CN114807357A - miR-564或miR-564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产品中的应用 - Google Patents

miR-564或miR-564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种miR‑564或miR‑564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产品中的应用；本发明中miR‑564在动脉夹层患者和健康样本中表达差异显著，进而通过检测所述miR‑564的表达量，能够准确、快捷、简单的实现主动脉夹层的辅助诊断。

Description

miR-564或miR-564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产 品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种miR-564或miR-564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产品中的应用。
背景技术
心血管疾病具有很高的死亡率和发病率，是世界范围内威胁人类健康和生命的主要疾病之一。主动脉夹层(AD)是最复杂的心血管疾病之一，当主动脉内膜撕裂后血液进入中膜导致发病。在AD的发展中，最凶险后果是主动脉完全破裂导致的快速死亡，这减少了对包括心脏在内的其他器官的血液供应。在临床上，AD患者的治疗主要是手术治疗，目的是闭合内膜撕裂，重建假腔造成的血管闭塞区的血流。然而，外科治疗造成的创伤及并发症，不仅会导致继发性损伤，而且不能逆转AD的发生和发展。因此，对AD进行早期发现和早期干预，防止术后复发，对降低其造成的死亡率具有重要意义。然而，目前为止，可用于AD快速诊断和治疗的重要分子靶点尚未确定。因此，迫切需要确定AD 预防和治疗的新目标。
人主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)是血管壁的主要成分之一，在多种心血管疾病的发病机制中起着至关重要的作用。VSMCs的重构是与主动脉扩张相关的早期过程。此外，血管平滑肌细胞功能障碍被认为是导致血管重塑中层变性的最重要因素之一。特别是，在AD进展过程中，VSMCs经历了从收缩(分化) 表型到合成(去分化)表型的转换，表现为增殖和迁移能力增强，分化标志表达减少。此外，AD进展的另一个典型标志是炎症的发生和发展，如巨噬细胞和单核细胞的浸润，或炎症因子表达水平的增加。因此，也有研究报道，包括位于主动脉壁内的炎症和内皮细胞设计的炎症，在AD中起着重要的作用。在此，我们旨在了解血管重构的机制，以寻找新的AD靶点。
MicroRNAs(miRNAs)是一类与下游mRNAs的3’非翻译区(3’UTR)结合并导致其降解的非编码小RNA。新的证据表明，在血管组织中丰富的miRNAs 在包括AD在内的心血管疾病的发生和发展中起着至关重要的调节作用。许多研究表明，AD的miRNA表达异常，Wang等人发现在急性AD组织中 miR-107-5p的表达维持在较高水平。进一步的实验证明miR-107-5p与大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs)24的增殖和凋亡有关。Duan等人报道称，miR-133a 上调有可能挽救急性主动脉夹层(AD)。Wang等人证实miR-134-5P可以募集 STAT5B/ITGB1来调节AD 26。此外，miRNA似乎还通过调节炎症的发展来调节AD的触发和进展。Wang等人通过基因芯片分析和生物信息学研究，证实了大量miRNA在健康和AD患者中的差异表达，其中一些与炎症有关。总之， miRNAs具有在AD诊断和治疗中有希望成为靶点的特性。
