CN102839179A - 一种鉴别肺癌亚型的microRNA标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴别肺癌亚型的microRNA，所述的microRNA选自：a）序列如SEQ ID No.n所示的microRNA，其中n为2，3，4或7；或b）与SEQ ID No.n所示序列互补的microRNA。本发明还提供了上述microRNA的用途和基于上述microRNA的试剂盒。本发明另提供了由上述microRNA组成的集、该集的用途和基于该集的试剂盒。其优点在于：上述microRNA可构成两个组合：SEQ ID No.2和SEQ ID No.7、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，可分别用于鉴别诊断小细胞肺癌与非小细胞肺癌、肺腺癌与肺鳞癌，且诊断速度快、成本低、结果准确可靠，为肺癌患者进行准确的靶向治疗提供了重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及肺癌亚型的诊断，具体地说，涉及鉴别肺癌亚型的microRNA标志物及该microRNA的应用。
背景技术
肺癌已成为目前世界上病死率第一位的恶性肿瘤，2011年世界卫生组织最新资料显示，2008年全球约有160万肺癌新患者，约有140万肺癌患者死亡。在肺癌患者中，小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）约占15%，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80%，NSCLC主要包括腺癌（adenocarcinoma lung cancer，AC）及鳞癌（squamous cell lung cancer，SQ）两大类型。肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一，即便早期（pIa-pIb）肺癌经手术及放化疗治疗后的5年复发率仍然高达40%，而大部分患者（约75%）就诊时已处于中晚期，已失去了外科手术及多学科根治的最佳时机，极易复发及远处转移，I-IV期患者总体5年生存率仅约10%。造成这种状况的主要原因是缺乏有效的肺癌早期诊断及早期治疗的方法。
肺癌治疗已进入个体化时代，不同亚型、不同分期的肺癌治疗方案不同。SCLC早期即发生血行转移，首选治疗方案为全身化疗联合放疗，而非手术切除。根治性手术是SQ及AC的首选治疗方法，辅助以放化疗。分子靶向治疗被认为是特异性最高的肺癌个体化治疗手段，如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）络氨酸激酶抑制剂仅对EGFR突变的肺腺癌患者有效，SQ对培美曲赛治疗效果不如AC，用贝伐单抗治疗可引起致命的大出血。因此，准确的肺癌病理分型对肺癌患者靶向治疗方案的选择至关重要，研究肺癌肿瘤标志物，并准确的对肺癌进行分子分型，进而正确指导靶向治疗显得尤为迫切，并将会带来巨大的社会效益及经济效益。
microRNA（miRNA）是一类小的内源性非编码RNA分子，大小为20-25个核苷酸（nt），这些小的microRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。它们大约在10年前被发现，已被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中发挥重要作用（Bartel, D.P. (2004) Cell 116, 281-297, Ambros, V. (2004) Nature 431, 350-355；He, L. et al. (2004) Nat Rev Genet 5, 522-531）。microRNA比mRNA在作为肿瘤生物标志物方面具有更大的优势，因为它们在体外非常稳定（Lu, J. et al., (2005) Nature 435, 834-838; Lim, L.P. et al., (2005) Nature 433, 769-773）。
microRNA是从初级转录物（pri-microRNA）产生的，pri-microRNA被RNase III Drosha加工为含茎-环结构的前体microRNA（pre-microRNA）。接着，在Dicer（一种RNase III）的作用下，发夹状的pre-microRNA在细胞质中进一步被切割产生成熟的microRNA，这些成熟的microRNA与其他蛋白质一起组成microRNA-蛋白质复合体（miRNP）。microRNA引导miRNP到达它们的靶mRNA，在此它们发挥各自的功能（参见综述例如Bartel, D.P. (2004) Cell 23, 281-292；He, L. and Hannon, G.J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5, 522-531）。
