CN102776185B - 由血浆microRNA组合成的肝癌诊断标志物及一种诊断肝癌的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由血浆microRNA组合成的肝癌诊断标志物，含有该标志物的试剂盒，以及一种诊断肝癌(特别是早期肝癌)的新方法。所述的肝癌诊断标志物由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，优选由编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801和hsa-miR-1228的核酸分子组成。所述的试剂盒可用于诊断肝细胞癌，尤其是早期肝细胞癌，或者区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个健康个体的血浆、至少一个慢性乙肝患者的血浆或者至少一个肝硬化患者的血浆。

Description

由血浆microRNA组合成的肝癌诊断标志物及一种诊断肝癌的新方法

技术领域

本发明涉及一种由血浆microRNA组合成的肝癌诊断标志物及一种诊断肝癌(特别是早期肝癌)的新方法，所述的血浆microRNA包含hsa-miR-122，hsa-miR-192，hsa-miR-21，hsa-miR-223，hsa-miR-26a，hsa-miR-27a以及hsa-miR-801。

背景技术

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内最常见的实体恶性肿瘤之一。其代表了肝癌的主要组织学类型，可能占所有肝癌病例的70％-85％。世界每年会出现大约600000个新病例，和几乎相同数目的死亡病例，这反映出对这种疾病缺乏有效的早期诊断和治疗(Thorgeirsson，S.S.and Grisham，J.W.(2002)Nat Genet 31，339-346；Jemal A et al.(2011)CA Cancer J Clin 61：69-90.；Bosch F.X.et al(2004)Gastroenterology 127，S5-S16；Perz J.F.et al.(2006)J Hepatol 45，529-538)。

肝细胞癌是一类预后很差的癌症。此种疾病患者的预后取决于疾病分期。HCC患者未经手术治疗，5年生存率为＜5％，手术后生存率为60％-70％。肿瘤尺寸＜2cm且采用外科手术切除的患者的5年生存率能够达到86％。但是，没有经过任何治疗的早期癌症患者(肿瘤尺寸＜5cm)的3年生存率仅为17-21％。这证明了早期癌症检测对于治疗以及提高患者生存率都是非常重要的。(Tang，Z.Y.(2001)World J Gastroenterol 7，445-454；Chambers，A.F.et al.(2002)Nat Rev Cancer 2，563-572；Motola-Kuba D.et al.(2006)Annalsof Hepatology 5，16-24)。

一个明确的肝癌诊断经常以组织学确认为基础。组织可以通过针穿刺或活检来取样。一些肝癌分化良好，这意味着它们几乎完全由生长的、成熟的肝细胞组成。因此，这些癌症在显微镜下看起来非常类似于非肝癌组织。此外，并非所有的病理学家都能够识别分化良好的肝癌和正常肝组织的细微差别。一些病理学家会把肝癌误认为肝腺癌。腺癌是一种不同类型的癌症，它从肝外起源。转移性腺癌和原发性肝癌治疗方法不同，因此，需要早期检测以区分这些不同类型的肿瘤，指导HCC患者的治疗，以改善患者长期生存率。

肝穿刺或活检的最常见风险是出血，因为肝癌是含血管非常丰富的肿瘤。在许多情况下，可能没有必要进行组织活检或穿刺。如果患者具有发生肝癌的危险因素(例如，肝硬化，慢性乙型肝炎，或慢性丙型肝炎)，血浆中α-甲胎蛋白(AFP)的水平显著升高，并且有相符合的影像学诊断，医生几乎可以不通过活检就能确定病人患有肝癌。目前，AFP是唯一的用于早期诊断肝癌的血清标志物(Mizejewski，G.J.(2003)Expert RevAnticancer Ther 2，709-735；Paul，S.B.et al.(2007)Oncology 72，Suppl.1，117-123)。然而，这种单一的标志物灵敏度低，且经常出现假阳性结果，例如在大量的肝硬化患者中，AFP也会升高。此外，血清AFP仅能检测出60％的肝癌患者。因此，发现早期诊断HCC的新的分子标志物以及开发灵敏的检测方法具有重要意义。

巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期(Llovet，J.M.(2003)Lancet 362，1907-1917)是最近几年出现的，用于HCC患者的临床分期。BCLC分期将肿瘤的发展阶段与推荐的治疗策略联系起来，并定义了每个肿瘤分期的护理标准(Llovet，J.M.(2008)J Natl CancerInst 100，698-711)。极早期HCC患者(0期)最适合做手术切除。早期HCC患者(A期)最适合做放疗(肝肿瘤切除、肝移植或局部消融)。中期HCC患者(B期)适合做肝动脉化学栓塞(TACE)。而中晚期HCC患者(C期)可用索拉菲尼治疗。终末期(D期)患者可接受对症治疗。

microRNA(miRNA)是一类小的内源性非编码RNA分子，大小为20-25个核苷酸(nt)，这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。它们大约在10年前被发现，已被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中发挥重要作用(Bartel，D.P.(2004)Cell 116，281-297，Ambros，V.(2004)Nature 431，350-355；He，L.et al.(2004)Nat Rev Genet 5，522-531)。miRNA比mRNA在作为肿瘤生物标志物方面具有更大的优势，因为它们在体外非常稳定(Lu，J.et al.，(2005)Nature435，834-838；Lim，L.P.et al.，(2005)Nature 433，769-773)。

miRNA是从初级转录物(pri-miRNA)产生的，pri-miRNA被RNase III Drosha加工为含茎-环结构的前体miRNA(pre-miRNA)。接着，在Dicer(一种RNase III)的作用下，发夹状的pre-miRNA在细胞质中进一步被切割产生成熟的miRNA，这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成miRNA-蛋白质复合体(miRNP)。miRNA引导miRNP到达它们的靶mRNA，在此它们发挥各自的功能(综述参见例如Bartel，D.P.(2004)Cell 23，281-292；He，L.andHannon，G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5，522-531)。