目前，已经证明miR-564通过介导癌细胞的增殖、侵袭和死亡在各种癌症中发挥重要作用。然而，miR-564对VSMCs的调控作用尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miR-564或miR-564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产品中的应用，其中，所述miR-564在动脉夹层患者和健康样本中表达差异显著，进而通过检测所述miR-564的表达量，能够准确、快捷、简单的实现主动脉夹层的辅助诊断；此外，所述miR-564的过表达能够抑制VSMCs 的迁移、增殖和表型转化，进而能够实现动脉夹层患者的预防和治疗。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种miR-564或miR-564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产品中的应用。
优选地，所述产品包括试剂盒、药物、生物制剂。
本发明第二方面提供一种用于诊断主动脉夹层的试剂盒，所述试剂盒包括识别所述miR-564的标记物。
优选地，所述标记物为所述miR-564互补的cDNA的结合引物或结合所述 miR-564的生物大分子；
所述生物大分子包括抗体、抗体功能片段、RAN结合蛋白和RAN结合蛋白功能片段。
优选地，所述miR-564互补的cDNA的结合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明第三方面提供一种用于治疗主动脉夹层的药物，所述药物包括所述的miR-564或miR-564表达载体。
本发明第四方面提供一种miR-564或miR-564表达载体在制备抑制VSMCs 迁移、增殖或表型转换产品中的应用。
本发明第五方面提供一种抑制VSMCs迁移、增殖或表型转换产品，所述产品包括所述的miR-564或miR-564表达载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明中miR-564在动脉夹层患者和健康样本中表达差异显著，进而通过检测所述miR-564的表达量，能够准确、快捷、简单的实现主动脉夹层的辅助诊断。
在机制上，本发明miR-564直接与靶基因原癌基因(Ski)和神经颗粒素 (NRGN)相互作用，调节VSMCs的生物学功能；通过动物实验证明miR-564主要通过介导表型转换和炎症反应来缓解AD的进展；因此，本发明miR-564的过表达能够抑制VSMCs的迁移、增殖和表型转化，进而能够实现延缓AD进展，为AD的诊治提供了潜在治疗靶标。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例中miR-564的鉴定和表征结果。
图2为本发明实施例中miR-564抑制剂促进VSMCs迁移、增殖和表型转化的研究结果。
图3为本发明实施例中miR-564模拟物抑制VSMCs的迁移、增殖和表型转化的研究结果。
图4为本发明实施例中MIR-564模拟物抑制PDGF-BB16诱导的VSMCs 迁移、增殖、去分化和病理生理功能的研究结果。
图5为本发明实施例中miR-564抑制剂促进VSMCs迁移、增殖、表型转换过程中的去分化和PDGF-BB诱导的病理生理功能的研究结果。
图6为本发明实施例中miR-564在VSMC中的直接靶点的研究结果；
图7为本发明实施例中小鼠体内miR-564过表达可缓解主动脉夹层的研究结果；
图8为本发明实施例中AD小鼠模型主动脉切片的Masson染色结果；
图9为本发明实施例中各组小鼠基质金属蛋白酶的表达水平；
图10为本发明实施例中动物模型中miR-564在不同细胞中的相对表达及炎症标志物的表达水平；
图11为本发明实施例中LPS诱导的RAW264.7中炎症因子的表达水平。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
本发明实施例提供一种miR-564或miR-564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产品中的应用。
本发明中miR-564在动脉夹层患者和健康样本中表达差异显著，进而通过检测所述miR-564的表达量，能够准确、快捷、简单的实现主动脉夹层的辅助诊断。
在机制上，本发明miR-564直接与靶基因原癌基因(Ski)和神经颗粒素 (NRGN)相互作用，调节VSMCs的生物学功能；通过动物实验证明miR-564主要通过介导表型转换和炎症反应来缓解AD的进展；因此，本发明miR-564的过表达能够抑制VSMCs的迁移、增殖和表型转化，进而能够实现延缓AD进展，为AD的诊治提供了潜在治疗靶标。
