CN117448442A - 一种用于检测动脉粥样硬化性心血管疾病的3′端2′-o-甲基化修饰微小核糖核酸组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测动脉粥样硬化性心血管疾病的3′端2′‑O‑甲基化修饰微小核糖核酸组合及其应用，所述3′端2′‑O‑甲基化修饰miRNA选自hsa‑miR‑320a‑3p、hsa‑miR‑7d‑3p、hsa‑miR‑486‑5p和hsa‑miR‑423‑3p中的一种或多种。本发明属于动脉粥样硬化性心血管疾病的分子生物检测领域，本发明还提供了一种检测动脉粥样硬化性心血管疾病的试剂盒，所述试剂盒及检测方法能够无创、快速、准确地对动脉粥样硬化性心血管疾病进行辅助筛查检测。

Description

一种用于检测动脉粥样硬化性心血管疾病的3′端2′-O-甲基 化修饰微小核糖核酸组合及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于检测动脉粥样硬化性心血管疾病3′端2′-O-甲基化修饰微小核糖核酸组合及其应用。
背景技术
动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)是危害全球人类健康的主要原因之一。中国ASCVD患病率处于持续上升阶段，死亡率占我国人口总死亡的40％以上，居各种疾病首位，高于肿瘤及其他疾病。现有评估ASCVD发生风险的临床标志物存在各种局限性，如血脂常规检测无法针对急性事件给予有效预警，心肌标志物在心肌损伤后才出现异常，影像学检查技术经济成本高、不利于普检、筛查及监测。因此仍需寻找高灵敏性、特异性及临床应用价值更佳的ASCVD标志物，以利于该病的风险评估、残余风险预防、预警及判别。
微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类内源性、长度为19～22个核苷酸的单链非编码小分子RNA，其可与下游靶蛋白基因信使RNA(mRNA)的3′端非翻译区互补结合，在基因转录后水平调控靶蛋白表达，进而在细胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育，并参与多种疾病过程。不同疾病患者外周血循环中存在特定变化的miRNA谱，是一类极具临床应用潜能的疾病诊断生物学标记和治疗靶标。已有大量研究证实，ASCVD患者循环miRNA表达谱与对照具有明显差异，可作为ASCVD患者危险分层、风险评估、病情监控及预后评估的潜在新指标。
近年来，RNA表观遗传学修饰成为RNA领域最新的研究热点，其中3′端最后一个核糖上的2′-OH位点的甲基化修饰，即3′端2′-O-甲基化(2′-O-methylation,2′Ome)修饰是目前已知的miRNA修饰最常见的形式之一，被修饰的miRNA稳定性增强，并具有更强的生物学功能。大量研究证据表明，外周血中RNA甲基化修饰水平测定在多种疾病诊断中具有极高的临床和转化应用价值，具备成为一类新的液体活检分子标志物潜能。探索ASCVD患者外周血中的2′Ome修饰水平，或可为ASCVD这类复杂疾病的判别、病情监控及预后评估开辟一条新途径和新方法，具有重要的应用前景和意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测动脉粥样硬化性心血管疾病的3′端2′-O-甲基化修饰微小核糖核酸组合及其应用。基于所述标志物的检测方法能够无创、快速、精准地对ASCVD进行辅助诊断检测，在ASCVD筛查诊断研究中具有重要的应用价值。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测ASCVD患者的3′端2′-O-甲基化修饰的microRNA，所述3′端2′-O-甲基化修饰miRNA选自hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-7d-3p、hsa-miR-486-5p和hsa-miR-423-3p或其组合。
本发明前期运用高碘酸钠(NaIO4)氧化处理结合小分子RNA测序技术，对患者血清中2′-O-甲基化修饰miRNA表达谱进行测定，在单样本血清水平，运用茎环PCR结合加尾PCR法验证测序结果，筛选ASCVD患者血清中2′-O-甲基化修饰水平显著、稳定变化的一组miRNA，再在样本血清中对筛选的miRNA进行复筛和验证，获得得4种差异血清2′-O-甲基化修饰miRNA标志物。
根据本发明筛选得到的与ASCVD相关的2′-O-甲基化修饰microRNA标志物为hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-7d-3p、hsa-miR-486-5p和hsa-miR-423-3p，其在至少一种靶血清中与在至少一种健康对照血清中差异表达，因此可以反映出在ASCVD患者及健康者中的差异表达，体现了ASCVD诊断的高敏感性和高特异性。
