CN112553340A

CN112553340A - ncRNA在诊断肝癌中的应用、肝癌诊断试剂、试剂盒以及诊断系统

Info

Publication number: CN112553340A
Application number: CN202011606913.XA
Authority: CN
Inventors: 曾超; 杜巧芳; 王秋丽; 张喆; 郭林
Original assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Youzhiyou Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112553340B

Abstract

本发明公开了ncRNA在诊断肝癌中的应用、肝癌诊断试剂、试剂盒以及诊断系统，属于生物医学领域。本发明公开了检测ncRNA表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，该ncRNA包括SEQ ID NO.1‑6所示的RNA。以SEQ ID NO.1‑6所示的ncRNA作为标志物组，用于肝癌诊断，具有更高敏感度和特异度，提高诊断结果的准确性；本发明为肝癌的诊断提供了一种新的思路。

Description

ncRNA在诊断肝癌中的应用、肝癌诊断试剂、试剂盒以及诊断系统

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及ncRNA在诊断肝癌中的应用、肝癌诊断试剂、试剂盒以及诊断系统。

背景技术

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种在全球范围内常见的实体恶性肿瘤，属于原发性肝癌的其中一种，约占所有原发性肝癌病例的90％。2016年中国新发肝细胞肝癌占全球55％，发病率位于全球第四，死亡率位居第三。2018年全球肝癌发病841080例，占同期癌症发病总数的4.7％；全球因肝癌死亡人数为781631例，占同期癌症死亡总数的8.2％，位居所有癌种第四。在中国，HCC发病率高于0.02％以上，而欧美大部分地区的发病率只有0.005％左右。

肝炎病毒感染是肝癌发生的最主要原因。临床调查资料显示，病毒性肝炎约有10％会发展成慢性活动性肝炎，而慢性活动性肝炎中有50％可发展成肝硬化，肝硬化发生肝癌的几率约9.9-16.6％。其中以乙型肝炎为主，其次为丙型肝炎。因此，慢性病毒性肝炎和肝硬化是肝癌的常见诱因，其中乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染为主要危险因素，二者联合所致肝癌占全部肝癌发病数的80％以上。据统计，2019年我国乙肝病毒携带者约9000万人，其中约2800万人为慢性乙肝患者。麦肯锡公司报告提到，每10万个人中，急性与慢性乙型病毒性肝炎的患病人数，中国有963例，美国有35例，中国是美国的28倍。

由于症状不明显，病毒性肝炎在人群中快速传播，也为肝癌留下巨大的前期病变空间。肝癌病程约两年半，由于早期症状不明显，两年内一般难以发现，导致许多患者在发现时已处于中晚期、错过最佳治疗期，同时也导致肝癌死亡率居高不下。据统计，中国肝癌早期病人占所有肝癌病患的23.2％，而中晚期占76.8％。

肝癌缺乏有效的早期诊断，同时，由于肝细胞肝癌对放疗和化疗均不敏感，预后总体较差。据统计，肝细胞肝癌患者的5年生存率约为7％，而肿瘤尺寸<2cm且采用外科手术切除的患者的5年生存率可达86％。在目前治疗尚无更好策略之际，对高危人群的有效筛选和肝癌的早期诊断，是提高生存率、降低病死率的有效途径。而对小肝癌的早期发现和诊断，生物标志物最具优势。

由于肝癌含血管十分丰富，在许多情况下均没有必要进行病理或穿刺活检。目前，α-甲胎蛋白(AFP)是临床上用于诊断肝癌的血清标志物。然而，约30％～40％的确诊肝癌患者的AFP没有明显升高，AFP的肝癌诊断灵敏度仅为20％-65％，而在约20～50％的慢性肝炎肝硬化患者中，AFP也会升高。导致AFP的诊断特异性偏低。因此，发现早期诊断肝癌的新的分子标志物以及开发灵敏的检测方法具有重要意义。中国卫健委医政管理局发布的2019年版原发性肝癌诊疗规范已提出，对血清AFP阴性人群，可借助AFP-L3、PIVKAⅡ和血浆miRNA进行早期诊断。

非编码核糖核酸(non-coding RNA，简称ncRNA)，是各种不编码蛋白质的RNA分子的通称。非编码RNA除了在转录和转录后水平上发挥作用外，还在基因表达的表观遗传学调控中发挥重要作用。最近的研究显示，真核生物基因组中约90％的基因是转录基因，这些转录基因中只有1-2％编码蛋白质；大多数转录为ncRNA。

ncRNA种类较多，包括tRNA、rRNA、snoRNA、snRNA、microRNA、piRNAs与lncRNA等等。U11 snRNA(small nuclear ribonucleic acid)就是体内存在的一个ncRNA，位于小剪切体蛋白复合物中。小剪切体蛋白复合物利用U11来识别信使RNA的5'剪切位点，这表明U11是真核生物RNA剪切系统的重要组成部分。microRNA(miRNA)是在真核生物中广泛存在的一类内源性的非编码RNA，长度约为22bp。Andrew Z.Fire和Craig C.Mello因发现这类小RNA的作用机制RNAi而获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。miRNA广泛参与各种生命过程的调控，包括增殖、分化、凋亡及细胞周期调控等等。miRNA与人体的多种癌症发生有着极为密切的关系，其可作为一种新的致癌基因或抑癌基因，参与癌症的发生、发展、侵袭和转移。