在本发明中对上述产品类型不作严格限制，例如，上述产品类型包括但不限于试剂盒、药物和生物制剂。
本发明又一实施例提供一种用于诊断主动脉夹层的试剂盒，该试剂盒包括识别上述miR-564的标记物。
进一步地，上述标记物为miR-564互补的cDNA的结合引物或结合miR-564 的生物大分子；
其中，生物大分子包括抗体、抗体功能片段、RAN结合蛋白和RAN结合蛋白功能片段。
更进一步地，miR-564互补的cDNA的结合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；具体地，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为 AGGCACGGTGTCAGCAGGC。
本发明另一实施例提供一种用于治疗主动脉夹层的药物，该药物包括 miR-564或miR-564表达载体。
在本发明中对miR-564表达载体不作严格限制，只要能够表达miR-564即可，例如，在一实施方式中，miR-564表达载体为miR-564表达质粒。
本发明再一实施例提供一种miR-564或miR-564表达载体在制备抑制 VSMCs迁移、增殖或表型转换产品中的应用。
本发明实施例还提供一种抑制VSMCs迁移、增殖或表型转换产品，所述产品包括所述的miR-564或miR-564表达载体。
以下通过具体的实施例对本发明技术方案作进一步详细说明，但是，应当理解为，这些实施例仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例
1、材料与方法
1.1细胞培养、处理及转染
对本实施例所用细胞进行支原体污染检测。用短串联重复序列(STR)对人主动脉血管平滑肌细胞进行鉴定，并在添加10％胎牛血清(FBS)(Excell Bio，中国上海)和1％青霉素-链霉素液的DMEM s培养液中培养。在37℃、5％二氧化碳的加湿培养箱中培养VSMC。miR-564模拟物、miR-564抑制剂及其阴性对照(NC) 购自中国上海GenePharma。根据说明书，它们被重新溶解在DEPC水中，工作浓度为20μM，并保存在-20℃，用lipo2000转染血管平滑肌细胞。以20ng/mL PDGF-BB诱导实验12h或24h。
1.2细胞增殖分析
VSMCs(2×104个细胞)接种于96孔板中过夜，之后进行细胞增殖分析。按照说明使用CCK-8试剂盒和EDU试剂盒检测细胞增殖，使用酶标仪和荧光显微镜分别测量CCK8的吸光度并获得EDU图像。
1.3划痕实验
细胞接种于6孔板(2×105个细胞)中，在生长培养液中培养过夜。然后，当VSMCs密度达80％时，进行细胞转染。细胞达到100％融合后，对单层细胞进行划痕实验，用PBS冲洗细胞两次。随后，将细胞维持在无血清的培养液中。根据愈合面积来评估细胞迁移。在0h、12h、24h、36h和48h拍照评价细胞的愈合能力，用荧光显微镜对细胞进行成像。采用ImageJ1.5.1软件测量愈合面积。
1.4Transwell实验
细胞(2×105个)接种于12孔板中，转染miRNAs和对照组12h，胰酶消化并转移到无FBS的小室。将这些小室置于含有10％胎牛血清(500μL)的下层小室中培养24h，然后用4％多聚甲醛固定30min。然后，用0.1％结晶紫染色30min，最后用PBS清洗。用ImageJ 1.5.1软件测量迁移细胞的图像。
1.5 RNA提取、逆转录和实时定量聚合酶链式反应
按照说明书，使用Trizol从VSMCs和组织中提取总RNA。接下来，将1 μg的RNA用miRNA 1st strand cDNA synthesis kit或HiScript III 1st Strand cDNA SynthesisKit合成cDNA。定量实时聚合酶链式反应使用Hiff Uncon Power qPCRSYBR Green MasterMix进行。基因表达水平与GAPDH/U6基因表达水平归一化。
1.6采用放射免疫沉淀法
按照说明书使用RIPA缓冲液从血管平滑肌细胞或组织中分离蛋白质。采用BCA蛋白分析试剂测定蛋白质浓度。蛋白质样品(25μg)用12.5％十二烷基硫酸钠-PAGE进行电泳，然后转移到PVDF膜上。每层膜用含5％脱脂牛奶的 Tween20(TBS-T)缓冲液封闭1h，并与抗α-SMA，CNN1，SM-MHC，和β-ctin 的一抗在4℃孵育过夜。在5％的脱脂牛奶中加入相应的二抗孵育1h，用Fusion Solos系统获得印迹图像。
