CN109563548B - 用于鉴定胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤的体外方法 - Google Patents

用于鉴定胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤的体外方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于筛选具有发展胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的风险的对象的体外方法，其包括：(a)测量从待筛选的对象分离出的生物样品中获得的至少hsa‑miR‑33a*、或至少hsa‑miR‑320a、或至少hsa‑let‑7e、或至少hsa‑let‑7f、或至少hsa‑miR‑1257、或至少hsa‑miR‑1304、或至少hsa‑miR‑151b、或至少hsa‑miR‑3120‑3p、或至少hsa‑miR‑3133、或至少hsa‑miR‑3714、或至少hsa‑miR‑4468、或至少hsa‑miR‑4639‑5p、或至少hsa‑miR‑4713‑5p、或至少hsa‑miR‑4714‑5p、或至少hsa‑miR‑4770、或至少hsa‑miR‑548d‑3p、或至少hsa‑miR‑761的表达模式或水平；(b)将待筛选的对象的所述至少hsa‑miR‑33a*、或至少hsa‑miR‑320a、或至少hsa‑let‑7e、或至少hsa‑let‑7f、或至少hsa‑miR‑1257、或至少hsa‑miR‑1304、或至少hsa‑miR‑151b、或至少hsa‑miR‑3120‑3p、或至少hsa‑miR‑3133、或至少hsa‑miR‑3714、或至少hsa‑miR‑4468、或至少hsa‑miR‑4639‑5p、或至少hsa‑miR‑4713‑5p、或至少hsa‑miR‑4714‑5p、或至少hsa‑miR‑4770、或至少hsa‑miR‑548d‑3p、或至少hsa‑miR‑761的表达模式或水平与已经建立的表达模式或水平对比，其中至少任何上述miRNA的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。

Description

用于鉴定胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤的体外方法
技术领域
本发明可以被包括在使用特定的生物标志物来鉴定给定的疾病或病症的个性化医疗领域中。具体地，本发明中使用一些微小RNA(也称为miRNA或miR-)来鉴定具有发展胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)，优选胰腺导管腺癌(PDAC)的风险的人类对象。
背景技术
胰腺导管腺癌(PDAC)是西方国家癌症死亡的第四大原因，并且在所有主要恶性肿瘤的预后最差，五年生存率仅为6％。到诊断时，大多数患者出现无法进行根治性切除术的局部晚期或转移性疾病，平均存活期不到1年{Stathis，#2281；Raimondi，2009#2150}。这些可怕的统计数据是由于该肿瘤的高侵袭性、对可用治疗的反应有限，大多数情况下对化疗和放射的抗性以及缺乏早期检测方法{Hezel，2006#2114；Costello，#3039}。
目前，最好的诊断测试包括计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)结合磁共振胰胆管造影(MRCP)和内镜超声引导细针穿刺活检(EUS-FNA){Seufferlein，#3163}。随着这些成像技术的使用越来越多，导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)(PDAC最常见的囊性前体病变)的诊断不断增加，占切除胰腺肿瘤的高达25％{Andrejevic-Blant，2007#3175}。然而，它们不足以在发育异常的早期阶段评估IPMN的恶性或检测胰腺癌{Vilmann，2006#3195}。因此，迫切需要更深入地了解PDAC的分子致癌作用、新的早期诊断生物标志物和有效的治疗靶标以改善该恶性疾病的结果。
微小RNA(miRNA)是19-25个核苷酸的小内源性非编码RNA，其通过抑制mRNA翻译或靶向mRNA以降解而在转录后水平负调节基因表达(Bartel，2004#3178)。估计miRNA可调节多于60％的蛋白质编码基因的翻译，并参与调节广泛的生物过程，如细胞增殖、分化、凋亡和发育{Esteller，#3179；Di Leva，#3158}。它们的失调在癌症的发展和进展中起着至关重要的作用，它们可以通过靶向一种或甚至数百种mRNA来起到肿瘤抑制因子或癌基因的作用{Esquela-Kerscher，2006#968}。
miRNA的异常表达已在人类癌症中广泛报道，包括PDAC及其前体病变{Zhang，2009#3189；Yu，#3183}。正常组织和恶性组织之间miRNA的差异表达可能由miRNA基因的染色体改变引起，其中许多位于癌症相关基因组区域、DNA点突变、表观遗传机制或miRNA加工机制中改变{Di Leva，#3181}。一些对miRNA表达谱的研究已经确定了PDAC的miRNA特征，这些特征与诊断、分期、进展、预后和对治疗的反应相关{Jamieson，#3186；Giovannetti，#265；Papaconstantinou，#3193；Giovannetti，#3191}。
对于本发明，我们已经使用下一代测序技术首次分析了miRNome PDAC和IPMN。我们已经鉴定并发现了新的候选微小RNA作为早期检测胰腺癌的生物标志物。