根据miRNA与其靶mRNA之间的互补性程度，miRNA可以指导不同的调节过程。那些与miRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异降解。因此，在这种情况下，miRNA是担当小干扰RNA(siRNA)的角色；与miRNA互补性较低的靶mRNA被引导进入细胞降解途径，或者在蛋白质翻译上平上被阻遏而mRNA水平不受影响。但是，目前miRNA抑制其靶mRNA翻译的机制尚有争议。

高通量microRNA定量技术(如microRNA微阵列)，是以实时定量PCR为基础的microRNA检测，为研究癌症基因组中microRNA表达谱提供了有力的工具。可获得的现有数据表明miRNA表达失调可能与某种癌症的发生和/或发展相关。例如，研究表明hsa-miR-15及hsa-miR-16-1均定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遗传基因座上，在大约70％的CLL患者中，这两种microRNA基因缺失或下调。另外，在结肠癌中has-miR-143及has-miR-145表达下调；而miRNA let-7的表达在肺癌中经常降低(Michael，M.Z.et al.(2003)MolCancer Res 1，882-891；Mayr，C.et al.(2007)Science 315，1576-1579)。事实上，常见癌症经常存在相关microRNA表达改变，而且microRNA通常定位于与癌症相关的基因组区域，因此可以推测miRNA可能发挥着抑癌基因和癌基因的双重作用(Esquela-Kerscher，A.and Slack，F.J(2006)Nat Rev Cancer 6，259-269；Calin，G.A.and Croce，C.M.(2007)J Clin Invest 117，2059-2066；Blenkiron，C.and Miska，E.A.(2007)Hum Mol Genet16，R106-R113)。已证实的microRNA在人类癌症中的异常表达更突出了它们作为诊断和预后生物标志物的潜在应用价值。

迄今为止，已有学者报导了人肝细胞癌中microRNA表达谱(Murakami，Y.et al.(2006)Oncogene 25，2537-2545；Li，W.et al.(2008)Int J Cancer 123，1616-1622；Huang，Y.S.et al.(2008)Hepatology 23，87-94；Ladeiro，Y.et al.(2008)Hepatology 47，1955-1963；Jiang，J.et al.(2008)Clin Cancer Res 14，419-427)。这些研究均表明，与正常肝细胞或组织相比，特定的microRNA在恶性细胞或组织中存在异常表达。因此，它们有助于更深刻理解肿瘤恶性转化和发展的过程。

在诸多类型的标本中，由于血液容易获取，临床操作简单、创伤小，患者所受的风险及痛苦小，被认为最适合用于筛选高危人群，以其早期发现、诊断和治疗肿瘤患者。来源于肿瘤的microRNA已被证明在人类血浆或血清中以非常稳定的形式存在，免受内源RNase酶活性的影响。这些在血清或血浆中的来源于肿瘤的microRNA足以被检测到，可以作为肿瘤生物标志物。此外，由于血浆和血清的microRNA水平密切相关，血浆或血清中的microRNA都可以作为肿瘤诊断标志物，而应用于临床(Mitchell，P.S.et al.(2008)Proc Natl AcadSci USA 105，10513-10518；Gilad，S.et al.(2008)PLoS ONE 3，e3148；Chen，X.et al.(2008)Cell Res 18，997-1006)。

最近，有三个研究报道了HCC患者中的血清microRNA。Qu等(Qu，KZ.et al(2011)JClin Gastroenterol 45：355-60)研究了血清hsa-miR-16、hsa-miR-195以及hsa-miR-196a在283个样本上的诊断价值，发现hsa-miR-16具有最好的诊断效能，灵敏度和特异性分别为72.1％和88.8％。Xu等(Xu，J.et al(2011)Molecular Carcinogenesis 50：136-42)发现了血液中hsa-miR-21、hsa-miR-122和hsa-miR-223是区分HCC和健康个体的潜在标志物。然而，这些microRNA不能区分HCC和乙肝患者。Li等(Li，LM.et al(2010)Cancer Res 70，9798-807)报道了血清microRNA显著的诊断价值，hsa-miR-375的灵敏度和特异性分别为96％和100％，hsa-miR-375、hsa-miR-25以及hsa-let-7f联合应用后，灵敏度和特异性分别为97.9％和99.1％。以上结果提示，血清microRNA诊断HCC是可行的，但是这些研究存在诸多缺陷，如用于筛选的microRNA数目有限，样本量小或缺少独立的验证。因此，仍然有必要在HCC患者的血浆或血清中发现有诊断价值的microRNA生物标志物。通过多个microRNA生物标志物联合应用可以快速、准确、低成本的早期诊断HCC患者。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一个新的肝细胞癌(特别是早期肝细胞癌BCLC 0期和A期)的诊断标志物，从而提供一种新的肝细胞癌诊断方法。

本发明的第二个目的是提供一种用于诊断肝细胞癌(特别是早期肝细胞癌BCLC 0期和A期)的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种用于区分肝细胞癌患者的血浆和健康人的血浆的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种用于区分肝细胞癌患者的血浆与慢性乙肝患者的血浆的试剂盒。