1.7 RNA免疫沉淀(RIP)
VSMCs(1×107细胞)用miR-564模拟物或阴性对照处理。细胞在PBS中洗涤，在含有1％PMSF和1％蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中冰冻10min。收集的 VSMC在4℃、12000转的条件下离心20分钟。然后，裂解上清液在4℃下ago2 或对照IgG然后加入蛋白A/琼脂糖珠(美国德克萨斯州圣克鲁斯)，在4℃下孵育5h。最后提取RNA，用qRT-PCR方法检测目的基因的表达水平。
1.8RNA下拉
细胞(1×107个细胞)在冰冷的PBS中洗涤，在玻璃研磨机中于冰上裂解缓冲液中匀浆30min，然后重悬在裂解缓冲液中，在4℃下旋转裂解30min。离心后保留上清液。然后，用阻断缓冲液处理的琼脂糖珠与探针在4℃下共孵育3h，去除上清液后，用高盐缓冲液和低盐缓冲液洗涤。最后提取RNA，用qRT-PCR 方法检测目的基因的表达。
1.9动物实验
青岛大学动物保护与利用委员会批准了所有动物实验规程(编号：20201215C573320201231021)。雄性C57BL/6小鼠(4周龄)购自北京生命河实验动物科技有限公司。随机分为对照组(n＝11)、重度AD组(n＝11)、agomiR-NC组 (n＝11)和agomiR-564组(n＝11)。对照组每8h腹腔注射生理盐水200μl，重度AD 组、AgomiR-NC组和AgomiR-5 6 4组分别给予血管紧张素II(AngⅡ)(4mg/kg/8h) 和β氨基丙腈(BAPN)(0.33g/kg/2 4h)，连续14d。然后，每隔7天经尾静脉注射一次AgomiR564，共28d(对照组和重度AD组为生理盐水；AgomiR-564组为 0.625mg/kg)。安乐死小鼠，采集主动脉组织，进行后续实验。
1.10荧光原位杂交(FISH)
取动脉进行最佳切割温度(OCT)包埋，获得FISH检测的动脉横断面。简单地说，首先，组织切片在室温下升温，并用4％多聚甲醛固定。然后，先用2 ×生理盐水柠檬酸钠(SSC)洗涤2min，然后在复合消化液中洗涤(8min)，然后是 2×SSC(2min)、甲醛(10min)、70％乙醇(2min)、80％乙醇(2min)，最后是100％乙醇(2min)。按照规程将探针溶解并添加到组织切片中。然后，将动脉置于70℃的水浴中7min，在40℃的水浴中孵育过夜。在免疫荧光方面，首先用抗α-SMA 一抗孵育动脉，然后用二抗孵育切片，同时用DAPI对细胞核进行反染。使用尼康钛-S倒置相差显微镜拍摄图像。
1.11苏木精-伊红(H&E)染色
采用H&E染色试剂盒进行。组织切片用4％多聚甲醛固定。接下来，细胞核和细胞外基质分别被苏木精或曙红染成紫色或粉红色。图像处理采用Image J.
1.12 Masson‘s三色染色
用PBS洗涤组织切片去除OCT包埋，根据说明书使用Masson的三色染色试剂盒(Solarbio，中国，北京)。组织切片脱水固定观察。细胞核和胶原纤维/ 蛋白染色呈蓝色。细胞质、肌肉和红细胞均染成红色。
1.13细胞内ROS的检测
采用ROS检测试剂盒检测细胞内ROS水平，将细胞接种于24孔板中(1× 103个细胞)，待细胞生长至50％融合时再进行转染组。DCFH-DA工作液按生产厂家说明书配制，用于细胞培养。染色的细胞用尼康钛-S倒置相差显微镜拍摄。
1.14临床标本研究
由青岛大学附属医院机构评审委员会批准(编号：QYFYWZLL26404)，所有实验均遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。组织标本来自青岛大学附属医院(青岛)2019年2月至2020年1月。研究参与者对这些标本的使用获得了知情同意。收集的健康和AD样本，排除标准为18岁以下患者、马凡氏综合征、Ehler-Danlos 综合征、Turner综合征、二尖瓣病变、大动脉炎、主动脉溃疡、冠状动脉疾病等结缔组织疾病或其他主动脉病变。健康的主动脉标本来自意外死亡的健康供者，捐赠给可持续发展的研究，为人类医学的发展做出贡献。所有标本均用冷 PBS冲洗，去除血液和血管壁，为后续研究做准备。
1.15统计分析
