的第0天，按当地站点常规做法在手术前后测量血红蛋白和血细胞比容。这些样本由站点的当地实验室处理，以加快结果通知和影响临床护理的后续决策。此外，将手术后血红蛋白和血细胞比容的血液样本送至中心实验室，在那里结果可输入研究数据库。

i.在REACT注射前，使用浸量尺(dip stick)进行显微镜尿液分析以确认无感染。

j.评估血清和尿液样品中的β2-微球蛋白。

k.采集、冷冻和储存研究样品(血清/血浆和尿液)进行新的生物标志物的评估。

表3:缩写和专业术语

1.CAKUT和慢性肾病

CAKUT的常见组成部分是膀胱输尿管反流，其定义为尿液从膀胱回流到一个或两个输尿管、肾盂或两者。原发性膀胱输尿管反流(VUR)是儿童期最常见的先天性尿路的异常，大部分在尿路感染(UTI)发作后诊断出来。VUR被认为易患尿路感染(UTI)和肾瘢痕形成形成。与VUR相关的肾瘢痕形成形成又被称为反流性肾病(RN)。RN的长期潜在并发症包括高血压、蛋白尿和进展为终末期肾病(ESRD)[5]。肾脏发育异常的患者最容易发生ESRD，因为即使在VUR得到纠正后，肾脏仍会继续恶化(Brakeman)。Ardissino等发现发育不良患者中近26％的终末期肾病与膀胱输尿管反流有关。RN在儿童或成人中的确切发病率尚不清楚。RN占所有慢性肾功能衰竭儿童中的12％至21％[1,2]。根据2008年北美小儿肾脏试验和合作研究报告，RN是8.4％的儿童慢性肾病的第四大常见病因，是5.2％的移植患者和3.5％的透析患者的主要病理[3]。在CKID研究中，涉及586名1至16岁的儿童群组，具有估算GFR为30至90mL/min/1.73m²。RN是87名(14.8％)患者CKD的根本原因。在成人中，阻塞性尿路病占2005年ESRD点流行病例的0.3％，其中一小部分可能是由于RN。很少群组研究对抗反流手术后的患者进行长期随访。在来自以色列的一个群组中，100名患者中只有1名在20年后发展为CKD。在通过IVP确定为肾瘢痕形成形成的另一患者群组中，18％的患者在20年后发展为CKD。无论如何，由RN引起的成人ESRD的发病率很低。

慢性肾病(CKD)的特征是进行性肾病，如果不进行治疗干预会恶化，直到患者达到ESRD。CKD被定义为肾功能减退，通过肾小球滤过率(GFR)降低或肾损伤迹象表明，如尿白蛋白排泄增加。CKD的全球患病率估计为8-16％。为了生存，ESRD患者需要肾脏替代疗法(透析或肾移植)。通过早期干预预防或延迟CKD的不良后果是CKD管理的主要策略。然而，早期治疗并不理想，导致对改善干预策略以管理CKD和延迟进展为ESRD的医疗需求明显未得到满足。

CKD患者的治疗集中于减缓进展并为肾功能衰竭/替代作准备。对于许多患者而言，CKD作为复杂共患病群体的一部分出现。当患者达到ESRD时，需要肾脏替代疗法(即，透析或移植)。绝大多数第5阶段患者接受血液透析[4]。透析可替代约5-15％的肾功能，取决于使用强度和频率；当肾脏衰竭时，透析还有助于恢复体液和电解质平衡。然而，开始血液透析的ESRD患者的预期寿命仅为4至5年[5]。此外，血液透析与多种严重并发症以及对生活质量的干扰有关，如每周需要进行多达3次的透析。尽管肾移植目前仍然是最有效的治疗方式；但是器官长期短缺。如果患者能够获得用于移植的肾脏，则需要长期免疫抑制治疗来预防排斥反应。使用这些方案会导致更高的感染发生率，从长远来看，还会导致某些类型的癌症[6]。总之，对于CKD的改进疗法存在迫切的医学需求，这种疗法可以明显减缓疾病的进展并明显延迟或减少对肾移植的需求。表4根据GFR测量定义了CKD阶段。肾病的初始阶段(第1阶段)持续数年，其特征是微量白蛋白尿(30-300mg/24小时)，然后是大量白蛋白尿(>300mg/24小时)。随着肾脏过滤血液废物的能力下降，血清肌酐升高。随着肾脏损伤的加重(第2-4阶段)，血压升高进一步加剧肾病。当肾脏完全停止运作时(第5阶段[ESRD])，需要肾脏替代疗法(透析或移植)。

表4：CKD的分类和患病率估算总结

阶段*	说明	GFR(mL/min/1.73m<sup>2</sup>)
			1	具有正常或增加GFR的肾损伤	>90
2	GFR轻度下降的肾损伤	60-89
			3	GFR中度下降	30-59
4	GFR重度下降	15-29
			5	肾衰竭	<15(或透析)

*来源：National Kidney Foundation,2002.National KidneyFoundation.2002.KDOQI clinical practice guidelines for chronic kidneydisease:evaluation,classification,and stratification.Am J Kidney Dis.39:S1-266.

1.1非临床药理学研究

在一系列临床前研究中，Tengion(以前的regenerative medicine公司)定义了SRC的药理学特征，并通过增强肾脏结构和功能来延缓CKD实验模型的进展[7-12]。Tengion随后进行了安全性药理学和GLP毒理学研究。表5示出这些非临床研究的总结。

表5：非临床药理学和毒理学研究总结

注意：

a.基于动物模型估算肾重量。实际重量在研究报告的合适地方列出。

b.剂量是指SRC或REACT。

c.施用两个剂量REACT，一个在0个月时，另一个在3个月时。

d.使用固定在刺穿囊的尖锐针头上的注射器将REACT递送至啮齿动物并沉积REACT。

e.使用插管刺穿囊外加钝端递送插管将REACT递送至犬以沉积REACT。

1.1.1.药效学

在多种CKD动物模型中建立SRC作为REACT生物活性成分的原理验证。例如，CKD的5/6肾切除术(Nx)啮齿动物质量减少模型允许优化选择治疗相关的SRC细胞群。CKD的70％Nx犬模型证实在大型哺乳动物中的SRC活性，而ZSF-1大鼠用作表明SRC在与T2DM相关的模型中作用的原理验证[13]。在CKD的多个实验模型中，SRC直接递送至肾皮质，通过直接移植或组织代替诱导再生反应，并通过假定的旁分泌机制诱导分泌因子[9,14-17]。

这种干预策略显著提高CKD的5/6Nx模型和ZSF-1啮齿动物模型的存活率、稳定疾病进展并延长寿命。多个肾单位结构的形态正常化伴随着功能的改善，包括肾小球滤过、肾小管蛋白处理、电解质平衡和浓缩尿液的能力。在ZSF-1大鼠模型中也观测到血压降低和循环肾素水平降低。SRC治疗后观测到的功能改善伴随着肾小球硬化、肾小管变性和间质炎症和纤维化的显著减少。在靶器官或其他组织中未记录一生中有毒理学意义、临床病理学或组织学变化。基于在不同CKD动物模型中进行的多项临床前研究的结果，在不可逆肾病之前注射至患病器官时，SRC(即，REACT的活性成分)可有效延缓CKD的进展。这些结果为在ESRD前研究患者中这种基于细胞的干预的影响提供了依据。

1.1.2.安全性药理学

1.1.2.1.肾外活性

在各种大鼠和犬模型中施用REACT(即，在基于明胶的水凝胶中配制的SRC)，以评估直接的心血管和呼吸系统药理学效应。在啮齿动物5/6Nx模型中评估以不同百分比的明胶(0.75-1.0％)配制的较低和较高SRC浓度的急性效应。在正常犬模型中，在REACT递送之前、期间和之后不久评估血压的潜在变化。未研究REACT对中枢神经系统的影响，因为：1)动物在REACT注射之前、期间和之后显示正常的行为；2)预计含有完整肾细胞的研究产品不会对中枢神经系统产生影响；以及3)REACT被递送至肾脏。

1.1.2.2.血液动力学效应

5/6Nx研究(研究#4)的大鼠接受REACT或媒介物对照，并在4天内监测潜在的血液动力学效应。在该REACT制剂研究中治疗的77只动物中，16只动物在REACT递送期间或之后立即出现呼吸暂停。共有9只动物死亡；死亡原因分为呼吸暂停(n＝3)、肾出血(n＝2)和与CKD相关的死亡(n＝4)。经历呼吸暂停的16只动物中有6只未用阿托品预先治疗；在经历呼吸暂停的这些动物中，有2只在使用阿托品之前受麻醉影响而死亡。经历呼吸暂停的16只动物中有10只用阿托品治疗，并且全部从外科手术和REACT注射中恢复。

另一方面，在ZSF-1大鼠研究、犬药理学研究或评估施用量对血压的短期影响的两项(完整)犬初步研究中，未观测到5/6Nx大鼠研究中发生的呼吸暂停、肾出血和死亡。总之，不受任何理论的束缚，这种模型特定的血流动力学反应可能归因于：1)质量严重减少的啮齿动物残余肾的血流动力学改变[18]；2)肾间质压力施用的瞬时变化触发中枢自主神经反应[19,20]；以及3)组织灌注或递送至肾脏后出血引起的急性缺氧。用阿托品(atropine，副交感神经系统的竞争性拮抗剂)预先治疗有助于减轻模型特定的血流动力学变化。阿托品的作用表明对REACT递送可能的自主反应，这是对严重质量减少的CKD的5/6Nx啮齿动物模型特异的。

1.1.2.3.剂量体积

使用一系列REACT剂量、体积和浓度(研究#5)，选择正常犬来评估REACT递送至肾脏之前、期间和之后的血压。在本研究中，每个肾脏的每个极接受2.5mL REACT；因此，以12.5x10⁶个细胞/克肾脏质量的剂量递送总共10mL/120g或0.083mL/g。REACT治疗的耐受性良好；没有不良的全身反应(身体或血清学)，也没有表明REACT递送导致肾损伤或其他组织损伤的任何有意义的毒理学或组织形态学变化。与CKD的严重质量减少啮齿动物模型相比，未记录呼吸暂停、肾出血或死亡。

1.1.3.动力学、迁移和持久性

与其他靶向柔软器官的基于细胞的疗法一样，研究产品的生物分布数据有限。为此，另外三项研究提供了关于REACT在递送后选定采样时间在肾脏内的潜在迁移和持久性的证据[16,17,21]。本节总结了这些研究的结果；研究人员手册中提供了详细信息。

1.1.3.1.ZSF-1大鼠

SRC用罗丹明B超顺磁性氧化铁(SPIO)颗粒标记。这种造影剂专为细胞标记而配制，易于被非吞噬细胞内化。将SPIO标记的细胞施用于ZSF-1大鼠肾脏。递送后24小时，通过MRI和整个器官光学成像检测SPIO标记的细胞。此外，ZSF-1大鼠接受了用CelSense-19F标记的SRC，在注射后3小时、24小时和7天通过核磁共振定量[16,22]。

使用CKD的5/6Nx模型进行急性ZSF-1检测和长期供体细胞检测均显示大量保留的SPIO标记细胞。细胞递送后24小时的临床相关MRI检测揭示注射了SPIO标记的细胞的肾脏前极的一个区域。对整个肾脏进行切片并用普鲁士蓝(Prussian blue)染色显示，大量铁标记的SPIO细胞从皮质注射部位迁移和分布，这证实它们存在于肾皮质和髓质的管状和管周空间中。

同样，整个器官荧光成像突出位于ZSF-1大鼠肾脏前极上皮层的注射部位及其周围的细胞检测。递送后3小时和24小时检测到19F标记的SRC，证实在肾脏中几乎100％保留。7天后，检测到19F标记的SRC减少了一个数量级，与连续尿排泄一致。