在具体的实施方案中，本发明所涉及的2′-O-甲基化修饰的miRNA标志物的基因序列为，2′Ome-miR-320a-3p对应的序列为SEQ ID NO:1；2′Ome-miR-7d-3p对应的序列为SEQID NO:2；2′Ome-miR-486-5p对应的序列为SEQ ID NO:3；2′Ome-miR-423-3p对应的序列为SEQ ID NO:4。
第二方面，本发明提供检测血清3′端2′-O-甲基化修饰miRNA的系统在制备筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用，所述血清2′Ome-microRNA为2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p或其组合。
在具体的实施方案中，所述2′Ome-miR-320a-3p的序列如SEQ ID NO.1所示的单链RNA，2′Ome-miR-7d-3p的序列如SEQ ID NO.2所示的单链RNA，2′Ome-miR-486-5p的序列如SEQ ID NO.3所示的单链RNA，2′Ome-miR-423-3p的序列如SEQ ID NO.4所示的单链RNA。
在具体的实施方案中，所述检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA的系统包括检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA试剂和/或仪器。
在具体的实施方案中，所述产品包括系统，所述系统包括试剂和/或系统，所述试剂包括制剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供一种用于筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的试剂盒，其特征在于，含有检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA的试剂，所述2′Ome-microRNA为2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p或其组合。
在具体的实施方案中，所述2′Ome-miR-320a-3p的序列如SEQ ID NO.1所示的单链RNA，2′Ome-miR-7d-3p的序列如SEQ ID NO.2所示的单链RNA，2′Ome-miR-486-5p的序列如SEQ ID NO.3所示的单链RNA，2′Ome-miR-423-3p的序列如SEQ ID NO.4所示的单链RNA。
在具体的实施方案中，所述试剂盒采用茎环法和加Poly(A)尾法两种RT-qPCR技术检测血清3′端2′-O-甲基化修饰miRNA表达水平变化。
在具体的实施方案中，采用茎环法为原理的RT-qPCR不能准确识别miRNA的3′端2′-O-甲基化位点，而加Poly(A)尾RT-qPCR因2′-O-甲基化位点显著抑制了Poly(A)聚合酶活性，可以准确、可靠地测量检测血清3′端2′-O-甲基化修饰miRNA修饰水平变化。
在具体的实施方案中，采用茎环法为原理的RT-qPCR中，逆转录酶不能准确识别miRNA的3′端2′-O-甲基化位点，而加Poly(A)尾RT-qPCR中，逆转录酶Poly(A)聚合酶准确识别miRNA的3′端2′-O-甲基化位点。
在具体的实施方案中，校准茎环法和加尾法的扩增效率后，分别逆转录等量的RNA，加尾法荧光定量检测出现延迟扩增。
在具体的实施方案中，所述试剂盒还包括两种RT-qPCR检测试剂，分别为茎环法反转录试剂部分和荧光定量检测试剂部分，加尾法反转录试剂部分和荧光定量检测试剂。
优选的，所述茎环法反转录试剂部分包括无酶水、逆转录酶、dNTPs、逆转录酶缓冲液、RT-Primer等组分。
优选的，所述茎环法荧光定量检测试剂部分包括无酶水、rTaq酶、10Xbuffer(Mg2+plus)、dNTPs、Probe TM等组分。
优选的，所述加尾法反转录试剂部分包括无酶水、5x miScript Hispec Buffer、10x miScript Nucleics Mix、MiScript Reverse Transcriptase Mix等组分。
优选的，所述加尾法荧光定量检测试剂部分包括无酶水，QuantiTect SYBR GreenPCR Master、10xmiScript universal Primer、Forward Primer Assay等组分。
第四方面，本发明提供一种筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的系统，所述系统包括：
