CN106636440A - 血浆microRNAs用于制备筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂的用途 - Google Patents

血浆microRNAs用于制备筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了血浆microRNAs用于制备筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂的用途，由如下microRNAs组成：miR‑224‑3p、miR‑146a‑5p、miR‑564、miR‑615‑5p、miR‑601；miR‑224‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR‑146a‑5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR‑564的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；miR‑615‑5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；miR‑601的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明提供的血浆microRNAs标记物可以准确用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者，灵敏度高，特异性强，实现男性群体中肺腺癌患者的无介入诊断。

Description

血浆microRNAs用于制备筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的 诊断试剂的用途
技术领域
本发明属于临床诊断领域，涉及肺腺癌筛查诊断试剂，具体涉及血浆microRNAs用于制备筛查诊断肺腺癌患者的诊断试剂的用途。
背景技术
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势，年平均增长近2％。肺癌根据病理学特点的不同分为多种组织类型，肺癌组织类型不同，其治疗措施也不同。根据2004版WHO分类，常见肺癌组织病理学分型分为非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。非小细胞癌又分为鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大细胞癌(LCC)。不同肺癌临床治疗方案不同，预后效果也不同。因此，为了提高治疗效果，肺癌的治疗策略已经从传统的以分期为基础的治疗模式转变为以组织学类型和基因突变为指导的个体化、精准的多学科治疗模式。个体化治疗提高了肺癌的治疗和预后效果。
腺癌作为最常见的肺癌组织学类型，在全球及我国发病率均呈上升趋势。流行病学研究结果显示，非小细胞肺癌的发病有明显的性别差异，尤其是腺癌。腺癌占原发肺癌的50％，是非吸烟患者的主要组织学类型。目前在肺癌研究最深入、临床应用最多的是针对表皮生长因子受体EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂，而易瑞沙、吉非替尼和厄洛替尼是其主要的代表。随着对这类小分子靶向治疗药物研究的深入，逐渐发现其疗效与肺癌患者的临床特征相关，其中亚裔、女性、腺癌、不吸烟是其临床“优势人群”的主要特征(杨新杰等，盐酸埃克替尼一线治疗晚期肺腺癌的临床疗效观察，中国肺癌杂志2013年7月；马智勇等，易瑞沙治疗男性、不吸烟或轻度吸烟的晚期肺腺癌患者疗效研究，医药论坛杂志2010年11月)。
这些结果让研究者得出一个推测：腺癌在男性和女性中的发病率、发病机制和临床治疗效果均存在差异。为了适应个性化治疗，腺癌的研究有必要分性别开展。
复旦大学附属中山医院黄威博士在毕业论文“三种病理亚型肺癌组织中肿瘤标记物的发现、验证及其靶基因的初步筛选”中详细研究了用于肺癌诊断的microRNAs标记物。首先，作者应用激光捕获显微切割技术从44例正常肺组织、36例腺癌、30例鳞癌及16例小细胞癌中获取纯的上皮细胞和肿瘤细胞，进行全基因组microRNAs表达分析，经过方差分析和聚类分析发现16个差异表达的microRNAs可以区分三种肺癌病理亚型(肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌)，并最终确定其中的7个作为候选标记物进行进一步验证；然后，作者在三种病理亚型肺癌组织中验证7个候选microRNAs肿瘤标记物，建立诊断肺癌病理亚型的回归模型，并且分析7个候选microRNAs的预后价值，结果发现：单个候选microRNA鉴别正常肺组织与肺腺癌的AUC值不理想，经过Logistic回归分析建立模型发现hsa-miR-375和hsa-miR-34a两个相互配合可以得到最佳AUC 0.910，敏感性80％，特异性97％，敏感度较低。也就是说，经过作者的研究，无论是单个microRNA还是多个microRNAs的联合均不能有效诊断区分正常肺组织与肺腺癌，准确度和敏感度不尽如人意。而且，该方法是一种基于组织中标志物的方法，需要取患者的肺组织用于检测，依然是一种介入诊断方法，不方便。
申请人认为，上述博士论文未能筛选出有效诊断区分正常肺组织与肺腺癌的microRNAs的关键原因在于忽视了肺腺癌的性别差异，样本分类错误，自然无法得出理想结果。
发明内容
本发明的目的在于提供血浆microRNAs用于制备筛查诊断肺腺癌患者的诊断试剂的用途；具体地，为提高筛查的准确度、敏感度和特异性，根据性别差异，提供一组血浆microRNAs标记物用于制备筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂，提供另外一组血浆microRNAs标记物用于制备筛查诊断女性群体中肺腺癌患者的诊断试剂。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的技术方案如下：