1.1.3.2.非肾组织的猪非GLP分析

在临床前非GLP研究中，将SPIO标记的SRC递送至活猪的肾脏(n＝11)。在30天的研究期间使用MRI监测细胞分布。标记的SRC分布在两个主要区室中：膀胱和肾实质。排泄的主要途径是尿液。注意，在非靶器官部位没有异位SRC迁移或特定部位移植的证据[23]。

1.1.3.3.非肾组织的犬非GLP分析

在临床前非GLP研究中，将SPIO标记的SRC递送至活犬宿主的肾脏。在注射后30分钟时通过MRI监测细胞分布。与来自活猪模型的观测结果一致，表明注射的SPIO标记的SRC保留在肾实质中或排泄到尿液中，30分钟后，SPIO标记的SRC同样保留在注射部位的肾实质内。

1.1.3.4.结论

-基于使用SPIO和CelSense-19F的SRC标记研究，SRC分布在注射部位(肾实质)并通过尿液排出。

-基于大量组织学评估，在非靶器官(排泄期间的尿路除外)中未检测到递送至大鼠、猪和犬肾脏中的SRC。

-基于临床试验中有关同种异体间充质干细胞的报告以及有关自体间充质干细胞的安全性的已发表数据，自体REACT相关物质也不应引起异位组织生长、器官功能障碍或肿瘤发展[24-28]。

1.2.毒理学研究

为了评估REACT的安全性，进行了三项GLP安全性研究，即，一项研究在CKD的大鼠ZSF-1模型中进行，另外两项研究在正常犬中进行。

1.2.1.ZSF-1大鼠单剂量研究

本研究目的是评估在ZSF-1大鼠(包括T2DM、高血压和严重肥胖的不受控制的代谢综合征模型)中单次施用REACT的安全性。大鼠接受：1)高剂量REACT；2)低剂量REACT；3)假手术；或4)仅生物材料。每只动物接受4次测试品注射，每个肾脏的每个极注射一次。在治疗后3个月和6个月评估结果。

1.2.1.1.肾脏相关发现

对每个肾脏的8个区域(每个区域3个染色点)进行评估，包括对每个肾脏150个肾小球的评估和评分后，未记录与治疗相关的肾脏结果。除与注射和/或注射部位明显瘢痕相关的变化外，在疾病模型的背景下，认为所有肾脏都是正常的。在治疗后3或6个月未观测到与测试品相关的肾脏结果。认为所有宏观和微观肾脏变化都与ZSF-1肥胖大鼠肾病的自然进展或注射程序有关。

所有组的肾脏变化在男性中更严重，并且与性别之间疾病阶段的差异一致。总之，手术后6个月，与假手术组相比，低浓度REACT治疗组的肾组织学严重程度评分存在明显降低的趋势(即，肾小球损伤评分、肾小管间质损伤评分和整体肾单位评分较低)。

基于研究组之间不存在差异，未观测到不良效应水平(NOAEL)为高剂量，6.25x10⁶个细胞/g KWest。

1.2.1.2.非肾脏发现

在非靶组织中未观测到与REACT安全性相关的结果。未观测到REACT相关的输尿管或膀胱(REACT排泄的主要途径)变化。在检查的任何引流(淋巴结)或过滤(肝、肺、脾)组织中，不存在与REACT相关的效应，也无可观测的REACT细胞物质。

1.2.1.3.临床病理学

针对基线至研究结束(治疗后3或6个月)之间以及治疗组和对照组之间的差异，评估了临床实验室测试(包括血液学、临床化学和特殊尿液分析组)的结果。未发现与REACT相关的临床上有意义的实验室异常。

1.2.1.4.结论

-所有动物都存活到研究结束(治疗后3或6个月)。

-没有显著安全性相关的临床病理学结果或可归因于治疗的毒理学上有意义的安全性相关结果。

-未确定与REACT相关的临床上有意义的实验室异常。

-观测到的NOAEL为6.25x10⁶个细胞/gK West。

1.2.2.初始单剂量犬研究

初始犬毒理学研究评估了与假手术治疗或生物材料治疗相比，单次施用两种不同剂量的REACT的安全性。将测试物品递送至每个肾脏的一个极中。总共有32只杂种狗入选研究；16只在1个月时评估，16只在3个月时评估。

1.2.2.1.总体结果

在治疗后1或3个月时，所有32只动物均存活至其指定的终止时间点。在整个研究过程中，动物似乎健康状况良好。没有有意义的临床病理学结果。没有肾功能不全(氮血症)的迹象，也没有GFR降低的指征。

1.2.2.2.肾脏相关结果

在1个月或3个月的终点未观测到与REACT递送相关的宏观或微观结果。在对每个肾脏的8个区域(每个区域3个染色点)进行增强评估后，未记录与治疗相关的肾脏结果，包括对每个肾脏150个肾小球的评估和评分。除了与注射部位瘢痕相关的变化外，所有肾脏都正常。认为所有宏观和微观肾脏变化都是背景结果或与注射程序有关。

1.2.2.3.非肾脏发现

在其他(非肾脏)组织中未发现与测试品相关的结果。认为所有宏观和微观变化都是背景变化且在正常范围内。

1.2.2.4.与程序相关的发现

最常见的异常包括切口部位肿胀(血清肿形成)和研究结束时体重减轻。关于切口部位肿胀，16只动物中有10只(10/16)在注射后具有无菌血清肿形成，而16只动物中有9只(9/16)在治疗后形成。

这些动物的腹膜后切口有不同程度的肿胀，兽医认为有必要进行治疗。

许多动物在REACT施用后(32只中有29只)和治疗手术后(32只中有18只)出现轻度食欲不振。大多数动物(32只中有28只)经历了从基线(注射前)至终止的体重减轻。值得注意地，基线(治疗前2周)和治疗(第0天；肾脏注射)之间比治疗和终止之间发生的体重减轻更多。体重减轻还发生在所有治疗组，并被判断为与研究的压力性质有关。

1.2.2.5.结论

-基于临床病理学、尿液分析和兽医评估，所有动物在其指定终止时间点存活并且在整个研究期间总体健康状况良好。

-在治疗后1个月或3个月，无论是低剂量还是高剂量的REACT，都不会产生宏观或微观的副作用，与假手术治疗或生物材料治疗后的观测结果类似。

-病理评估显示在检查的靶器官(肾脏)或非靶器官中无REACT安全相关(宏观或微观)的结果。

-基于解剖病理学，观测到的NOAEL是更高的测试浓度，即，11.7x10⁶个细胞/gKWest。

1.2.3.重复剂量犬研究

第二项犬毒理学研究评估了施用两个重复剂量REACT的安全性。在基线(时间零)和3个月时，将每个剂量递送至两个肾脏中。在基线注射程序之前4至6周，对所有动物的每个肾脏进行两次肾活检。对照动物注射PBS。动物在基线注射后监测6个月。

1.2.3.1.研究结果

在整个研究过程中，所有8只动物都处于良好的临床健康状态，并在6个月时存活至其指定终止时间点。8只动物中有5只出现轻微或不明显的体重减轻，其中2只动物在研究期间体重减轻>3％。肾脏注射至初始治疗之间比初始治疗至终止之间发生更大的体重减轻。临床病理和尿液分析数据显示没有异常趋势。没有肾功能不全的迹象，也没有GFR降低的指征。

1.2.3.2.肾脏相关发现

在6个月的时间点未观测到与REACT注射安全相关的宏观或微观结果。在对每个肾脏的8个区域(每个区域3个染色点)进行增强评估后，未记录与治疗相关的肾脏结果，包括每个肾脏150个肾小球的评估和评分。除了与注射部位瘢痕相关的变化(包膜中的纤维化/慢性炎症；皮质/髓质中的明显纤维化/慢性炎症和炎症细胞)外，所有肾脏均正常。

1.2.3.3.非肾脏相关发现

在非靶组织中未确定与测试品安全相关的结果。认为所有宏观和微观变化都是背景变化，因而认为是在正常范围内。

1.2.3.4.结论

-基于临床病理、尿液分析和兽医评估数据，所有动物都存活至其指定终止时间点，并且健康状况良好。

-病理学评估显示在检查的靶器官(肾脏)或非靶器官中没有与REACT安全性相关(宏观或微观)的结果。

-在6个月的时间点，与注射了PBS的对照动物相比，未观测到两个重复剂量的REACT的有害影响。

1.3.非临床结论

来自大剂量范围(300至1500万个SRC/g肾组织注射)和REACT治疗后延长时间(长达一年)的多项动物研究包括三项GLP研究的证据，表明来自REACT递送至肾脏的并发症潜在风险类似于与标准肾活检操作相关的并发症的潜在风险[1-3]。

除了与CKD的5/6肾切除术啮齿动物质量减少模型特定的注射程序和心血管结果相关的变化外，REACT递送后在靶器官或非靶组织中未发现一生中意外的血液学、泌尿学、血清学或组织学变化。

1.4.I期临床试验：中期结果

1.4.1.

2013年4月，在瑞典斯德哥尔摩(Stockholm,Sweden)的卡罗林斯卡大学医院Huddinge(Karolinska University Hospital Huddinge)启动首次人体临床试验：在慢性肾病患者中进行自体肾脏增强(REACT)的I期开放标签安全性和递送优化研究(RMTX-CL001)。这是REACT注射至CKD受试者中的I期开放标签安全性和递送优化研究。REACT由获自受试者肾活检的SRC制造，用明胶生物材料配制，并注射回受试者的左肾。主要目标是评估在受体肾脏的一个部位注射REACT的安全性和最佳递送，通过治疗后12个月手术和/或产品相关不良事件(AE)来度量。次要目标是通过比较从基线至REACT注射后12个月的实验室检查结果，然后是18个月的额外观察期来评估肾功能。每个受试者CKD疾病进展的基线率用作他/她自己的“对照”，以监测肾功能不全随时间的变化。从卡罗林斯卡大学医院招募的6名受试者登记进入研究。此外，北卡罗来纳大学(University of North Carolina)的研究登记1名受试者。

1.4.2.不良事件

在7名患有透析前糖尿病肾病(CKD 3b/4期)的53至70岁男性受试者群组中，所有受试者均从腹腔镜REACT递送手术中恢复，没有即时围手术期并发症。值得注意地，没有受试者出现血尿，这被前瞻性地认为是最有可能发生的不幸事件。一名受试者在注射REACT后第2天出现肠扭转，需要进行部分结肠切除术，并伴有吻合口出血。根据研究人员的判断，该事件与研究产品或程序无关。一名受试者经历了与腹腔镜注射程序相关的皮肤感染。另一名伴有呼吸道炎症的受试者从外科手术中康复。与临床试验相关的所有严重不良事件(SAE)示于表6。

9个SAE中有8个被认为可能与注射手术有关。没有AE或SAE被认为与活检程序相关。迄今为止，尚未发现与REACT或其他研究程序相关的延迟或迟发性不良反应(如，负向免疫介导反应)。基于目前的数据，与REACT治疗相关的最高风险似乎来自注射手术。因此，正在采取措施减少手术程序的持续时间并改善手术结果。

表6：研究RMTX-CL001中报告的严重不良事件

1.4.3.估算肾小球滤过率(eGFR)

7名患有T2DM和CKD 3b/4期的男性患者在左肾中注射REACT。这些受试者的注射前信息表明，他们的eGFR平均降低为6.1ml/min/年。REACT治疗后，联合组(所有受试者)的eGFR降低为-3.1ml/min/年(图1中的灰色线)。