根据microRNA与其靶mRNA之间的互补性程度，microRNA可以指导不同的调节过程。那些与microRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰（RNAi）相同的机制被特异降解。因此，在这种情况下，microRNA是担当小干扰RNA（siRNA）的角色；与microRNA互补性较低的靶mRNA被引导进入细胞降解途径，或者在蛋白质翻译上平上被阻遏而mRNA水平不受影响。
高通量microRNA定量技术如microRNA微阵列，是以实时定量PCR为基础的microRNA检测，为研究癌症基因组中microRNA的表达谱提供了有力的工具。可获得的现有数据表明microRNA表达失调可能与某种癌症的发生和/或发展相关。例如，研究表明hsa-miR-15及hsa-miR-16-1均定位在慢性淋巴性白血病（CLL）中缺失的遗传基因座上，在大约70%的CLL患者中，这两种microRNA基因缺失或下调。另外，在结肠癌中has-miR-143及has-miR-145表达下调；而microRNA let-7 的表达在肺癌中经常降低（Michael, M.Z. et al. (2003) Mol Cancer Res 1, 882-891; Mayr, C. et al. (2007) Science 315, 1576-1579）。事实上，常见癌症经常存在相关microRNA表达改变，而且microRNA通常定位于与癌症相关的基因组区域，因此可以推测microRNA可能发挥着抑癌基因和癌基因的双重作用（Esquela-Kerscher, A. and Slack, F.J (2006) Nat Rev Cancer 6, 259-269；Calin, G.A. and Croce, C.M. (2007) J Clin Invest 117, 2059-2066；Blenkiron, C. and Miska, E.A. (2007) Hum Mol Genet 16, R106-R113）。已证实的microRNA在人类癌症中的异常表达更突出了它们作为诊断和预后生物标志物的潜在应用价值。
近年来对肺癌组织的研究表明，在肺癌中约有70个microRNA表达异常。但上述前人的结果都是从未经纯化肺癌组织的混合细胞中获得的，其杂交信号可以来自肺癌细胞，也可以来自肺癌组织中的炎症细胞、间质细胞甚至正常肺组织细胞，而这些非目的细胞的比例在不同肺癌组织中可以存在很大的差异，从而造成了结果的不可靠。王漱阳和朱虹光等人发现，整块肿瘤组织的microRNA表达谱与被显微切割下来的纯净癌细胞有所不同。因此，只有从纯净的靶细胞中检测得到的microRNA表达，才能正确反映特异性细胞在体内的表达情况，并可能成为可靠的肿瘤标志物和治疗靶点。而目前从肺癌组织中分离纯净的靶细胞获得的能够准确诊断肺癌亚型的microRNA报道较少。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种鉴别肺癌亚型的microRNA。
本发明的再一的目的是，提供一种上述microRNA的用途。
本发明的另一的目的是，提供一种基于上述microRNA的鉴别肺癌亚型的试剂盒。
本发明的第四个目的是，提供一种鉴别肺癌亚型的microRNA集。
本发明的第五个目的是，提供一种上述microRNA集的用途。
本发明的第六个目的是，提供一种基于上述microRNA集的鉴别肺癌亚型的试剂盒。
本发明的第七个目的是，提供一种鉴别肺癌亚型的microRNA芯片。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种鉴别肺癌亚型的microRNA，所述的microRNA选自：
a）序列如SEQ ID No.n所示的microRNA，其中n为2，3，4或7；或
b）与SEQ ID No.n所示序列互补的microRNA。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的鉴别肺癌亚型的microRNA在制备鉴别肺癌亚型的试剂中的用途。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种鉴别肺癌亚型的试剂盒，所述的试剂盒中含有如上所述的鉴别肺癌亚型的microRNA。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种鉴别肺癌亚型的microRNA集，所述的集至少包含下列中的一种：
a）包含序列如SEQ ID No.3所示的microRNA和序列如SEQ ID No.4所示的microRNA的集；
b）包含序列如SEQ ID No.2所示的microRNA和序列如SEQ ID No.7所示的microRNA的集。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的鉴别肺癌亚型的microRNA集在制备鉴别肺癌亚型的试剂中的用途。
为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：
一种鉴别肺癌亚型的试剂盒，所述的试剂盒中含有如上所述的鉴别肺癌亚型的microRNA集。
为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是：