miRNA不仅丰富而稳定地存在于血液等体液中，其表达水平与疾病、癌症密切相关，这些miRNA通常被称为循环miRNA。在疾病状态下，miRNA在体液中的表达谱与在组织细胞中一样，会发生特征性的改变，提示miRNA作为一种新的无创伤性生物标志物的可能性。自2008年以来已有大量学术文献报道血液miRNA可作为潜在的肿瘤标志物。胰腺癌综合诊治指南(2018版)中国抗癌协会胰腺癌专业委员会提到miRNA作为潜在biomarker。microRNA的优势主要有以下几点。(一)无创：采取血液样本进行检测，对病人的损伤较小，能够克服创伤性检测带来的风险。(二)稳定：在临床血清、血浆样本中，miRNA以抵抗RNA酶的RNP形式稳定存在。(三)早期：循环microRNA在肿瘤早期阶段(比如癌前状态、极低肿瘤负荷的时候)就已经表现出异常，因此可以用于肿瘤高危人群的预警或者肿瘤早期检测。(四)简便：研究蛋白型的诊断标志物需要制备抗体，而miRNA的研究方法相对简便，发现-验证-应用的周期相对更短。

多个研究小组早在2011年即发现hsa-miR-122是一个潜在的肝癌诊断标志物。另外，已有多项研究成果指出，hsa-miR-21能够用来区分对照与肝癌患者。在其中一项研究中，由hsa-miR-21、hsa-miR-122与has-miR-223三者组成的小panel表现出一定的肝癌诊断性能。

现已发现多个miRNA在对照与肝癌患者间存在含量差异，具有肝癌诊断潜力，其中包括has-miR-192，has-miR-221、has-miR-150，has-miR-26a，has-miR-27a等。另外，has-miR-1228被发现在对照与若干癌症组间含量稳定，可以作为一个候选内参，用来对多种癌症检测结果进行归一化处理。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供ncRNA在诊断肝癌中的应用、肝癌诊断试剂、试剂盒以及诊断系统。本发明的研究发现以SEQ ID NO.1-6所示的ncRNA作为标志物组，用于肝癌诊断，具有更高敏感度和特异度，提高了诊断结果的准确性；本发明为肝癌的诊断提供了一种新的思路。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供检测ncRNA表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述ncRNA包括：hsa-miR-122、U11、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192以及hsa-miR-223。

其中，上述各ncRNA的碱基序列分别如SEQ ID NO.1-6所示。

本发明的实施例研究内容显示，相较于以单一ncRNA或其他ncRNA组合方式作为标志物，将上述6种ncRNA联合作为肝癌诊断的标志物，能够更好地区分肝癌患者和非肝癌患者，具有更高的敏感度和特异度，提高了诊断结果的准确性；为肝癌的诊断提供了一种新的思路。

可选的，在一些实施方案中，所述试剂为检测所述ncRNA的CT值的试剂。

可选的，在一些实施方案中，所述试剂包括如下核酸组合1-6中的至少一者：

核酸组合1：其用于检测hsa-miR-122，其包括SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14以及SEQ ID NO.20所示的核酸；

核酸组合2：其用于检测U11，其包括，SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.15以及SEQ IDNO.21所示的核酸；

核酸组合3：其用于检测hsa-miR-26a，其包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.16以及SEQ ID NO.22所示的核酸；

核酸组合4：其用于检测hsa-miR-27a，其包括SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13、SEQID NO.17以及SEQ ID NO.23所示的核酸；

核酸组合5：其用于检测hsa-miR-192，其包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.18以及SEQ ID NO.24所示的核酸；

以及核酸组合6：其用于检测hsa-miR-223，其包括SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.19以及SEQ ID NO.25所示的核酸。

上述各核酸组合经过了序列优化和改进，采用上述核酸组合检测对应ncRNA的CT值具有好的检测效果。

另一方面，本发明提供一种肝癌的诊断试剂或试剂盒，其包括：检测ncRNA表达水平的检测试剂；所述ncRNA包括：hsa-miR-122、U11、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192以及hsa-miR-22。

本发明提供了一种新的肝癌诊断试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒通过检测上述ncRNA的表达水平，对肝癌进行诊断，具有更高的敏感性和特异性，提高了诊断结果的准确性。