发明内容
本发明提供了一种通过优选微创的方法精确筛选和诊断患有或正发展胰腺癌的对象的明确的解决方案，所述方法不仅能够检测处于患胰腺癌风险的患者，而且能够检测可能患有导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的患者，因此能够在早期鉴定处于风险中的对象。
附图说明
图1.示出了研究设计的流程图。对一组胰腺组织样品进行下一代测序以发现生物标志物。通过qRT-PCR在2个独立的样品集合中分析候选miRNA。FDR：错误发现率；FC：倍数改变；IQR：四分间距。
图2.下一代测序结果。A)PDAC对比健康。热图TOP 50；B)IPMN对比健康。热图TOP50；C)组间分析示出基于miRNA表达的样品聚类。
图3.PDAC和IPMN样品共享共同的失调的微小RNA。A)文氏图示出PDAC和IPMN组中与正常胰腺样品(健康组)相比显著失调的miRNA。B)NGS数据的火山图。绿色：通常在PDAC和IPMN组中失调的miRNA(FDR<0.05)。深绿色：PDAC和IPMN组中强烈上调的miRNA(FC>2，FDR<0.05，所有样品的平均计数>400)。橙色交叉：训练组中被选中通过qRT-PCR进行验证的miRNA。
图4.研究结果的工作流程。两个独立样品组的PDAC和IPMN样品中的miRNA数量对比于健康胰腺组织显著过表达。
图5.8种miRNA的受试者工作特征(ROC)曲线说明了PDAC患者的高辨别力。
具体实施方式
定义
出于本发明的目的，阐述以下定义，包括：
-术语“筛选”理解为，在一般人群中检查或测试处于患有胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)，优选胰腺导管腺癌(PDAC)的风险的一组个体，其目的是将健康个体与患有未诊断的胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的患者或处于患所述适应症的高风险的患者区分开。
-术语“胰腺癌”是术语“胰腺瘤形成”的同义词，并且包括公认的医学定义。
-表述“胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)”是指在胰管内(导管内)生长的一种肿瘤(瘤)，其特征在于肿瘤细胞产生浓稠液体(粘液)。导管内乳头状粘液性瘤是重要的，因为如果不对它们进行治疗，它们中的一些会发展成侵袭性癌症(从良性肿瘤转变为恶性肿瘤)。正如结肠息肉如果不进行治疗就会发展成结肠癌，一些导管内乳头状粘液性瘤也会发展为侵袭性胰腺癌。导管内乳头状粘液性瘤可以是在胰腺肿瘤发展为侵袭性且难以治疗的癌症之前治疗胰腺肿瘤的机会。
-术语“hsa-miR-33a*”在本文中也称为hsa-miR-33a-3p MIMAT0004506，并且由以下序列组成：CAAUGUUUCCACAGUGCAUCAC。
-表述“微创生物样品”是指没有使用除用于从患者采血的细针以外的有害器械并因此没有伤害病人而从患者体内取出的任何样品。具体地，微创生物样品在本发明中指的是：血液、血清或血浆样品。
-本发明中描述的任何微小RNA或其组合的术语“上调”或“过表达”是指其表达水平相对于给定的“阈值”或“截止值”增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多。
-当提及本发明中描述的miRNA的表达水平时，术语“阈值”或“截止值”是指以给定的灵敏度和特异性指示，如果患者的表达水平高于所述阈值或截止值或参考水平，那么对象可能患有结肠直肠癌或结肠直肠腺瘤的参考表达水平。
-术语“包括”意指包括但不限于“包括”一词之后的任何内容。因此，术语“包括”的使用表示所列出的元素是必需的或强制性的，但是其他元素是可选的并且可以存在或不存在的。
-“由...组成”意味着包括并限于短语“由......组成”内的任何内容。因此，短语“由...组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且不存在其他元素。
-还应注意，本文使用的术语“试剂盒”不限于任何特定装置，并且包括适用于实施本发明的任何装置，例如但不限于微阵列、生物阵列、生物芯片或生物芯片阵列。
用于建立表达的阈值或截止水平的各种统计和数学方法在现有技术中是已知的。例如，可以基于来自受试者工作特征(ROC)图的数据来选择特定生物标志物的阈值或截止表达水平，如本发明的实施例和附图中所述。本领域技术人员将理解，这些阈值或截止表达水平可以变化，例如，通过沿着特定生物标志物或其组合的ROC图移动，以针对灵敏度或特异性获得不同值，从而影响总体测定性能。例如，如果目的是获得从临床角度上可靠的诊断方法，则我们应该尽力达成高灵敏度。然而，如果目标是获得具有成本效益的方法，我们应该尽力达成高特异性。最佳截止值是指：从特定生物标志物的ROC图上获得的能够产生最佳灵敏度和特异性的值。在阈值(截止值)范围上计算灵敏度和特异性值。因此，可以选择阈值或截止值，以使得在测定的患者群体的至少60％中，或在测定的患者群体的至少65％、70％、75％或80％中，灵敏度和/或特异性为至少约70％，并且可以为，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。