一种鉴别肺癌亚型的microRNA芯片，所述的microRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性的对应于SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.7所示的部分或全部序列。
本发明优点在于：
1、提供了可用于鉴别诊断肺癌亚型的四种microRNA，该四种microRNA可构成两个组合：SEQ ID No.2和SEQ ID No.7、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，可分别用于鉴别诊断小细胞肺癌与非小细胞肺癌、腺癌与鳞癌；
2、四种microRNA是从采用激光捕获显微分离系统从鳞癌、腺癌及小细胞癌组织中分离纯净的癌细胞，运用Agilent芯片技术进行全基因组microRNA差异表达分析筛选获得的，能更加准确地反应不同亚型肺癌细胞中的microRNA的表达谱，更加准确地显示肺癌的microRNA分子表型。且该四种microRNA经独立验证，证实其诊断小细胞肺癌与非小细胞肺癌、腺癌与鳞癌结果准确可靠，有利于快速、准确、低成本的鉴别诊断肺癌亚型以对患者进行准确的靶向治疗，可制备成诊断芯片或试剂盒，具有广阔的应用前景。
附图说明
附图1是石蜡包埋手术切除肺组织的ROC曲线分析。A：手术训练样本中microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC的AUC估算；B：手术训练样本中microRNA组合B鉴别SQ与AC的AUC估算。
附图2是石蜡包埋手术切除肺组织的ROC曲线分析。A：手术确认样本中microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC的AUC估算；B：手术确认样本中microRNA组合B鉴别SQ与AC的AUC估算。
附图3是支气管活检样本的ROC曲线分析。A：支气管活检样本中microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC的AUC估算；B：支气管活检样本中microRNA组合B鉴别SQ与AC的AUC估算。
附图4是支气管刷检样本的ROC曲线分析。A：支气管刷检样本中microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC的AUC估算；B：支气管刷检样本中microRNA组合B鉴别SQ与AC的AUC估算。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1 microRNA的筛选获取和独立验证
总体实验方案如下：
通过收集2008年8月至2011年12月间中山医院586例肺癌组织或脱落细胞样本，每例均由两名有经验的肺癌病理学家审核，586份样本被分配至五组之一，其中各组病例独立不重叠。
1. 发现组：采用激光捕获显微分离技术从82例（36例AC、30例SQ与16例SCLC）独立冷冻组织中提取癌细胞作微阵列研究，得到用于肺癌分型的候选microRNA，并进一步经定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）证实其价值。
2. 训练组：人工分离85份石蜡包埋的肺部组织（29例AC、24例SQ 与 32例SCLC）以确保癌细胞 > 75%。85份手术训练样本经定量RT-PCR后根据Logistic回归模型分别构建SCLC与NSCLC和SQ与AC鉴别诊断的microRNA组合。
3. 验证组：人工分离68份石蜡包埋的肺部组织（24例AC、21例SQ与23例SCLC）以确保癌细胞 > 75%。68份手术确认样本经RT-PCR证实microRNA组合的诊断价值。
4. 应用组A：从疑似肺癌病人与接受纤维支气管镜检查的病人中获取支气管活检样本144例（48例AC、48例SQ 与48例SCLC）。支气管镜活检诊断结果均由两位经验丰富病理学家审核。定量RT-PCR用以证实两个microRNA组合的诊断价值。
5. 应用组B：从疑似肺癌病人与接受纤维支气管镜检查的病人中获取支气管刷检样本207份（85例AC、69例SQ与53例SCLC）。显微镜检测癌细胞后排除未发现癌细胞的纤维支气管镜病人。为确保准确性与公正性，肺癌分型由上海肿瘤医院与中山医院两位细胞病理学家进行，两人分别有十年以上细胞学诊断经历。肿瘤分型经纤维支气管镜活检样本或手术样本的组织学诊断确认。定量RT-PCR用以证实两个microRNA组合的诊断价值。
具体实验方法及结果如下：
一、发现组：获取用于肺癌分型的候选microRNA
1 实验方法
1.1 Agilent芯片实验
1.1.1 样品RNA的放大和标记
提取癌细胞总RNA，总RNA采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒，Low Input Quick Amp Labeling Kit，One-Color（Cat#5190-2305, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US）和标准操作流程对样品总RNA中的mRNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit（Cat#74106, QIAGEN, GmBH, Germany）纯化标记后的cRNA。