可选的，在一些实施方案中，所述检测试剂为检测所述ncRNA的CT值的试剂。

可选的，在一些实施方案中，所述检测试剂包括如下核酸组合1-6中的至少一者：

另一方面，本发明提供一种检测ncRNA表达水平的方法，所述ncRNA包括：hsa-miR-122、U11、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192以及hsa-miR-223；所述方法包括：将提取自待测样品的总RNA进行逆转录反应，获得逆转录反应产物；对所述逆转录反应产物作为模板进行荧光定量PCR，得到所述ncRNA的表达水平。

可选的，在一些实施方案中，上述方法以非疾病的诊断或治疗为目的。

可选的，在一些实施方案中，所述ncRNA的表达水平以CT值表示。

可选的，在一些实施方案中，在所述逆转录反应体系中含有SEQ ID NO.7-12的核酸。

可选的，在一些实施方案中，在所述逆转录反应体系中，SEQ ID NO.7-12各自的浓度分别为：0.7-0.8μM、0.2-0.3μM、0.4-0.6μM、0.3-0.5μM、0.7-0.8μM以及0.7-0.8μM。

可选的，在一些实施方案中，在逆转录反应体系中，SEQ ID NO.7-12各自的浓度分别为：

0.75μM、0.25μM、0.5μM、0.4μM、0.75μM以及0.75μM。

本发明的实施例研究内容显示，SEQ ID NO.7-12所示的逆转录引物在逆转录反应体系中的比例和浓度对反应结果有影响作用，当以上述比例和浓度存在于逆转录反应体系中时，可以取得更好的检测效果。

可选的，在一些实施方案中，所述荧光定量PCR的PCR反应体系包括如下反应体系：

PCR反应体系1：其含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21所示的核酸；检测hsa-miR-122和hsa-miR-26a；

PCR反应体系2：其含有SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.25所示的核酸；检测U11和hsa-miR-223；

以及PCR反应体系3：其含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的核酸；检测hsa-miR-27a和hsa-miR-192。

将不同ncRNA的荧光定量PCR引物组合到不同的PCR反应体系反应中需要考虑不同引物间的干扰，避免非特异性扩增。经过发明人的创造性劳动发现，按上述PCR反应体系1-3进行PCR时，一方面缩短流程节约工作量，另一方面可以避免引物间干扰避免非特异性扩增，其大大地提高了检测效率。

可选的，在一些实施方案中，在逆转录反应前，所述方法还包括：总RNA提取步骤；所述总RNA提取步骤包括：往含有所述待测样品的RNA提取体系中加入Carrier RNA；

可选的，在一些实施方案中，每200μl所述待测样品对应添加3-6μg Carrier RNA。

本发明实施例的研究内容显示，添加Carrier RNA可以提高ncRNA的得率，添加过多或不添加也影响提取效率；每200μl所述待测样品对应添加3-6μg Carrier RNA，可将ncRNA的得率提高超过10倍。

可选的，在一些实施方案中，所述待测样品为血浆。

另一方面，本发明提供一种肝癌的诊断系统，其包括：信息获取模块、计算模块以及诊断模块；

所述信息获取模块用于获得受试者的检测信息，所述检测信息包括ncRNA的表达水平信息，所述ncRNA包括：hsa-miR-122、U11、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192以及hsa-miR-223；

所述计算模块用于将所述检测信息代入诊断模型计算Y值；

所述诊断模块用于根据所述Y值判断所述受试者的健康状况；如果Y值小于阈值，则判断所述受试者为非肝癌患者，如果Y值大于或等于所述阈值，则判断所述受试者为肝癌患者。

可选的，在一些实施方案中，所述ncRNA的表达水平信息以CT值表示。

可选的，在一些实施方案中，所述诊断模型的计算公式如下所示：

Y＝-0.92411*CT_hsa-miR-122+0.30222*CT_U11-0.060729*CT_hsa-miR-26a+0.55331*CT_hsa-miR-27-0.34901*CT_hsa-miR-192-0.069773*CT_hsa-miR-223+36.11292。

其中，CT_hsa-miR-122、CT_U11、CT_hsa-miR-26a、CT_hsa-miR-27、CT_hsa-miR-192和CT_hsa-miR-223代表对应ncRNA的CT值。

可选的，在一些实施方案中，所述阈值为0。

采用上述公式的计算结果，结合上述阈值，对受试者的健康状况如是否患肝癌进行诊断，具有更高的敏感性和特异度，能取得较为准确性的判断结果。

可选的，在一些实施方案中，所述诊断系统还包括检测模块；所述检测模块用于检测所述受试者的CT值信息。

可选的，在一些实施方案中，所述诊断系统还包括结果显示模块；所述结果显示模块用于显示所述诊断模块得出的诊断结果。例如结果显示模块可通过屏幕显示、语音播报或打印的方式显示诊断结果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为添加不同量和不同厂商Carrier RNA对hsa-miR-122提取效率的影响。

图2为建立诊断模型的肝癌受试组与对照受试组之间的ROC曲线和AUC。

图3为验证诊断模型的肝癌受试组与对照受试组之间的ROC曲线和AUC。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