本发明的第五个目的是提供一种用于区分肝细胞癌患者的血浆与肝硬化患者的血浆的试剂盒。

本发明的第六个目的是提供一种确定肝癌诊断标志物的方法。

这些及其它的目的通过以下描述将变得清楚，它们由独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。

在第一方面，本发明公开了一种肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。

特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。

在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。

在更加优选的实施方案中，所述的至少一种对照血浆来自健康个体、慢性乙肝患者或肝硬化患者。

在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC 0期和A期)。

在第二方面，本发明公开了一种肝细胞癌诊断试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。

特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-122、hsa-miR-26a，hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。

在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。所述的试剂盒还包含一个回归模型，如下：logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。

在更加优选的实施方案中，所述的至少一种对照血浆来自健康个体、慢性乙肝患者或肝硬化患者。

在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC 0期和A期)。

在第三方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个健康个体的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自健康个体。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。

特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-122、hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-26a，hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。

在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。所述的试剂盒还包含一个回归模型，如下：logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。

在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC 0期和A期)。

在第四方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个慢性乙肝的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自慢性乙肝患者。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。

特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-801或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。

在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。所述的试剂盒还包含一个回归模型，如下：logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。

在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC 0期和A期)。

在第五方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个肝硬化患者的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自肝硬化患者。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。

特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-801的核酸分子；且所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变。

在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。

在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。所述的试剂盒还包含一个回归模型，如下：logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-80，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。

在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC 0期和A期)。

在第六方面，本发明公开了一种确定肝癌诊断标志物的方法，包括：

(a)在一个或多个靶血浆中确定多个核酸分子的表达水平，每个核酸分子编码至少一个microRNA序列；

(b)在一个或多个对照血浆中确定上述多个核酸分子的表达水平；

(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的多个核酸分子的相应表达水平，来从所述多个核酸分子中鉴定出在所述的靶血浆和所述的对照血浆中差异表达的一个或多个核酸分子，将在所述的靶血浆和所述的对照血浆中差异表达的一个或多个核酸分子作为肝癌诊断标志物。

本发明的其他实施方案将从以下详细描述中变得明了。

附图说明

图1为本发明用于鉴定至少一个肝细胞肝癌靶血浆，特别是存在早期肝细胞肝癌(BCLC 0期和A期)的microRNA组合的筛选、训练以及验证阶段的实验设计流程图。

图2为确定本发明用于诊断肝细胞肝癌，特别是诊断早期肝细胞肝癌(BCLC 0期和A期)患者的血液中microRNA组合的主要方法步骤图。对照组包括健康、慢性乙肝和肝硬化受试者。

图3说明了包含本发明用于确定至少一个肝细胞肝癌靶血浆的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的逻辑回归模型。A)训练集(n＝407)中HCC组与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.76)相比，microRNA组合在区分HCC组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC＝0.86)。B)验证集(n＝390)中HCC组与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.68)相比，microRNA组合在区分HCC组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC＝0.89)。

图4说明了包含本发明用于进一步区分肝细胞癌患者血浆和健康个体、慢性乙肝患者或肝硬化患者的血浆的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的逻辑回归模型。A)验证集(n＝390)中HCC组与健康组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.64)相比，microRNA组合在区分HCC患者血浆和健康个体血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC＝0.95)。B)验证集(n＝390)中HCC组与慢性乙肝组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.62)相比，microRNA组合在区分HCC患者血浆和慢性乙肝患者的血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC＝0.85)。C)验证集(n＝390)中HCC组与肝硬化组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.78)相比，microRNA组合在区分HCC患者血浆和肝硬化患者的血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC＝0.89)。

图5说明了包含本发明用于鉴定不同BCLC分期的肝细胞癌的至少一个靶血浆的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的逻辑回归模型。A)极早期HCC(BCLC 0)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.68)相比，microRNA组合在区分极早期HCC患者血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC＝0.94)。B)早期HCC(BCLC A)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.65)相比，microRNA组合在区分早期HCC患者血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC＝0.90)。C)中期HCC(BCLC B)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.74)相比，microRNA组合在区分中期HCC患者血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC＝0.85)。D)进展期HCC(BCLC C)与对照组比较时mi croRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.79)相比，microRNA组合在区分进展期HCC患者血浆和对照血浆时并无显著差异(AUC＝0.80)。

图6说明了包含本发明用于鉴定AFP≤20ng/ml及AFP＞20ng/ml的肝细胞癌的至少一个靶血浆的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的逻辑回归模型。A)AFP≤20ng/ml的HCC组和对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.63)相比，microRNA组合在区分AFP≤20ng/ml的HCC组血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC＝0.87)。B)AFP＞20ng/ml的HCC组和对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.69)相比，microRNA组合在区分AFP＞20ng/ml的HCC组血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC＝0.90)。

图7为7个选出来的microRNA和AFP手术期间变化的箱线图。分别在术前和术后第6天，取行肝切除手术的54个HCC患者的血液样本。在术后第6天，AFP和3个microRNA(hsa-miR-21、hsa-miR-192和hsa-miR-223)的表达水平有明显改变。在外科切除术后，AFP和2个microRNA(hsa-miR-21和hsa-miR-192)的表达水平显著下降，hsa-miR-223的表达显著增加。

具体实施方式

本发明以如下出乎意料的发现为基础，即基于具有高诊断准确度的肝癌诊断标志物，肝细胞癌可以被可靠地鉴定。典型地，这里定义的肝癌诊断标志物包含被上调和下调的人类microRNA。更具体地，通过分析血浆中整体microRNA表达模式和/或单个microRNA的表达水平，所述的肝癌诊断标志物使得肝细胞癌能够在早期疾病状态得到检测，肝细胞癌患者的血浆和健康个体、慢性乙肝患者及肝硬化患者的血浆能够得到区分。