(1)样品扩增模块：提取待测样本的血清miRNA，使用前文任一所述的试剂盒对目标microRNA进行茎环法反转录，再进行实时荧光定量反应，检测荧光信号；对目标microRNA进行加尾法反转录，再进行实时荧光定量反应，检测荧光信号；
(2)结果分析模块：以茎环PCR结合加尾PCR法产生的循环数(CT值)差值(ΔCT值)的2ΔCt值视为miRNA 2′-O-甲基化修饰水平差异。
第五方面，本发明还保护前文所述的试剂盒、前文所述的系统在制备筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用。
本发明的动脉粥样硬化性心血管疾病包括冠心病(急性冠脉综合征、稳定性冠心病、心力衰竭)、脑血管疾病(短暂性脑缺血发作、缺血性卒中、出血性脑卒中)及外周动脉疾病等。
本发明所涉及的2′-O-甲基化修饰的miRNA标志物的基因序列为，2′Ome-miR-320a-3p对应的序列为SEQ ID NO:1；2′Ome-miR-7d-3p对应的序列为SEQ ID NO:2；2′Ome-miR-486-5p对应的序列为SEQ ID NO:3；2′Ome-miR-423-3p对应的序列为SEQ ID NO:4。
本发明的有益效果在于：本发明通过ASCVD患者和健康对照组血清中2′-O-甲基化修饰的miRNA的表达谱分析，发现57种miRNA在ASCVD患者血清中2′-O-甲基化修饰水平明显高于健康对照，进一步测试11种miRNA是否和测序结果中甲基化修饰水平一致；发现4种2′-O-甲基化修饰的miRNA可以作为分子标志物在ASCVD的诊断试剂或试剂盒中进行临床应用。
继续通过实验研究得到这4种2′-O-甲基化修饰的miRNA：2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p在ASCVD患者血清中表达水平显著、稳定变化；ROC曲线表明2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p可单独，也可以联合作为ASCVD辅助鉴别的分子标志物，为ASCVD的诊断和治疗提供多种新的应用方向。有研究报道miRNA对疾病的提前诊断和发病预测都有很好的特异性和敏感性，且稳定性好，检测结果可靠。最新研究已证实人类肿瘤组织中miRNA存在不同程度的2′-O-甲基化修饰，被修饰的miRNA稳定性增强，并具有更强的生物学功能，具备成为一类新的风险评估和鉴别诊断的分子标志物潜能。本发明的标本为受试者外周血，样品标本易于获得，临床操作性强且对受试者属于无创伤性。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为根据测序结果，用茎环法和加尾法RT-qPCR测定11种2′-O-甲基化修饰的miRNA在ASCVD组和对照组中的差异表达。
图2为对四种2′-O-甲基化修饰水平最显著的microRNA扩大样本量进行RT-qPCR测定。
图3为ASCVD和对照组的2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p的ROC分析以及四个miRNA联合的ROC分析。
图4为所述标志物的发现和验证方案。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值。
主要仪器：TL988-Ⅳ96实时荧光定量PCR仪来源为西安天隆科技有限公司，AxygenMaxyGeneⅡ梯度PCR扩增仪来源于美国康宁公司，高速冷冻离心机来源为德国Eppendorf公司。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测ASCVD患者2′-O-甲基化修饰的miRNA的方法，所述方法包括：
1、样本收集
研究对象：2021年1月至2022年12月在东部战区总医院心血管内科收治的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者70例。所有患者均经冠状动脉造影术证实，排除其他心血管疾病、血液系统疾病、内分泌系统疾病及其他严重器质性疾病患者。同期选取东部战区总医院健康体检中心的健康对照者60例。本研究通过东部战区总医院医学伦理学委员会批准许可，所有参与者均给出了书面知情同意书。
2、血清样本制备
含分离胶的促凝真空采血管收集患者治疗前及健康人对照禁食12h以上的静脉血3～5mL，血液标本采集后迅速在室温下3500r/m离心5min，离心半径13.5cm，分离上层血清置于-80度保存。所有标本均须避免严重脂血及溶血。
3、血清miRNA提取
融化血清后，用300μL DEPC水和相应的100μL血清样本，充分混匀后加入200μL的RNA提取酚试剂，立即震荡混匀。再加入200μL的氯仿，震荡混匀后静置20min，4℃16000g离心20min后吸取上清液约300μL于另一管，加入30μL醋酸钠和600μL的异丙醇。颠倒混匀成均一体系后，放于-20℃冰箱静置过夜沉淀。4℃16000g离心20min后弃上清，加入用DEPC水配置的75％的乙醇溶液1mL，上下颠倒EP管至管底沉淀漂起，再次用4℃16000g离心20min。再次弃上清，倒扣于桌面室温干燥10-20min。加20μLDEPC水溶解RNA，于-80℃冰箱保存或进行下一步实验。
