TW201418472A

TW201418472A - 由血漿ｍｉｃｒｏＲＮＡ組合成之肝癌診斷標誌物及診斷肝癌之新方法

Info

Publication number: TW201418472A
Application number: TW101142093A
Authority: TW
Inventors: Jia Fan; Jian Zhou; Zhi Dai; Lei Yu; Jie Hu; Zheng Wang
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan Univ
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2014-05-16

Abstract

本發明係關於一種由血漿microRNA組合成的肝癌診斷標誌物，含有該標誌物的套組，以及一種診斷肝癌(特別是早期肝癌)的新方法。所述的肝癌診斷標誌物由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列，較佳由編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801和hsa-miR-1228的核酸分子組成。所述的套組可用於診斷肝細胞癌，尤其是早期肝細胞癌，或者區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個健康個體的血漿、至少一個慢性B型肝炎患者的血漿或者至少一個肝硬化患者的血漿。

Description

由血漿mircoRNA組合成之肝癌診斷標誌物及診斷肝癌之新方法

本發明係關於一種一種由血漿microRNA組合成的肝癌診斷標誌物及一種診斷肝癌(特別是早期肝癌)的新方法，所述的血漿microRNA包含hsa-miR-122，hsa-miR-192，hsa-miR-21，hsa-miR-223，hsa-miR-26a，hsa-miR-27a以及hsa-miR-801。

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界範圍內最常見的實體惡性腫瘤之一。其代表了肝癌的主要組織學類型，可能占所有肝癌病例的70%~85%。世界每年會出現大約600000個新病例，和幾乎相同數目的死亡病例，這反應出對這種疾病缺乏有效的早期診斷和治療(Thorgeirsson,S.S.and Grisham,J.W.(2002)Nat Genet 31,339-346；Jemal A et al.(2011)CA Cancer J Clin 61：69-90.；Bosch F.X.et al(2004)Gastroenterology 127,S5-S16；Perz J.F.et al.(2006)J Hepatol 45,529-538)。

HCC是一類預後很差的癌症。此種疾病患者的預後取決於疾病分期。HCC患者未經手術治療，5年生存率為<5%，手術後生存率為60%~70%。腫瘤尺寸<2 cm且採用外科手術切除的患者的5年生存率能夠達到86%。但是，沒有經過任何治療的早期癌症患者(腫瘤尺寸<5 cm)的3年生存率僅為17~21%。這證明了早期癌症檢測對於治療以及提高患者生存率都是非常重要的。(Tang,Z.Y.(2001)World J Gastroenterol 7,445-454；Chambers,A.F.et al.(2002)Nat Rev Cancer 2,563-572；Motola-Kuba D.et al.(2006)Annals of Hepatology 5,16-24)。

雖然近年來早期偵測與手術移除肝細胞腫瘤可顯著地提升患者的存活率，但大多數的腫瘤在癌化過程(即，非致死階段)中仍無法被早期偵測出。在藉由相對正常的肝功能指數以及經過有效的臨床分期系統診斷的受控制的腫瘤病變確認的HCC患者中，只有約10%~20%目前適用於外科手術。此外，經手術切除的患者仍很可能會轉移/復發，且術後5年存活者亦只有30%~40%。

一個明確的肝癌診斷經常以組織學確認為基礎。組織可以通過細針穿刺或生物檢體來取樣。一些肝癌分化良好，這意味著它們幾乎完全由生長的、成熟的肝細胞組成。因此，這些癌症在顯微鏡下看起來非常類似於非肝癌組織。此外，並非所有的病理學家都能夠識別分化良好的肝癌和正常肝組織的細微差別。一些病理學家會把肝癌誤認為肝腺癌。腺癌是一種不同類型的癌症，它從肝外起源。轉移性腺癌和原發性肝癌治療方法不同，因此，需要早期檢測以區分這些不同類型的腫瘤，指導HCC患者的治療，以改善患者長期生存率。

肝穿刺或生物檢體的最常見風險是出血，因為肝癌是含血管非常豐富的腫瘤。在許多情況下，可能沒有必要進行組織生物檢體或穿刺。如果患者具有發生肝癌的危險因素(例如，肝硬化，慢性B型肝炎，或慢性C型肝炎)，血漿中α-胎蛋白(AFP)的水準顯著升高，並且有相符合的影像學診斷，醫生幾乎可以不通過生物檢體就能確定病人患有肝癌。目前，AFP是唯一的用於早期診斷肝癌的血清標誌物(Mizejewski,G.J.(2003)Expert Rev Anticancer Ther 2, 709-735；Paul,S.B.et al.(2007)Oncology 72,Suppl.1,117-123)。然而，這種單一的標誌物靈敏度低，且經常出現假陽性結果，例如在大量的肝硬化患者中，AFP也會升高。此外，血清AFP僅能檢測出60%的肝癌患者。因此，發現早期診斷HCC的新的分子標誌物以及開發靈敏的檢測方法具有重要意義。

巴賽隆納臨床肝癌(BCLC)分期(Llovet,J.M.(2003)Lancet 362,1907-1917)是最近幾年出現的，用於HCC患者的臨床分期。BCLC分期將腫瘤的發展階段與推薦的治療策略聯繫起來，並定義了每個腫瘤分期的護理標準(Llovet,J.M.(2008)J Natl Cancer Inst 100,698-711)。極早期HCC患者(0期)最適合做手術切除。早期HCC患者(A期)最適合做放療(肝腫瘤切除、肝移植或局部消融)。中期HCC患者(B期)適合做肝動脈化學栓塞(TACE)。而中晚期HCC患者(C期)可用索拉菲尼治療。終末期(D期)患者可接受對症治療。

許多診斷檢驗因受限於它們都是根據僅以單一的分子標誌的分析之事實，所以偵測的可靠性及/或正確性有可能會被影響。又，單一的分子標誌通常不能詳細地預測潛伏期、癌化過程及其相關。因此，目前仍持續需要一種鑑定用之替代性分子標誌及分析方式以克服該等限制。

microRNA(miRNA)是一類小的內源性非編碼RNA分子，大小為20~25個核苷酸(nt)，這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，通過翻譯水準的抑制或斷裂靶標mRNAs而調節基因的表現。它們大約在10年前被發現，已被認為在細胞發育、分化、增殖和凋亡中發揮重要作用(Bartel,D.P.(2004)Cell 116,281-297,Ambros,V.(2004) Nature 431,350-355；He,L.et al.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。miRNA比mRNA在作為腫瘤生物標誌物方面具有更大的優勢，因為它們在體外非常穩定(Lu,J.et al.,(2005)Nature 435,834-838；Lim,L.P.et al.,(2005)Nature 433,769-773)。

miRNA是從初級轉錄物(pri-miRNA)產生的，pri-miRNA被RNase III Drosha加工為含莖-環結構的前體miRNA(pre-miRNA)。接著，在Dicer(一種RNase III)的作用下，髮夾狀的pre-miRNA在細胞質中進一步被切割產生成熟的miRNA，這些成熟的miRNA與其他蛋白質一起組成miRNA-蛋白質複合體(miRNP)。miRNA引導miRNP到達它們的靶mRNA，在此它們發揮各自的功能(綜述參見例如Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292；He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。