以下举例说明的本发明可以适当地在缺少未在本文中特别揭示的任何一个或多个元素或限制的条件下实施。

本发明将根据特定的实时方式并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受到权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。

当术语“包含”被用在本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元素或步骤。为了实现本发明的目的，术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

除非特别声明，在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文描述或举例说明的其它顺序实施。

术语在其所应用的语境中的进一步定义将在下文中给出。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

本文所用的术语“癌症”(也称为“癌”)通常表示任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康的)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于基因重编程)。这种改变可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。

本文所用的术语“肝细胞”是指肝脏的细胞。因此，术语“肝细胞肝癌”是指在肝脏中的癌性生长。

肝癌的最常见类型是肝细胞肝癌(也称作肝癌，通常缩写为HCC)。本文所用的术语“肝细胞肝癌”表示肝脏原发恶性肿瘤。大多数HCC继发于病毒性肝炎感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是导致肝硬化的最常见因素)。在肝炎不是地方病的国家中，大多数肝脏恶性癌症不是原发性HCC，而是从机体其它部位例如结肠的癌症转移(播散)。HCC的治疗选择和预后依赖于许多因素，但是特别依赖于肿瘤大小和分期。通常结果不佳是因为仅10％-20％的肝细胞癌能够通过手术彻底切除。如果癌症不能被完全切除，则该疾病通常在3-6个月内是致命的。

与任何其它癌症一样，肝细胞癌在存在引起细胞高速复制和/或导致细胞避免凋亡的细胞突变时发生。特别地，乙型肝炎和/或丙型肝炎的慢性病毒感染能够通过反复引起机体自身免疫系统攻击肝细胞(其中一些被病毒感染，其它的仅是旁观者)而有助于肝细胞癌的发生。这种损伤-修复-再损伤的循环可导致修复期间的错误，最后将导致癌变，但是目前这种假说更适用于丙型肝炎。然而，在乙型肝炎中，病毒基因组整合进感染的细胞中是恶性肿瘤发生中最相关的因素。另外，反复大量饮酒具有相似作用。

巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期方案包含5个时期。极早期(0期)包括具有无临床症状的单个HCC＜2cm的患者。早期(A期)包括具有无临床症状的单个或三个HCC＜＝3cm的患者。中期(B期)包括具有无临床症状的多个HCC结节的患者。进展期(C期)包括具有临床症状的肿瘤和/或侵袭性肿瘤模式(血管侵犯或肝外播散)的患者。末期(D期)包括具有极其令人担忧的预后的患者。

因此，在本发明范围中，乙型肝炎感染或者肝硬化不仅被视为肿瘤病因学的危险因素，而且还是肿瘤发展的早期/中期(即“癌前状态”)，其与导致(通常为良性)非侵袭性赘生物的过度增殖性组织生长(随之可发展为恶性肿瘤如HCC)相关。

这种恶性肿瘤侵袭其它组织并经常发生转移。恶性细胞通常以进展性和不受控制的生长为特征。肉眼观察HCC看起来是结节性或浸润性肿瘤。结节型肿瘤可以是单发性(具有大体积)或多发性(当发展为硬化并发症时)。肿瘤结节为圆形至椭圆形，边界清楚但无包膜。弥漫型边界不清，且浸润门静脉，很少浸润肝静脉。

本发明中采用的哺乳动物靶血浆可以是人或非人类来源的。然而，本发明典型地采用人类血浆进行。本文所用的术语“一种或多种血浆”应被理解为不仅包括个体血浆。本文所用的术语“靶血浆”是指被至少认定是显示肝细胞癌的血浆，而术语“对照血浆”典型地表示从健康个体、慢性乙肝患者和肝硬化患者得到的不具有这种癌症特征的血浆。但是，在一些应用中，例如在不同癌症类型的血浆之间比较时，不具有肝细胞癌表型的血浆典型地被认为是“对照血浆”。

本发明所用的术语“血浆”，是血液中的黄色液体成分，其中全血中的血细胞通常以悬浮状态存在。它通常占了血液总体积的大约55％。它大部分是水(占体积的90％)，含有溶解的蛋白质、葡萄糖、凝血因子、矿物质离子、激素以及二氧化碳(血浆是排泄产物运输的主要途径)。血浆是通过将一管鲜血在离心机中离心直到血细胞沉在管底，随后将血浆倒出或抽出的方法来制备。血浆密度约为1025kg/m³或1.025kg/l。最近研究表明microRNA在血浆中是稳定的。术语“血浆样本”指从被检测的个人或对照中取得的血浆。

本发明所用的术语“患者”是指至少被认为患有肝细胞癌的人类，而本发明所用的“靶血浆”是指从患者中采集到的血浆。术语“健康个体”典型地一般表示不患有癌症的健康人。本发明所用的“对照血浆”表示从健康个体、慢性乙肝患者以及肝硬化患者采集到的血浆。但是，在一些应用中，例如当比较不同的癌症类型时，患有其它癌症类型的个体以及从这些个体采集到的血浆典型地被认为是对照。

典型地，使用的血浆样本来源于从被诊断患有肝细胞癌的受试者采集的生物试样。此外，为了确证获得的数据，对比样本可以从具有已知疾病状态的受试者采集。所述的生物学样本可包括机体组织及液体，如组织、血清、血细胞、痰和尿。另外，生物学样本可从具有肝细胞癌或疑为癌症的个体获得。另外，所述的样本如有需要可从获得的机体组织或液体中提纯后作为生物学样本使用。根据本发明，本发明中核酸标志物的表达水平在由对象衍生的生物学样本中确定。