1.2.2 芯片杂交
按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，Gene Expression Hybridization Kit（Cat#5188-5242, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US），在滚动杂交炉（Hybridization Oven, Cat#G2545A, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US）中65℃，10rpm，滚动杂交17小时，杂交cRNA上样量600ng，并在洗缸（staining dishes, Cat#121, Thermo Shandon, Waltham, MA, US）中洗片，洗片所用的试剂为 Gene Expression Wash Buffer Kit（Cat#5188-5327, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US）。
1.1.3 芯片扫描
完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner（Cat#G2565CA，Agilent technologies, Santa Clara, CA, US）进行扫描，软件设置Dye channel: Green, Scan resolution=3μm, 20bit。用Feature Extraction software 10.7（Agilent technologies, Santa Clara, CA, US）读取数据，最后采用Gene Spring Software 11.0（Agilent technologies, Santa Clara, CA, US）进行归一化处理，所用的算法为Quantile。
1.1.4 芯片信号的检测与分析
上述微阵列的统计学分析采用分类器PAM（Prediction Analysis of Microarray，可参见文献Tibshirani R et al (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:6567-6572）和分类器WEKA（Waikato Environment for Knowledge Analysis，可参见文献Frank E et al (2004) Bioinformatics 20:2479-2481）以选取子集及构建分类模型。候选microRNA的统计学分析采用Unpaired Unequal Variance t-test with Benjamini-Hochberg Correction 以分析是否存在可鉴别SCLC与NSCLC和SQ与AC的microRNA差异性表达，得到用于肺癌分型的microRNA。
1.2 定量RT-PCR反应验证
1.2.1 RNA提取和纯化
采用TRIZOL Reagent（Cat#15596-018, Life technologies, Carlsbad, CA, US），并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的总RNA抽提，抽提所得总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent technologies, Santa Clara, CA, US）电泳质检后使用RNeasy mini kit（Cat#74106, QIAGEN, GmBH, Germany）和 RNase-Free DNase Set（Cat#79254, QIAGEN, GmBH, Germany），纯化总RNA。
1.2.2 内参基因及引物
内参基因选用小RNA U47，U47和7个候选microRNA（has-miR-25、has-miR-205、has-miR-375、has-miR-29a、has-miR-29b、has-miR-27a、has-miR-34a）的基因的引物均向ABI公司订做购买成品。引物序列如下：
1.2.3 逆转录反应
参照Taqman microRNA RT反应试剂盒说明书，每个样本用100ng RNA上样，反应步骤、体系、条件如下：
①准备逆转录预混液：
②轻柔混合；
③热循环参数值：
1.2.4 实时PCR扩增反应
参照Taqman MicroRNA assays（ABI）反应试剂盒说明书在Roche-Light Cycling 480实时荧光定量PCR仪上进行，反应步骤、体系、条件如下：
① 准备实时定量PCR预混液：
其中每个实时定量PCR反应和对照做三个重复（10μl/反应）；
②轻柔混合；
③热循环参数值：
1.2.5 荧光数据采集