根據miRNA與其靶mRNA之間的互補性程度，miRNA可以指導不同的調節過程。那些與miRNA高度互補的靶mRNA通過與RNA干擾(RNAi)相同的機制被特異降解。因此，在這種情況下，miRNA是擔當小干擾RNA(siRNA)的角色；與miRNA互補性較低的靶mRNA被引導進入細胞降解途徑，或者在蛋白質轉譯上平上被阻遏而mRNA水準不受影響。但是，目前miRNA抑制其靶mRNA轉譯的機制尚有爭議。

高通量microRNA定量技術(如microRNA微陣列)，是以即時定量RT-PCR為基礎的microRNA檢測，為研究癌症基因組中microRNA表現譜提供了有力的工具。可獲得的現有資料表明miRNA表現失調可能與某種癌症的發生和/或發展相關。例如，研究表明hsa-miR-15及hsa-miR-16-1均定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遺傳基因座上，在大約70%的CLL患者中，這兩種microRNA基因缺失或下調。另外，在結腸癌中has-miR-143及has-miR-145表現下調；而miRNA let-7的表現在肺癌中經常降低(Michael,M.Z.et al.(2003)Mol Cancer Res 1,882-891；Mayr,C.et al.(2007)Science 315,1576-1579)。事實上，常見癌症經常存在相關microRNA表現改變，而且microRNA通常定位於與癌症相關的基因組區域，因此可以推測miRNA可能發揮著抑癌基因和癌基因的雙重作用(Esquela-Kerscher,A.and Slack,F.J(2006)Nat Rev Cancer 6,259-269；Calin,G.A.and Croce,C.M.(2007)J Clin Invest 117,2059-2066；Blenkiron,C.and Miska,E.A.(2007)Hum Mol Genet 16,R106-R113)。已證實的microRNA在人類癌症中的異常表現更突出了它們作為診斷和預後生物標誌物的潛在應用價值。

迄今為止，已有學者報導了人HCC中microRNA表現譜(Murakami,Y.et al.(2006)Oncogene 25,2537-2545；Li,W.et al.(2008)Int J Cancer 123,1616-1622；Huang,Y.S.et al.(2008)Hepatology 23,87-94；Ladeiro,Y.et al.(2008)Hepatology 47,1955-1963；Jiang,J.et al.(2008)Clin Cancer Res 14,419-427)。這些研究均表明，與正常肝細胞或組織相比，特定的microRNA在惡性細胞或組織中存在異常表現。因此，它們有助於更深刻理解腫瘤惡性轉化和發展的過程。

在諸多類型的標本中，由於血液容易獲取，臨床操作簡單、創傷小，患者所受的風險及痛苦小，被認為最適合用於篩選高危人群，以其早期發現、診斷和治療腫瘤患者。來源於腫瘤的microRNA已被證明在人類血漿或血清中以非常穩定的形式存在，免受內源RNase酶活性的影響。這些在血清或血漿中的來源於腫瘤的microRNA足以被檢測到，可以作為腫瘤生物標誌物。此外，由於血漿和血清的microRNA水準密切相關，血漿或血清中的microRNA都可以作為腫瘤診斷標誌物，而應用於臨床(Mitchell,P.S.et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105,10513-10518；Gilad,S.et al.(2008)PLOS ONE 3,e3148；Chen,X.et al.(2008)Cell Res 18,997-1006)。

最近，有三個研究報導了HCC患者中的血清microRNA。Qu等(Qu,KZ.et al(2011)J Clin Gastroenterol 45：355-60)研究了血清hsa-miR-16、hsa-miR-195以及hsa-miR-196a在283個樣本上的診斷價值，發現hsa-miR-16具有最好的診斷效能，靈敏度和特異性分別為72.1%和88.8%。Xu等(Xu,J.et al(2011)Molecular Carcinogenesis 50：136-42)發現了血液中hsa-miR-21、hsa-miR-122和hsa-miR-223是區分HCC和健康個體的潛在標誌物。然而，這些microRNA不能區分HCC和B型肝炎患者。Li等(Li,LM.et al(2010)Cancer Res 70,9798-807)報導了血清microRNA顯著的診斷價值，hsa-miR-375的靈敏度和特異性分別為96%和100%，hsa-miR-375、hsa-miR-25以及hsa-let-7f聯合應用後，靈敏度和特異性分別為97.9%和99.1%。以上結果提示，血清microRNA診斷HCC是可行的，但是這些研究存在諸多缺陷，如用於篩選的microRNA數目有限，樣本量小或缺少獨立的驗證。因此，仍然有必要在HCC患者的血漿或血清中發現有診斷價值的microRNA生物標誌物。通過多個microRNA生物標誌物聯合應用可以快速、準確、低成本的早期診斷HCC患者。

本發明的第一個目的是提供一個新的HCC(特別是早期肝細胞癌BCLC 0期和A期)的診斷標誌物，從而提供一種新的HCC診斷方法。

本發明的第二個目的是提供一種用於診斷HCC(特別是早期肝細胞癌BCLC 0期和A期)的套組。

本發明的第三個目的是提供一種用於區分HCC患者的血漿和健康人的血漿的套組。

本發明的第四個目的是提供一種用於區分HCC患者的血漿與慢性B型肝炎患者的血漿的套組。

本發明的第五個目的是提供一種用於區分HCC患者的血漿與肝硬化患者的血漿的套組。

本發明的第六個目的是提供一種確定肝癌診斷標誌物的方法。

這些及其它的目的通過以下描述將變得清楚，它們由獨立項的主題實現。本發明的一些較佳實施方案由附屬項的主題限定。

在第一方面，本發明公開了一種HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列。

在較佳的實施方案中，所述的多種核酸分子包含至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現。

在更佳的實施方案中，所述的在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調，以及至少一種編碼microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調。

特佳地，所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在較佳的實施方案中，所述的多種核酸分子還包含至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比不變。

在更佳的實施方案中，所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比不變的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-1228的核酸分子。

在最佳的實施方案中，所述的多種核酸分子包含編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228 的八個核酸分子的組合。

在更佳的實施方案中，所述的至少一種對照血漿來自健康個體、慢性B型肝炎患者或肝硬化患者。

在較佳的實施方案中，所述的HCC為早期HCC(BCLC 0期和A期)。

在第二方面，本發明公開了一種HCC診斷套組，其包含一種HCC診斷標誌物，所述的HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列。

特佳地，所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-122、 hsa-miR-26a,hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在最佳的實施方案中，所述的多種核酸分子包含編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八個核酸分子的組合。所述的套組還包含一個回歸模型，如下： logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801

其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表現水準是以hsa-miR-1228為內源性對照檢測得到，模型中的logit(p=HCC)值在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調。

在較佳的實施方案中，所述的HCC為早期HCC(BCLC 0期和A期)。

在第三方面，本發明公開了一種用於區分至少一個HCC患者的血漿和至少一個健康個體的血漿的套組，其包含一種HCC診斷標誌物，所述的HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列，所述的多種核酸分子包含至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現，所述的至少一種對照血漿來自健康個體。