在本发明的体外方法中用于检测的样本通常应以临床可接受的方式采集，优选以核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式保存。待分析的样品典型地来自血液。另外，肝组织或其它类型的样本也可以使用。样本，尤其在初步加工后可以合并。但是，也可以使用没有合并的样本。

本发明所用的术语“microRNA”(或″miRNA″)具有其在本领域中的普通含义(Bartel，D.P.(2004)Cell 23，281-292；He，L.and Hannon，G.J.(2004)Nat Rev Genet 5，522-531)。因此，“microRNA”表示来自遗传基因位点的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，尽管其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。

miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特定的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生典型地折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。采用Dicer方法切割这个miRNA前体可以得到miRNA双链体，其发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。所述的miRNA随后被引导到其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。

本发明所用的术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指miRNA初级转录物的一部分，成熟miRNA从该miRNA初级转录物加工得到。典型地，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(将miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段都算在内，但排除更远端的序列)。

本发明所用的术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码microRNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码microRNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的microRNA序列的核酸分子典型地编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。

本发明所用的术语“编码microRNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5’→3’)匹配或相应于所编码的miRNA(5’→3’)序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5’→3’)序列，或者换句话说，匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3’→5’)的分子)。本发明所用的术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对(优选Watson-Crick碱基对)的能力。

在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一个或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。

因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多个核酸分子可包括一个或多个“有义核酸分子”和/或一个或多个“反义核酸分子”。有时，所述的诊断试剂盒包括一个或多个“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标志物)的全体或至少一个亚集合，所述差异表达的miRNA是特定情况存在或发生倾向的指征，所述的特定情况在本发明中指肝细胞癌症。另一方面，当诊断试剂盒包括一个或多个“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一个或多个特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)等。

在本发明中定义的多个核酸分子可以包含至少2个、至少10个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1000个、至少10000个或至少100000个核酸分子，每个分子编码至少一个miRNA序列。

本发明所用的术语“差异表达”是指特定microRNA在靶血浆中的表达水平与在对照血浆中相比是改变的，所述对照血浆可以是健康个体的血浆或其它类型疾病患者的血浆，其可以是上调(即在靶血浆中microRNA浓度增加)或下调(即在靶血浆中microRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在靶血浆中被激活至比在对照血浆中更高或更低的水平。

在本发明范围内，如果核酸分子在靶血浆和对照血浆中的相应表达水平典型地相差至少5％或至少10％，优选至少20％或至少25％，最优选至少30％或至少50％，则该核酸分子被认为是差异表达的。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶血浆中的表达水平与对照细胞相比上调至少1.3倍或至少1.5倍，或反之在靶血浆中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。

本发明所用的术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一个或多个被分析血浆中的浓度。

如上所述，术语“对照血浆”典型地指从不具有肝细胞癌表型特征的个体采集的血浆。但是，在一些应用中，例如当比较不同癌症时，从其它癌症患者采集的血浆典型地被认为是“对照血浆”。

表达水平的测定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.et al.(2001)CurrentProtocols in Molecular Biology.Wiley & Sons，Hoboken，NJ)。所述的测定可以在RNA水平进行，例如使用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在RNA逆转录(及克隆)后的DNA水平进行，例如通过定量PCR或实时PCR技术。本发明所用的术语“测定”包括编码上述至少一个microRNA序列的任何核酸分子的分析。但是，由于pri-miRNA及re-mRNA半寿期短，仅典型地测量成熟miRNA的浓度。

在特定的实施方案中，在一个给定样品的若干独立测量(例如两次、三次、五次或十次测量)和/或在若干靶血浆或对照血浆内的若干次测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。

所获得的靶血浆和对照血浆的表达水平之间的差异可以进一步以对照核酸进行标准化，例如管家基因的表达水平，已知管家基因的表达水平不根据采集样本的个体的疾病状态而不同。典型的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在处于不同非癌和癌(前)状态的采集样本的个体中稳定表达的另一种miRNA。

但是，代替在任何实验中确定一个或多个血浆样本的表达水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一个或多个临界值。在这种情况中，一个或多个靶血浆的相应表达水平可以用一个稳定表达的对照miRNA进行标准化来确定。如果计算的“标准化”的表达水平高于相应定义的临界值，则说明基因表达上调。反之，如果计算的“标准化”的表达水平低于相应定义的临界值，则说明microRNA表达下调。

在本发明中，术语“鉴定肝细胞癌和/或区分其它的HBV感染相关疾病”意为也包括预测和可能性分析(在“诊断”意义上)。本发明公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查受试者状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于通过血浆样本检测癌变，并提供有用信息给医生以进行诊断。另外，本发明还用于区别肝细胞癌和其它HBV感染相关疾病，包括慢性乙肝和肝硬化。

在本发明中，所鉴定的一个或多个差异表达的核酸分子一起代表一种标志物，该标志物是血浆样本中肝细胞癌的指征。本发明所用的术语“标志物”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在肝细胞癌患者血浆和对照血浆之间不同。本发明中，所述的标志物也指一组标志物并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码至少一种能鉴定个体的表型状态的miRNA序列。

在第一方面，本发明公开了一种肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列。

典型地，包含在肝细胞癌诊断标志物中的核酸分子是人类序列，下文称为“has”(智人(Homo sapiens))。

特别优选地，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及内参hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的一个或多个核酸分子。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