60℃时进行荧光数据采集，吸收波长：490nm；释放波长：530nm。Cp值由LC480软件经过二次衍生法计算而得。注意加入各反应成分后需要充分混匀并稍作离心。每个标本的每个基因重复检测三次。用未配对t检验对microRNA在正常肺组织及不同亚型肺癌中的表达进行差异性分析。
1.2.6 统计学分析
定量RT-PCR的统计学分析以delta Ct（ΔCt）值代表各microRNA表达水平；获取ΔCt需减去内源性对照U47的循环阈值（Ct）。训练期数据与Ct值的逐步Logistic回归模型被用于诊断性microRNA组合之构建。MedCalc（10.4.7.0）软件被用于受试者工作特征（ROC）曲线的绘画及回归分析。作为准确性指标，ROC曲线下面积（AUC）用于评估被选microRNA的诊断价值。另外，McNemar's Chi-squared test被用于分析细胞学与microRNA组合间是否存在显著性差异。所有P值均采用双侧检验数值。
2 实验结果
对比PAM分类器及WEKA分类器发现7个两者共有（也即重叠）的microRNA：has-miR-205，has-miR-25，has-miR-27a，has-miR-29a，has-miR-29b，has-miR-34a和has-miR-375（见表1）；十折交叉验证结果提示重叠的microRNA鉴别SCLC、AC与SQ的平衡预测准确率达90.8%（见表2）。
表1 7个候选microRNA的核苷酸序列及PAM、WEKA预测分析肺AC、SQ及SCLC结果
表2 十折交叉验证候选microRNA鉴别SCLC、AC与SQ的平衡预测准确率
根据肺癌分型的临床标准，以ROC评估重叠的microRNA分类鉴别SCLC与NSCLC和SQ与AC的效果见表3。对比SCLC与NSCLC病例发现SCLC样本中has-miR-205、has-miR-27a、has-miR-29a、has-miR-29b与has-miR-34a呈低表达；经AUC检测上述microRNA的诊断准确性分别为0.762、0.976、0.864、0.873与0.988。SCLC样本中has-miR-25与has-miR-375呈高表达；经AUC检测上述microRNA的诊断准确性分别为0.823与0.978。对比SQ与AC病例发现SQ样本中has-miR-29a、has-miR-29b、has-miR-34a与has-miR-375呈低表达；其相应AUC值分别为0.896、0.894、0.791与0.941。SQ样本中has-miR-205、has-miR-25与has-miR-27a呈高表达；其相应AUC值为0.917、0.931与0.786。综合讨论，以上结果提示重叠之microRNA为最佳候选者，经定量RT-PCR检测可进一步证实其意义。
表3 ROC评估重叠的microRNA分类鉴别SCLC与NSCLC和SQ与AC的效果
二、训练组：使用石蜡包埋手术组织构建microRNA组合
1 实验方法
激光显微切割分离85例石蜡包埋的肺癌组织（29例AC、24例SQ 与 32 例SCLC）以确保癌细胞 > 75%。抽提组织RNA，进行定量RT-PCR后根据Logistic回归模型分别构建SCLC/NSCLC和SQ/AC鉴别诊断的microRNA组合。其中，定量RT-PCR具体操作同发现组。
2 实验结果
上述发现组得到的7个候选microRNA首先参与85份石蜡包埋手术组织（训练数据组）的独立队列研究。经定量RT-PCR检测发现其实验结果与微阵列结果相似（见表4）。
为鉴别SCLC与NSCLC，由7个候选microRNA开始对训练数据进行逐步Logistic回归分析，生成logit模型A = -3.6303+2.5935*( has-miR-29a)-0.9431*( has-miR-375)；其相应AUC值为0.991，平衡准确率达95.6%（见图1A）。同样，为鉴别SQ与AC，经逐步Logistic回归分析生成logit模型B = 2.8974+1.0175*( has-miR-34a)-1.1748*( has-miR-205)；其相应AUC值为96.0%（见图1B）。
表4 7个候选microRNA在石蜡包埋手术组织中的诊断准确性
三、验证组
1 实验方法
激光显微切割分离68例石蜡包埋的肺癌组织（24例AC、21例SQ及23例SCLC）以确保癌细胞 > 75%。抽提组织RNA，进行定量RT-PCR证实两个microRNA组合的诊断价值。其中，定量RT-PCR具体操作同发现组。
2 实验结果
经68份石蜡包埋手术组织（验证数据组）的独立队列研究进一步确认训练数据组生成的microRNA组合A（has-miR-29a / has-miR-375）与B（has-miR-34a / has-miR-205）。采用microRNA组合A对验证组的SCLC与NSCLC病例加以鉴别，得平衡准确率94.4%和AUC值0.982（见图2A）。同样，采用microRNA组合B对验证组的SQ与AC病例加以鉴别，得平衡准确率94.4%和AUC值0.982（见图2B）。结果证实上述两个microRNA组合能分别用于手术样本中SCLC与NSCLC和SQ与AC的高准确性诊断。
四、应用组A：支气管活检样本中应用microRNA组合
1 实验方法