一组用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的血浆microRNAs标记物，由如下microRNAs组成：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601；miR-224-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR-146a-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR-564的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；miR-615-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；miR-601的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
一组筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的microRNAs引物、探针的组合，microRNAs引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物：miR-224-3p的反转录引物序列如SEQ ID NO.9所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.17所示，定量PCR后引物序列如SEQ IDNO.25所示；miR-146a-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.18所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-564的反转录引物序列如SEQ ID NO.11所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.19所示，定量PCR后引物序列如SEQID NO.25所示；miR-615-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.20所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-601的反转录引物序列如SEQ ID NO.13所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.21所示，定量PCR后引物序列如SEQID NO.25所示；各microRNAs探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
一种用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂，含有上述microRNAs引物、探针的组合。
一种用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂盒，含有上述microRNAs引物、探针的组合。
进一步地，所述的诊断试剂盒还含有PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及标准品和/或对照品。
筛查诊断女性群体中肺腺癌患者的技术方案如下：
一组用于筛查诊断女性群体中肺腺癌患者的血浆microRNAs标记物，由如下microRNAs组成：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p；miR-224-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR-146a-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR-648的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；miR-523-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；miR-758-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
一组筛查诊断女性群体中肺腺癌患者的microRNAs引物、探针的组合，microRNAs引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物：miR-224-3p的反转录引物序列如SEQ ID NO.9所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.17所示，定量PCR后引物序列如SEQ IDNO.25所示；miR-146a-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.18所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-648的反转录引物序列如SEQ ID NO.14所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.22所示，定量PCR后引物序列如SEQID NO.25所示；miR-523-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO.15所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.23所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-758-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO.16所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.24所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；各microRNAs探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