在该群组中监测REACT治疗对CKD进展的潜在影响大约一年后，肾功能的预期降低似乎已通过向单个肾脏单次注射REACT得到改变。如图1所示，REACT治疗后的eGFR(灰色线)相比REACT治疗前的eGFR(黑色线)的比较表明，7名受试者中有6名治疗后eGFR降低的速率有所减少。每名受试者在REACT治疗之前和之后eGFR的年变化速率示于表7。

表7：按受试者估算肾小球滤过率(RMTX-CL001)

1.4.4.血清肌酐

在该群组中，治疗前血清肌酐(sCR)水平普遍升高，这在患有T2DM和中度至重度肾功能不全(CKD 3b/4期)的受试者中是可预料的。表8中示出每名受试者在REACT治疗之前和之后sCR的年变化率。与REACT治疗之前观测到的sCr增加速率相比，所有受试者在REACT治疗后均表现出其个体sCr增加速率的降低。

表8：受试者的血清肌酐(RMTX-CL001)

该群组的sCR总体预先治疗水平为>100μmole/L/年。REACT治疗后，sCR降至<50μmole/L/年。如图2所示，REACT治疗之后的sCR(灰色线)相比REACT治疗之前的sCr(黑色线)的比较表明，该群组经历REACT治疗之后sCr增加速率的降低。该变化对每名受试者都是一致的。

1.4.5.肾皮质厚度

患有慢性肾病的患者经历肾功能部分(即，皮质)变薄。随着疾病的进展，由于纤维化和瘢痕形成，CKD患者的肾皮质厚度减少。在REACT的临床前研究中，皮质厚度的增加与肾再生有关，并且在所有4种动物研究中都得到了组织学证实。在临床试验TNG-CL010和TNG-CL011中，使用成像技术评估皮质厚度；未进行活检来确认厚度增加的基础。测量右肾和左肾的皮质厚度，以确定注射的左肾是否显示可归因于REACT注射的任何皮质厚度变化。右肾作为未注射对照。

平均地，左肾皮质厚度从基线时的14mm增加至REACT治疗一年后的约16mm。皮质厚度的这种变化不足以导致左肾总体积的增加(数据未示出)。在右肾皮质中未观测到皮质厚度的变化。

1.4.6.血红蛋白

由于肾脏促红细胞生成素产生的改变以及慢性尿毒症导致的代谢异常，CKD可能与贫血有关[29]。在临床试验RMTX-CL001中，7名受试者中有3名在REACT治疗后表现出血红蛋白水平的提高，而其余4名受试者在研究期间保持正常水平。

1.4.7.血压

在临床试验TNG-CL010和TNG-CL011期间监测血压。受试者接受药物以控制其血压。值得注意地，在REACT治疗后的前6个月内，6名受试者中有3名减少了抗高血压药物摄入量。

1.5.潜在风险

一般地，与临床使用REACT相关的潜在风险可大致分为3类：肾活检、REACT产品和递送至受体肾脏。本节描述与这些步骤中的每一个相关的潜在风险的评估。

此时，没有与使用REACT相关的特定警告或预防措施。但是，使用本产品时必须考虑肾活检和经皮注射程序的警告和注意事项。肾活检的风险已在该程序100年的使用和发展中得到充分描述。肾脏经皮穿刺器械的历史较短。肾活检和经皮穿刺肾脏注射的风险包括：

1.注射/活检部位侧面疼痛

2.注射/活检时可能发生在肾脏周围或沿穿刺轨迹任何地方的出血，并且可能足以导致临床上显著的贫血、急性肾损伤(AKI)、血肿，以及在包膜下出血的情况下，“Page肾”和急性高血压

3.穿刺损伤对肾脏的手术损伤，以及包括结缔组织、骨骼和腹内脏器在内的其他结构的损伤。

1.5.1.与肾活检相关的潜在风险

自体肾细胞将通过根据标准医疗实践[1-3]进行的肾活检获自个体受试者，并与参与医院/医疗机构的标准操作程序一致。单次肾活检至少需要2个组织核心，以获得足够的肾皮质组织用于产生REACT。长约10mm的16号活检针将切除患病肾脏平均总体积的0.01-0.02％。由于将收获肾小球总数的约0.001％[3]，预计活检不会对肾功能产生不利影响。

用于诊断程序的肾活检风险低，在美国通常基于门诊的镇静作用下进行[30,31]。由有资质的介入医师进行时，准确靶向皮质的肾活检产生有限的肾损伤[27]。另一方面，活检部位肾损伤的报告描述了血管损伤和不同程度的缺血和梗塞。损伤的严重程度取决于活检程序期间受损伤血管的大小和数量[32]。

出血是与常规肾活检相关的最常见的不良事件。几乎所有患者都因活检而出现镜下血尿，但这无临床意义[2,31]。另一方面，3-9％的患者出现肉眼血尿[30,31]，并且通常在活检后24小时内消退。最严重的并发症是需要输血和/或导致患者死亡的严重出血。不到1％的肾活检需要输血，不到0.01％的病例发生死亡[33-35]。

1.5.2.与REACT产品相关的潜在风险

研究产品REACT由通过肾活检从同一受试者获得的自体肾细胞组成。基于自体干细胞移植的经验，由REACT注射至肾脏引起免疫反应(如，移植排斥)的风险似乎不太可能。

由于肾脏是高度灌注器官，注射的SRC是否会留在注射部位是不确定的。三个位置被认为是SRC最有可能迁移的目的地：1)包膜下空间；2)体循环；和3)尿路。SRC泄漏至包膜下空间预期不会对受试者构成风险。例如，包膜下空间通常用于注射内分泌组织，如胰岛细胞[36]。肾包膜还可用作能够迁移至肾实质的天然干细胞的生态位[37]。此外，直接注射至肾脏中通过尿路提供自然消除途径来减少SRC进入体循环的可能性。而且，异源、同种异体干细胞(即，间充质干细胞)的静脉内施用已在临床试验中得到评估，对受试者无明显风险[24-28]。

REACT制剂中使用的猪皮B型明胶符合药物和食用明胶专著(欧洲药典7.0，美国药典-国家处方集USP35 NF30)要求。明胶广泛用于制药和医疗应用，包括用于再生产品的细胞移植。基于明胶的生物相容性、广泛应用以及使用含有REACT的猪明胶进行的GLP毒理学研究结果，预计明胶不会对研究受试者造成不利影响。

1.5.3.与REACT治疗相关的潜在风险

使用经皮技术进入肾脏进行REACT递送。十多年来，已将经皮入路用于消融肾脏肿块。对该方法的简要回顾可见Salagierski and Salagierski(2010)[38]。在REACT治疗和术后随访期间将执行安全性措施，以降低过度出血和其他不良事件的可能性。如第6节所述，将密切监测患者。

Cain及其同事(1976)[39]报告，将肾细胞匀浆注射至啮齿动物肾脏中不会产生明显的不良事件。类似地，REACT递送至肾脏后观测到的形态学效应与重复进行的犬肾活检报告的结果一致，即，存在成熟的结缔组织踪迹，没有与最小结构变化相关的功能缺陷[32]。增加犬的囊内肾脏水量会升高肾内压以及短暂增加肾重量和全身血压[19,20]。然而，在评估施用体积对血压的短期影响的初步犬研究中，REACT体积增加至每个肾脏6mL后，对血压没有不利影响。

1.6.潜在益处

实现CKD中临床上显著改善的潜力得到了在肾功能不全的临床前动物模型(即，在其他方面健康的大鼠和犬中肾功能下降的手术模型加上T2DM的ZSF-1大鼠模型)中测试REACT的研究的支持。主要发现是REACT显著降低已受损肾脏的结构和功能恶化的速率，在动物模型中达到有临床相关性的程度。因此，参与该临床试验的受试者有可能从REACT治疗中受益，如可能降低CKD的进展速率。

2.I期试验目标和目的

本临床试验基于再生细胞的产品-肾脏增强(REACT)，旨在改善患有CKD和T2DM的受试者的肾功能。REACT的治疗干预旨在基于当前的护理标准延迟肾脏替代疗法(透析或移植)的需要，肾脏替代疗法对于终末期CKD患者是不可避免的。本研究的目的是比较以下受试者中的安全性和有效性：在REACT产品一可用就随机接受其第一次治疗至多2次注射REACT(间隔(最多)3个月(+12周))的受试者，相比在接受至多2次注射REACT前的前面12至18个月期间随机经历同期标准护理治疗CKD的受试者。此外，基于筛选访视前18个月的充分历史临床数据，每名受试者的肾功能衰退的年速率用作比较物，以监测REACT注射之前和之后肾功能不全的进展速率。

在最后一次REACT注射后的24个月内，REACT治疗降低了eGFR下降的速率(率率)并改善了肾功能。

2.1.主要目标

评估在一个受体肾脏中注射REACT的安全性。

主要终点：

-两次REACT注射后6个月eGFR的变化

-注射后6个月肾脏特定程序和/或产品相关不良事件(AE)的发生率

2.2.次要目标

通过评估注射后24个月的时间肾脏特定不良事件来评估REACT施用的安全性和耐受性。

次要终点：注射后24个月的肾脏特定实验室评估。

2.3.探索性目标

评估注射后24个月的时间REACT对肾功能的影响。

探索性终点：

-肾结构和功能(包括eGFR、血清肌酐和蛋白尿)的临床诊断和实验室评估，以评估肾病进展速率的变化。

-维生素D水平

-碘海醇成像

-血压控制

-肾脏体积的MRI评估

3.研究产品

3.1.研究药物的描述

REACT是由在生物材料(基于明胶的水凝胶)中配制的SRC组成的可注射产品。表9示出研究产品的概述。有关SRC和REACT以及制备工艺的详细说明请参阅研究人员手册。

表9：研究产品

3.2.REACT的获得和制备

REACT在位于美国北卡罗来纳州温斯顿-塞勒姆(Winston-Salem,NorthCarolina,USA)的Twin City Bio LLC的GMP设备中生产。

3.2.1.活检

使用标准程序技术采集活检材料以评估左肾或右肾。使用16号活检针必须采集至少2个组织核心，每个测量为1.5cm，以便为自体REACT的制造提供足够的材料。Twin CityBio LLC收到活检材料后，对样品进行标记并遵循严格的记录措施，以确保保持产品的可追溯性。Twin City Bio LLC通知站点有关用于制备REACT的活检样品的充足性和质量，并确认REACT注射的预定日期。如果不能使用活检材料，受试者应停止研究。

3.2.2.SRC的选择

在受试者计划的REACT治疗前约4周，将自体肾细胞从液氮冷冻机的气相中取出，解冻，并通过酶消化从肾组织中分离。使用标准技术培养和扩增细胞。

细胞培养基旨在扩增原代肾细胞且不含任何分化因子。收获的肾细胞进行密度梯度分离获得SRC，其主要由以其再生潜力闻名的肾上皮细胞组成[40]。其他实质(血管)和基质(集合管)细胞可能零星存在于自体SRC群中。

如果有足够的细胞可用，使用同一活检材料为研究制备额外的REACT制剂并在GMP条件下于液氮冷冻机的气相中储存。

所有受试者接受2次REACT注射系列。时间和事件表显示，2次REACT注射系列的施用间隔为3个月，研究访视窗口为12周。无论如何，尽一切努力确保在第一次注射后3个月施用第二次REACT注射。Twin City Bio LLC通知站点以获得有关第二次注射的预定日期的信息。

3.2.3.配制

SRC在基于明胶的水凝胶中配制，以提高在注射至肾皮质后运送和递送期间的稳定性。猪明胶溶解于缓冲液中以形成热响应水凝胶。尽管在室温下为流体，该生物材料在冷却至冷藏温度(2至8℃)时凝胶化。注射前，REACT研究产品必须温热至≥20℃至26℃以液化水凝胶。