使用GraphPad Prism Version 8进行统计分析，并以平均值和标准差(SD)表示。组间差异采用非配对t检验和单因素方差分析。每个实验至少进行三次。P 值<0.05被认为具有统计学意义。
2、实验结果
2.1 miR-564的鉴定和表征
用qRT-PCR检测了临床评价中miR-564的表达水平；与健康人相比，AD 患者miR-564的水平大约下调了11倍(p＝0.0158)(图1中A)。同样，FISH结果证实miR-564在AD中有丰富的差异表达(图1中B和图1中C)，其中α-SMA 作为中膜的标记。接下来，研究了miR-564在AngⅡ-BAPN诱导的AD小鼠模型中的表达。结果表明，与对照组小鼠相比，AD组小鼠miR564的表达也显著下调(p＝0.0032)(图1中D)。为了证实这些发现，研究了miR-564在病理性VSMCs中的作用，并观察到在PDGF-BB(20ng/ml)处理下miR-564的表达以时间依赖的方式减少，在24小时达到显著下调(图1中E)。
图1中，A为miR-564在主动脉夹层(AD)组织和正常组织中的相对表达。 (n＝10)，用qRT-PCR进行定量。数据显示为平均值±SD，*p<0.05与CTL。
B和C为用荧光原位杂交(FISH)检测到miR-564在AD和人类正常动脉中的表达，白色箭头表示miR-564的点。比例尺＝5 0 0μm。数据显示为平均值±标准差，*p<0.0 5与CTL，n＝3，生物复制。
D为定量逆转录聚合酶链式反应结果显示，血管紧张素II(AngⅡ)和β氨基丙腈(BAPN)处理14d后，miR564在小鼠动脉中的表达。
E为用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测不同时间点血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)miR-564的相对表达。数据显示为平均值±SD，**p<0.01与CTL，n＝3，生物复制。
综上所述，miR-564通过调节VSMCs功能参与AD的进展。
2.2 miR-564抑制剂调节VSMC迁移和增殖表型转化
研究miR-564对VSMCs增殖和表型转化的影响。首先，敲低miR-564，用于检测基因敲除效率。将敲低的miR-564导入VSMCs，转染效率如图2中A 所示；然后，划痕实验和transwell试验用于评估VSMCs的迁移，结果表明抑制miR-564促进了细胞迁移(图2中B和C)。此外，用于测试细胞增殖能力的 EDU实验结果表明，抑制miR-564对细胞生长具有负面影响(图2中D)。众所周知，VSMC的迁移和增殖很可能与表型转换有关，用α-SMA、Calponin和SM-MHC等表型转换标记验证miR564对表型转换的影响，这些基因的蛋白质表达水平基本上受到抑制(图2中E)。
图2中，A为用miR-564抑制剂下调VSMC中miR-564的表达24小时，用qRT-PCR分析miR-564的相对表达。数据显示为平均值±SD，*p<0.05与 CTL。N＝3，生物复制。
B、C为伤口愈合和Transwell实验测量细胞在miR-564抑制剂转染24小时后的迁移。数据显示平均值±SD，与CTL相比，*p<0.05。N＝3，生物复制。
D为EDU染色结果，转染miR-564抑制剂24h后，VSMCs细胞增殖，Scale Bar＝200μm，数据显示平均值±SD，与CTL比较P<0.0 5。N＝3，生物复制。
E为用miR-564抑制剂转染VSMCs 48h后，Western blotting分析VSMCs 表型转换标志物的蛋白表达水平。数据显示，与CTL相比，均值±SD，*p<0.05， **p<0.01，**p<0.001。N＝3，生物复制。
以上结果表明：miR-564基因敲除通过促进VSMC的迁移和增殖而加速表型转换。
2.3过表达miR-564抑制VSMCs的迁移和增殖表型转化
为了进一步研究miR-564在VSMC中的生物学作用，有必要使用miR-564 模拟物过表达miR-564，过表达miR-564并将其导入VSMCs，以提高miR-564 的水平(图3中A)。随后，对VSMCs的迁移进行了研究，观察到miR-564水平的升高显著降低了VSMCs的迁移(图3中B和C)。此外，确定miR-564是否也参与VSMCs的增殖。结果证实，在miR-564过表达后，VSMCs的增殖发生了显著变化(图3中D)。特别是，与NC相比，miR-564模拟物显著增加了收缩标志物的蛋白表达水平(图3中E)。