一种用于筛查诊断女性群体中肺腺癌患者的诊断试剂，含有上述microRNAs引物、探针的组合。
一种用于筛查诊断女性群体中肺腺癌患者的诊断试剂盒，含有上述microRNAs引物、探针的组合。
进一步地，所述的诊断试剂盒还含有PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及标准品和/或对照品。
本发明的有益效果：
本发明提供的一组血浆microRNAs标记物可以准确用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者，灵敏度高，特异性强，实现男性群体中肺腺癌患者的无介入诊断；本发明提供的另一组血浆microRNAs标记物可以准确用于筛查诊断女性群体中肺腺癌患者，灵敏度高，特异性强，实现女性群体中肺腺癌患者的无介入诊断。
附图说明
图1为5个microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)联合诊断区分男性病例组和男性健康对照组的ROC曲线图；
图2为5个microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)联合诊断区分女性病例组和女性健康对照组的ROC曲线图；
图3为验证集中用5个microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)联合诊断区分男性病例组和男性健康对照组的准确性图；
图4为验证集中用5个microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)联合诊断区分女性病例组和女性健康对照组的准确性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。
肺腺癌患者和健康志愿者自2014年9月至2015年9月期间于南京军区南京总医院和南京鼓楼医院收集，取血经患者同意并通过南京军区南京总医院和南京鼓楼医院伦理委员会审批。男性病例组由96名原发性肺腺癌男性患者组成，女性病例组由82名原发性肺腺癌女性患者组成，取血之前均未进行手术、化疗、放疗或内分泌治疗。男性健康对照组和女性健康对照组分别由58例男性健康志愿者和54例女性健康志愿者组成。样本年龄均在25-60岁之间，男性病例组与男性健康对照组以及女性病例组与女性健康对照组之间年龄均无统计学差异(P值分别为0.072和0.068)。所有患者和健康志愿者均经过组织病理确证。将男性病例组、女性病例组、男性健康对照组、女性健康对照组随机对半分成测试集和验证集。测试集用于血浆差异microRNAs的发现，并初步用于评价差异microRNAs作为标记物筛查男性群体中肺腺癌患者和筛查女性群体中肺腺癌患者的诊断效能；验证集用于进一步验证microRNAs标记物的诊断准确性。样本分组情况如下表：
实施例1：基于microRNA芯片的血浆差异microRNA发现及定量确证
一、实验材料
1、仪器试剂
高速离心机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计购自德国Eppendorf公司；NanoDrop 1000分光光度计购自美国赛默飞世尔Thermo Scientific公司；Agilent2100Bioanalyzer System购自美国Agilent公司；普通PCR反应仪和实时荧光PCR仪购自美国PE公司；DYCP-31B型电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；BIO-RAD凝胶成像分析购自美国伯乐；超低温冰箱购自海尔集团。mirvanaTMparisTMkit购自美国Ambion公司；AgilentRNA 6000Pico Kit购自美国Agilent公司；Trizol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan Universal PCR Master Mix、cDNA合成试剂盒购自美国赛默飞世尔Thermo Scientific公司；引物、探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。未特别强调的仪器和试剂均为本领域技术人员常规使用的仪器和试剂，且易于获得。
2、实验样品
早晨空腹抽取测试集肺腺癌患者和健康志愿者外周血2mL，放入EDTA管内，轻轻混匀，使血与管内抗凝物质充分接触，防止血细胞破裂。将EDTA管放入4℃冰箱，在2小时内分离血浆。首先，820g转速离心10分钟，将上层液相小心吸出，避免吸取中间白色细胞层。将上层液相转入事先预冷的1.5mL离心管，16000g转速继续离心10分钟，以便进一步分离血浆和血细胞。将第二步离心以后得到的血浆，以500μL体积分装，转入-80℃冰箱长期保存。
其他材料包括常规试剂、常规仪器等均为本领域技术人员熟知并易于获取的材料。相关试剂的配制按照产品说明书操作，或者按本领域技术人员熟知的常规方法配制即可。
二、实验方法
1、血浆总RNA的提取
mirvanaTMparisTMkit用于抽提血浆总RNA，NanoDrop 1000分光光度计测定总RNA浓度。对RNA质量的评价通过Agilent RNA 6000Pico Kit由Agilent 2100BioanalyzerSystem来完成。方法均参照各自说明书。用RNA完整指数(RIN)衡量总RNA的质量，该值从1到10分别反应样本的质量。RIN≥7-10表示质量好，RIN≥5表示质量中等，RIN＜5表示质量差。本实验中，以RIN＞5作为抽提总RNA合格的标准。
2、全基因组microRNA分析