特佳地，所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-122、hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-26a,hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在較佳的實施方案中，所述的HCC為早期HCC(BCLC 0期和A期)。

在第四方面，本發明公開了一種用於區分至少一個HCC患者的血漿和至少一個慢性B型肝炎的血漿的套組，其包含一種HCC診斷標誌物，所述的HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列，所述的多種核酸分子包含至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現，所述的至少一種對照血漿來自慢性B型肝炎患者。

在更加較佳的實施方案中，所述的在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調，以及至少一種編碼microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調。

特佳地，所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-801或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在較佳的實施方案中，所述的HCC為早期HCC(BCLC 0期和A期)。

在第五方面，本發明公開了一種用於區分至少一個HCC患者的血漿和至少一個肝硬化患者的血漿的套組，其包含一種HCC診斷標誌物，所述的HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列，所述的多種核酸分子包含至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現，所述的至少一種對照血漿來自肝硬化患者。

特佳地，所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-801的核酸分子；且所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。

在更加較佳的實施方案中，所述的在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比不變的至少一種編碼至少一個microRNA序列的核酸分子選自至少一種編碼hsa-miR-1228的核酸分子。

在最佳的實施方案中，所述的多種核酸分子包含編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八個核酸分子的組合。所述的套組還包含一個回歸模型，如下： logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-80

在較佳的實施方案中，所述的HCC為早期HCC(BCLC 0期和A期)。

在第六方面，本發明公開了一種確定肝癌診斷標誌物的方法，包括： (a)在一個或多個靶血漿中確定多個核酸分子的表現水準，每個核酸分子編碼至少一個microRNA序列； (b)在一個或多個對照血漿中確定上述多個核酸分子的表現水準； (c)通過對比在步驟(a)和(b)中獲得的多個核酸分子的相應表現水準，來從所述多個核酸分子中鑑定出在所述的靶血漿和所述的對照血漿中差異表現的一個或多個核酸分子，將在所述的靶血漿和所述的對照血漿中差異表現的一個或多個核酸分子作為肝癌診斷標誌物。

本發明的其他實施方案將從以下詳細描述中變得明瞭。

本發明以如下出乎意料的發現為基礎，即基於具有高診斷準確度的肝癌診斷標誌物，HCC可以被可靠地鑑定。典型地，這裡定義的肝癌診斷標誌物包含被上調和下調的人類microRNA。更具體地，通過分析血漿中整體microRNA表現模式和/或單個microRNA的表現水準，所述的肝癌診斷標誌物使得HCC能夠在早期疾病狀態得到檢測，HCC患者的血漿和健康個體、慢性B型肝炎患者及肝硬化患者的血漿能夠得到區分。

以下舉例說明的本發明可以適當地在缺少未在本文中特別揭示的任何一個或多個元素或限制的條件下實施。

本發明將根據特定的即時方式並參照附圖加以描述，但是本發明不受其限制，僅受到申請專利範圍限制。所描述的附圖僅是示意性的，被認為是非限制性的。

當術語“包含”被用在本發明說明書和申請專利範圍中時，其不排除其它元素或步驟。為了實現本發明的目的，術語“由...組成”被認為是術語“包含”的較佳實施方案。如果在下文中某一組被定義為包含至少一定數目的實施方案，這也應被理解為揭示了一個較佳地僅由這些實施方案組成的組。

除非特別聲明，在提及單數形式名詞時使用的不定冠詞或定冠詞例如“一個”或“一種”，“所述”，包括該名詞的複數形式。

本發明中的術語“大約”表示本領域技術人員能夠理解的仍可保證論及特徵的技術效果的準確度區間。該術語通常表示偏離指示數值的±10%，較佳±5%。

此外，說明書和申請專利範圍中的術語第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及諸如此類，是用於區分相似的元素，不是描述順序或時間次序必須的。應理解，如此應用的術語在適當的環境下可互換，並且本發明描述的實施方案能以不同於本文描述或舉例說明的其它順序實施。

術語在其所應用的語境中的進一步定義將在下文中給出。

以下術語或定義僅僅是為了幫助理解本發明而提供。這些定義不應被理解為具有小於本領域技術人員所理解的範圍。

本文所用的術語“癌症”(也稱為“癌”)通常表示任何類型的惡性贅生物，即與未受影響的(健康的)野生型對照細胞相比顯示或具有發生癌特徵傾向的靶細胞的任何形態學和/或生理學改變(基於基因重程式設計)。這種改變可涉及細胞大小和形狀(變大或變小)、細胞增殖(細胞數增加)、細胞分化(生理學狀態變化)、凋亡(程式性細胞死亡)或細胞存活。

本文所用的術語“肝細胞”是指肝臟的細胞。因此，術語“肝癌”是指在肝臟中的癌性生長。

肝癌的最常見類型是肝細胞癌(也稱作肝癌，通常縮寫為HCC)。本文所用的術語“肝細胞癌”表示肝臟原發惡性腫瘤。大多數HCC繼發於病毒性肝炎感染(B型肝炎或C型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是導致肝硬化的最常見因素)。在肝炎不是地方病的國家中，大多數肝臟惡性癌症不是原發性HCC，而是從機體其它部位例如結腸的癌症轉移(播散)。HCC的治療選擇和預後依賴於許多因素，但是特別依賴於腫瘤大小和分期。通常結果不佳是因為僅10%~20%的HCC能夠通過手術徹底切除。如果癌症不能被完全切除，則該疾病通常在3-6個月內是致命的。

與任何其它癌症一樣，HCC在存在引起細胞高速複製和/或導致細胞避免凋亡的細胞突變時發生。特別地，B型肝炎和/或C型肝炎的慢性病毒感染能夠通過反覆引起機體自身免疫系統攻擊肝細胞(其中一些被病毒感染，其它的僅是旁觀者)而有助於HCC的發生。這種損傷-修復-再損傷的循環可導致修復期間的錯誤，最後將導致癌變，但是目前這種假說更適用於C型肝炎。然而，在B型肝炎中，病毒基因組整合進感染的細胞中是惡性腫瘤發生中最相關的因素。另外，反覆大量飲酒具有相似作用。

巴賽隆納臨床肝癌(BCLC)分期方案包含5個時期。極早期(0期)包括具有無臨床症狀的單個HCC<2cm的患者。早期(A期)包括具有無臨床症狀的單個或三個HCC<=3 cm的患者。中期(B期)包括具有無臨床症狀的多個HCC結節的患者。進展期(C期)包括具有臨床症狀的腫瘤和/或侵襲性腫瘤模式(血管侵犯或肝外播散)的患者。末期(D期)包括具有極其令人擔憂的預後的患者。

因此，在本發明範圍中，B型肝炎感染或者肝硬化不僅被視為腫瘤病因學的危險因素，而且還是腫瘤發展的早期/中期(即“癌前狀態”)，其與導致(通常為良性)非侵襲性贅生物的過度增殖性組織生長(隨之可發展為惡性腫瘤如 HCC)相關。