实施例2
从测序结果中选取有表达变化的11种2′-O-甲基化修饰microRNA。采用36例ASCVD患者、36例健康对照作为独立样本，用定量RT-PCR法验证其是否与测序结果表达一致。11种2′-O-甲基化修饰microRNA序列见表1。
表1：11种2′-O-甲基化修饰microRNA序列
1、茎环法反转录反应和实时荧光定量反应
使用茎环法反转录对目标microRNA进行反转录，具体体系如表2所示。
表2：茎环法反转录体系
体系组分 10ul体系
无酶水 3.5ul
逆转录酶缓冲液(5Xbuffer) 2ul
dNTPs 1ul
RT-Primer(无色探针) 1ul
逆转录酶 0.5ul
RNA 2ul
反转录的反应条件为16℃30min，42℃30min,85℃5min，4℃停，进行后续PCR反应。
使用茎环法实时荧光定量反应对目标microRNA进行扩增，具体体系如表3所示。
表3：茎环法实时荧光定量反应体系
体系组分 20ul体系
无酶水 13.77ul
10xbuffer(Mg2+plus) 3.2ul
dNTPs 0.4ul
Probe TM(粉色探针) 0.33ul
rTaq酶 0.3ul
cDNA 2ul
扩增反应使用的仪器在TL988-Ⅳ96实时荧光定量PCR仪上进行，反应程序设置见表4，其它设置均为系统默认值。茎环法实时荧光定量试剂盒逆转录引物和qPCR扩增正向引物来源于美国ABI公司TaqManTMMicroRNA Assay，其余试剂来源于Takara。
表4：茎环法样本扩增条件。
2、加尾法反转录反应和实时荧光定量反应
使用加尾法反转录对目标microRNA进行反转录，具体体系如表5所示。
表5：加尾法反转录体系。
体系组分 10ul体系
5x miScript Hispec Buffer 2ul
10x miScript Nucleics Mix 1ul
MiScript Reverse Transcriptase Mix 1ul
RNA 6ul
反转录的反应条件为37℃60min，95℃5min,4℃停。每10μL的反转录反应物中加入30μL无酶水轻柔混匀，瞬离，进行后续PCR反应。
使用加尾法法实时荧光定量反应对目标microRNA进行扩增，如表6所示。
表6：加尾法法实时荧光定量反应体系。
体系组分 20ul体系
无酶水 4ul
QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10ul
10xmiScript universal Primer 2ul
Forward Primer Assay 2ul
cDNA 2ul
扩增反应使用的仪器在TL988-Ⅳ96实时荧光定量PCR仪上进行，反应程序设置见表7，其它设置均为系统默认值。加尾法实时荧光定量试剂盒qPCR正向引物来源于广州锐博生物技术有限公司的miDETECT A Track microRNA Forward Primer，其余试剂来源QIAGEN。
表7：加尾法样本扩增条件。
每一个样本均做三个复孔，统计时取平均数。熔解曲线查看引物特异性，单峰为特异性扩增。采用相对定量的方法来检测ASCVD与正常健康对照血清中microRNA3′端2′-O-甲基化修饰水平，以2ΔCt值(ΔCt＝Ct加尾-Ct茎环)作为目的基因在血清中的相对表达水平。
3、表达水平分析
利用SPSS软件进行结果分析，发现ASCVD患者血清11种3′端2′-O-甲基化修饰的miRNA中，hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-7d-3p、hsa-miR-486-5p和hsa-miR-423-3p的2′-O-甲基化修饰水平均显著高于健康对照，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)，结果见图1。
实施例3
本实施例按照实施例1和2所述方法，扩大样本量，在70例ASCVD患者和60例正常对照样本进行检测，进一步地验证本发明所述的试剂盒的使用效果。