因此，本发明中引用的每个实施方式优选通过在从待诊断或筛选的对象分离的样品中测定至少本发明中引用的微小RNA的表达水平，并将所述微小RNA的表达水平与预定阈值或截止值比较，其中所述预定阈值或截止值对应于在ROC曲线中的所希望的灵敏度下与最高特异性相关的所述微小RNA的表达水平，所述预定阈值或截止值的计算是基于处于发展胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的风险中的患者群体中测得的微小RNA的表达水平，其中所述微小RNA中的至少一种相对于所述预定截止值的过表达，以所希望的灵敏性指示对象患有胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
描述
在这项研究中，我们通过下一代测序在一组胰腺样品(包括PDAC、IPMN和健康胰腺)中进行了全基因组miRNA分析。我们的研究结果表明，基于组织的miRNA表达可以区分PDAC患者和对照对象，以及区分前期病变IPMN患者和健康个体。据我们所知，这是在胰腺癌背景下应用大规模平行测序进行生物标志物发现的首次报告之一。这种高通量分析已经允许鉴定用于检测携带PDAC或IPMN的患者的大量推定miRNA生物标志物。此外，我们在2个不同的样品组中验证了30种miRNA的表达模式，从而证实了它们区分PDAC或IPMN与对照的能力。在这个意义上，可高度区分PDAC或IPMN与健康组织的上述30种微小RNA的列表如下：miR-103a、miR-151a-5p、miR-155、miR-16、miR-181a、miR-181b、miR-192、miR-21、miR-221、miR-23a、miR-29a、miR-429、miR-93、miR-320a、let-7e、let-7f、miR-1257、miR-1304、miR-151b、miR-3120-3p、miR-3133、miR-33a*、miR-3714、miR-4468、miR-4639-5p、miR-4713-5p、miR-4714-5p、miR-4770、miR-548d-3p和miR-761。这些miRNA中的一些代表以前没有报道过的新的生物标志物。最后，我们已经定义了能够以高准确度区分PDAC患者的最佳的基于miRNA的预测因子。
首次将miRNA与癌症关联是来自Calin等人的研究，其中他们在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中表征了染色体13q14，并展示miR-15和miR-16在约70％的CLL病例中缺失或下调{Calin，2002#3180}。从那以后，已经在几种人类癌症中描述了miRNA的表达改变，例如乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺癌和胰腺癌等{Piepoli，#3188}。Lu等人对来自334个白血病和实体癌症患者的217种miRNA进行了系统分析，并发现miRNA表达谱根据肿瘤的发育谱系和分化状态将人类癌症分类{Lu，2005#1980}。与此一致，我们的全基因组miRNome分析显示PDAC、IPMN和健康胰腺组织具有差异miRNA谱。近年来，一些针对胰腺组织中大规模miRNA谱的研究已经鉴定了许多差异表达的miRNA，这主要通过微阵列、qRT-PCR卡或基因芯片进行。尽管测量平台和实验室方案之间存在差异，之前的报告和我们的研究之间的样品量也存在差异，我们已经能够确认来自不同研究的公布结果。在通过qRT-PCR验证的30种miRNA中，我们已经发现以前报道的PDAC组织中改变的miRNA的一致表达(即miR-103a、miR-151a-5p、miR-155、miR-16、miR-181a、miR-181b、miR-192、miR-21、miR-221、miR-23a、miR-29a、miR-429和miR-93的上调){Jamieson，#3186；Piepoli，#3188；Bloomston，2007#3182；Szafranska，2007#3190；Lee，2007#3192；Bauer，#3207}，但我们还鉴定了几种在PDAC中显著上调的新miRNA(17种miRNA)(miR-320a、let-7e、let-7f、miR-1257、miR-1304、miR-151b、miR-3120-3p、miR-3133、miR-33a*、miR-3714、miR-4468、miR-4639-5p、miR-4713-5p、miR-4714-5p、miR-4770、miR-548d-3p和miR-761)。
此外，下表1提供了在血浆集合中分析的自上述30种miRNA的列表中的17种miRNA的PDAC或IPMN与健康患者之间的表达的比较。
Figure BDA0001920106910000051
表1.PDAC或IPMN与健康患者之间表达的比较。
另外，下表2提供了在血浆集合中分析的上述17种miRNA的ROC曲线分析。
Figure BDA0001920106910000061
表2.在血浆集合中分析的上述17种miRNA的ROC曲线分析。
此外，我们在此提供来自上述血浆集合的最佳miRNA组合的ROC曲线分析(参见下表3)。
Figure BDA0001920106910000062
Figure BDA0001920106910000071
表3.来自表1的血浆集合的最佳miRNA组合的ROC曲线分析。
此外，由于IPMN病变呈现的发病率增加和恶性风险高，我们的目的是研究IPMN以及PDAC的miRNome，以鉴定用于检测所述两种胰腺瘤形成的候选miRNA。到目前为止，很少有研究分析IPMN中的miRNA表达。Habbe等人表明，所分析的12种RNA中的10种显著过表达，其在胰腺癌中被上调{Habbe，2009#2164}。Matthaei H等人和Lubezky S等人展示了某些miRNA在低等级和高等级IPMN中具有不同的表达水平，它们可用作侵袭性的标志物{Matthaei，#3184；Lubezky，#3185}。