3.2.4.用于注射的REACT产品

在REACT注射的预定日期前10至14天，受试者向诊所报告并接受评估以核实持续资格。如果受试者不符合REACT注射条件，则研究人员和发起人讨论可能的选择，例如，是否有足够的稳定性在未来尝试REACT注射。如果受试者仍然符合条件，制造REACT产品并运送至临床中心。站点有责任确保REACT货物直接交付给站点人员。使用经皮入路将REACT注射至符合条件的受试者经活检的肾脏中。经皮方法采用标准化技术(如，通过射频或低温方法消融肾脏肿块的技术)[38]。

每名受试者计划进行两次REACT注射。然而，如果出现任何不利的安全风险，或肾功能迅速恶化，或发生不受控制的糖尿病或不受控制的高血压，或发生恶性肿瘤或并发，则不应施用第二次REACT注射。

已被冷冻但未用于制造REACT的肾细胞可保留在Twin City Bio LLC液氮冷冻机的气相中，直到EOS访视。那时，如果不再需要这些肾细胞，它们会被消除所有个人信息的识别，并储存于液氮冷冻机的气相中最多5年。目的是在实验室研究中测试这些肾细胞。在知情同意程序期间，每名受试者都提供不用于REACT注射的自体细胞的储存和未来使用的书面同意。受试者可选择在研究完成后销毁这些细胞。

3.2.5.REACT剂量

1期临床试验(TNG-CL010和TNG-CL011)受试者的REACT剂量为3x10⁶SRC/g估算肾重量(g KWest)。同样，在本研究中，每个REACT注射液包含3x10⁶个细胞/g KWest。由于REACT中SRC的浓度为100x10⁶个细胞/mL，每100g肾重量的剂量体积为3.0mL。待施用的REACT体积是通过术前MRI体积3D评估或椭球公式(长度x宽度AP平面x宽度横切平面x0.62)确定。表10显示基于估算肾重量的施用体积示例。

表10：相对于估算肾重量的REACT剂量

缩写：估算肾重量(g KW^est)；SRC(选定的肾细胞)

注意：

a.REACT的剂量为3x10⁶个细胞/g估算肾重量。

b.肾重量在肾活检前由进行的MRI研究估算

c.8mL是最大剂量体积(mL)

REACT的剂量基于通过MRI计算的肾体积。与其他方法相比，使用MRI测量肾体积更准确，并且沿任何方向获取真实的断层扫描数据，而没有电离辐射或肾毒性造影剂的风险。对于去除肾周脂肪的离体器官，由MRI估算肾体积测量值(mL)约为干重测量值的92％至97％(以克为单位)。作为保守方法，REACT剂量使用1g等于1mL的换算来计算。待施用的REACT体积由术前MRI体积3D评估或椭球公式(长度x宽度AP平面x宽度横切平面x0.62)确定。这确保受试者不会接受比之前在动物研究中测试的剂量更高的REACT剂量。

3.2.5.1.两次REACT注射的原理

所有受试者都打算接受两次计划的REACT注射，以允许剂量探索并评估效果的持续时间。基于非临床研究的科学原理是，REACT(同源自体SRC)的生物活性成分通过增强肾脏结构和功能来延缓CKD实验模型的进展[7-12]。因此，可输注的细胞越多，肾功能的潜在改善就越大。然而，一次可递送至肾脏的细胞总数目受到肾脏大小以及肾囊无弹性的限制。因此，有可能通过在第一次注射的细胞整合至肾脏后通过第二次注射施用更多数目的SRC来提高治疗益处。

除了通过施用两次REACT注射至同一肾脏来增加SRC数目外，还可评估效果的持续时间。CKD肾脏中功能性肾单位失能的过程随时间可能会不利地影响通过REACT注射递送的“新”细胞。因此，REACT可能不会带来长期的治疗益处。探索在第一次注射后的适当时间间隔内进行第二次REACT注射的影响，将解决这个问题。

在本研究中，受试者在第一次注射后3个月接受第二次REACT注射，研究访视窗口为12周。无论如何，应尽一切努力确保在第一次注射后3个月施用第二次REACT注射。然而，如果出现任何不利的安全风险，或肾功能迅速恶化，或发生不受控制的糖尿病或不受控制的高血压，或发生恶性肿瘤或并发感染，则不施用第二次REACT注射。

3.2.5.2.两次REACT注射的安全性

为了评估将两个剂量的REACT施用至经活检的肾脏的安全性，进行了犬GLP毒理学研究(参见第1.2.2节)。与临床研究设计类似，研究动物(n＝8)在基线前4至6周进行肾活检。在基线和3个月时将每个剂量递送至两个肾脏；在基线注射后观测动物6个月。虽然对照动物接受了PBS，但REACT治疗的动物接受了比本临床研究中使用的剂量更大两倍的剂量。简言之，与基线治疗后6个月的对照动物相比，未观测到两个剂量的REACT对经活检的肾脏的有害影响。病理学评估显示在检查的靶器官(肾脏)或非靶器官中均无与REACT安全性相关(宏观或微观)的结果。在对每个肾脏的8个区域(每个区域3个染色点)进行增强评估后，未记录与治疗相关的肾脏结果，包括对每个肾脏150个肾小球的评估和评分。除与注射部位瘢痕相关的变化外，所有肾脏均表现正常。没有肾功能不全的迹象，也没有GFR降低的指征。研究人员手册中提供了详细信息。

3.3.研究药物包装

产品递送系统由3个组件组成：

1)10mL标准的

注射器

2)注射器密封包装

3)用于将包装运送至临床站点的REACT运送容器

将装有REACT的注射器在设计用于保持产品的完整性以及产品和注射器的无菌性的包装内运送至临床站点。产品递送系统的代表性图像在图3中示出。

产品递送系统由表11中列出的组件组成。与REACT产品接触的材料为USP VI级或等效材料。注射器、管道和辅助部件获自表11中列出的供应商或满足生物相容性分类和产品兼容性测试要求的其他供应商。注射器在包装中通过伽马灭菌进行预先消毒。装填后，将管密封并切断。

表11：产品递送系统组件

*已进行额外的测试(细胞毒性，MEM洗脱，体外：USP<87>；兔血细胞溶血:ASTMF756-00；塑料制品的理化试验：USP<661>)。

3.4.研究药物标签

REACT产品由获自每名个体受试者的肾活检的扩增的自体的SRC制备，因而是受试者特异性的。每个装有注射器的包装上都贴有标签，其包含以下内容：“仅供自体使用”。此外，标签表明该药物(REACT)为“仅研究使用”。

3.5.研究药物运送

所有活检标本均使用美国联邦法规(42CFR Part 72)规定的包装并根据各个承运商指南运送至Twin City Bio LLC。

由于REACT水凝胶制剂在运送过程中必须保持2至8℃的温度，因此REACT产品装在经验证可将温度保持在2至8℃的运送容器中从Twin City Bio LLC运送到临床站点。将REACT包装放置在塑料外部密封袋中，然后放置于来自Minnesota Thermal Sciences的冷藏运送容器中。运送容器中还包含温度记录器。运送容器的代表性图像示于图4。

当运送容器及时到达诊所用于预定注射时，从运送容器中取出内部REACT包装并平衡至受控室温(≥20℃至26℃)。

两名个体在受试者在场的情况下独立验证识别信息，从而确认信息与特定研究参与者正确匹配。

一旦水凝胶变成液体，手术助理就在无菌区域打开容器，并将注射器交给医生，医生将REACT经皮注射至经活检的肾脏的肾皮质中。

3.5.1.储存标本的处置

标本储存在液氮冷冻机的气相中。

4.研究计划

4.1.整体研究设计

研究流程概述显示于图5的图表中。

在患者签署ICF后，他们经过筛选进入研究。筛选评估包括实验室评估、体检以及ECG和MRI研究，所有这些都在活检之前进行。在第一次筛选评估的45天内，对满足所有I/E标准的患者进行左肾活检。在活检过程中，采集两个组织核心并将其送至Twin City Bio以制造REACT。如果患者在活检后经历明显的AE/SAE(如，过度出血、AV瘘管发展)而无法安全注射，患者将停止研究。

在美国北卡罗来纳州Twin City Bio的GMP设备收到后一两周，Twin City Bio通知站点收到的组织是否具有足够的尺寸和质量来制造REACT。如果结果是肯定的，该站点将确认预定的注射日期。如果活检不能用于制造REACT(无论出于何种原因)，患者将停止研究。

在预定注射前10至14天，患者向诊所报告进行注射前合格访视，包括对I/E标准的最终审查和肾脏闪烁扫描研究。如果患者符合注射条件，站点通知Twin City Bio使用冷冻肾细胞制造REACT产品。在注射当天(第0天)，患者到达医院并接受REACT注射至经活检的肾脏。

4.2.受试者数目

登记多达15名完成筛选程序并满足所有入选和排除标准的受试者。

4.3.治疗依从性

符合条件的受试者通过至多两次注射系列接受其自体的REACT制剂。使用经皮入路将研究产品施用至经活检的肾脏中。REACT产品制剂和给药程序在本方案以及研究参考手册中详细说明。

所有受试者都打算接受两次REACT注射。如果出现任何不利的安全风险，或者受试者的健康状况会受到威胁，则不施用第二次REACT注射。

4.4.研究持续时间

一旦自体的REACT制剂可用，受试者就开始其REACT注射系列。第一次REACT注射前1个月间隔，第二次注射前3个月间隔，加上最后一次注射后24个月的随访期，2次REACT注射系列的研究持续时间为28个月。

5.研究人群

5.1.受试者入选标准

除非另有说明，受试者必须满足每个入选标准才能参与研究。除非另有说明，在筛选访视、肾活检之前和每次REACT注射之前评估入选标准。

1.患者为男性或女性，知情同意之日年龄为18至65岁。

2.除了CAKUT的记录史外，患者还有肾脏和/或尿路的异常的记录史。

3.患者已确诊为III/IV期CKD，不需要肾透析，REACT注射前的筛选访视时确定eGFR为14至50mL/min/1.73m²，包括端值。

4.受试者在筛选访视时、肾活检前和REACT注射前的血压低于140/90。注意BP不应明显低于115/70。

5.在筛选访视之前和前24个月内应至少间隔3个月进行至少3次eGFR或sCr测量，以确定CKD的进展速率。

6.在肾活检和REACT注射开始之前7天至之后7天期间，患者愿意并能够避免服用NSAID(包括阿司匹林)以及氯吡格雷、普拉格雷或其他血小板抑制剂。

7.在肾活检和REACT注射开始之前7天至之后7天期间，患者愿意并能够避免食用鱼油和血小板聚集抑制剂，如双嘧达莫(即，

)。

8.患者愿意并能够配合方案的各个方面。

9.患者愿意并能够提供签署的知情同意书。

5.2.受试者排除标准

满足下列任何排除标准的受试者不符合参与研究的条件。除非另有说明，否则在筛选访视时、肾活检之前和每次REACT注射之前评估排除标准。

1.患者有肾移植史。

2.患者诊断为肾积水，SFU 4级或5级。

3.患者有未矫正的VUR 5级。

4.患者的皮质厚度用MRI测量小于5mm。

5.患者有已知的过敏或禁忌症，或对卡那霉素或结构相似的氨基糖苷类抗生素有过严重的全身反应。

6.患者对人血制品或动物源性材料(如，牛、猪)有过敏性或严重全身反应史或禁忌症。

7.患者有严重全身反应史或局部麻醉剂或镇静剂的任何禁忌症。

8.患者在REACT注射6周内出现需要胃肠外抗生素治疗的临床上明显的感染。

9.患者在REACT注射之前的最后3个月期间有急性肾损伤或经历肾功能迅速下降。

10.患者在REACT注射之前有以下任何情况：肾肿瘤、多囊肾病、会干扰REACT注射程序的解剖学异常或尿路感染的证据。

注意：如果肾脏仍然可进入并符合接受REACT注射的标准，则解剖学异常不是排除性的。

11.患者有III级或IV级心力衰竭(NYHA功能分类)