表1

microRNA	序列(5′→3′)
		hsa-miR-122	uggagugugacaaugguguuug
hsa-miR-192	cugaccuaugaauugacagcc
		hsa-miR-21	uagcuuaucagacugauguuga
hsa-miR-223	ugucaguuugucaaauacccca
		hsa-miR-26a	uucaaguaauccaggauaggcu
hsa-miR-27a	uucacaguggcuaaguuccgc
		hsa-miR-801	gauugcucugcgugcggaaucgac
hsa-miR-1228	ucacaccugccucgcccccc

本发明公开的所有microRNA序列均已经储存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36，D154-D158)。

编码hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，编码hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调，编码hsa-miR-1228的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

本发明所用的术语“任何一个或多个核酸分子”或“所述多个核酸分子中的一个或多个”，是指所述的多个核酸分子的任何一个亚组，如任何一个、任何两个、任何三个、任何四个、任何五个、任何六个、任何七个、任何八个、任何九个、任何十个等等核酸分子，每个核酸分子编码至少一个microRNA序列。

在最优选的实施方案中，所述的多个核酸分子包含分别编码hsa-miR-122(SEQ IDNO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ IDNO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ IDNO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8个核酸分子的组合。所述的8个核酸分子的组合包含于如下逻辑回归模型：

logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

所述的模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，hsa-miR-1228在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

本发明所用的术语“核酸分子组合”是指将至少两个核酸表达水平作为一个整体来使用。优选将相对变化或通过一个公式计算出的结果作为一个整体来使用。

在第二个方面，本发明公开了一种肝癌诊断试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列。

特别优选地，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122(SEQID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及内参hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的一个或多个核酸分子。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

编码hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，编码hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调，编码hsa-miR-1228的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

在最优选的实施方案中，所述的多个核酸分子包含分别编码hsa-miR-122(SEQ IDNO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ IDNO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ IDNO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8个核酸分子的组合。本发明的试剂盒还包含含有上述8个核酸分子的组合的逻辑回归模型：

logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

所述的模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，hsa-miR-1228在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

在第三方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个健康人的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，所述的多种核酸分子包含至少一种编码mi croRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自健康人。

特别优选地，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及内参hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的一个或多个核酸分子。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

编码hsa-miR-122、hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，编码hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调，编码hsa-miR-1228的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

在最优选的实施方案中，所述的多个核酸分子包含分别编码hsa-miR-122(SEQ IDNO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ IDNO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ IDNO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8个核酸分子的组合。本发明的试剂盒还包含含有上述8个核酸分子的组合的逻辑回归模型：

logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

所述的模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，hsa-miR-1228在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

在第四方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个慢性乙肝的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，所述的多种核酸分子包含至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自慢性乙肝患者。

特别优选地，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及内参hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的一个或多个核酸分子。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

编码hsa-miR-801或hsa-miR-21的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调，编码hsa-miR-1228的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

在最优选的实施方案中，所述的多个核酸分子包含分别编码hsa-miR-122(SEQ IDNO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ IDNO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ IDNO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8个核酸分子的组合。本发明的试剂盒还包含含有上述8个核酸分子的组合的逻辑回归模型：

logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

所述的模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，hsa-miR-1228在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

在第五方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个肝硬化患者的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，所述的多种核酸分子包含至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自肝硬化患者。

特别优选地，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及内参hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的一个或多个核酸分子。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

编码hsa-miR-801的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调，编码hsa-miR-1228的任何一个或多个核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

在最优选的实施方案中，所述的多个核酸分子包含分别编码hsa-miR-122(SEQ IDNO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ IDNO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ IDNO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8个核酸分子的组合。本发明的试剂盒还包含含有上述8个核酸分子的组合的逻辑回归模型：

logit(p＝HCC)＝-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

所述的模型中的logit(p＝HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，hsa-miR-1228在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比未改变。

在第六方面，本发明公开了一种确定肝癌诊断标志物的方法，包括：

(a)在一个或多个靶血浆中确定多个核酸分子的表达水平，每个核酸分子编码至少一个microRNA序列；

(b)在一个或多个对照血浆中确定上述多个核酸分子的表达水平；

(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的多个核酸分子的相应表达水平，来从所述多个核酸分子中鉴定出在所述的靶血浆和所述的对照血浆中差异表达的一个或多个核酸分子，将在所述的靶血浆和所述的对照血浆中差异表达的一个或多个核酸分子作为肝癌诊断标志物，来鉴定一个或更多个肝癌患者的靶血浆。

本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述的附图和实施例只是为了例证本发明的特定实施方案，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。

实施例1：血浆样本采集和制备：

本发明中的试验已得到本地伦理委员会的批准并获得所有患者的知情同意。本发明中microRNA生物标志物的筛选阶段、训练阶段以及验证阶段的实验设计如图1所示。用被推荐的血浆microRNA组合来鉴别肝细胞癌患者的血浆样本的主要方法步骤如图2所示。

在2008年8月到2010年6月间，934个满足合格标准(图2)的血液样本被预先从上海中山医院和公共卫生中心采集。这些样本从167个健康捐献者(健康组)，169个慢性乙肝患者(CHB组)，141个HBV感染后肝硬化患者(肝硬化组)，以及457个HBV感染相关HCC患者(HCC组)获得。这些样本被按照时间先后顺序划归为3个阶段(图1)。患者的临床表现被总结在表3和4中。

表2：选择患者的合格标准

表3

微阵列受试者特征

表4

训练集和验证集受试者特征

抽取外周血(4ml)放入EDTA管中，30分钟内，将EDTA管在820g条件下离心10分钟。然后，将1ml血浆转移到1.5ml管中，在16,000g条件下离心10分钟以除去残留的细胞碎屑。随后将上清液转移到干净的管中，在-80℃储存。