已确认的两个microRNA组合A和B、4个microRNA（has-miR-205、has-miR-29a、has-miR-34a与has-miR-375）被应用于144例支气管活检组织样本。定量RT-PCR具体方法同发现组。
2 实验结果
经144份石蜡包埋支气管活检组织的独立队列研究进一步确认microRNA组合A（has-miR-29a/ has-miR-375）与B（has-miR-34a/ has-miR-205）。采用microRNA组合A对应用组A的SCLC与NSCLC病例加以鉴别，得平衡准确率97.5%和AUC值0.991（见图3A）。同样，采用microRNA组合B对应用组A的SQ与AC病例加以鉴别，得平衡准确率98%和AUC值0.988（见图3B）。结果证实上述microRNA组合A和B能分别用于手术样本中SCLC与NSCLC和SQ与AC的高准确性诊断。
五、应用组B：支气管刷检脱落细胞样本或超声内镜引导针吸活检（E-BUS）脱落细胞样本中应用microRNA组合
1 实验方法
已确认的A与B两组microRNA（miR-205、miR-29a、miR-34a与miR-375）被应用于207份支气管刷检样本，该样本来自细胞学诊断为肺癌的病人。联合纤维支气管镜活检组织或手术样本共诊断SCLC 53例、SQ 69例和AC 85例。定量RT-PCR具体方法同发现组。
2 实验结果
支气管刷检脱落细胞样本中应用microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC得平衡准确率86.5%和AUC值0.947（见图4A）。同样，支气管刷检样本中应用microRNA组合B鉴别SQ与AC得平衡准确率90.0%和AUC值0.962（见图4B）。结果表示上述microRNA组合可应用于支气管刷检、超声内镜引导针吸活检（E-BUS）脱落细胞样本并能高度准确地鉴别SCLC与NSCLC和SQ与AC。
综合上述结果显示microRNA组合A及B可应用于石蜡包埋手术切除肺癌组织、支气管活检肺癌组织、支气管刷检脱落细胞样本及超声内镜引导针吸活检（E-BUS）脱落细胞样本，并能高度准确地鉴别SCLC与NSCLC和SQ与AC。
实施例2 microRNA 组合A和组合B的临床应用
支气管刷检细胞样本肺癌分型由上海肿瘤医院与中山医院两位细胞病理学家进行，将细胞分型与microRNA组合分型诊断准确率做直接的比较。结果见表5，从表中可以看出，microRNA组合A（has-miR-29a和has-miR-375）与细胞学诊断相比虽未能提高NSCLC诊断却能促进SCLC诊断；同时，microRNA组合B（has-miR-205和has-miR-34a）可更有效鉴别AC与SQ。联合使用细胞学与microRNA组合进行检测能大大提高肺癌亚型的诊断，减少细胞学未能确诊的病人，有助解决刷检细胞学未能准确诊断肺癌亚型的难题。结合细胞学与microRNA组合进行检测使刷检得以取代活检，因而免去了危重病人与肿瘤未能切除的病人不必要的有创操作。
表5 细胞学诊断与microRNA组合诊断的比较
注：表中，a：微小RNA组合+细胞病理学家1；b：微小RNA组合+细胞病理学家2；c：微小RNA组合与细胞病理学家1的对比；d：微小RNA组合与细胞病理学家2的对比；e：联合诊断 1与细胞病理学家1的对比；f：联合诊断 2与细胞病理学家2的对比。
实施例3 microRNA芯片的制备
将表1提供的microRNA（SEQ ID No.2、3、4、7）转换成互补序列，根据产生序列的GC比对特征在序列两端加上10-20nt的连接序列；核心序列不同，连接序列也不同。连接序列可以由程序随机产生，连接序列和核心序列形成的探针满足以下条件：
1）探针序列中，同一种核苷酸（A、C、G、T）的数量不能超过序列总数的50%；
2）任何连续的A、T或C、G的数量不能超过序列总数的50%；
3）G、C含量占序列总数的40%-60%；
4）探针序列不能自杂交，即探针序列中互补片段的长度不能超过探针长度的30%。
为使合成的探针稳定的结合在玻片上，采用常规的方法在合成后探针的5’端进行糖基修饰。
芯片的点制：先将玻片的表面进行烷基化修饰，以提高结合能力。采用常规的芯片点样方法进行点样，为了检测杂交试验的可重复性，每个探针在玻片上点3-6个杂交点。
芯片制备所采用的固相载体还可以使用尼龙膜、经活性基团修饰的硅片、塑料片等。
实施例4 试剂盒的制备
将实施例3制备的芯片封装好，与使用说明书一起置于一盒中，构成试剂盒。所述的试剂盒还可以包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所述的各种试剂，如：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 一种鉴别肺癌亚型的microRNA标志物及其应用
<130> /
<160> 23
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
cauugcacuu gucucggucu ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