12.患者有FEV1/FVC≥70％。

13.患者在过去3年内有癌症史(不包括非黑素瘤皮肤癌和宫颈原位癌)。

14.如筛选访视时评估，患者患有临床意义的肝病(ALT或AST大于正常上限的3倍)。

15.如筛选访视时评估，患者乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)和/或人类免疫缺陷病毒(HIV)的活动性感染呈阳性。

16.患者在过去3年内有需要治疗的活动性结核(TB)史。

17.患者免疫功能低下或正在接受免疫抑制剂治疗，包括在REACT注射3个月内接受慢性肾小球肾炎治疗的个体。

注意：允许吸入性皮质类固醇和慢性低剂量皮质类固醇(每天少于或等于7.5mg)以及用于间歇性症状(如，哮喘)的短期应用皮质类固醇。

18.患者的预期寿命少于2年。

19.女性患者在研究过程中怀孕、哺乳(母乳喂养)或计划怀孕。或者，女性患者具有生育潜能并且没有使用高效的节育方法，包括禁欲。或者，女性患者不愿意在整个研究期间继续使用高效的节育方法。

20.患者有酗酒和/或药物滥用史，会损害患者遵守方案的能力。

21.患者的健康状况会因参与研究而受到危害。

22.患者在REACT注射前3个月内使用过研究产品。

5.3.禁用和伴随药物

-在肾活检和REACT注射之前7天至之后7天的研究开始期间，禁止服用非甾体抗炎药(包括阿司匹林)以及氯吡格雷、普拉格雷或其他血小板抑制剂。

-接受阿司匹林(最高100g/天的剂量)，用于40岁以上或有心血管疾病或中风的额外危险因素的糖尿病受试者的心脏病的一级预防和用于阿司匹林治疗的预期益处超过与治疗相关的风险的受试者。

-在肾活检和REACT注射之前7天至之后7天的研究开始期间，禁止服用鱼油和血小板聚集抑制剂，如双嘧达莫(即，潘生丁)。

-正在进行ACEI或ARB治疗的受试者必须在肾活检前至少8周开始治疗。在立即REACT注射前的6周期间，治疗必须稳定。稳定治疗定义为剂量调整不少于当前剂量的1/2且不超过当前剂量的2倍。此外，除非有医疗需要，从筛选至12个月的EOS访视期间，不应更改ACEI或ARB剂量方案。允许因医疗需要而中断剂量长达7天。

-在研究期间应避免使用干扰sCr测量的药物，如甲氧苄啶(trimethoprim)、决奈达隆(dronedarone)和西咪替丁(cimetidine)。如果基于医疗要求而需要这类药物，则应与医疗监督员讨论该情况并在CRF中记录。

-在研究过程中禁止使用研究药物。

研究药物被定义为尚未经FDA批准使用的药物。

5.4.受试者退出

如果受试者在进行肾活检之前停止研究，则该受试者被视为筛查失败。如果受试者在肾活检后但在第一次REACT注射之前停止研究，则受试者不是筛查失败，但不被视为登记并可以被替换。如果受试者在REACT注射后但在随访期结束之前停止研究，则不能替换受试者。

应尽一切努力确保注射AKA的受试者返回所有后续随访和程序，包括EOS访视。

6.研究访视

在研究期间要进行的临床评估和程序的时间表显示在时间和事件表中，即表1。同样，研究计划的样品采集和临床实验室评估时间表显示在实验室时间和事件表中，即表2。在进行任何研究特定的评估或程序(包括筛选)之前，受试者根据ICH GCP指南和21CFRPart 50提供书面知情同意书。

6.1.筛选

所有筛选评估都在允许安排在筛选访视的60天内进行肾活检的时间范围内进行。例如，如果受试者签署知情同意书，然后两天后去实验室抽血，那么抽血的日期被认为是第一次筛选评估的日期(即，不是同意书签署的日期)。

在筛选访视时进行肾脏超声检查以核实受试者合格(即，没有肾肿瘤、多囊肾病、肾囊肿或其他会干扰REACT注射程序的解剖学异常的证据)，同时获得基线回声读数。此外，从筛选访视时间至肾活检前的第-1天进行无造影剂的MRI研究，以确定肾脏大小和体积。

为符合研究登记条件，受试者的eGFR在筛选访视时必须为15至50mL/min/1.73m²，包括端点。为确定进入标准的eGFR，站点使用筛选期间评估的eGFR，并使用CKD-EPI公式[41]计算。

6.2.活检

活检安排在筛选访视的60天内。活检在允许约1个月后安排第一次REACT注射的时间范围内进行。肾活检核心通常在周三或周四采集。

受试者在活检前1至3天向医院或临床研究中心报告以进行活检前评估。尽可能采集和评估活检前实验室样品，以验证持续合格。在入院和最终验证入选和排除标准后，按照第7.5.1节所述进行活检。

使用冷藏运送容器将在无菌条件下使用16号活检针从每名登记受试者采集至少2个长度为1.5cm的活检核心运送至Twin City Bio LLC。Twin City Bio LLC联系站点以确认收到足够的活检材料来制造REACT。如果活检不能用于制备REACT，受试者停止研究。

未经历活检并发症的受试者按照站点常规做法在当天出院。否则，受试者将留在医院过夜进行观察。只要任何与活检相关的AE已消退、稳定或恢复至基线，受试者就会在活检后的第二天出院。

6.3.REACT注射

受试者接受两次计划的REACT注射，以允许剂量探索并评估效果的持续时间。如时间和事件表(即，表1)所示，2次REACT注射系列间隔3个月施用，研究访视窗口为12周。无论如何，尽一切努力确保在第一次注射后3个月进行第二次REACT注射。

如果出现任何不利的安全风险，或肾功能迅速恶化，或发展为不受控制的糖尿病或不受控制的高血压，或发展为恶性肿瘤或并发感染，则不进行第二次REACT注射。

合格的受试者在REACT治疗的早晨到达医院或临床研究中心。使用第7.5.2节中讨论的经皮入路向受试者注射自体REACT。

6.4.REACT注射后出院

在REACT注射后的第二天和出院前，进行超声检查以检测可能的亚临床不良反应(如，肿胀、积液)。如果在REACT注射后发生与产品或程序相关的AE，则受试者在AE消退、稳定或恢复至基线时出院。如果与站点的常规做法一致，则在不少于2小时的观察和监测后，受试者在REACT注射的当天出院。

6.5.随访

受试者在第一次和第二次REACT注射后的第7、14和28天(±3天)和第2个月(±7天)返回诊所进行随访。当二次REACT注射系列相隔3个月施用时，受试者不参加安排在3个月和6个月的随访。这些访视在时间和事件表(表1)以及实验室时间和事件表(表2)中显示为“可选”。相反，受试者在计划的最终REACT注射前10至14天向临床中心报告以进行治疗前评估。

在最后一次REACT注射后，受试者在治疗后第6、9、12、15、18、21和24个月(±7天)内完成对安全性和有效性的长期随访评估。

6.6.研究结束访视

本节描述了受试者进行EOS访视的情况；例如，由于过早停止研究或完成所有方案指定的随访。

-如果受试者在接受肾活检后但在REACT注射之前停止研究，则该受试者完成除MRI和/或肾闪烁扫描研究之外的所有EOS评估。如果受试者正在经历与研究产品或研究程序相关的SAE，直到SAE消退、稳定或恢复至基线，受试者才停止。

-如果受试者在接受一次或两次REACT注射后但在完成所有方案指定的随访之前停止研究，在停止时对他/她进行EOS访视。如果受试者正在经历与研究产品或研究程序相关的SAE，直到SAE消退、稳定或恢复至基线，受试者才停止。

-如果受试者完成所有方案指定的随访，最后一次REACT注射后24个月EOS访视时对他/她进行所有EOS评估。如果受试者正在经历与研究产品或研究程序相关的SAE，直到SAE消退、稳定或恢复至基线，受试者才停止。

6.7.研究完成

研究完成定义为最后一名受试者完成EOS访视的时间，或最后一名受试者被认为错过随访、撤回同意或死亡的时间。

7.研究评估和程序

7.1.人口统计学和病史

筛选访视时获得每名受试者的人口统计学特征。

从筛选访视时开始所有CKD相关病史和所有其他重要病史都记录在CRF中。在整个研究过程中，在CRF中定期更新仍在进行中的医疗状况。

7.2.临床评估

7.2.1.生命体征

待测量的生命体征包括收缩压/舒张压、心率、呼吸速率和体温。在受试者以坐姿休息至少5分钟后测量血压。在活检前访视(第-3天至第-1天)和注射前访视(第-14天至第-10天访视)时，进行3次BP测量且使用3次测量的平均值(收缩压和舒张压)满足进入标准并录入CRF。

7.2.2.体检

综合检查评估所有相关的身体系统，而中期检查包括对那些被认为适合该受试者的身体系统的具体评估。作为临时检查的一般规则，受试者的不良事件在检查之前或结合检查进行审查，并视情况包括对相关身体系统的评估。CRF中仅记录有临床意义的异常。

在包括全面或中期体检的每次访视时测量受试者的体重。体重指数(BMI)计算为kg/m²。

7.2.3.ECG

受试者平躺佩戴血压袖带5分钟但未在心脏水平充气，获得12导联心电图。评估心电图记录并将结果录入CRF中。

7.2.4.伴随药物

CRF中记录的伴随药物如下：

-筛查访视直至第一次REACT注射：记录任何CKD特定药物以及可能影响肾血流动力学和/或血清肌酐测量值的药物。此外，记录用于治疗CRF中记录的AE的任何药物。活检程序中使用的外科药物不需要在CRF中记录，除非它们的使用超出预期的剂量和/或施用频率。

-第一次REACT注射直至随访3至6个月：记录治疗后3至6个月内服用的任何药物，取决于施用第二次REACT注射的时间。在REACT注射程序中使用的外科药物不需要在CRF中记录，除非其使用超出预期的剂量和/或施用频率。

-第二次(最终)REACT注射直至随访6个月：记录在最后一次REACT治疗后直至6个月服用的任何药物。在REACT注射程序中使用的外科药物不需要在CRF中记录，除非其使用超出预期的剂量和/或施用频率。

-随访6个月至EOS访视：记录可能影响肾血流动力学的CKD特定药物和可能影响血清肌酐测量值的药物。记录用于治疗CRF中记录的任何AE的药物。

7.3.实验室评估

计划的临床实验室评估列于表12中。除非另有说明，分析将由中心实验室进行。研究期间采集生物样品的计划示于表2。

表12：临床实验室评估

7.3.1.eGFR

使用慢性肾脏病流行病学合作研究(CKD-EPI)公式估算GFR，该方程包含血清肌酐和胱抑素C[41]。为了与每名受试者的历史值比较，可能有必要在生成历史数据的站点实验室进行第二次分析。

7.3.2.常规尿分析

收集尿液并通过标准系列分析。收集各种类型尿样的时间表示于表2。

在两个不同时间段收集尿液：24小时收集和“现场”尿液。现场尿液收集物用于试纸条(dipstick)尿分析(测试棒)评估。收集各种类型尿样的时间表示于表2。为提供蛋白和白蛋白排泄的全面情况，对所有样品的总蛋白和白蛋白进行评估。