通过分析70例ASCVD患者和60例健康对照中血清中的2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p的表达水平来评估其对ASCVD的检测效果。结果表明，70例ASCVD患者血清中2′Ome-miR-320a-3p的相对表达量为10.9790(5.0865～24.4766)，与60例健康对照的相对表达量5.1533(3.0282～14.8931)相比，差异有统计学意义(P<0.01)，具有显著性差异。70例ASCVD患者血清中2′Ome-miR-7d-3p的相对表达量为8.0983(3.1785～18.8959)，与60例健康对照的相对表达量1.3732(0.4484～4.1180)相比，差异有统计学意义(P<0.001)，具有极显著性差异。70例ASCVD患者血清中2′Ome-miR-486-5p的相对表达量为2.1994(1.3226～5.4014)，与60例健康对照的相对表达量0.8546(0.5355～1.7198)相比，差异有统计学意义(P<0.001)，具有极显著性差异。70例ASCVD患者血清中2′Ome-miR-486-5p的相对表达量为93.7015(27.9221～342.1140)，与60例健康对照的相对表达量54.9832(15.3765～117.1357)相比，差异有统计学意义(P<0.05)。ASCVD患者血清中2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p的相对表达量都高于健康人组，见图3。
进一步，我们使用ROC曲线及曲线下面积(area under the curve，AUC)分析来验证2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p作为ASCVD诊断分子标志物的潜能。分析显示，血清标志物2′Ome-miR-320a-3p曲线下面积为0.657(95％CI:0.563～0.750,P＝0.002)、2′Ome-miR-7d-3p曲线下面积为0.772(95％CI:0.690～0.855,P<0.001)、2′Ome-miR-486-5p曲线下面积为0.797(95％CI:0.722～0.872,P<0.001)，2′Ome-miR-423-3p曲线下面积为0.615(95％CI:0.519～0.712,P＝0.024)如表8所示。进一步地，将四种2′Ome-microRNAs形成的联合标志物组合，分析显示其AUC达到0.871(95％CI:0.811～0.932，P<0.001)，大于单一miRNA的AUC，结果显示四个miRNA联合检测组合有助于提高对ASCVD鉴别的效果，如图4所示。说明2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p不仅分别可以区分ASCVD患者与健康对照，可以作为ASCVD中的诊断生物标记物，这四种标志物联合也可以作为ASCVD患者和健康对照的区分标记物，以提早对ASCVD患者进行筛查。检测的血液标本易于获得，临床可操作性强且属于无创性操作，而且循环2′Ome-microRNA稳定性好，检测便利，因此，2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p具有作为ASCVD无创性检验生物标志物值得推广和临床应用。
表8：四种2′Ome-microRNA的AUC值
AUC 95％CI P值
2′Ome-miR-320a-3p 0.657 0.563～0.750 0.002
2′Ome-miR-7d-3p 0.772 0.690～0.855 P<0.001
2′Ome-miR-486-5p 0.797 0.722～0.872 P<0.001
2′Ome-miR-423-3p 0.615 0.519～0.712 0.024
以上四种联合 0.871 0.811～0.932 P<0.001
综上，本发明筛选发现了4种与动脉粥样硬化性心血管疾病相关的血清标志物，并以基于此标志物制备了诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的试剂盒，开发了基于此标志物的诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的方法，并对所述方法进行验证(如图4)，结果表明，本发明提供的4种血清标志物2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p在动脉粥样硬化性心血管疾病血清中表达水平显著上调，4个microRNAs联合检测对动脉粥样硬化性心血管疾病诊断的敏感度、特异性较好，有助于动脉粥样硬化性心血管疾病的诊断，具有潜在的临床应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA的系统在制备筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用，其特征在于，所述2′Ome-microRNA选自2′Ome-miR-320a-3p、2′Ome-miR-7d-3p、