microRNA芯片检测以及结果分析由上海生物芯片有限公司完成。microRNA芯片包含723个人microRNAs和76个人病毒microRNAs探针，microRNA数据来自Sanger v.10.1数据库。每一张芯片包含八个上样位点。总RNA(100ng)通过Cy3标记，芯片通过XDR Scan(PMT100，PMT5)扫描芯片上的信号。标记和杂交过程按照Agilent microRNA芯片系统说明书操作。芯片图像信息通过软件转换为强度值，消除背景嘈杂信号以后，信号强度值直接输入到软件进行分析。在对样本的检测过程中，发现hsa-miR-1228在血浆中稳定表达，故选用hsa-miR-1228作为内参，将杂交得到的原始信号进行标准化，得到以2为底数的log值。如果一个样本在芯片上重复检测的数值，其变异系数大于15％或者阳性信号值不到5％，认为该样本质量不合格，在下一步试验中将被排除。可以检测到的microRNA定义为在超过50％的样本中，芯片都能检测到阳性信号。
3、实时荧光定量PCR
具体参照试剂盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqManMicroRNA Assay、TaqMan Universal PCR Master Mix的说明书，每个样品上样量为100ng，反应步骤如下：
100ng RNA标本加入每个RT反应试管中，Nuclease-free water补足体积；加入各反应成分后稍作离心混匀，在PCR反应仪执行如下程序：
16℃30min→42℃30min→85℃5min→4℃保存。
参照TaqMan MicroRNA Assay说明书在实时荧光定量PCR仪上进行，体系和条件如下：
加入各反应成分并充分混匀后稍作离心，每个孔10μL，每个样本做三个复孔。在荧光定量PCR仪上执行如下程序：
总共40个循环。60℃时进行荧光数据采集，吸收波长为490nm，释放波长为530nm。Cp值由SDS软件经过二次衍生法计算得到。
4、数据统计分析
以芯片检测结果中最稳定的hsa-miR-1228作为内参对照，利用Agilent FeatureExtraction软件进行数据定量分析。芯片的图像信息通过Scanner Control Rev.7.0软件转换为密度值。信号经背景消除后直接导入GeneSpring GX10软件进行标准化。以重复试验获得的平均标准化数据比较研究分析。Benjamini-Hochberg校对的非配对t检验(p≤0.01)。利用hierarchical clustering algorithm软件进行聚类分析，筛选出男性肺腺癌与男性健康对照、女性肺腺癌与女性健康对照中具有显著性差异的血浆microRNAs。
实时荧光PCR数据采用与芯片相同的内参标准化，非配对t检验确定组间差异。p＜0.05设为统计学差异。F检验和T检验分析通过荧光实时定量PCR检测得到的microRNAs表达值之间的显著性差异，通过SPSS软件分析实现，p＜0.05认为有统计学意义，均为双侧。
未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。
三、实验结果
microRNA芯片检测结果发现，与男性健康对照组相比，男性病例组出现大量上调或下调表达的microRNAs，部分microRNAs差异表达非常明显；与女性健康对照组相比，女性病例组出现大量上调或下调表达的microRNAs，部分microRNAs差异表达非常明显。
由于microRNA芯片对microRNA表达特征的研究是间接的，在分析过程中仍存在特异性和敏感度不高等缺点。因此，所得结果有一定的假阳性，需要辅助其他更为准确的表达研究方法加以验证，本实验利用荧光实时定量RT-PCR来进行鉴定。
结果有13个血浆差异microRNA得到荧光实时定量RT-PCR的确认，表达水平如下：
上表中，斜线代表变换变化不明显。得到上述血浆差异microRNA后，进行下一步实验，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价单个血浆差异microRNA及其联合用于诊断区分男性肺腺癌与男性健康对照、女性肺腺癌与女性健康对照的诊断效能。其中，由于miR-205、miR-206和miR-155-5p的p值大于0.05，不列入下一步实验考察。
实施例2：ROC曲线评价血浆差异microRNA的诊断效能
ROC曲线评价法的原理：
诊断试验的基本评价指标有敏感度、特异性等，综合评价指标有Youden指数、ROC、AUC等。对于诊断试验的评价，首先应该知道受试者的真实类别，即哪些属于健康组，哪些属于疾病组。划分健康组和疾病组的标准就是金标准(如本申请中公认的组织病理诊断法)。对于按金标准确定的疾病组和健康组，采用诊断试验检测的结果可以分为如下情况：
阳性(True Positive,TP)；诊断试验检测为阳性(与金标准结果一致)；
阴性(True Negative,TN)；诊断试验检测为阴性(与金标准结果一致)；
假阳性(False Positive,FP)：诊断试验检测为阳性(与金标准结果不一致)；
假阴性(False Negative,FN)：诊断试验检测为阴性(与金标准结果不一致)。
可以用下表表示：
诊断试验的敏感度＝A/(A+C)；诊断试验的特异性＝D/(B+D)。通过敏感度和特异性可以得出诊断试验相对于金标准的诊断灵敏程度和特异程度。敏感度高代表将疾病例诊断为阴性的个数少，漏诊率低；特异性高代表将健康例诊断为阳性的个数少，误诊率低。
ROC曲线正是基于上述敏感度和特异性绘制出的曲线。以诊断试验中可能的诊断界值作为诊断点，根据上述表格计算出相应的敏感度和特异性。然后，以敏感度为纵坐标，1-特异性为横坐标，将各诊断点时各点的敏感度和特异性点在坐标图中标出，连接坐标点得到平滑曲线，该曲线即为ROC曲线。诊断点设置的越多越密，得到的ROC曲线就越平滑。
ROC曲线是以每一个检测结果作为可能的诊断界值，其曲线下面积AUC的大小表明了诊断试验准确度的大小。ROC曲线下面积AUC(ROCAUC)作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，完全无价值的诊断试验AUC为0.5，理想的诊断试验AUC为1，而一般认为对于一个诊断试验，ROC AUC在0.5～0.7之间时诊断价值较低，在0.7～0.9之间时诊断价值中等，在0.9以上时诊断价值较高。