用mirVana PARIS microRNA分离试剂盒(mirVana PARIS miRNA Isolation kit)按照厂家(Ambion，Austin，TX)提供的使用说明来抽提总RNA，用NanoDrop 1000分光光度计(NanoDrop Technologies，Waltham，MA)来定量检测其浓度。

实施例2：microRNA微阵列分析：

使用Agilent microRNA微阵列平台(Agilent microRNA microarray platform，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)对特定血浆样本中的microRNA进行定性分析。该微阵列包含来自Sanger database v.10.1的723个人类microRNA的探针。将来自137个血浆样本中任一个的总RNA(100ng)掺入单色CY3用于标记。用XDR扫描仪(PMT100，PMT5)对基因芯片进行扫描，按照Agilent microRNA微阵列系统的规程进行标记和杂交。通过Feature Extraction Software Rev.9.5.3(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)将微阵列图像信息转化成光点强度值。将除掉背景后的信号用稳定的内参hsa-miR-1228进行标准化。然后，进行底数为2的log转换。一个陈列上重复点的片间变异系数(CV)超过15％或可检测到的信号小于5％为不可信样本，排除上述不可信样本后，进行进一步分析。

受试者的人口学特征通过描述性统计来报告。卡方或T检验被用于训练集和验证集之间的比较(表5)。Kruskal-Wallis检验被用于HCC组、健康组、CHB组以及肝硬化组之间的总体比较。Mann-Whitney未配对检验被用于两组之间的比较。这些检验得到的p值全部通过Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。所有的p值都是双侧的。

采用以下标准来选择在微阵列上有可检出信号的候选microRNA用于验证：(1)HCC组、健康组、CHB组以及肝硬化组之间的Kruskal-Wallis检验的校正后的p值＜0.001；(2)HCC组和健康组之间的Mann-Whitney未配对检验的校正后的p值＜0.05；(3)HCC组和CHB组之间的Mann-Whitney未配对检验的校正后的p值＜0.00000001；以及(4)HCC组和肝硬化组之间的Mann-Whitney未配对检验的校正后的p值＜0.0001。

实施例3：137个样本的微阵列数据

用于进一步验证的15个候选microRNA在微阵列分析中的表达如表5所示，满足选择标准的microRNA用黑体表示。

表5

15个候选microRNA在微阵列中的表达

实施例4：通过102个血浆样本评价候选microRNA

采用102个血浆样本的独立群组以及不同的技术平台来对微阵列筛选出的15个候选microRNA进行评价。使用TaqMan MicroRNA检测试剂盒(TaqMan MicroRNA assay kit，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)按照厂家的使用说明操作。所有的检测都重复3次。以hsa-miR-1228的表达水平作为内参。在超过102个样本的20％中表现出CT值大于35个循环的microRNA被排除，不再进行进一步分析。

Kruskal-Wallis检验被用于HCC组、健康组、CHB组以及肝硬化组之间的总体比较。Mann-Whitney检验被用于两组之间的比较。这些检验得到的p值全部通过Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。所有的p值都是双侧的。

15个候选microRNA在微阵列分析中的表达如表5所示。15个候选microRNA中的12个通过了质量控制过程。它们中的7个(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)在HCC组和对照组之间表达水平具有显著差异。15个候选mi croRNA在定量RT-PCR上的表达谱如表6所示。特别优选的microRNA(SEQ ID NO：1 to SEQ ID NO：7)用黑体表示。

表6

102个样品中15个候选microRNA在定量RT-PCR上的表达谱

对照组包括健康个体、CHB患者以及肝硬化患者。在HCC组和对照组中差异表达的microRNA用黑体表示。ND表示不能确定，因为该microRNA未通过质量控制过程。

实施例5：在含有407个样本的训练集中建立一个microRNA诊断模型

在另外的305个血浆样本上使用定量RT-PCR检测方法来进一步评价7个差异表达的microRNA的表达谱。

407个血浆样本被结合起来用作训练集来建立HCC诊断microRNA组合。同样地，Kruskal-Wallis检验被用于HCC组、健康组、CHB组以及肝硬化组之间的总体比较。Mann-Whitney未配对检验被用于两组之间的比较。这些检验得到的p值全部通过Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。所有的p值都是双侧的。

逐步逻辑回归模型被用于基于训练集选择microRNA诊断标志物。被诊断患有HCC的预测概率被用作替代标志物来建立受试者工作特征(ROC)曲线。ROC曲线下面积(AUC)被用于评价血清AFP和microRNA组合的诊断效能。MedCalc(10.4.7.0)软件被用于进行ROC和回归分析。

7个候选microRNA在训练集中的表达谱和诊断效能如表6所示。microRNA组合的AUC显著地大于AFP的AUC(0.86vs.0.76，p＜0.001，图3A)。

表6

训练集中microRNA表达情况和诊断效能

#对照组包括健康个体、乙肝患者和肝硬化患者

实施例6：在390个样本的验证集中验证上述microRNA组合

从训练集中估计的参数被用于独立的验证集(390血浆样本)上预测被诊断患有HCC的概率。同样地，采用定量RT-PCR检测方法来进行实验。预测概率被用来建立受试者工作特征曲线。

MicroRNA组合与AFP之间的AUC在验证集中的比较表明microRNA组合的诊断准确度显著高于AFP(AUC：0.89vs.0.68，p＜0.001，图3B)。