7.3.3.血液学

REACT注射后的出血是参与本研究的受试者已知且可预见的风险。因此，血红蛋白和血细胞比容在每次REACT注射a)之前、b)之后4小时由当地实验室测量，并与基线水平比较。还测量其他出血参数(如，APTT、PTT-INR、血小板)。

7.3.4.病毒血清学

从每名受试者获得的活检核心用于SRC的扩增和选择。感染HIV、HBV和/或HCV会阻碍为该受试者制造REACT产品。因此，每名受试者都要进行病毒性血源性病原体检测，包括HIV、HBV和HCV。

7.3.5.药物筛选

与排除标准#24(见第5.2节)一致，如果受试者“有……药物滥用史，会损害受试者遵守方案的能力”，他们不符合参与研究的条件。因此，受试者进行药物滥用测试。

7.3.6.妊娠筛查

使用试纸在站点进行定性尿妊娠测试。如果测试结果为阳性，则由临床实验室进行验证性测试。如果站点做法不接受试纸的结果，则将尿样送至中心实验室进行分析。验证性FSH测试的绝经后妇女不必在整个研究过程中进行妊娠测试。

7.4.肾脏影像学

7.4.1.超声

在筛选访视时进行肾脏超声检查以验证受试者合格(即，没有肾肿瘤、多囊肾病、肾囊肿或其他会干扰REACT注射程序的解剖学异常的证据)，同时获得基线回声读数。在第0天和第1天进行住院肾活检后，以及在第0天和第1天进行住院REACT注射后，也进行超声，目的是监测可能的亚临床AE。在CRF中记录超声结果(如，阻力指数、长度等)。

7.4.2.计算机断层扫描

根据研究站点的通常护理标准，在REACT注射程序期间，计算机断层扫描(CT)可与超声结合使用。

7.4.3.磁共振成像

从筛选访视至肾活检前的第-1天进行无造影剂的MRI研究，以确定肾脏大小和体积。在站点初始访视期间，取决于可用的MRI设备为每个站点确定MRI程序。通常应使用1.5-T装置。MRI成像研究有助于确定肾脏体积(用于剂量计算)。使用标准顺序进行MRI，无需注射造影剂。例如，可使用快速3D梯度回波序列VIBE计算肾体积测量值，采集时间为22秒，空间分辨率为2x1.4x1.2 mm。成像参数记录于源文件和CRF中。对患者进行总共四次MRI。

7.4.4.肾闪烁扫描

使用放射性示踪剂^99mTc-二巯基丁二酸(DMSA)或Tc99m MAG3(巯基乙酰三甘氨酸)，将肾闪烁扫描用于评估左右肾功能。该方法被认为是测量肾皮质功能最可靠的方法。如果站点常规做法被认为与使用^99mTc-DMSA或Tc99mMAG3的程序完全等效，则站点遵循其程序。本研究中的所有患者都接受了四次肾闪烁扫描研究。在第一次REACT注射之前、最后一次REACT注射之前、最后一次REACT注射后的6个月访视时以及所有患者的EOS访视时进行肾闪烁扫描。

7.5.外科手术

7.5.1.活检

在无菌条件下使用符合站点做法的超声或CT引导方法进行肾活检。需要两个活检核心为SRC的选择和REACT的制备提供足够的材料。同样，将16号针头用于确保获得足够的材料。如果需要，可使用15号针头。如果可能，可对活检核心进行床边检查以确保获得足够的皮质材料。

由于活检组织用于制备REACT，该站点确保在无菌条件下采集组织核心，从而使随后的细胞扩增和选择期间的污染风险最小化。

受试者将保持仰卧4小时，同时监测血红蛋白、血压、肉眼血尿、腹部/胁腹部痛和胁腹部瘀斑。只要任何与活检相关的AE已消除、稳定或恢复至基线，符合站点常规做法受试者就会在活检后的第二天出院。重要地，肾活检后施用的任何止痛药都经过仔细选择，避免使用具有肾毒性潜力的药物。

如果受试者在活检后出现明显的不良事件，这会使受试者在REACT注射后增加明显不良反应的风险，那么他/她不接受REACT治疗，而是跟踪直到事件消退，然后停止研究。

7.5.2.REACT注射

在进行REACT注射之前，手术医生对受试者进行以下评估：

-进行体检以确定手术的可行性。

-评估出血参数，包括凝血系列、PTT-INR、血小板、血红蛋白、血细胞比容和其他相关实验室研究。

o注意：REACT注射后的出血是参与本研究的受试者已知且可预见的风险。因此，每次REACT注射a)之前、b)4小时之后和c)24小时之后测量血红蛋白和血细胞比容，并与基线水平进行比较。

-回顾影像学研究，包括超声、MRI和/或CT，以进入途径、肾脏深度和皮质-髓质交界处的外观。

-绘制可能的REACT细胞沉积位置。

-根据美国麻醉师协会(ASA)对于气道评估、病史、过敏和药物确定分类和相关的围手术期/术后风险。

-访问受试者和受试者的家人/支持者来讨论程序、其风险和可能的并发症。回答问题，并获得书面知情同意。

根据站点常规做法静脉内给予预防性抗生素。如有必要，可进行初始CT扫描以评估邻近内脏、肾脏位置和肾囊肿的存在。结合超声，CT扫描也可有助于定位皮质-髓质交界处。

REACT通过与细胞递送相容的针头/套管和注射器靶向注射至肾皮质。目的是通过穿透肾囊引入REACT并将REACT沉积至肾皮质的多个部位。最初，使用插入肾皮质约1cm的15至20号套管针/入口插管刺穿肾囊。

在I期临床研究中，通过18号针头施用REACT。建议2期研究使用18号或更小的针头进行REACT递送。针头穿过入口插管内并推进至肾脏施用REACT。REACT的注射速率为1至2ml/min。每次注射1至2分钟后，内针会沿着皮层内的针程缩回至第二个注射部位，依此类推，直到针尖到达入口插管末端或直到已注射整个REACT产品。使用经皮递送方法，使用直接、实时成像来进行入口插管/套管针和递送针的放置。选项包括单独超声或超声和互补CT。

手术期间，采用中度清醒镇静；连续测量生命体征。如果有影像学证据表明细胞外渗至中枢或外周肾血管、肾髓质部分，或通过肾皮质并进入腹膜后软组织，或有活动性出血的证据，则停止注射REACT。

完成REACT注射后，取出内针，外插管留在原位以追踪栓塞。取出外插管(套管针)期间，肾皮质穿刺部位和穿过腹膜后腔的针迹用可吸收的明胶颗粒/海绵(如，

[Pfizer])或纤维蛋白封闭剂(如，TISSEEL[Baxter])或其他合适的药剂进行栓塞，以防止肾脏过度出血。

手术完成后，进行CT平扫或彩色多普勒超声评估，以对穿刺部位细胞注射和任何血肿或出血事件进行成像。受试者术后在恢复室环境中监护2至3小时，并进行护理评估和生命体征测量。没有出现并发症的受试者在注射REACT的当天出院，符合站点常规做法。

8.安全评估和管理

8.1.不良事件和严重不良事件

8.1.1.不良事件的定义

AE是在接受研究治疗后或期间出现不良医学状况(包括异常实验室检查结果)或原有病症恶化，无论是否被认为与研究程序或研究产品有因果关系。原有病症是在受试者签署知情同意书之前被诊断并记录为受试者病史的一部分的临床病症(包括正在治疗的病症)。稳定或未改变的原有病症不应被视为不良事件。

研究人员负责确保从活检程序当天至最后一次注射REACT之后12个月期间发生的所有由研究人员观测到或由受试者报告的AE都得到监测并记录在受试者的医疗记录和由发起人或其指定人员提供的CRF中。所有受试者从同意之时起至活检程序当天之前发生的AE应当记录为病史。

将治疗期间出现的不良事件(TEAE)定义为在第一次注射REACT之后开始或在第一次注射前开始但在第一次注射REACT之后严重程度或频率增加的任何AE。

认为有必要对AE评估和执行随访时，可在研究期间的任何时间进行计划外访视。

8.1.1.1.严重不良事件的定义

严重不良事件(SAE)是以任何剂量的研究产品、比较剂或安慰剂在研究的任何阶段(即，基线、治疗、清除或随访)发生且满足以下一项或多项的不良事件：

-导致死亡

-直接危及生命

-需要住院或延长现有住院时间

-导致持续或明显的残疾或丧失能力

-导致先天性异常或先天缺陷

-可能危及受试者或可能需要医疗干预以防止上述结果之一的重要医疗事件。

活检程序当天、治疗期间或最后一次REACT注射后12个月内发生的所有SAE，无论它们是否与研究程序或研究产品有关，都必须记录在受试者的医疗记录和CRF中。

8.1.1.2.其他重要的不良事件

具有特定临床重要性的重要事件包括导致受试者过早停止研究的SAE和AE。这些事件记录在受试者的医疗记录和CRF中。可准备这些事件的叙述以包含在临床研究报告中。

以下部分描述了有关程序和产品相关事件的“特别关注的不良事件”。仔细监测受试者是否发生这些可能的AE。

8.1.1.3.程序相关事件

术后疼痛：如果受试者在活检或REACT注射后经历疼痛，推荐施用扑热息痛(paracetamol)或扑热息痛-可待因(codeine)组合。腰部或腹部更剧烈的疼痛需要超声检查以排除明显的肾周出血。如果出现剧烈疼痛，有必要施用阿片类药物。如果需要高于最大授权剂量的镇痛剂量来缓解疼痛，那么研究人员必须进行额外的临床评估以确定过度疼痛的可能原因。

出血：在肾活检和REACT注射程序后，受试者进行定期血红蛋白和血压监测。受试者卧床并监测正常凝血指标的维持情况。如果发生出血且受试者在卧床休息后仍处于低血压，可考虑输血。如果仍不能控制出血，可考虑手术。在极少数情况下，可进行肾血管造影以确定出血源。可在同一程序中进行线圈栓塞。

其他并发症：在极少数情况下，活检期间可能穿刺其他器官(如，肝脏、胆囊和肺)。在这些情况下，可与咨询外科医生讨论适当的治疗和随访。

死亡：<0.01％的患者发生肾活检导致的死亡[26,34,35]。遵守严格的入选/排除标准确保可能容易失控或过度出血的受试者不会参与本试验。

8.1.1.4.产品相关事件

不会发生与REACT产品相关的事件。

8.2.不良事件强度和关系评估

8.2.1.强度等级

强度使用美国国家癌症研究所的“不良事件的通用术语标准”(CTCAE)4.03版(参见evs.nci.nih.gov/ftp1/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_Quick Reference_8.5x11.pdf)来评估。如果AE不包括在CTCAE中，则根据以下标准确定AE的强度：

-轻度(1级)：AE对于受试者很明显，但不干扰日常活动。

-中度(2级)：AE干扰日常活动，但对对症治疗或休息有反应。

-重度(3级)：尽管对症治疗，AE仍明显限制受试者进行日常活动的能力。重度事件通常丧失能力。

-危及生命(4级)：受试者处于死亡的直接风险。

-死亡(5级)

如果强度(等级)在一天内变化，记录最大强度(等级)。如果强度(等级)在较长时间内变化，将这些变化记录为单独的事件(每个等级具有单独的开始和停止日期)。

区分严重和重度AE很重要。重度是强度的度量，而严重性由严重不良事件定义下的标准(见第8.1.1.1节)定义。因此，重度AE不一定符合严重性标准。

8.2.2.关系评估

研究人员应判断AE可能是由研究程序或研究产品引起是否有合理的可能性。如果不存在暗示关系的正当理由，则AE被归类为“不相关”。如果有任何正当理由(即使未确定)怀疑可能存在因果关系，则认为该AE与研究程序或研究产品“可能相关”或“相关”。