這種惡性腫瘤侵襲其它組織並經常發生轉移。惡性細胞通常以進展性和不受控制的生長為特徵。肉眼觀察HCC看起來是結節性或浸潤性腫瘤。結節型腫瘤可以是單發性(具有大體積)或多發性(當發展為硬化併發症時)。腫瘤結節為圓形至橢圓形，邊界清楚但無包膜。彌漫型邊界不清，且浸潤門靜脈，很少浸潤肝靜脈。

本發明中採用的哺乳動物靶血漿可以是人或非人類來源的。然而，本發明典型地採用人類血漿進行。本文所用的術語“一種或多種血漿”應被理解為不僅包括個體血漿。本文所用的術語“靶血漿”是指被至少認定是顯示HCC的血漿，而術語“對照血漿”典型地表示從健康個體、慢性B型肝炎患者和肝硬化患者得到的不具有這種癌症特徵的血漿。但是，在一些應用中，例如在不同癌症類型的血漿之間比較時，不具有HCC表型的血漿典型地被認為是“對照血漿”。

本發明所用的術語“血漿”，是血液中的黃色液體成分，其中全血中的血細胞通常以懸浮狀態存在。它通常占了血液總體積的大約55%。它大部分是水(占體積的90%)，含有溶解的蛋白質、葡萄糖、凝血因子、礦物質離子、激素以及二氧化碳(血漿是排泄產物運輸的主要途徑)。血漿是通過將一管鮮血在離心機中離心直到血細胞沉在管底，隨後將血漿倒出或抽出的方法來製備。血漿密度約為1025 kg/m³或1.025 kg/l。最近研究表明microRNA在血漿中是穩定的。術語“血漿樣本”指從被檢測的個人或對照中取得的血漿。

本發明所用的術語“患者”是指至少被認為患有HCC的人類，而本發明所用的“靶血漿”是指從患者中採集到的血漿。術語“健康個體”典型地一般表示不患有癌症的健康人。本發明所用的“對照血漿”表示從健康個體、慢性B型肝炎患者以及肝硬化患者採集到的血漿。但是，在一些應用中，例如當比較不同的癌症類型時，患有其它癌症類型的個體以及從這些個體採集到的血漿典型地被認為是對照。

典型地，使用的血漿樣本來源於從被診斷患有HCC的受試者採集的生物試樣。此外，為了確證獲得的資料，對比樣本可以從具有已知疾病狀態的受試者採集。所述的生物學樣本可包括機體組織及液體，如組織、血清、血細胞、痰和尿。另外，生物學樣本可從具有HCC或疑為癌症的個體獲得。另外，所述的樣本如有需要可從獲得的機體組織或液體中提純後作為生物學樣本使用。根據本發明，本發明中核酸標誌物的表現水準在由物件衍生的生物學樣本中確定。

在本發明的體外方法中用於檢測的樣本通常應以臨床可接受的方式採集，較佳以核酸(特別是RNA)或蛋白質的方式保存。待分析的樣品典型地來自血液。另外，肝組織或其它類型的樣本也可以使用。樣本，尤其在初步加工後可以合併。但是，也可以使用沒有合併的樣本。

本發明所用的術語“microRNA”(或"miRNA")具有其在本領域中的普通含義(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292；He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。因此，“microRNA”表示來自遺傳基因位點的RNA分子，其從可以形成局部RNA前體miRNA結構的轉錄物加工而來。成熟miRNA通常長度為20、21、22、23、24或25個核苷酸，儘管其它數目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27個核苷酸。

miRNA編碼序列具有與側翼基因組序列配對的潛力，使成熟miRNA放置在非完全配對的RNA雙鏈體之內(本文也稱作莖-環或髮夾結構或pre-miRNA)，所述雙鏈體作為從更長的前體轉錄物進行miRNA加工的中間體。這一加工典型地通過分別稱為Drosha和Dicer的兩種特定的內切核酸酶的連續作用而發生。Drosha從初級轉錄物(本文也稱作“pri-miRNA”)產生典型地折疊成髮夾或莖-環結構的miRNA前體(本文也稱作“pre-miRNA”)。採用Dicer方法切割這個miRNA前體可以得到miRNA雙鏈體，其髮夾或莖-環結構的一條臂包含成熟miRNA，另一條臂包含類似大小的節段(通常稱為miRNA*)。所述的miRNA隨後被引導到其靶mRNA以發揮其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自與預測的蛋白質編碼區不同的基因組節段。

本發明所用的術語“miRNA前體”(或“前體miRNA”或“pre-miRNA”)是指miRNA初級轉錄物的一部分，成熟miRNA從該miRNA初級轉錄物加工得到。典型地，pre-miRNA折疊成穩定的髮夾(即雙鏈體)或莖-環結構。髮夾結構典型地長度為50-80個核苷酸，較佳60-70個核苷酸(將miRNA殘基，與miRNA配對的殘基，及任何間插節段都算在內，但排除更遠端的序列)。

本發明所用的術語“編碼微RNA序列的核酸分子”是指編碼microRNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，該術語不僅指成熟miRNA，也指相應的如上所述的前體miRNA及初級miRNA轉錄物。另外，本發明不限於RNA分子，也包括相應的編碼microRNA的DNA分子，例如通過逆轉錄miRNA序列產生的DNA分子。編碼本發明的microRNA序列的核酸分子典型地編碼單個miRNA序列(即個體miRNA)。但是，也可能這種核酸分子編碼兩個或多個miRNA序列(即兩個或多個miRNA)，例如一個轉錄單位包含在常用調節序列如啟動子或轉錄終止子控制下的兩個或多個miRNA序列。

本發明所用的術語“編碼microRNA序列的核酸分子”也被理解為包括“有義核酸分子”(即核酸序列(5'→3')匹配或相應於所編碼的miRNA(5'→3')序列的分子)及“反義核酸分子”(即核酸序列互補於所編碼的miRNA(5'→3')序列，或者換句話說，匹配所編碼的miRNA序列的反向互補序列(3'→5')的分子)。本發明所用的術語“互補”是指“反義”核酸分子序列與相應的“有義”核酸分子序列(具有互補於反義序列的序列)形成鹼基對(較佳Watson-Crick鹼基對)的能力。

在本發明範圍內，兩個核酸分子(即“有義”和“反義”分子)可以完全互補，即它們不含有任何鹼基錯配和/或額外的或缺失的核苷酸。或者，兩個分子包含一個或多個鹼基錯配或者在它們的核苷酸總數上不同(由於添加或缺失導致)。較佳地，“互補”核酸分子包含與包含在相應的“有義”核酸分子中的序列顯示完全互補性的至少10個連續核苷酸。

因此，包含在本發明的診斷套組中的編碼miRNA序列的多個核酸分子可包括一個或多個“有義核酸分子”和/或一個或多個“反義核酸分子”。有時，所述的診斷套組包括一個或多個“有義核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被認為組成了差異表現的miRNA(即分子標誌物)的全體或至少一個子集合，所述差異表現的miRNA是特定情況存在或發生傾向的指征，所述的特定情況在本發明中指HCC。另一方面，當診斷套組包括一個或多個“反義核酸分子”(即與miRNA序列互補的序列)時，所述分子可包含適合用於檢測和/或定量給定樣品中的一個或多個特定(互補)miRNA序列的探針分子(用於進行雜交測定)和/或寡核苷酸引物(例如用於逆轉錄或PCR應用)等。