A为用miR-564模拟物在VSMC中过表达miR-564 24小时，用qRT-PCR 分析miR-564的相对表达。数据显示为平均值±SD，*p<0.05与CTL。N＝3，生物复制。
B和C为将miR-564模拟转染细胞24小时后，通过伤口愈合和transwell 实验检测miR-564对细胞迁移能力的影响，数据显示与CTL相比，均值±SD， P<0.05。N＝3，生物复制。
D为用EDU染色检测miR-564对VSMC增殖的调节作用，Scale Bar＝2 0 0 μm，均值±SD，P<0.0 5。N＝3，生物复制。
E为Western blotting分析转染miR-564模拟细胞24h后VSMCs表型转换标志物的蛋白表达水平。数据显示，与CTL相比，均值±SD，*p<0.05，**p<0.01。 N＝3，生物复制。
结果表明：miR-564在保护VSMCs功能方面起重要作用，并且可以抑制与 AD进展密切相关的VSMCs迁移、增殖表型转化和ROS的产生。
2.4体外细胞病理分析
VSMCs对血管壁损伤或某些生长因子刺激的反应通常由分化表型转变为去分化表型。PDGF-BB在创伤后由血小板释放，在刺激细胞生长和促进VSMCs 的增殖、迁移和去分化方面发挥重要作用。验证miR-564是否参与PDGF-BB 诱导的VSMC信号转导的调控。观察到PDGF-BB处理显著降低了miR-564的表达(图4中E)。同时，用miR-564模拟物处理可减轻PDGF-BB对VSMCs迁移、增殖、表型转换和病理生理功能的影响(图4中A-D)。
图4中，A、B为MIR-564模拟物抑制PDGF-BB诱导的VSMCs迁移、增殖、去分化和病理生理功能创伤愈合实验和Transwell实验检测PDGF-BB(20 ng/mL)处理后VSMCs的迁移能力。数据显示为平均值±SD，*p<0.05与CTL； **p<0.01与CTL。N＝3，生物复制。
C为用EDU染色分析法检测PDGF-BB(20ng/mLPDGF-BB)作用24h对 MIR-564细胞增殖能力的影响，比例尺＝200μm，均值±SD，与CTL比较， P<0.05；N＝3，生物复制。
D为Western blotting分析，经PDGF-BB(20ng/mL)处理24h后，VSMCs 的表型转换标志物水平发生了变化，平均值±SD与CTL比较，*P<0.05；与 CTL相比，**P<0.01，***P<0.001。N＝3，生物复制。
与miR-564模拟物相比，miR-564抑制剂导致了相反的结果(图5中A-D)。
图5中，A、B为miR-564抑制剂促进VSMCs迁移、增殖、表型转换过程中的去分化和PDGF-BB诱导的病理生理功能和经20ng/mL PDGF-BB处理后不同组别的创伤愈合试验和Transwell分析图。数据显示为平均值±SD，*p<0.05 与CTL；**p<0.01与CTL。N＝3，生物复制。
C为EDU染色分析法检测PDGF-BB(20ng/mL)作用24小时对miR-564细胞增殖能力的影响。标尺＝200μm。数据显示为平均值±SD，*p<0.05，**p<0.01。 N＝3，生物复制。
D为Western blotting检测转染miR-564抑制剂与PDGF-BB(20ng/mL)作用 24h后VSMCs表型转换标志物的蛋白表达水平。
综上所述，miR-564对PDGF-BB诱导的VSMCs的病理功能具有正向调节作用。
2.5鉴定miR-564在VSMC中的直接靶点
为进一步探讨miR-564对AD的抑制作用，通过生物信息学分析确定 miR-564的靶点，以了解其调控机制。TargetScan和miRDB算法预测有几个基因可能是miR-564的直接靶标(图6中A)。众所周知，miRNA与其信使核糖核酸靶标结合可通过与精氨酸2(Ago2)形成络合物而导致翻译抑制或RNA降解。因此，为了验证这一预测，制备了一种使用Ago2抗体的RIP检测方法，并验证了这种相互作用，同时应用IgG作为阴性对照。如图6中B所示，SKI、CNBP和NRGN三个靶点都富含在AGO复合体中，表明它们是VSMC中miR-564的潜在靶点。接下来，进一步探索miR-564是否与这三种蛋白的表达调控有关，发现miR-564可以显著抑制SKI和NRGN的表达，而CNBP的表达没有明显变化(图6中C)。