相关性分类的定义是：

-不相关：未发生接触研究治疗，或AE的发生在时间上无合理关联，或AE被认为不太可能与研究治疗相关。

-不太可能相关：研究治疗和AE在时间上不密切相关，和/或AE可通过接触研究治疗药物产品以外的原因更一致地解释。

-可能相关：研究治疗和AE在时间上合理相关，并且AE可通过接触研究治疗药物产品以外的原因得到很好的解释。

-相关：研究治疗和AE在时间上合理相关，并且AE更可能是通过接触研究产品而不是其他原因来解释，或者研究治疗是AE的最可能原因。

出于安全性分析的目的，所有被判断为“可能相关”或“相关”的AE都被认为是治疗相关的不良事件。

8.3.记录和报告不良事件

受试者自发报告和/或回答研究人员提出的未解决问题，或通过观察发现，或通过实验室报告、成像报告、咨询笔记、调查仪器和其他数据采集工具记录的不良事件记录在受试者的病历和CRF中。

尽可能使用标准医学术语报告不良事件。实验室值或生命体征的临床显著变化不需要报告为AE，除非异常变化构成SAE和/或导致治疗停止或退出研究。

对于每个AE，记录开始日期、停止日期、每个可报告事件的强度、与研究程序或研究产品的关系判断、采取的行动、严重程度(如果适用)以及事件是否导致停止治疗或退出研究。

8.3.1.妊娠

妊娠既不是AE也不是SAE，除非发生与妊娠有关的并发症。所有关于先天性异常/出生缺陷的报告都是SAE。自发性流产应作为SAE报告和处理。然而，无并发症的选择性流产不应作为AE处理。

参与本研究的女性受试者所经历的所有妊娠都将在与SAE相同的时间范围内使用CRF的妊娠表进行报告。所有妊娠的过程，包括围产期和产后结果，无论受试者是否已停止参与研究，都将被追踪直至消除，包括对新生儿健康状况的随访至6周龄。

研究产品的施用对妊娠女性或发育中的胎儿的影响是未知的。因此，在研究过程中计划怀孕，或整个研究期间未使用高效避孕方法，或不愿继续使用高效避孕方法的有生育潜力的女性受试者不符合参与研究的条件。(参见排除标准#23；第5.2节)

8.4.个体受试者的停止规则

TA受试者可能会因以下退出研究：

-任何临床不良事件、实验室异常、并发疾病、继续参与研究会不符合受试者的最佳利益的其他医疗状况或情况。

-出现任何排除标准。

如果受试者终止研究，应在最后一次访视时进行EOS评估。

如果发生以下任何事件，在完成审查之前，其他任何受试者都不能接受REACT注射：

-被评为重度或危及生命且与REACT或研究程序相关的SAE

-已登记的受试者死亡

-在超过一名受试者中出现与REACT相关的类似SAE

-在超过一名受试者中由于手术或其他问题无法递送至少50％的REACT剂量

9.统计方法和计划分析

9.1.样本量

登记至多15名完成筛选程序并满足所有入选和排除标准的受试者。

统计分析本质上主要是描述性的。除非另有说明，连续变量通过呈现非缺失观测值(n)、平均值、标准差、中值、最小值和最大值来总结。分类变量通过呈现每个类别的频率计数和百分比来总结。

9.2.评估标准

9.2.1.分析目标和终点

9.2.1.1.主要

评估在一个受体肾脏中注射REACT的安全性。

主要终点：注射后24个月的程序和/或产品相关不良事件(AE)。

9.2.1.2.次要

通过评估注射后24个月的时间肾脏特定不良事件来评估REACT施用的安全性和耐受性。

次要终点：注射后24个月的肾脏特定实验室评估。

9.2.1.3.探索性

在注射后24个月的时间评估REACT对肾功能的影响。

探索性终点：肾脏结构和功能(包括eGFR、血清肌酐和蛋白尿)的临床诊断和实验室评估，以评估肾病进展速率的变化。

9.3.人口统计学和基线特征

人口统计学数据和基线特征对于连续变量通过样本大小、平均值、标准差、中值、最小值和最大值以及对于分类变量通过频率和比例进行总结。这些总结针对完整分析集和注射分析集产生。人口统计学和基线特征信息以描述性统计呈现；未计划生成推论统计。这些数据以表格形式提供。

9.4.疗效分析

主要疗效终点是在最后一次REACT注射后1、3、6和12个月时获得的eGFR系列测量值。使用慢性肾脏病流行病学合作研究(CKD-EPI)公式估算GFR，该方程包含血清肌酐和胱抑素C[1]。

在每个时间点测量的估算GFR通过呈现每个治疗组的原始数据和从基线值的变化的描述性统计来总结。

9.5.探索性分析

进行探索性分析以检查与健康相关生活质量(HR-QoL)的潜在变化。

9.6.统计方法

受试者完成KDQOL-SF^TM调查(即，肾脏疾病和生活质量简表)。KDQOL-SF是与肾病患者相关的36项经验证的HR-QoL工具[42]。这种针对特定疾病的HR-QoL工具由以下分量表组成：

-“身体(PCS)和心理(MCS)功能SF-12量表”包含关于总体健康、活动限制、完成所需任务的能力、抑郁和焦虑、能量水平和社交活动的项目。

-“肾脏疾病负担分量表”包含有关肾脏疾病如何干扰日常生活、占用时间、引起沮丧或使受访者感到负担的项目。

-“症状和问题分量表”包含有关受访者感到如何受肌肉酸痛、胸痛、痉挛、皮肤发痒或干燥、呼吸短促、昏厥/眩晕、食欲不振、感觉疲惫或筋疲力尽、手或脚麻木、恶心或透析通路问题困扰的项目。

-“肾脏疾病对日常生活影响分量表”包含有关受访者感到如何受液体限制、饮食限制、在家或旅行工作的能力、对医生和其他医务人员的依赖感、压力或担忧、性生活和个人形象困扰的项目。

9.7.安全性分析

9.8.实验室评估

在立即REACT注射前采集基线值。观测到的从基线实验室数据的变化对于连续变量通过样本大小、平均值、标准差、中值、最小值和最大值以及对于分类变量通过频率和比例进行总结。实验室异常使用NCI CTCAE分级方案确定。将异常实验室值标记为高于或低于正常范围。本研究特别关注肾功能的实验室检测结果，特别是sCr、BUN和尿白蛋白。

总结了发生治疗紧急情况的实验室异常，定义为在基线至REACT注射后直至6个月基线后的任何时间增加至少一个毒性等级的值。如果基线数据缺失，则使用活检和注射之间最新的值作为基线值。如果基线和注射前数据缺失，则任何分级异常(即，至少为1级)被视为治疗中出现的。这些值针对完整分析集和注射分析集进行总结。观测到的从基线值的变化以描述性统计呈现；未计划生成推论统计。这些数据以表格形式提供。

9.9.不良事件

临床和实验室AE使用监管活动医学词典(MedDRA)18.1版按系统器官分类(SOC)和首选术语(PT)进行编码。使用美国国家癌症研究所的CTCAE 4.03版对不良事件进行分级。

治疗中出现的AE定义为在第一次注射REACT后开始的任何不良事件，或在第一次注射前开始但在第一次注射REACT之后严重性或频率增加的任何不良事件。治疗中出现的AE的总结(频率和比例)以SOC和PT显示。其他总结包括但不限于被判断为与程序和/或研究产品相关的治疗中出现的AE、强度、受试者退出的原因、SAE和死亡。治疗组报告事件数目(发生次数)和经历治疗中出现的AE的受试者数目(发生率)。在数据列表中提供了不良事件数据。

9.10.其他安全性评估

计算每名受试者从基线变化的生命体征，并在数据列表中提供。通过数据列表总结在其体检显示变化(如，从正常到异常)的受试者的数目和百分比。数据列表中提供研究期间出现异常心律或QT间期延长的受试者的数目和百分比。数据列表中提供来自病史、伴随用药、超声、肾脏闪烁扫描和MRI评估的数据。按需要生成这些评估的描述性统计。

9.11.活检和REACT注射

数据列表中提供活检和REACT注射数据。

10.结果

患有由CAKUT引起的肾病的一名患者注射了REACT。该患者为55岁男性，患有后尿道瓣膜。REACT注射后三个月，可获得数据的最近时间点，患者显示可检测的肾功能改善，如eGFR增加和白蛋白与肌酐比(ACR)降低所表明。如图8所示，通过eGFR测量，用REACT注射患者改善(即，增强)患者的肾功能。在REACT注射前一个月，患者的eGFR一直在下降，从注射前1个月的约40mL/min/1.73m²下降至注射时的约33mL/min/1.73m²(图8，灰色实线)。患者注射REACT后，患者的eGRF相对于其注射时的值增加，增至注射后2个月约34mL/min/1.73m²和注射后3个月约35mL/min/1.73m²(图8，黑色虚线)。

图9通过观测到患者白蛋白-肌酐比率(ACR)的降低，进一步证明患者的肾功能得到改善。在REACT注射时，患者的ACR升高，约为47mg/g的水平。然而，REACT注射后3个月，患者的ACR降低50％以上，降至约21mg/g，这可视为“正常”范围内(即，低于30mg/g)的ACR值。

这些REACT注射后肾功能改善的观察结果具有临床意义；无论根本原因，目前治疗CKD的治疗选择都不能改善肾功能，而仅仅是降低器官功能的下降速率。

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实施例2-生产SRC的方法和组合物的非限制性实施例

实施例2.1-溶液的制备

在本实施例中，本实施例部分提供了用于分离和表征异质肾细胞群和制备再生疗法产品的各种培养基配方和溶液的组分。

表13：培养基和溶液

将Dulbecco's磷酸缓冲盐溶液用于所有细胞清洗。

实施例2.2-异质未分级肾细胞群的分离

本实施例部分说明从人分离未分级(UNFX)异质肾细胞群。进行初始组织解离以从人肾组织产生异质细胞悬液。

通过肾活检的肾组织为异质肾细胞群提供来源材料。可使用包括皮质、皮髓质分界或髓质组织中的一种或多种的肾组织。在一个实施方案中，使用皮髓质分界组织。CKD肾脏需要多个活检核心(至少2个)，避免瘢痕组织。在计划植入最终NKA前约4周，临床研究人员在临床站点从患者获得肾组织。组织在实施例2.1的组织运送培养基中运送。

然后用实施例2.1的组织清洗溶液清洗组织，以在处理组织用于细胞提取之前减少进入的生物负载。

将肾组织切碎、称重并在实施例2.1的消化溶液中解离。将所得细胞悬液在Dulbecco's改良Eagle培养基(D-MEM)+10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen，CarlsbadCalif.)中中和，清洗并重悬于无血清、无补充剂的角质细胞培养基(KSFM)(Invitrogen)中。对细胞悬液进行15％(w/v)碘克沙醇(OptiPrep^TM，Sigma)梯度去除红细胞和碎片，然后在组织培养物处理过的聚苯乙烯烧瓶或培养皿中以25,000个细胞/cm²的密度在实施例2.1的肾细胞生长培养基中开始培养。例如，可将细胞以25x10⁶个细胞/瓶接种到T500 Nunc烧瓶中的150ml 50:50培养基。

实施例2.3-分离的肾细胞群的细胞扩增

肾细胞扩增取决于接受的组织量和从进入组织分离肾细胞的成功。如果需要，可冷冻保存分离的细胞(见下文)。由于从个体患者分离的细胞的固有变异性，肾细胞生长动力学可能因样品而异。