在本發明中定義的多個核酸分子可以包含至少2個、至少10個、至少50個、至少100個、至少200個、至少500個、至少1000個、至少10000個或至少100000個核酸分子，每個分子編碼至少一個miRNA序列。

本發明所用的術語“差異表現”是指特定microRNA在靶血漿中的表現水準與在對照血漿中相比是改變的，所述對照血漿可以是健康個體的血漿或其它類型疾病患者的血漿，其可以是上調(即在靶血漿中microRNA濃度增加)或下調(即在靶血漿中microRNA濃度降低或消失)。換句話說，核酸分子在靶血漿中被啟動至比在對照血漿中更高或更低的水準。

在本發明範圍內，如果核酸分子在靶血漿和對照血漿中的相應表現水準典型地相差至少5%或至少10%，較佳至少20%或至少25%，最較佳至少30%或至少50%，則該核酸分子被認為是差異表現的。因此，後者的值相應於給定核酸分子在靶血漿中的表現水準與對照細胞相比上調至少1.3倍或至少1.5倍，或反之在靶血漿中的表現水準下調至少0.7倍或至少0.5倍。

本發明所用的術語“表現水準”是指特定的miRNA序列從其基因組基因座被轉錄的程度，即miRNA在一個或多個被分析血漿中的濃度。

如上所述，術語“對照血漿”典型地指從不具有HCC表型特徵的個體採集的血漿。但是，在一些應用中，例如當比較不同癌症時，從其它癌症患者採集的血漿典型地被認為是“對照血漿”。

表現水準的測定典型地遵循本領域熟知的已建立的標準程式(Sambrook,J.et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology.Wiley & Sons,Hoboken,NJ)。所述的測定可以在RNA水準進行，例如使用miRNA特異性探針進行Northern印跡分析，或者在RNA逆轉錄(及選殖)後的DNA水準進行，例如通過定量PCR或即時PCR技術。本發明所用的術語“測定”包括編碼上述至少一個microRNA序列的任何核酸分子的分析。但是，由於pri-miRNA及re-mRNA半生期短，僅典型地測量成熟miRNA的濃度。

在特定的實施方案中，在一個給定樣品的若干獨立測量(例如兩次、三次、五次或十次測量)和/或在若干靶血漿或對照血漿內的若干次測量中獲得的表現水準的標準值被用於分析。標準值可以用本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值±2 SD(標準差)或平均值±3 SD的範圍可被用作標準值。

所獲得的靶血漿和對照血漿的表現水準之間的差異可以進一步以對照核酸進行標準化，例如管家基因的表現水準，已知管家基因的表現水準不根據採集樣本的個體的疾病狀態而不同。典型的管家基因包括β-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白P1等。在較佳的實施方案中，對照核酸是已知在處於不同非癌和癌(前)狀態的採集樣本的個體中穩定表現的另一種miRNA。

但是，代替在任何實驗中確定一個或多個血漿樣本的表現水準，也可以基於實驗證據和/或現有技術資料定義針對特定疾病表型(即疾病狀態)的一個或多個臨界值。在這種情況中，一個或多個靶血漿的相應表現水準可以用一個穩定表現的對照miRNA進行標準化來確定。如果計算的“標準化”的表現水準高於相應定義的臨界值，則說明基因表現上調。反之，如果計算的“標準化”的表現水準低於相應定義的臨界值，則說明microRNA表現下調。

在本發明中，術語“鑑定HCC和/或區分其它的HBV感染相關疾病”意為也包括預測和可能性分析(在“診斷”意義上)。本發明公開的組合物和方法意在臨床應用，以決定治療形式，包括治療性干預，診斷標準如疾病階段，和疾病監控和疾病監視。根據本發明，可提供用於檢查受試者狀態的中間結果。這種中間結果可與額外資訊組合以說明醫生、護士或其它從業人員診斷出該物件患有該疾病。或者，本發明可用於通過血漿樣本檢測癌變，並提供有用資訊給醫生以進行診斷。另外，本發明還用於區別HCC和其它HBV感染相關疾病，包括慢性B型肝炎和肝硬化。

在本發明中，所鑑定的一個或多個差異表現的核酸分子一起代表一種標誌物，該標誌物是血漿樣本中HCC的指征。本發明所用的術語“標誌物”是指一組核酸分子(例如miRNA)，其中各個核酸分子的表現水準在HCC患者血漿和對照血漿之間不同。本發明中，所述的標誌物也指一組標誌物並代表最低數目的(不同)核酸分子，每種核酸分子編碼至少一種能鑑定個體的表型狀態的miRNA序列。

典型地，包含在HCC診斷標誌物中的核酸分子是人類序列，下文稱為“has”(智人(Homo sapiens))。

特佳地，所述的多種核酸分子包含編碼hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及內源性對照hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的一個或多個核酸分子。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

本發明公開的所有microRNA序列均已經儲存在miRBase資料庫中(http：//microrna.sanger.ac.uk/；也參見Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。

編碼hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調，編碼hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調，編碼hsa-miR-1228的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比未改變。

本發明所用的術語“任何一個或多個核酸分子”或“所述多個核酸分子中的一個或多個”，是指所述的多個核酸分子的任何一個子群組，如任何一個、任何兩個、任何三個、任何四個、任何五個、任何六個、任何七個、任何八個、任何九個、任何十個等等核酸分子，每個核酸分子編碼至少一個microRNA序列。

在最佳的實施方案中，所述的多個核酸分子包含分別編碼hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8個核酸分子的組合。所述的8個核酸分子的組合包含於如下邏輯回歸模型：logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209* hsa-miR-801

其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表現水準是以hsa-miR-1228為內源性對照檢測得到。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

所述的模型中的logit(p=HCC)值在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調，hsa-miR-1228在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比未改變。

本發明所用的術語“核酸分子組合”是指將至少兩個核酸表現水準作為一個整體來使用。較佳將相對變化或通過一個公式計算出的結果作為一個整體來使用。

在第二個方面，本發明公開了一種肝癌診斷套組，其包含一種HCC診斷標誌物，所述的HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA 序列。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

在最佳的實施方案中，所述的多個核酸分子包含分別編碼hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8個核酸分子的組合。本發明的套組還包含含有上述8個核酸分子的組合的邏輯回歸模型：logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209* hsa-miR-801

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

在第三方面，本發明公開了一種用於區分至少一個HCC患者的血漿和至少一個健康人的血漿的套組，其包含一種HCC診斷標誌物，所述的HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列，所述的多種核酸分子包含至少一種編碼microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現，所述的至少一種對照血漿來自健康人。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

編碼hsa-miR-122、hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調，編碼hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調，編碼hsa-miR-1228的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比未改變。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

在第四方面，本發明公開了一種用於區分至少一個HCC患者的血漿和至少一個慢性B型肝炎的血漿的套組，其包含一種HCC診斷標誌物，所述的HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個 microRNA序列，所述的多種核酸分子包含至少一種編碼microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現，所述的至少一種對照血漿來自慢性B型肝炎患者。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