结果表明miR-564可能与SKI和NRGN的mRNAs结合并影响VSMC的功能。鉴于NRGN和SKI的重要作用。设计并合成了小干扰 RNA(SiRNA)介导的SKI和NRGN来击倒。Transwell和Edu实验检测VSMCs 的迁移和增殖，表明si-NRGN和si-SKI抑制细胞迁移和增殖，这与miR-564 的作用一致，进一步证明了miR564对NRGN和SKI的调节作用(图6中D-G)。同时发生的，用α-SMA、Calponin和SM-MHC等细胞表型转换标志物来验证 NRGN和SKI对VSMC表型转换的影响，结果表明，转染组α-SMA、Calponin 和SM-MHC表达增强，而miR-564抑制剂的作用相反，miR564模拟物增强了这一作用(图6中H和I)。
图6中，A为TargetScan和miRDB算法用于预测miR564的直接靶点。
B为RNA免疫沉淀法显示miR-564与SKI/CCHC型锌指核酸结合蛋白 (CNBP)/NRGN的相互作用，使用Ago2抗体，以IgG抗体为阴性对照；随后进行qRT-PCR。数据显示为平均值±SD，*p<0.05与CTL；ns，与CTL无显著差异。N＝3，生物复制。
C为用qRT-PCR方法检测miR-564模拟物转染VSMC 24h后 SKI/CNBP/NRGN基因的表达水平。数据显示为平均值±SD，*p<0.05与CTL； **p<0.01与CTL。N＝3，生物复制。
D-G为转染si-NRGN/si-SKI和miR-564 24h后的Transwell实验和EDU染色的代表性图像，Scale bar＝200μm，n＝3，生物复制。
H和I为Western blotting分析转染si-NRGN/si-ski和miR-564 24h后VSMCs 表型转换标志的蛋白表达水平。n＝3，生物复制。
2.6miR-564在体内抑制AD的进展
为了进一步验证miR-564在血管内皮细胞表型转化和体内AD中的作用，建立了AngⅡ-BAPN诱导的AD小鼠模型(过程见图7中A)。由于AD的死亡率极高，首先检查了小鼠的存活率。通过上调agomiR-564(图7中B)，AD小鼠的存活率显著提高。接下来，检测了各组小鼠主动脉血管的HE染色(图7中 C)，与模型组和agomiR-NC组相比，agomiR-564治疗组小鼠明显的AD症状明显减轻。重要的是，agomiR-564过表达的受损动脉表现出明显的内中膜厚度减少和血管损伤，miR-564的表达显著增加(图7中D-F)，经agomiR-564治疗的小鼠，AD引起的胶原纤维断裂和血管损伤明显逆转；鉴于miR-564在体外表型转化中的关键作用，在AD模型小鼠中检测了这些细胞功能，一致地，在 AD模型小鼠和agomiR-NC小鼠中，表型转换标记蛋白显著下调，而这种影响被尾静脉注射agomiR-564逆转(图7中G)。此外，在AD模型中，经miR-564 处理后，潜在的下游靶点NRGN和SKⅠ也受到抑制(图7中H和I)。AD小鼠模型主动脉切片的Masson染色结果如图8所示，由图8可知，agomiR-564过表达组胶原蛋白显著增加。同时，基质金属蛋白酶的表达水平也发生了显著变化(如图9所示)，agomiR-564过表达组能够显著降低MMP-9和MMP-2的表达。
图7中，A为AD小鼠模型的诱导和系统治疗。
B为注射血管紧张素II(AngⅡ)(4mg/kg/8h)和β-氨基丙腈 (BAPN)(0.33g/kg/24h)或生理盐水(200μL)的小鼠存活(生理盐水对照组11只， AngⅡ-BAPN组11只，AngⅡ-BAPN-agomiR-NC组11只，AngⅡ -BAPNagomiR-564组11只)。每天都要评估变量。数据显示平均值±SD， **p<0.01与CTL；ns，与CTL不显著；##p<0.01与模型组。
C为建立AD模型后的小鼠主动脉和大体特征图像，以及14d以上采集的主动脉。
D为AD-22模式下的主动脉内径。数据显示均值±标准差，***p<0.001，与模型组比较####p<0.0001，ns，与agomiR NC比较无显著差异。N＝5，生物复制。
E为小鼠主动脉血管HE染色图；
F为定量逆转录聚合酶链式反应分析AD模型建立后14d内主动脉 miR-564的表达水平。数据显示：平均值±SD，**p<0.01vs ctl；###p<0.001vs 模型组；ns，与agomiR NC相比无显著差异。