开发了确定的细胞扩增程序，以适应因进入组织的可变性而导致的细胞回收范围(表14)。肾细胞的扩增涉及使用确定细胞培养程序在封闭培养容器(如，T瓶、CellFactories、

)中的肾细胞生长培养基(表13)连续传代。

为人体临床试验开发了不含BPE的培养基，以消除与使用BPE相关的固有风险。在不含BPE的培养基中评估细胞生长、表型(CK18)和细胞功能(GGT和LAP酶活性)，并与动物研究中使用的含有BPE的培养基进行比较。两种培养基中肾细胞生长、表型和功能相当(数据未显示)。

表14人肾活检的细胞回收

一旦在最初的T瓶中观测到细胞生长(第0代)且没有可见的污染迹象，就更换培养基，此后每隔2至4天更换一次(图7B)。通过在显微镜下肉眼观察培养物来评估细胞以验证肾细胞形态。由于细胞聚集在一起，培养物独特表现出紧密扁平或鹅卵石外观。这些形态特征在扩增期间变化，并且可能不会出现在每个传代中。使用在整个细胞扩增过程中使用的培养容器中不同汇合水平的细胞图像库来估计细胞培养物汇合度。

当培养容器至少50％汇合时，肾细胞通过胰蛋白酶消化传代(图7B)。将分离的细胞收集到含有肾细胞生长培养基的容器中，计数并计算细胞活力。在每次细胞传代时，将细胞以500至4000个细胞/cm²接种到足够数量的培养容器中，以将细胞数目扩增到配制NKA所需的数目(图7B)。将培养容器放置于37℃、5％CO₂环境的培养箱中。如上所述，监测细胞形态和汇合度且每隔2至4天更换一次组织培养基。表15列出来自人供体的6个肾活检的细胞分离和扩增期间观测到的人肾细胞的活力。

表15培养的人肾细胞的细胞活力

代数(n＝6)	细胞活力(平均％)	范围(％)
			P0	88	84-93
P1	91	80-98
			P2	94	92-99
P3	98	97-99

来自不同患者的组织的固有变异性导致不同的培养细胞产量。因此，严格限定细胞传代的时间或每次传代所需的培养容器的数目和类型以达到目标细胞数目是不切实际的。通常肾细胞经历2或3次传代；然而，培养持续时间和细胞产量可能取决于细胞生长速率。

用0.25％胰蛋白酶和EDTA(Invitrogen)分离细胞进行收获或传代。通过台盼蓝排除法评估活力，并使用血细胞计数器手动或使用自动Cellometer.RTM计数系统(NexcelomBioscience,Lawrence Mass)计数。

实施例2.4培养细胞的冷冻保存

扩增的肾细胞进行常规冷冻保存，以适应个体患者细胞生长的固有变异性，并按预先确定的临床时间表提供产品。在需要另一NKA的情况下(如，由于患者生病、不可预见的处理事件等延迟)，冷冻保存的细胞还提供了备用细胞来源。已建立了用于冷冻保存细胞并在解冻后恢复活的有功能的细胞的条件。

为了冷冻保存，将细胞悬浮在冷冻保存溶液(参见实施例2.1)中，终浓度为约50x10⁶个细胞/mL，并分配到小瓶中。将含有约50x10⁶个细胞/mL的1ml小瓶放置于受控速率冷冻机的冷冻室中并以预先设定的速率冷冻。冷冻后，将细胞转移至液氮冷冻机中进行半成品储存。

实施例2.5SRC细胞群的制备

选定的肾细胞(SRC)可根据时间表由已从冷冻保存的细胞生长的最终培养容器中制备，或直接由扩增培养物制备(图7B)。

如果使用冷冻保存的细胞，将细胞解冻并铺在组织培养容器上进行最后的扩增步骤。当最终培养容器达到约50-100％汇合度时，细胞即可进行SRC分离处理。NKA的培养基更换和最终清洗稀释了最终产品中任何残留的冷冻保存液。

一旦最终的细胞培养容器达到至少50％汇合度，将培养容器转移至设置为37℃，5％CO₂环境下2％氧气的低氧培养箱(图7C)，并过夜培养。细胞可在氧气控制设置为2％氧气的培养箱中保持长达48小时。暴露于与生理学更相关的低氧(2％)环境提高细胞分离效率，并能够更好地检测低氧诱导的标志物，如VEGF。

在细胞暴露于低氧条件足够时间后(如，过夜至48小时)，用0.25％胰蛋白酶和EDTA(Invitrogen)分离细胞。通过台盼蓝排除法评估活力，并使用血细胞计数器手动或使用自动

计数系统(Nexcelom Bioscience,Lawrence Mass.)计数。细胞用DPBS清洗一次并在DPBS中重悬至约850x10⁶个细胞/mL。

基于细胞浮力密度，使用密度梯度离心来分离收获的肾细胞群。肾细胞悬液在7％碘克沙醇密度梯度溶液(OptiPrep；OptiMEM中60％(w/v)；参见实施例2.1)中一步分离。

制备7％OptiPrep梯度溶液并在使用前测量指示所需密度的折射率(R.I.1.3456+/-0.0004)。收获的肾细胞在梯度溶液的顶部分层。将密度梯度在离心管或细胞处理器(如，COBE2991)中于室温以800g离心20分钟(不制动)。离心后收集不同团块的显示浮力密度大于约1.045g/mL的细胞级分。将保持浮力密度小于1.045g/mL的细胞排除并丢弃。

将SRC团块重悬于DPBS中(图7C)。通过4次DPBS清洗和1次明胶溶液步骤使最终产品中残留的OptiPrep、FBS、培养基和辅助材料的污染最小化。

Claims (48)

1.治疗患有慢性肾病(CKD)的受试者的肾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含：

(i)生物活性肾细胞群；

(ii)由所述肾细胞群分泌的囊泡；和/或

(iii)包含所述肾细胞群和至少一种非肾细胞群的球状体，

其中所述受试者具有肾脏和/或尿路的异常。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有来自肾脏和尿路的先天性异常(CAKUT)的CKD。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者具有肾脏发育的异常。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或已经患有原发性或继发性膀胱输尿管反流、反流性肾病、肾瘢痕形成或肾发育发育不全不良(hypodysplasia)伴有或不伴有感染和/或炎症。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述受试者易受尿路感染。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述受试者患有高血压或蛋白尿。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者已经具有抗反流后手术。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述受试者具有小于90mL/min/1.73m²的肾小球滤过率(GFR)、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述受试者小于18岁龄。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肾实质畸形。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述受试者具有输尿管重复、肾盂输尿管连接部梗阻、肾不发生、膀胱输尿管反流、肾发育不良、肾发育不全、肾发育不全不良、先天性肾积水、马蹄肾、后尿道瓣膜和梅干腹综合征、阻塞性肾发育不良、或无运动性纤毛病。

12.如权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述CAKUT已经由遗传因素引起或已经与遗传因素相关。

13.如权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述CAKUT已经由非遗传因素引起或已经与非遗传因素相关。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述非遗传因素是环境因素。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述异常包括Alagille综合征、Apert综合征、Bardet-Biedl综合征、Beckwith-Wiedemann综合征、腮-耳-肾综合征(BOR)、短指发育不良、Cenani-Lenz综合征、DiGeorge综合征、Fraser综合征、甲状旁腺功能减退性感音神经性耳聋和肾异常(HDR)、Kallmann综合征、乳腺-尺骨综合征、Meckel Gruber综合征、肾消耗病、Okihiro综合征、Pallister-Hall综合征、肾缺损综合征、发育不全、发育不良、肾发育不良、囊性发育不良、非囊性发育不良、VUR囊性发育不良、肾发育不全、孤立性囊性肾发育不全、孤立性非囊性肾发育不全、孤立性肾小管发生不良、Rubinstein-Taybi综合征、Simpson-Golabi Behmel综合征、Townes-Brock综合征、Zellweger综合征、Smith-Lemli-Opitz综合征、肾积水、骨髓发育不良、单侧/双侧不发生/发育不良、集合系统异常、不发生、肾盂输尿管连接部梗阻(UPJO)不发生、发育不良不发生、单侧不发生、VUR、旋转不良、交叉融合异位、VUR发育不良、丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶(DSTYK)双重突变、与UPJO相关的DSTYK突变、肾小管发生不良、囊肿、和/或不发育。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述受试者患有终末期肾病。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述慢性肾病是第I、II、III、IV或V期肾病。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述受试者每周接受至少1、2或3次透析。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物活性肾细胞群中至少超过80％的细胞表达GGT-1。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述生物活性肾细胞群中4.5％至81.2％的细胞表达GGT-1，所述生物活性肾细胞群中3.0％至53.7％的细胞表达AQP2，以及所述生物活性肾细胞群中81.1％至99.7％的细胞表达CK18。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中与来自肾活检的肾细胞的原代培养物相比，所述生物活性肾细胞群富含肾小管细胞，并且所述小管细胞通过透明质酸合酶-2(HAS-2)的作用在体外和体内均表达更高分子量种类的透明质酸(HA)。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中与来自肾活检的肾细胞的原代培养物相比，所述生物活性肾细胞群具有更小比例的远端肾小管细胞、集合管细胞、内分泌细胞、血管细胞和/或祖细胞样细胞。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述囊泡包含旁分泌因子。

24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述囊泡包含抑制纤溶酶原激活抑制剂-1(PAI-1)和/或TGFβ1的miRNA。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述至少一种非肾细胞群是内皮细胞群或内皮祖细胞群。

26.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述至少一种非肾细胞群是间充质干细胞群。

27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述施用是通过注射至所述受试者的一个或两个肾脏。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含温度敏感性使细胞稳定的生物材料，其(i)在8℃或以下维持基本固态，和(ii)在环境温度或以上维持基本液态，其中所述生物材料包含水凝胶，其中所述生物材料在8℃至环境温度或以上为固体至液体过渡阶段。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述生物活性肾细胞群、所述囊泡和/或所述球状体悬浮并分散在所述使细胞稳定的生物材料中。

30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述水凝胶包含明胶。

31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述生物活性肾细胞群、所述囊泡和/或所述球状体通过18至30号针头注射施用。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述针头具有约27号、约26号、约25号、约24号、约23号、约22号、约21号或约20号的直径。

33.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述治疗肾病包括改善所述受试者的肾功能。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述改善肾功能包括降低所述受试者的白蛋白与肌酐比率(ACR)。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述降低ACR是相对于所述受试者的基线ACR降低至少50％。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述降低ACR是相对于所述受试者的基线ACR降低至少60％。

37.如权利要求34所述的方法，其中所述降低ACR是将ACR降低至30mg/g和300mg/g之间，其中受试者在施用第一剂所述组合物之前包含高于300mg/g的ACR。

38.如权利要求34所述的方法，其中所述降低ACR是将ACR降低至小于30mg/g，其中所述受试者在施用第一剂所述组合物之前包含30mg/g和300mg/g之间的ACR。

39.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述降低ACR在施用第一剂所述组合物后3至6个月内实现。

40.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述降低ACR在施用第一剂所述组合物后2至3个月内实现。

41.如权利要求33所述的方法，其中所述改善肾功能包括增加所述受试者的eGFR。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述增加eGFR在施用第一剂所述组合物后2至4个月内实现。

43.如权利要求41所述的方法，其中所述增加eGFR在施用第一剂所述组合物后2个月内实现。

44.如权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述增加eGFR为高于所述受试者的基线eGFR至少5％。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述增加eGFR为高于所述受试者的基线eGFR至少10％。

46.如权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述肾脏和/或尿路的异常包含后尿道瓣膜。

47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述组合物包含(i)生物活性肾细胞群。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述生物活性肾细胞群的有效量包含3×10⁶个细胞/克所述受试者的估算肾重量。

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