編碼hsa-miR-801或hsa-miR-21的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調，編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調，編碼hsa-miR-1228的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比未改變。

在最佳的實施方案中，所述的多個核酸分子包含分別編碼hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8個核酸分子的組合。本發明的套組還包含含有上述8個核酸分子的組合的邏輯回歸模型： logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209* hsa-miR-801

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

在第五方面，本發明公開了一種用於區分至少一個HCC患者的血漿和至少一個肝硬化患者的血漿的套組，其包含一種HCC診斷標誌物，所述的HCC診斷標誌物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列，所述的多種核酸分子包含至少一種編碼microRNA序列的核酸分子，其在至少一種靶血漿中與在至少一種對照血漿中差異表現，所述的至少一種對照血漿來自肝硬化患者。

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

編碼hsa-miR-801的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調，編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a或hsa-miR-223的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調，編碼hsa-miR-1228的任何一個或多個核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比未改變。

在最較佳的實施方案中，所述的多個核酸分子包含分別編碼hsa-miR-122(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO：2)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：3)、hsa-miR-223(SEQ ID NO：4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO：5)、hsa-miR-27a(SEQ ID NO：6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO：7)以及hsa-miR-1228(SEQ ID NO：8)的8個核酸分子的組合。本發明的套組還包含含有上述8個核酸分子的組合的邏輯回歸模型：logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209* hsa-miR-801

上面提到的microRNA的核酸序列列在表1中。

在第六方面，本發明公開了一種確定肝癌診斷標誌物的方法，包括：(a)在一個或多個靶血漿中確定多個核酸分子的表現水準，每個核酸分子編碼至少一個microRNA序列；(b)在一個或多個對照血漿中確定上述多個核酸分子的表現水準；(c)通過對比在步驟(a)和(b)中獲得的多個核酸分子的相應表現水準，來從所述多個核酸分子中鑑定出在所述的靶血漿和所述的對照血漿中差異表現的一個或多個核酸分子，將在所述的靶血漿和所述的對照血漿中差異表現的一個或多個核酸分子作為肝癌診斷標誌物，來鑑定一個或更多個肝癌患者的靶血漿。

本發明通過附圖和如下實施例進一步描述，所述的附圖和實施例只是為了例證本發明的特定實施方案，不應理解為以任何方式限制本發明範圍之意。

實施例1：血漿樣本採集和製備：

本發明中的試驗已得到本地倫理委員會的批准並獲得所有患者的知情同意。本發明中microRNA生物標誌物的篩選階段、訓練階段以及驗證階段的實驗設計如圖1所示。用被推薦的血漿microRNA組合來鑑別HCC患者的血漿樣本的主要方法步驟如圖2所示。

在2008年8月到2010年6月間，934個滿足合格標準(圖2)的血液樣本被預先從上海中山醫院和公共衛生中心採集。這些樣本從167個健康捐獻者(健康組)，169個慢性B型肝炎患者(CHB組)，141個HBV感染後肝硬化患者(肝硬化組)，以及457個HBV感染相關HCC患者(HCC組)獲得。這些樣本被按照時間先後順序劃歸為3個階段(圖1)。患者的臨床表現被總結在表3和4中。

抽取外周血(4 ml)放入EDTA管中，30分鐘內，將EDTA管在820g條件下離心10分鐘。然後，將1ml血漿轉移到1.5ml管中，在16，000g條件下離心10分鐘以除去殘留的細胞碎屑。隨後將上清液轉移到乾淨的管中，在-80℃儲存。

用mirVana PARIS microRNA分離套組(mirVana PARIS miRNA Isolation kit)按照廠家(Ambion，Austin，TX)提供的使用說明來抽提總RNA，用NanoDrop 1000分光光度計(NanoDrop Technologies，Waltham，MA)來定量檢測其濃度。

實施例2：microRNA微陣列分析：

用Agilent microRNA微陣列平臺(Agilent microRNA microarray platform，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)對特定血漿樣本中的microRNA進行定性分析。該微陣列包含來自Sanger database v.10.1的723個人類microRNA的探針。將來自137個血漿樣本中任一個的總RNA(100ng)摻入單色CY3用於標記。用XDR掃描器(PMT100，PMT5)對基因晶片進行掃描，按照Agilent microRNA微陣列系統的規程進行標記和雜交。通過Feature Extraction Software Rev.9.5.3(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)將微陣列圖像資訊轉化成光點強度值。將除掉背景後的信號用穩定的內源性對照hsa-miR-1228進行標準化。然後，進行底數為2的log轉換。一個陳列上重複點的片間變異係數(CV)超過15%或可檢測到的信號小於5%為不可信樣本，排除上述不可信樣本後，進行進一步分析。

受試者的人口學特徵通過描述性統計來報告。卡方或T檢驗被用於訓練集和驗證集之間的比較(表5)。Kruskal-Wallis檢驗被用於HCC組、健康組、CHB組以及肝硬化組之間的總體比較。Mann-Whitney未配對檢驗被用於兩組之間的比較。這些檢驗得到的p值全部通過Benjamini-Hochberg方法進行多重檢驗校正。所有的p值都是雙側的。

採用以下標準來選擇在微陣列上有可檢出信號的候選microRNA用於驗證：(1)HCC組、健康組、CHB組以及肝硬化組之間的Kruskal-Wallis檢驗的校正後的p值<0.001；(2)HCC組和健康組之間的Mann-Whitney未配對檢驗的校正後的p值<0.05；(3)HCC組和CHB組之間的Mann-Whitney未配對檢驗的校正後的p值<0.00000001；以及(4)HCC組和肝硬化組之間的Mann-Whitney未配對檢驗的校正後的p值<0.0001。

實施例3：137個樣本的微陣列資料

用於進一步驗證的15個候選microRNA在微陣列分析中的表現如表5所示，滿足選擇標準的microRNA用黑體表示。

實施例4：通過102個血漿樣本評價候選microRNA

採用102個血漿樣本的獨立群組以及不同的技術平臺來對微陣列篩選出的15個候選microRNA進行評價。使用TaqMan MicroRNA檢測套組(TaqMan MicroRNA assay kit，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)按照廠家的使用說明操作。所有的檢測都重複3次。以hsa-miR-1228的表現水準作為內源性對照。在超過102個樣本的20%中表現出CT值大於35個循環的microRNA被排除，不再進行進一步分析。

Kruskal-Wallis檢驗被用於HCC組、健康組、CHB組以及肝硬化組之間的總體比較。Mann-Whitney檢驗被用於兩組之間的比較。這些檢驗得到的p值全部通過Benjamini-Hochberg方法進行多重檢驗校正。所有的p值都是雙側的。

15個候選microRNA在微陣列分析中的表現如表5所示。15個候選microRNA中的12個通過了品質控制過程。它們中的7個(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)在HCC組和對照組之間表現水準具有顯著差異。15個候選microRNA在定量RT-PCR上的表現譜如表6所示。特佳的microRNA(SEQ ID NO：1 to SEQ ID NO：7)用黑體表示。