1、单个血浆差异microRNA用于诊断区分疾病组和对照组时，ROC曲线的绘制方法
将测试集所有样本中上述13个血浆差异microRNA的含量经内参标准化后，得到标准化值，以各可能的标准化值作为诊断点，按照上述方法绘制ROC曲线。
13个血浆差异microRNA单独诊断区分男性病例组VS.男性健康对照组、女性病例组VS.女性健康对照组的ROC曲线下面积AUC及最佳cut-off值处敏感度和特异性如下表所示：
上述结果表明，通过microRNA芯片并经实时荧光定量RT-PCR确证的10个血浆差异microRNAs单独用于诊断区分男性肺腺癌和男性健康对照或女性肺腺癌和女性健康对照的诊断效能较低，AUC在0.5～0.7之间，诊断价值较低。
2、多个血浆差异microRNAs联合用于诊断区分疾病组和对照组时ROC曲线绘制方法
将测试集所有样本中上述7个(男性和女性各有7个)血浆差异microRNA的含量经内参标准化后，得到标准化值，将男性肺腺癌样本作为组别1，男性健康志愿者样本作为组别2(或女性肺腺癌样本作为组别1，女性健康志愿者样本作为组别2)，对上述7个血浆差异microRNAs中任意多个血浆差异microRNAs在两组样本中的标准化值进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程。然后，将各样本中该任意多个血浆差异microRNAs的标准化值代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值，以可能的回归值作为诊断点，按照上述方法绘制ROC曲线。该ROC曲线即为该任意多个血浆差异microRNAs联合诊断时的诊断曲线，曲线下面积AUC及最佳cut-off值处敏感度和特异性可体现该任意多个血浆差异microRNAs的联合诊断效能。
结果表明：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601这5个血浆差异microRNAs联合用于诊断区分男性病例组VS.男性健康对照组时的诊断效能最高，且最佳cut-off值处敏感度和特异性高；miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p这5个血浆差异microRNAs联合用于诊断区分女性病例组VS.女性健康对照组时的诊断效能最高，且最佳cut-off值处敏感度和特异性高。结果如下表和图1和图2：
申请人进一步评价了诊断区分男性病例组和男性健康对照组的5个联合差异microRNAs对女性病例组和女性健康对照组的诊断效能，ROC曲线下面积AUC仅为0.586；申请人还进一步评价了诊断区分女性病例组和女性健康对照组的5个联合差异microRNAs对男性病例组和男性健康对照组的诊断效能，ROC曲线下面积AUC仅为0.614。该结果也进一步证明，肺腺癌具有明显的性别差异，这可能与不同性别肺腺癌的发病机理不同有关，体内代谢网络也存在明显差异，在进行诊断时应该区别对待，不同性别采用不同诊断指标才能获得高准确率。
实施例3：在验证集中进一步验证血浆差异microRNAs联合诊断的准确性
一、实验材料
同实施例1。
二、实验方法和结果
1、血浆总RNA的提取和实时荧光定量PCR的方法同实施例1。
2、在验证集中，基于上述二元逻辑回归方程将验证集男性肺腺癌和男性健康志愿者样本中的5个血浆差异microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)含量的标准化值作二元逻辑回归变换，计算出男性样本中的该5个血浆差异microRNAs含量的逻辑回归值。低于最佳cut-off值0.568的预测为男性健康志愿者，高于最佳cut-off值0.568的预测为男性肺腺癌，最后计算出以该5个代谢标志物水平预测男性肺腺癌和男性健康志愿者分组的准确率。结果如图3，基于5个血浆差异microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601)验证集样本中的预测准确率为98.7％，仅将1例男性健康志愿者误诊为肺腺癌患者，准确率非常高。
3、在验证集中，基于上述二元逻辑回归方程将验证集女性肺腺癌和女性健康志愿者样本中的5个血浆差异microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)含量的标准化值作二元逻辑回归变换，计算出女性样本中的该5个血浆差异microRNAs含量的逻辑回归值。低于最佳cut-off值0.604的预测为女性健康志愿者，高于最佳cut-off值0.604的预测为女性肺腺癌，最后计算出以该5个代谢标志物水平预测女性肺腺癌和女性健康志愿者分组的准确率。结果如图4，基于5个血浆差异microRNAs(miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p)验证集样本中的预测准确率为98.5％，仅将1例女性健康志愿者误诊为肺腺癌患者，准确率非常高。
实施例4：诊断试剂和诊断试剂盒的制备
上述实施例表明，miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601联合诊断区分男性肺腺癌和男性健康志愿者的准确度高，敏感度和特异性强，可基于miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601制作用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂或诊断试剂盒。该诊断试剂或诊断试剂盒中包括miR-224-3p引物、探针；miR-146a-5p引物、探针；miR-564引物、探针；miR-615-5p引物、探针；miR-601引物、探针。引物具体包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。当然，诊断试剂盒还含有PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及标准品和/或对照品。引物和探针的设计是本领域常规技术手段，下表为引物和探针的一种设计，也可以设计成其他序列。