用于肝癌诊断的6个血浆ncRNA标志物的筛选

一、样本血浆采集流程

样本类型为血浆(EDTA抗凝，非溶血)。

样本血浆采集方法：用无菌注射器抽取受检者外周血到EDTA抗凝管里，立即轻轻颠倒混匀；室温下离心2000g 10分钟，然后将上层透明血浆0.5mL-1mL转移至新的离心管中；16,000g、10分钟离心，然后将上清转移至干净的保存管中，于-80℃保存，并避免反复冻融超过5次。

所有使用的器具均为RNA专用、无RNase和DNase的一次性耗材。

冻存样本的运输采用2-8℃冷藏或冷冻密封运输。

二、受试者入组

按照上述采集流程，采集得到93例受试者血液样本。其中包括53名肝癌组受试者与40名对照组受试者，入组标准如下：

肝癌组受试者：

临床初诊为肝癌，特别是早期肝癌BCLC 0期和A期。

对照组受试者：慢性乙肝患者；肝硬化患者；非肝癌恶性肿瘤患者；健康人。

三、用于肝癌诊断的血浆ncRNA的发现。

通过文献挖掘初步筛选如下具有肝癌诊断潜力的ncRNA：hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-150、hsa-miR-192、hsa-miR-221、hsa-miR-223。另外，has-miR-1228作为一个在对照与肝癌组间含量稳定的miRNA，也被纳入下述靶点初筛流程。最后，将U11纳入初筛流程，考察其是否具有对照与肝癌组间差异。具体步骤为：

(1)提取血浆总RNA

从制备得到的受试者血浆中各吸取200μL到RNase-free离心管中，利用凯杰miRNeasy Serum/Plasma Kit进行包含ncRNA的总RNA提取。操作步骤按照试剂盒说明书进行。

在病毒核酸提取过程中，通常会加入carrier RNA以提高核酸得率，但凯杰miRNeasy Serum/Plasma Kit并未提供carrier RNA，并且，目前尚未发现在血浆ncRNA特别是miRNA提取过程中添加carrier RNA的实际案例。本实施例中首先对carrier RNA效果进行了对比检测。在加入氯仿步骤前，向每份200μL血浆样本加入不同品牌和不同添加量的carrier RNA(6μg/μL)，以hsa-miR-122为检测对象，结果如图1所示。每200μL血浆加入0.5μL新景carrier RNA(6μg/μL)时，hsa-miR-miR-122检测结果CT值与未加入carrier RNA组相比提前了约4.1CT，即得率提高超过10倍。故后续提取实验均加入0.5μL新景carrier RNA(6μg/μL)以提高ncRNA得率。

(2)ncRNA的逆转录

表1.各ncRNA的碱基序列

对于ncRNA中的microRNA：hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-150、hsa-miR-192、hsa-miR-221、hsa-miR-223，设计特异性茎环引物SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29以用于逆转录反应，对于ncRNA中的U11，设计线性引物SEQ ID NO.8以用于逆转录反应。

表2.逆转录引物序列

利用Takara PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser进行ncRNA的逆转录反应得到cDNA，反应体系和过程如下：

表3去除gDNA的体系

反应温度:42℃2min；4℃holding。

表4.逆转录体系

表1反应完毕的RNA mix	10μl
		PrimeScript RT Enzyme Mix I	1μl
逆转录引物(10μM)	4μl
		5x PrimeScript Buffer 2	4μl
RNase-free H<sub>2</sub>O	1μl
		Total	20μl

反应温度:37℃15min；85℃5min；4℃holding。

(3)cDNA梯度稀释与荧光定量PCR反应

为了确定cDNA的合理稀释范围，进行了稀释倍数为2、5、10、100、1000的梯度稀释实验，以hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-150、hsa-miR-192、hsa-miR-221、hsa-miR-223、has-miR-1228、U11作为考察对象，利用TAKARA Taq HS、自配buffer和ABI 7500荧光定量PCR仪，以及使用如下表所示的引物探针序列和反应体系对各个ncRNA进行荧光定量PCR检测。

表5.各ncRNA对应使用的PCR引物和探针序列

表6.PCR反应体系

ddH<sub>2</sub>O	8.5μl
		2×buffer	12.5μl
ROX工作液	0.4μl
		上游引物(10μM)	0.5μl
下游引物(10μM)	0.5μl
		探针(5μM)	0.5μl
Taq酶	0.2μl
		稀释后的cDNA	2μl
合计	25μl

以ABI 7500荧光定量PCR仪为例，反应体系的运行流程为：95℃5min,(95℃15s，60℃40s收集荧光)45个循环。

结果判读以7500software为例，设置AutoBaseline，设置Threshold为Auto，得到各个ncRNA的CT值。然后进行线性回归分析并计算R²，结果如下：