對照組包括健康個體、CHB患者以及肝硬化患者。在HCC組和對照組中差異表現的microRNA用黑體表示。ND表示不能確定，因為該microRNA未通過品質控制過程。

實施例5：在含有407個樣本的訓練集中建立一個microRNA診斷模型

在另外的305個血漿樣本上使用定量RT-PCR檢測方法來進一步評價7個差異表現的microRNA的表現譜。

407個血漿樣本被結合起來用作訓練集來建立HCC診斷microRNA組合。同樣地，Kruskal-Wallis檢驗被用於HCC 組、健康組、CHB組以及肝硬化組之間的總體比較。Mann-Whitney未配對檢驗被用於兩組之間的比較。這些檢驗得到的p值全部通過Benjamini-Hochberg方法進行多重檢驗校正。所有的p值都是雙側的。

逐步邏輯回歸模型被用於基於訓練集選擇microRNA診斷標誌物。被診斷患有HCC的預測概率被用作替代標誌物來建立受試者工作特徵(ROC)曲線。ROC曲線下面積(AUC)被用於評價血清AFP和microRNA組合的診斷效能。MedCalc(10.4.7.0)軟體被用於進行ROC和回歸分析。

7個候選microRNA在訓練集的表現譜和診斷效能如表6所示。microRNA組合的AUC顯著地大於AFP的AUC(0.86 vs.0.76，p<0.001，圖3A)。

實施例6：在390個樣本的驗證集中驗證上述microRNA組合

從訓練集估計的參數被用於獨立的驗證集(390血漿樣本)上預測被診斷患有HCC的概率。同樣地，採用定量RT-PCR檢測方法來進行實驗。預測概率被用來建立受試者工作特徵曲線。

microRNA組合與AFP之間的AUC在驗證集中的比較表明microRNA組合的診斷準確度顯著高於AFP(AUC：0.89 vs.0.68，p<0.001，圖3B)。

microRNA組合與AFP區分HCC組和健康組、CHB組以及肝硬化組的效能也進行了對比(圖4)。該分析證明了microRNA組合與AFP皆可區分HCC組和非HCC。然而，microRNA組合的AUC顯著大於AFP(HCC與健康組：0.95 vs.0.64，p<0.001，HCC與CHB：0.85 vs.0.62，p<0.001 and HCC與肝硬化組：0.89 vs.0.78，p=0.002)。

實施例7：microRNA組合與AFP在不同BCLC分期的診斷表現

microRNA組合與AFP在不同BCLC分期的診斷表現被進一步評價(圖5)。在診斷早期和中期HCC(BCLC 0、A和B期)方面，microRNA組合的診斷表現顯著高於AFP(BCLC 0期，AUC 0.94 vs.0.68，p<0.001；BCLC A期，AUC 0.90 vs.0.65，p<0.001；BCLC B期，AUC 0.85 vs.0.74，p<0.001；圖5A，5B and 5 C)。當microRNA組合和AFP之間的比較聚焦在BCLC C期患者上時，其診斷表現並無顯著差異(AUC 0.80 vs.0.79，p=0.24，圖5D)。

實施例8：microRNA組合在AFP正常(20ng/ml)組和高AFP(>20ng/ml)組中的診斷表現

按照AFP水準評估microRNA組合診斷準確度。在AFP正常(20ng/ml)組中，microRNA組合的AUC顯著大於AFP的AUC(0.87 vs.0.63，p<0.001，圖6A)。在高AFP(>20ng/ml)組中，microRNA組合的AUC仍然顯著大於AFP的AUC(0.90 vs.0.69，p<0.001，圖6B)。

實施例9：HCC切除術前後的microRNA表現變化

分別在術前和術後第6天，取接受肝外科切除術的54個HCC患者的血液樣本。使用定量RT-PCR來監控microRNA表現譜的變化。所有的檢測都重複3次，以減少誤差。hsa-miR-1228的表現水準用作內源性對照。

觀察得到，hsa-miR-21、hsa-miR-192和AFP的表現水準在HCC切除術後顯著降低(平均差異分別為0.77、1.74和6.66，p值分別為p<0.001、p=0.03和p<0.001，圖7)。hsa-miR-223，hsa-miR-26a和hsa-miR-27a的術後表現水準與術前表現水準相比有所升高(平均差異分別為-0.61、-0.81和-0.55，p值分別為p=0.02、0.06和0.06)。hsa-miR-122和hsa-miR-801的表現水準並未由於手術產生顯著變化。

所獲得的結果證實microRNA在HCC患者血漿中的特異性表現。因此，這裡規定的microRNA集可作為獨特的microRNA生物標誌物，通過HCC血漿microRNA表現譜分析，不僅可以早期診斷肝癌的發生，也可區別HCC和慢性B型肝炎以及肝硬化。

本發明對於血漿microRNA表現生物標誌物的鑑別和驗證提供了可在血液樣本中進行篩選、早期診斷、區別診斷HCC的獨特的分子標誌物。

在此舉例描述的本發明可以適當地在不存在非本文特別揭示的任何要素、限制的條件下實施。因此，例如術語“包含”、“包括”“含有”等應解讀為具有廣泛含義且無限制。另外，本文應用的術語和表現用於描述而並非限制本發明，且沒有使用這些術語和表現排除所表現或描述的特徵的任何等價形式或其組成部分之意，但是應意識到在本發明請求保護的範圍內可以進行各種修改。因此，應理解儘管本發明通過即時方式和選擇性特徵進行特別揭示，本領域技術人員可以得出對本發明的修改和改變，這種修改和改變應被認為在本發明的範圍之內。

本發明進行了一般地並上位地描述。落入上位描述範圍內的每個較窄的下位概念和次上位概念也組成了本發明的一部分。包括帶有從其中除去任何主題的條件或否定限制的上位描述，而無論所除去的主題是否在本發明中特別引述。

其它實施方式在申請專利範圍內。另外，當本發明的各個特徵或方面用馬庫斯方式描述時，本領域技術人員能意識到本發明也以馬庫斯的任何成員或成員子群組方式被描述。

圖1為本發明用於鑑定至少一個HCC靶血漿，特別是存在早期HCC(BCLC 0期和A期)的microRNA組合的篩選、訓練以及驗證階段的實驗設計流程圖。

圖2為確定本發明用於診斷HCC，特別是診斷早期HCC(BCLC 0期和A期)患者的血液中microRNA組合的主要方法步驟圖。對照組包括健康、慢性B型肝炎和肝硬化受試者。

圖3說明瞭包含本發明用於確定至少一個HCC靶血漿的較佳microRNA組合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的邏輯回歸模型。A)訓練集(n=407)中HCC組與對照組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.76)相比，microRNA組合在區分HCC組血漿和對照組血漿時具有顯著高的診斷準確度(AUC=0.86)。B)驗證集(n=390)中HCC組與對照組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.68)相比，microRNA組合在區分HCC組血漿和對照組血漿時具有顯著高的診斷準確度(AUC=0.89)。