上述实施例表明，miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p联合诊断区分女性肺腺癌和女性健康志愿者的准确度高，敏感度和特异性强，可基于miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-648、miR-523-5p、miR-758-5p制作用于筛查诊断女性群体中肺腺癌患者的诊断试剂或诊断试剂盒。该诊断试剂或诊断试剂盒中包括miR-224-3p引物、探针；miR-146a-5p引物、探针；miR-648引物、探针；miR-523-5p引物、探针；miR-758-5p引物、探针。引物具体包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。当然，诊断试剂盒还含有PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及标准品和/或对照品。引物和探针的设计是本领域常规技术手段，下表为引物和探针的一种设计，也可以设计成其他序列。
本发明提供的一组血浆microRNAs标记物可以准确用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者，灵敏度高，特异性强，实现男性群体中肺腺癌患者的无介入诊断；本发明提供的另一组血浆microRNAs标记物可以准确用于筛查诊断女性群体中肺腺癌患者，灵敏度高，特异性强，实现女性群体中肺腺癌患者的无介入诊断。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京九寿堂医药科技有限公司
<120> 血浆microRNAs用于制备筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂的用途
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<213> 人工序列
<400> 26
cgtatcca 8

Claims (5)

1.一组用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的血浆microRNAs标记物，其特征在于，由如下microRNAs组成：miR-224-3p、miR-146a-5p、miR-564、miR-615-5p、miR-601；miR-224-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR-146a-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR-564的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；miR-615-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；miR-601的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一组筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的microRNAs引物、探针的组合，microRNAs引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物，其特征在于：miR-224-3p的反转录引物序列如SEQ ID NO.9所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.17所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-146a-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.18所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-564的反转录引物序列如SEQ ID NO.11所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.19所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-615-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.20所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；miR-601的反转录引物序列如SEQ ID NO.13所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.21所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示；各microRNAs探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
3.一种用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂，其特征在于：含有权利要求2所述的microRNAs引物、探针的组合。
4.一种用于筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂盒，其特征在于：含有权利要求2所述的microRNAs引物、探针的组合。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于：还含有PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶等，以及标准品和/或对照品。
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