表7.cDNA梯度稀释实验R²汇总

实验组	稀释倍数从2到1000	稀释倍数从5到1000
			hsa-miR-122	0.9626	0.9821
hsa-miR-21	无线性	0.9912
			hsa-miR-150	0.9593	0.9833
hsa-miR-192	无线性	0.9916
			hsa-miR-221	无线性	0.9946
hsa-miR-233	无线性	0.9986
			hsa-miR-26a	无线性	0.9762
hsa-miR-27a	无线性	0.9937
			hsa-miR-1228	无线性	0.9909
U11	0.9988	0.9992

结果显示，cDNA稀释倍数为5至1000倍时，以上所有ncRNA的CT值线性良好；cDNA稀释2至1000倍时，除hsa-miR-122、hsa-miR-150和U11外，其他ncRNA的CT值均无线性，cDNA稀释2倍时的PCR扩增受到明显抑制。故采用5倍稀释cDNA进行靶点初步筛选。

利用上述的引物探针序列和扩增体系，对5倍稀释后的样本cDNA进行荧光定量PCR检测，得到所有ncRNA在各样本中的CT值。

(4)数据统计分析

首先使用IBM SPSS Modeler 18.0软件对所有ncRNA的CT值进行逻辑回归初步分析，各ncRNA在回归模型中的P值如下：

表8.各ncRNA的P值

靶点	P
		hsa-miR-122	0.0005
U11	0.9683
		hsa-miR-21	0.9214
hsa-miR-26a	0.0465
		hsa-miR-27a	0.6580
hsa-miR-150	0.7843
		hsa-miR-192	0.1254
hsa-miR-221	0.8798
		hsa-miR-223	0.0836
has-miR-1228	0.9322

结果显示，U11、hsa-miR-21和has-miR-1228的P值接近1，提示这三个ncRNA在对照与肝癌组间含量相对稳定，可作为内参进行其他各ncRNA的相对表达水平计算。各ncRNA的相对表达水平以两种±deltaCT表示，其中±deltaCT_microRNA-U11＝±(CT_microRNA-CT_U11)，即以U11为参考标志物对生物变异进行归一化；或者±deltaCT_{microRNA-miR-21}＝±(CT_miRNA-CT_miR-21)，即以hsa-miR-21为参考标志物对生物变异进行归一化；或者±deltaCT_{microRNA-miR-1228}＝±(CT_miRNA-CT_miR-1228)，即以has-miR-1228为参考标志物对生物变异进行归一化。使用IBM SPSS Statistics 26软件，分别以两种±deltaCT对各个标志物进行肝癌受试组与对照受试组之间的接受者操作特性曲线(receiver operatingcharacteristic curve，简称ROC曲线)分析，并计算出曲线下面积(Area under theCurve，简称AUC)，结果如下：

表9.AUC结果1

	-(CT<sub>microRNA</sub>-CT<sub>U11</sub>)	-(CT<sub>microRNA</sub>-CT<sub>miR-21</sub>)	-(CT<sub>microRNA</sub>-CT<sub>miR-1228</sub>)
				miR-122	0.751	0.736	0.744
miR-192	0.690	0.647	0.662
				miR-150	0.527	0.509	0.516
miR-221	0.534	0.502	0.507

表10.AUC结果2

	CT<sub>microRNA</sub>-CT<sub>U11</sub>	CT<sub>microRNA</sub>-CT<sub>miR-21</sub>	CT<sub>microRNA</sub>-CT<sub>miR</sub>-1228
				miR-26a	0.618	0.531	0.536
miR-27a	0.600	0.517	0.528
				miR-223	0.610	0.529	0.531

结果显示，所有ncRNA标志物在以U11作为参考标志物时的AUC均优于以has-miR-21或has-miR-1228作为参考标志物时的AUC，即以U11对各ncRNA标志物进行归一化，可以使各ncRNA标志物在区分肝癌受试者与对照受试者时的分类性能更优。hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192和hsa-miR-223在以U11作为参考标志物时的AUC≥0.60。

基于hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-150、hsa-miR-192、hsa-miR-221、hsa-miR-223和U11的CT值或-deltaCT_microRNA-U11＝-(CT_microRNA-CT_U11)，使用IBMSPSS Modeler 18.0软件，利用支持向量机法(support vector machines,简称SVM)进行不同标志物组合的诊断模型建立，然后对不同模型进行肝癌受试组与对照受试组之间的ROC曲线分析，并计算出AUC，结果如下：

表11.标志物-deltaCT_microRNA-U11值模型的AUC

表12.标志物CT值模型的AUC

结果显示，利用包含hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192、hsa-miR-22和U11的CT值建立的诊断模型，能够更好地区分肝癌组与对照组，故选择U11、hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192和hsa-miR-223作为构建肝癌诊断试剂盒的6个血浆ncRNA标志物。

为了进一步提高诊断模型的分类性能，对cDNA进行梯度稀释与荧光定量PCR检测，逆转录体系固定为20μL，利用包含hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192、hsa-miR-22和U11的CT值建立诊断模型并计算AUC，对比结果如下：