MicroRNA组合与AFP区分HCC组和健康组、CHB组以及肝硬化组的效能也进行了对比(图4)。该分析证明了MicroRNA组合与AFP皆可区分HCC组和非HCC。然而，MicroRNA组合的AUC显著大于AFP(HCC与健康组：0.95vs.0.64，p＜0.001，HCC与CHB：0.85vs.0.62，p＜0.001and HCC与肝硬化组：0.89vs.0.78，p＝0.002)。

实施例7：MicroRNA组合与AFP在不同BCLC分期的诊断表现

MicroRNA组合与AFP在不同BCLC分期的诊断表现被进一步评价(图5)。在诊断早期和中期HCC(BCLC 0、A和B期)方面，MicroRNA组合的诊断表现显著高于AFP(BCLC 0期，AUC 0.94vs.0.68，p＜0.001；BCLC A期，AUC 0.90vs.0.65，p＜0.001；BCLC B期，AUC0.85vs.0.74，p＜0.001；图5A，5B and 5C)。当MicroRNA组合和AFP之间的比较聚焦在BCLC C期患者上时，其诊断表现并无显著差异(AUC 0.80vs.0.79，p＝0.24，图5D)。

实施例8：MicroRNA组合在AFP正常(≤20ng/ml)组和高AFP(＞20ng/ml)组中的诊断表现

按照AFP水平评估MicroRNA组合诊断准确度。在AFP正常(≤20ng/ml)组中，MicroRNA组合的AUC显著大于AFP的AUC(0.87vs.0.63，p＜0.001，图6A)。在高AFP(＞20ng/ml)组中，MicroRNA组合的AUC仍然显著大于AFP的AUC(0.90vs.0.69，p＜0.001，图6B)。

实施例9：HCC切除术前后的MicroRNA表达变化

分别在术前和术后第6天，取接受肝外科切除术的54个HCC患者的血液样本。使用定量RT-PCR来监控microRNA表达谱的变化。所有的检测都重复3次，以减少误差。Hsa-miR-1228的表达水平用作内参。

观察得到，Hsa-miR-21、hsa-miR-192和AFP的表达水平在HCC切除术后显著降低(平均差异分别为0.77、1.74和6.66，p值分别为p＜0.001、p＝0.03和p＜0.001，图7)。Hsa-miR-223，hsa-miR-26a和hsa-miR-27a的术后表达水平与术前表达水平相比有所升高(平均差异分别为-0.61、-0.81和-0.55，p值分别为p＝0.02、0.06和0.06)。Hsa-miR-122和hsa-miR 801的表达水平并未由于手术产生显著变化。

所获得的结果证实microRNA在肝细胞癌患者血浆中的特异性表达。因此，这里规定的microRNA集可作为独特的microRNA生物标志物，通过肝细胞癌血浆microRNA表达谱分析，不仅可以早期诊断肝癌的发生，也可区别肝细胞癌和慢性乙肝以及肝硬化。

本发明对于血浆microRNA表达生物标志物的鉴别和验证提供了可在血液样本中进行筛选、早期诊断、区别诊断肝细胞癌的独特的分子标志物。

在此举例描述的本发明可以适当地在不存在非本文特别揭示的任何要素、限制的条件下实施。因此，例如术语“包含”、“包括”“含有”等应解读为具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述而并非限制本发明，且没有使用这些术语和表达排除所表现或描述的特征的任何等价形式或其组成部分之意，但是应意识到在本发明请求保护的范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管本发明通过实时方式和选择性特征进行特别揭示，本领域技术人员可以得出对本发明的修改和改变，这种修改和改变应被认为在本发明的范围之内。

本发明进行了一般地并上位地描述。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位概念也组成了本发明的一部分。包括带有从其中除去任何主题的条件或否定限制的上位描述，而无论所除去的主题是否在本发明中特别引述。

其它实施方式在权利要求范围内。另外，当本发明的各个特征或方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何成员或成员亚组方式被描述。

Claims (9)

1.一种肝细胞肝癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列；所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达；所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八个核酸分子。

2.一种肝细胞肝癌诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的肝细胞肝癌诊断标志物。

3.如权利要求2所述的肝细胞肝癌诊断试剂盒，其特征在于，还包含一个回归模型，如下：logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a 以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit（p=HCC）值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。

4.一种用于区分至少一个肝细胞肝癌患者的血浆和至少一个健康个体的血浆的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的肝细胞肝癌诊断标志物，其中，所述的至少一种对照血浆来自健康个体。

5.如权利要求4所述的用于区分至少一个肝细胞肝癌患者的血浆和至少一个健康个体的血浆的试剂盒，其特征在于，还包含一个回归模型，如下：logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a 以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit（p=HCC）值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。

6.一种用于区分至少一个肝细胞肝癌患者的血浆和至少一个慢性乙肝患者的血浆的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的肝细胞肝癌诊断标志物，其中，所述的至少一种对照血浆来自慢性乙肝患者。

7.如权利要求6所述的用于区分至少一个肝细胞肝癌患者的血浆和至少一个慢性乙肝患者的血浆的试剂盒，其特征在于，还包含一个回归模型，如下：logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a 以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit（p=HCC）值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。

8.一种用于区分至少一个肝细胞肝癌患者的血浆和至少一个肝硬化患者的血浆的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的肝细胞肝癌诊断标志物，其中，所述的至少一种对照血浆来自肝硬化患者。

9.如权利要求8所述的用于区分至少一个肝细胞肝癌患者的血浆和至少一个肝硬化患者的血浆的试剂盒，其特征在于，还包含一个回归模型，如下：logit（p=HCC）=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801，其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a 以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit（p=HCC）值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。

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