圖4說明瞭包含本發明用於進一步區分HCC患者血漿和健康個體、慢性B型肝炎患者或肝硬化患者的血漿的較佳microRNA組合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的邏輯回歸模型。A)驗證集(n=390)中HCC組與健康組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.64)相比，microRNA組合在區分HCC患者血漿和健康個體血漿時具有顯著高的診斷準確度(AUC=0.95)。B)驗證集(n=390)中HCC組與慢性B型肝炎組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.62)相比，microRNA組合在區分HCC患者血漿和慢性B型肝炎患者的血漿時具有顯著高的診斷準確度(AUC=0.85)。C)驗證集(n=390)中HCC組與肝硬化組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP (AUC=0.78)相比，microRNA組合在區分HCC患者血漿和肝硬化患者的血漿時具有顯著高的診斷準確度(AUC=0.89)。

圖5說明瞭包含本發明用於鑑定不同BCLC分期的HCC的至少一個靶血漿的較佳microRNA組合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的邏輯回歸模型。A)極早期HCC(BCLC 0)與對照組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.68)相比，microRNA組合在區分極早期HCC患者血漿和對照組血漿時具有高得多的診斷準確度(AUC=0.94)。B)早期HCC(BCLC A)與對照組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.65)相比，microRNA組合在區分早期HCC患者血漿和對照組血漿時具有高得多的診斷準確度(AUC=0.90)。C)中期HCC(BCLC B)與對照組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.74)相比，microRNA組合在區分中期HCC患者血漿和對照組血漿時具有高得多的診斷準確度(AUC=0.85)。D)進展期HCC(BCLC C)與對照組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.79)相比，microRNA組合在區分進展期HCC患者血漿和對照血漿時並無顯著差異(AUC=0.80)。

圖6說明瞭包含本發明用於鑑定AFP20 ng/ml及AFP>20 ng/ml的HCC的至少一個靶血漿的較佳microRNA組合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的邏輯回歸模型。A)AFP20 ng/ml的HCC組和對照組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.63)相比，microRNA組合在區分AFP20 ng/ml的HCC組血漿和對照組血漿時具有高得多的診斷準確度(AUC=0.87)。B)AFP>20 ng/ml的HCC組和對照組比較時microRNA組合的診斷價值的ROC曲線圖。與AFP(AUC=0.69)相比，microRNA組合在區分AFP>20 ng/ml的HCC組血漿和對照組血漿時具有高得多的診斷準確度(AUC=0.90)。

圖7為7個選出來的microRNA和AFP手術期間變化的箱線圖。分別在術前和術後第6天，取行肝切除手術的54個HCC患者的血液樣本。在術後第6天，AFP和3個microRNA(hsa-miR-21、hsa-miR-192和hsa-miR-223)的表現水準有明顯改變。在外科切除術後，AFP和2個microRNA(hsa-miR-21和hsa-miR-192)的表現水準顯著下降，hsa-miR-223的表現顯著增加。

<110> 復旦大學附屬中山醫院

<120> 由血漿microRNA組合成的肝癌診斷標誌物及一種診斷肝癌的新方法

<130> XXXXX EP1

<150> CN XXXXXXXX

<151> 2011XX-XX

<160> 8

<170> PatentIn version 1.1

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hsa-miR-122 microRNA

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hsa-miR-192 microRNA

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hsa-miR-21 microRNA

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hsa-miR-223 microRNA

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hsa-miR-26a microRNA

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hsa-miR-27a microRNA

<400> 6

<210> 7

<211> 24

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hsa-miR-801 microRNA

<400> 7

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<212> RNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hsa-miR-1228 microRNA

<400> 8

Claims

一種肝細胞癌診斷標誌物，其係由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列，所述的多種核酸分子包含編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801以及hsa-miR-1228的八個核酸分子。
如申請專利範圍第1項所述的肝細胞癌診斷標誌物，其中所述的hsa-miR-801、hsa-miR-192以及hsa-miR-21的核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調；所述的編碼hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-223的核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被下調。
如申請專利範圍第1項所述的肝細胞癌診斷標誌物，其中所述的編碼hsa-miR-1228的核酸分子在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比不變。
如申請專利範圍第1~3項中任一項所述的肝細胞癌診斷標誌物，其中所述的至少一種對照血漿來自健康個體、慢性B型肝炎患者或肝硬化患者。
如申請專利範圍第1~3項中任一項所述的肝細胞癌診斷標誌物，其中所述的肝細胞癌為早期肝細胞癌。
一種肝細胞癌診斷套組，其特徵在於：包含如申請專利範圍第1~3項中任一項所述的肝細胞癌診斷標誌物。
如申請專利範圍第6項所述的肝細胞癌診斷套組，其中還包含一個回歸模型，如下：logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-1 92+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表現水準是以hsa-miR-1228為內源性對照檢測得到，模型中的logit(p=HCC)值在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調。
如申請專利範圍第6項所述的肝細胞癌診斷套組，其中所述的至少一種對照血漿來自健康個體、慢性B型肝炎患者或肝硬化患者。
如申請專利範圍第6項所述的肝細胞癌診斷套組，其中所述的肝細胞癌為早期肝細胞癌。
一種用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個健康個體的血漿的套組，其特徵在於：包含如申請專利範圍第1項所述的肝細胞癌診斷標誌物，其中，所述的至少一種對照血漿來自健康個體。
如申請專利範圍第10項所述的用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個健康個體的血漿的套組，其中還包含一個回歸模型，如下：logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表現水準是以hsa-miR-1228為內源性對照檢測得到，模型中的logit(p=HCC)值在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調。
如申請專利範圍第10項所述的用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個健康個體的血漿的套組，其中所述的肝細胞癌為早期肝細胞癌。
一種用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個慢性B型肝炎患者的血漿的套組，其特徵在於：包含如申請專利範圍第1項所述的肝細胞癌診斷標誌物，其中，所述的至少一種對照血漿來自慢性B型肝炎患者。
如申請專利範圍第13項所述的用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個慢性B型肝炎患者的血漿的套組，其中還包含一個回歸模型，如下：logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表現水準是以hsa-miR-1228為內源性對照檢測得到，模型中的logit(p=HCC)值在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調。
如申請專利範圍第13項所述的用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個慢性B型肝炎患者的血漿的套組，其中所述的肝細胞癌為早期肝細胞癌。
一種用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個肝硬化患者的血漿的套組，其特徵在於：包含如申請專利範圍第1項所述的肝細胞癌診斷標誌物，其中，所述的至少一種對照血漿來自肝硬化患者。
如申請專利範圍第16項所述的用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個肝硬化患者的血漿的套組，其中還包含一個回歸模型，如下：logit(p=HCC)=-1.424-0.292*hsa-miR-122+0.4511*hsa-miR-192+0.6112*hsa-miR-21-0.1796*hsa-miR-223-0.2487*hsa-miR-26a-0.3542*hsa-miR-27a+0.209*hsa-miR-801其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a以及hsa-miR-801的表現水準是以hsa-miR-1228為內源性對照檢測得到，模型中的logit(p=HCC)值在至少一種靶血漿中的表現與在至少一種對照血漿中的表現相比被上調。
如申請專利範圍第16項所述的用於區分至少一個肝細胞癌患者的血漿和至少一個肝硬化患者的血漿的套組，其中所述的肝細胞癌為早期肝細胞癌。