表13.cDNA梯度稀释对比实验

实验组	稀释倍数	cDNA加入ddH<sub>2</sub>O(μL)	AUC
				1	20	380	0.923
2	10	180	0.941
				3	5	80	0.892

结果显示，cDNA稀释倍数为10倍，即在20μL cDNA中加入180μL ddH₂O时，诊断模型在区分肝癌组和对照组时的分类性能最好。

实施例2

用于肝癌诊断的血浆ncRNA标志物的逆转录与荧光定量PCR体系构建

为实现以单一反应液同时进行6个血浆ncRNA标志物的逆转录反应，共实施了12批次实验以探索不同逆转录引物的配比，并以参考标志物U11的复孔间deltaCT_U11为评价标准，结果如下：

表14.逆转录体系对比实验结果

在体系1、2中，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10在20μL反应液中加入量＞1μL，此时逆转录体系稳定性受影响较大，出现多靶点曲线异常情况；在体系3、7、8、9中，SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.8加入量比例为1：1：0.5，该4批次实验中出现2次U11重复性差的情况，故舍弃。排除deltaCT_U11＞0.5的体系，经后续优化，最终确定如下体系，可保证各ncRNA的逆转录重复性高。

表15.单管逆转录体系

二、6个血浆ncRNA标志物的荧光定量PCR引物探针组合配制

(1)引物探针筛选

为了使荧光定量PCR检测流程更加便捷高效，故考虑将6个ncRNA的检测形式从单重PCR优化为二重或三重PCR形式。由于miRNA的特异性茎环引物的结构特殊性，单重PCR检测时的部分引物探针在二重以上的PCR体系里已无法呈现出良好的扩增性能，故进行了二个阶段的引物探针筛选工作。阶段一：通过大量批次实验筛选确定各标志物的荧光定量PCR引物与探针；阶段二：通过排列组合筛选二重或三重PCR的标志物组合，结果如下：

表16.二重PCR标志物组合筛选

代表二重PCR扩增曲线正常，

代表二重PCR扩增曲线出现异常。

而在三重PCR的结果中，hsa-miR-27和hsa-miR-223无论在何种三重组合中均无法获得良好的扩增曲线，推测该两靶点由于自身miRNA序列的特殊性导致正向引物无法耐受三重PCR体系。综合以上结果，采用以下的二重PCR体系：组合1为hsa-miR-122(VIC)和hsa-miR-26a(FAM)；组合2为U11(VIC)和hsa-miR-223(FAM)；组合3为hsa-miR-27a(FAM)和hsa-miR-192(VIC)。

(2)二重PCR体系构建

通过进一步引物探针和体系优化，最终实现以如下三管反应体系进行6个血浆ncRNA标志物的荧光定量PCR检测，同时在下述反应体系性能评价中能使检测限低至绝对拷贝数10拷贝：

表17.反应体系1-检测hsa-miR-122(VIC)和hsa-miR-26a(FAM)

ddH<sub>2</sub>O	6.9μl
		2×buffer	12.5μl
ROX工作液	0.4μl
		SEQ ID NO.13(10μM)	0.5μl
SEQ ID NO.14(10μM)	0.5μl
		SEQ ID NO.16(10μM)	0.5μl
SEQ ID NO.20(5μM)	0.5μl
		SEQ ID NO.22(5μM)	0.5μl
Taq酶	0.2μl
		合计	23μl

表18.反应体系2-检测U11(VIC)和hsa-miR-223(FAM)

ddH<sub>2</sub>O	6.9μl
		2×buffer	12.5μl
ROX工作液	0.4μl
		SEQ ID NO.8(10μM)	0.5μl
SEQ ID NO.13(10μM)	0.5μl
		SEQ ID NO.15(10μM)	0.5μl
SEQ ID NO.19(10μM)	0.5μl
		SEQ ID NO.21(5μM)	0.5μl
SEQ ID NO.25(5μM)	0.5μl
		Taq酶	0.2μl
合计	23μl

表19.反应体系3-检测hsa-miR-27a(FAM)和hsa-miR-192(VIC)

在扩增样本cDNA前，先向cDNA产物中加入180μL ddH₂O，混合均匀后，吸取2μL加入反应体系中。进行荧光定量PCR扩增时每个反应孔均收集VIC与FAM两个通道的荧光信号。

以ABI 7500荧光定量PCR仪为例，3个反应体系的运行流程均为：95℃5min,(95℃15s，60℃40s收集荧光)45个循环。

(3)反应体系性能评价

利用Jurkat细胞系基因组DNA对6个血浆ncRNA的阳性参考品进行精确定量，并利用绝对拷贝数10-1000拷贝的阳性参考品作为模板，对3个反应体系的6个标志物进行性能评价，评价指标包含10拷贝模板时荧光定量PCR之CT值的复孔CV％(n＝10)和梯度模板时荧光定量PCR之CT值的线性回归R²，结果如下表：