uccuucauuc caccggaguc ug 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
cauugcacuu gucucggucu ga 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
guaacgugaa cagagccaga cu 22
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
uccuucauuc caccggacuc ug 22
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
aggaaguaag guggccugag ac 22
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
uuuuucguuc ggcucgcgug a 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
aaaaagcaag ccgagcgcac u 21
<210> 14
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
<210> 15
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
aucgugguag acuuuagcca au 22
<210> 16
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 16
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 17
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 17
aucgugguaa acuuuaguca caa 23
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 18
uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 19
aagagucacc gauucaaggc g 21
<210> 20
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 20
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 21
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 21
accgucacag aaucgaccaa ca 22
<210> 22
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 22
uaaugauucu gccaaaugaa auauaagaua ucacugugua aaaccguucc auuuugauuc 60
ugaggu 66
<210> 23
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 23
auuacuaaga cgguuuacuu uauauucuau agugacacau uuuggcaagg uaaaacuaag 60
acucca
Claims (7)
1.一种鉴别肺癌亚型的microRNA，其特征在于，所述的microRNA选自：
a）序列如SEQ ID No.n所示的microRNA，其中n为2，3，4或7；或
b）与SEQ ID No.n所示序列互补的microRNA。
2.权利要求1所述的microRNA在制备鉴别肺癌亚型的试剂中的用途。
3.一种鉴别肺癌亚型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求1所述的microRNA。
4.一种鉴别肺癌亚型的microRNA集，其特征在于，所述的集至少包含下列中的一种：
a）包含序列如SEQ ID No.3所示的microRNA和序列如SEQ ID No.4所示的microRNA的集；
b）包含序列如SEQ ID No.2所示的microRNA和序列如SEQ ID No.7所示的microRNA的集。
5.权利要求4所述的microRNA集在制备鉴别肺癌亚型的试剂中的用途。
6.一种鉴别肺癌亚型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求4所述的microRNA集。
7.一种鉴别肺癌亚型的microRNA芯片，其特征在于，所述的microRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性的对应于SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.7所示的部分或全部序列。
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