2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p或其组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述2′Ome-miR-320a-3p的序列如SEQ IDNO.1所示的单链RNA，2′Ome-miR-7d-3p的序列如SEQ ID NO.2所示的单链RNA，2′Ome-miR-486-5p的序列如SEQ ID NO.3所示的单链RNA，2′Ome-miR-423-3p的序列如SEQ ID NO.4所示的单链RNA。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA的系统包括检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA试剂和/或仪器。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括系统，所述系统包括试剂和/或系统，所述试剂包括制剂或试剂盒。
5.一种用于筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的试剂盒，其特征在于，含有检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA的试剂，所述2′Ome-microRNA选自2′Ome-miR-320a-3p、
2′Ome-miR-7d-3p、2′Ome-miR-486-5p和2′Ome-miR-423-3p或其组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述2′Ome-miR-320a-3p的序列如SEQID NO.1所示的单链RNA，2′Ome-miR-7d-3p的序列如SEQ ID NO.2所示的单链RNA，2′Ome-miR-486-5p的序列如SEQ ID NO.3所示的单链RNA，2′Ome-miR-423-3p的序列如SEQ IDNO.4所示的单链RNA。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，采用茎环法和加Poly(A)尾法两种RT-qPCR技术检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA表达水平变化；
优选的，采用茎环法为原理的RT-qPCR不能准确识别miRNA的3′端2′-O-甲基化位点，而加Poly(A)尾RT-qPCR因2′-O-甲基化位点显著抑制了Poly(A)聚合酶活性，可以准确、可靠地测量检测3′端2′-O-甲基化修饰miRNA修饰水平变化；
优选的，采用茎环法为原理的RT-qPCR中，逆转录酶不能准确识别miRNA的3′端2′-O-甲基化位点，而加Poly(A)尾RT-qPCR中，逆转录酶Poly(A)聚合酶准确识别miRNA的3′端2′-O-甲基化位点；
优选的，茎环法和加尾法分别逆转录等量RNA，加尾法荧光定量检测出现延迟扩增。
8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括茎环法反转录试剂部分和荧光定量检测试剂部分，加尾法反转录试剂部分和荧光定量检测试剂部分；
优选的，茎环法反转录试剂部分由无酶水、逆转录酶、dNTPs、逆转录酶缓冲液、RT-Primer组成；
优选的，茎环法荧光定量检测试剂部分由无酶水、rTaq酶、10Xbuffer(Mg2+plus)、dNTPs、Probe TM组成；
优选的，加尾法反转录试剂部分由无酶水、5x miScript Hispec Buffer、10xmiScript Nucleics Mix、MiScript Reverse Transcriptase Mix组成；
优选的，加尾法荧光定量检测试剂部分由无酶水，QuantiTect SYBR Green PCRMaster、10xmiScript universal Primer、Forward Primer Assay组成。
9.一种筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的系统，其特征在于，所述系统包括：
(1)样品扩增模块：提取待测样本的血清miRNA，使用权利要求4-6任一所述的试剂盒对目标microRNA进行茎环法反转录，再进行实时荧光定量反应，检测荧光信号；对目标miRNA进行加尾法反转录，再进行实时荧光定量反应，检测荧光信号；
(2)结果分析模块：以茎环PCR结合加尾PCR法产生的循环数(CT值)差值(ΔCT值)的2ΔCt值视为miRNA 2′-O-甲基化修饰水平差异。
10.权利要求5-8任一所述的试剂盒、权利要求9所述的系统在制备筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断动脉粥样硬化性心血管疾病的产品中的应用；
优选的，所述动脉粥样硬化性心血管疾病选自冠心病、脑血管疾病或外周动脉疾病。
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