表20.反应体系性能评价结果

结果显示3个反应体系的最低检测限至少低至10拷贝，同时在10-1000拷贝的模板浓度范围内线性良好。

实施例3

用于肝癌诊断的试剂盒的配制组装

试剂盒包含Carrier RNA和如下两个反应体系：逆转录反应体系、二重PCR反应体系。逆转录反应体系和二重PCR反应体系的配制组装方法如下：

表21.逆转录反应体系和二重PCR反应体系的配制组装

试剂盒能够以1管逆转录混合液进行6个血浆ncRNA的特异性茎环法逆转录，并以3管PCR混合液进行6个血浆ncRNA的同时检测，简便高效。

实施例4

建立与验证用于肝癌诊断的诊断模型

一、建立诊断模型

按照肝癌组与对照组受试者入组标准，采集得到131例受试者血液样本，其中63例肝癌组血液样本，68例对照组血液样本，然后按照血浆制备方法得到受试者血浆样本。

采用凯杰miRNeasy Serum/Plasma Kit和实施例3的试剂盒所带Carrier RNA进行包含ncRNA的总RNA提取，然后利用实施例3的试剂盒进行逆转录与PCR检测。

具体地，按照下表配制逆转录体系：

表22.逆转录体系

试剂	使用量
		逆转录混合液	12μL
RNA	0.1-5μg
		RNase-free H<sub>2</sub>0	补至8μL
Total	20μL

逆转录反应条件如下：37℃15min；85℃5min；4℃holding。

向逆转录所得的每份cDNA中加入180μL ddH₂O，混合均匀后取2μL加入23μL PCR混合液1，取2μL加入23μL PCR混合液2，取2μL加入23μL PCR混合液3，混合均匀后进行荧光定量PCR扩增，扩增程序如下：

表23.荧光定量PCR扩增程序

结果显示，各ncRNA在所有样本中的复孔deltaCT均小于0.5，一致性优异。使用IBMSPSS Modeler 18.0软件，利用支持向量机法(support vector machines,简称SVM)对结果中的各标志物CT值进行诊断模型建立，然后对不同模型进行肝癌受试组与对照受试组之间的ROC曲线分析，并计算出AUC＝0.944，P＜0.0001，此时模型函数如下：

肝癌受试组与对照受试组之间的ROC曲线与AUC如图2所示。

肝癌阳性判断值定为0：Y≥0时，推定为肝癌；Y<0时，推定为非肝癌。此时敏感度93.7％，特异度83.8％。131例样本总符合率87.79％。具体诊断结果如下表所示：

二、验证诊断模型

按照肝癌组与对照组受试者入组标准，采集制备得到134例受试者血浆样本，其中64例肝癌组血浆样本，70例对照组血浆样本，然后按照上述方法和模型对肝癌组与对照组进行诊断。肝癌受试组与对照受试组之间的ROC曲线与AUC＝0.960，P＜0.0001，如图3所示。

肝癌阳性判断值定为0：Y≥0时，推定为肝癌；Y<0时，推定为非肝癌。此时敏感度90.6％，特异度91.4％。134例样本总符合率91.04％。具体诊断结果如下表所示：

本发明创新地在诊断过程中采用了如下措施：

首先，在提取过程加入一定量的carrier RNA，提高得率超过10倍，同时通过大量优化使得检测体系的检测限可低至绝对拷贝数10拷贝，这两点使得在使用成品试剂盒检测超过100例实际样本时，各ncRNA在所有样本里的复孔一致性优异，结果准确可靠。

其次，本发明纳入了在对照与肝癌组间含量稳定的U11作为检测靶点之一，同时利用各ncRNA的CT值建立诊断模型，符合全局归一化的思路，结果显示此CT模型与单一内参的deltaCT值模型相比更加优异。

最后，本发明通过对比实验确认了逆转录产物的合理稀释倍数，并配合经过优化的6in1逆转录体系和3管二重PCR体系。综合上述措施，最终诊断模型的分类性能优异，经验证在134例样本中的总符合率超过90％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉友芝友医疗科技股份有限公司

<120> ncRNA在诊断肝癌中的应用、肝癌诊断试剂、试剂盒以及诊断系统

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210> 2

<211> 360

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

agauucuccu ugugaagucu uccuuucagu ucagaagaaa uggaauucgc ucuucaacuu 60

caggaaguug aaauaaagag uugcuuggau uuuguguuca ccuuuaccaa aaaauggauu 120

ugguaacacu gccacccugc uuugguaaca gagaaagcaa aaagggcuuc ugucgugagu 180

ggcacacgua gggcaacucg auugcucugc gugcggaauc gacaucaaga gauuucggaa 240

gcauaauuuu uugguauuug ggcagcuggu gaucguuggu cccggcgccc uuucuuugcu 300

guuauauguu aggcgaaaua uuacgcguuu ggaguaagug gugcuuuuug uaacugaaaa 360

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

uucaaguaau ccaggauagg cu 22

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

uucacagugg cuaaguuccg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

cugaccuaug aauugacagc c 21

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

ugucaguuug ucaaauaccc ca 22

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacca aaca 54

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaccaacgat caccagc 17

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacag ccta 54

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgc ggaa 54

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgg ctgt 54

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgactg gggt 54

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cagtgcgtgt cgtggag 17

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgagtggagt gtgacaatg 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caactcgatt gctctgcg 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccgagttcaa gtaatccagg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccgagttcac agtggctaag 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgacctatg aattgacagc cg 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cgagtgtcag tttgtcaaat ac 22