G为蛋白印迹定量分析结果显示，agomiR-564显著增加了收缩标志物的水平。
H、I为AD模型中NRGN和SKI的mRNA表达水平。数据显示平均值± SD，**p<0.01与CTL；#p<0.05与模型组；ns，与agomiR NC相比无显著意义。 N＝3，生物复制。
由于炎症被认为是AD调节的重要途径，因此也观察到miR-564在巨噬细胞中的高表达(图10中A)。动物实验进一步证实，miR564的调节还包括对炎症因子如单核细胞趋化蛋白-1、白介素1β和肿瘤坏死因子-α的调节(下调)和对凋亡因子如p53的调节(上调)(图10中B-E)。免疫荧光法检测炎症细胞在体内的表达，发现CD11b在病变组织中的表达显著增加，表明主动脉夹层发生时炎症水平显著增加(图10中F)。此外，还检测了LPS诱导的RAW264.7中炎症因子的表达，在RAW264.7中转染miR-564模拟物(miR-564mimic)后，使用 qRT-PCR检测MCP-1、IL-1β和TNF-α的相对表达(图11)，miR-564显著抑制了巨噬细胞炎症的增加；这些结果有力地表明miR-564通过抑制VSMCs的生物学作用而有助于抑制AD的进展，可被认为是治疗AD的潜在靶点。
图10中，A为miR-564在不同细胞中的表达水平。**与CTL相比，P<0.01。 N＝3，生物复制。
B-D为炎症因子(单核细胞趋化蛋白-1、白介素1-β、肿瘤坏死因子-α)和凋亡因子(P53)的表达水平。数据显示为平均值±SD，*p<0.05与CTL；**p<0.01 与CTL；ns，与CTL不显著。N＝3，生物复制。
F为免疫荧光法检测CD11b的表达。Scale Bar＝500μm。
上述实验仅仅是本申请发明人实验的一部分，但其足以证明：
本发明中miR-564在动脉夹层患者和健康样本中表达差异显著，进而通过检测所述miR-564的表达量，能够准确、快捷、简单的实现主动脉夹层的辅助诊断。
在机制上，本发明miR-564直接与靶基因原癌基因(Ski)和神经颗粒素 (NRGN)相互作用，调节VSMCs的生物学功能；通过动物实验证明miR-564主要通过介导表型转换和炎症反应来缓解AD的进展；因此，本发明miR-564的过表达能够抑制VSMCs的迁移、增殖和表型转化，进而能够实现延缓AD进展，为AD的诊治提供了潜在治疗靶标。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
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Claims (9)

1.miR-564或miR-564表达载体在制备诊断/治疗主动脉夹层产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、药物、生物制剂。
3.一种用于诊断主动脉夹层的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括识别权利要求1所述miR-564的标记物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物为所述miR-564互补的cDNA的结合引物或结合所述miR-564的生物大分子；
所述生物大分子包括抗体、抗体功能片段、RAN结合蛋白和RAN结合蛋白功能片段。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述miR-564互补的cDNA的结合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.一种用于治疗主动脉夹层的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的miR-564或miR-564表达载体。
7.miR-564或miR-564表达载体在制备抑制VSMCs迁移、增殖或表型转换产品中的应用。
8.一种抑制VSMCs迁移、增殖或表型转换产品，其特征在于，包括权利要求7所述的miR-564或miR-564表达载体。
9.miR-564或miR-564表达载体在制备抑制炎症的药物中的应用。
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