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

actggatacg accaaac 17

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

catcaagaga tttcggaag 19

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

actggatacg acagcc 16

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

actggatacg acgcgg 16

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

actggatacg acggctg 17

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctggatacga ctgggg 16

<210> 26

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgactc aaca 54

<210> 27

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacca ctgg 54

<210> 28

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacga aacc 54

<210> 29

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgg ggggc 55

<210> 30

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 30

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 31

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 31

ucucccaacc cuuguaccag ug 22

<210> 32

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 32

agcuacauug ucugcugggu uuc 23

<210> 33

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 33

ucacaccugc cucgcccccc 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gccgagtagc ttatcagact g 21

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cttatcagac tgatgttgag 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cgagtctccc aacccttgt 19

<210> 37

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tctcccaacc cttgta 16

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cgagagctac attgtctgct g 21

<210> 39

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ctggatacga cgaaac 16

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cgagtcacac ctgcctc 17

<210> 41

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ctggatacga cgggg 15

Claims

1.检测ncRNA表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述ncRNA包括：hsa-miR-122、U11、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192以及hsa-miR-223。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述ncRNA的CT值的试剂；

优选的，所述试剂包括如下核酸组合1-6中的至少一者：

核酸组合2：其用于检测U11，其包括，SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.15以及SEQ ID NO.21所示的核酸；

核酸组合4：其用于检测hsa-miR-27a，其包括SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.17以及SEQ ID NO.23所示的核酸；

核酸组合5：其用于检测hsa-miR-192，其包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.18以及SEQ ID NO.24所示的核酸；

以及核酸组合6：其用于检测hsa-miR-223，其包括SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQID NO.19以及SEQ ID NO.25所示的核酸。

3.一种肝癌的诊断试剂或试剂盒，其特征在于，其包括：检测ncRNA表达水平的检测试剂；所述ncRNA包括：hsa-miR-122、U11、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192以及hsa-miR-22。

4.根据权利要求3所述的肝癌的诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为检测所述ncRNA的CT值的试剂；

优选的，所述检测试剂包括如下核酸组合1-6中的至少一者：

5.一种检测ncRNA表达水平的方法，其特征在于，所述ncRNA包括：hsa-miR-122、U11、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-192以及hsa-miR-223；所述方法包括：提取待测样品的总RNA进行逆转录反应，获得逆转录反应产物；以所述逆转录反应产物作为模板进行荧光定量PCR，得到所述ncRNA的表达水平；

优选的，所述ncRNA的表达水平以CT值表示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应的逆转录反应体系中含有SEQ ID NO.7-12的核酸；

优选的，在所述逆转录反应体系中，SEQ ID NO.7-12各自的浓度分别为：0.7-0.8μM、0.2-0.3μM、0.4-0.6μM、0.3-0.5μM、0.7-0.8μM以及0.7-0.8μM；

优选的，在逆转录反应体系中，SEQ ID NO.7-12各自的浓度分别为：

0.75μM、0.25μM、0.5μM、0.4μM、0.75μM以及0.75μM。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的PCR反应体系包括如下反应体系：

PCR反应体系1：其含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示的核酸；

PCR反应体系2：其含有SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.19、SEQID NO.21和SEQ ID NO.25所示的核酸；

以及PCR反应体系3：其含有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的核酸；

优选的，所述方法还包括：总RNA提取步骤；所述总RNA提取步骤包括：往含有所述待测样品的RNA提取体系中加入Carrier RNA；

优选的，每200μl所述待测样品对应添加3-6μg Carrier RNA；

优选的，所述待测样品为血浆。

8.一种肝癌的诊断系统，其特征在于，其包括：信息获取模块、计算模块以及诊断模块；

所述计算模块用于将所述检测信息代入诊断模型计算Y值；

9.根据权利要求8所述的诊断系统，其特征在于，所述ncRNA的表达水平信息以CT值表示；

优选的，所述诊断模型的计算公式如下所示：

Y＝-0.92411*CT_hsa-miR-122+0.30222*CT_U11-0.060729*CT_hsa-miR-26a+0.55331*CT_hsa-miR-27-0.34901*CT_hsa-miR-192-0.069773*CT_hsa-miR-223+36.11292；

优选的，所述阈值为0。

10.根据权利要求9所述的诊断系统，其特征在于，所述诊断系统还包括检测模块；所述检测模块用于检测所述受试者的CT值信息；

优选的，所述诊断系统还包括结果显示模块；所述结果显示模块用于显示所述诊断模块得出的诊断结果。