我们的NGS结果已经证明PDAC和IPMN病变共享325个显著失调的miRNA。这表明异常的miRNA表达在胰腺癌发展的早期发生。从在IPMN中被证实显著上调的30种miRNA中，已经描述了6种(即miR-155，miR-16，miR-181a，miR-21，miR-221和miR-93){Habbe，2009#2164；Matthaei，#3184；Lubezky，#3185；Caponi，#3187}。然而，在IPMN中发现失调的其他24种miRNA以前没有被报道过。
为了确保结果可靠，我们确证了之前在3个独立样品集合(NGS集合、训练集合和测试集合)中提到的所有30种miRNA的相同表达模式，因此我们观察到冷冻组织样品中的差异miRNA谱与EUS-FNA样品中的差异miRNA谱良好相关。Szafranska等人报道了来自新鲜胰腺FNA活检的miRNA分析将恶性组织与良性组织区分开{Szafranska，2008#271}。Ali等人验证了来自PDAC诊断性FNA的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)细胞块中7种miRNA的表达{Ali，#3112}。
因此，我们的研究证实了通过验证更大群体中的更多数量的miRNA来检测FNA样品中的miRNA的可行性。值得注意的是，在测试集合中，miR-93，miR16，miR-548d-3p和miR-320a的PDAC具有高辨别准确度，其中AUC超过0.95。即使AUC超过0.8，它们在训练集合中的表现也不如测试集合中那样准确，因为患者的临床特征不同。
总之，本研究鉴定了在PDAC和IPMN生物样品(例如肿瘤样品或微创生物样品，如血浆样品、血液样品、脑脊液(CSF)样品或血清样品)中通常失调的新miRNA，其具有潜力用作诊断生物标志物。此外，这些结果可能会出现新的治疗目标。
因此，本发明的第一方面涉及一种筛选处于发展胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的风险中的对象的体外方法，其包括：(a)测量从待筛选的对象的分离的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*、或至少hsa-miR-320a、或至少hsa-let-7e、或至少hsa-let-7f、或至少hsa-miR-1257、或至少hsa-miR-1304、或至少hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-3120-3p、或至少hsa-miR-3133、或至少hsa-miR-3714、或至少hsa-miR-4468、或至少hsa-miR-4639-5p、或至少hsa-miR-4713-5p、或至少hsa-miR-4714-5p、或至少hsa-miR-4770、或至少hsa-miR-548d-3p、或至少hsa-miR-761的表达模式或水平；(b)将待筛选的对象的所述至少hsa-miR-33a*、或至少hsa-miR-320a、或至少hsa-let-7e、或至少hsa-let-7f、或至少hsa-miR-1257、或至少hsa-miR-1304、或至少hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-3120-3p、或至少hsa-miR-3133、或至少hsa-miR-3714、或至少hsa-miR-4468、或至少hsa-miR-4639-5p、或至少hsa-miR-4713-5p、或至少hsa-miR-4714-5p、或至少hsa-miR-4770、或至少hsa-miR-548d-3p、或至少hsa-miR-761的表达模式或水平与已经建立的表达模式或水平对比，其中至少任何上述miRNA的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-33a*和以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-1257、hsa-miR-1304、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少miR-33a*和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-320a以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-1257、hsa-miR-1304、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-33a*、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-320a和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-let-7e以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-miR-33a*、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-1257、hsa-miR-1304、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-let-7e和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-let-7f以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-miR-33a*、hsa-miR-103a、hsa-miR-1257、hsa-miR-1304、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-let-7f和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-1257以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1304、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-1257和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-1304以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-1304和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-151b以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-151b和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-3120-3p以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-3120-3p和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-3133以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-3133和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-3714以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-3714和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-4468以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-4468和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-4639-5p以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-4639-5p和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-4713-5p以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-4713-5p和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-4714-5p以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-4714-5p和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-4770以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-4770和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-548d-3p以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-761and hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-548d-3p和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-761以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-548d-3p和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-761和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量从待筛选的对象的分离的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a的表达模式或水平；和(b)将待筛选的对象的所述至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a的表达模式或水平与已经建立的表达模式或水平对比，其中所述至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
本发明的另一种优选实施方式涉及用于筛选处于发展胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的风险中的对象的体外方法，其包括：(a)测量从待筛选对象的分离的生物样品中获得的至少hsa-miR-103a、或至少hsa-miR-151a-5p、或至少hsa-miR-181b、或至少hsa-miR-192、或至少hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-29a、或至少hsa-miR-429的表达模式或水平；(b)将所述至少hsa-miR-103a、或至少hsa-miR-151a-5p、或至少hsa-miR-181b、或至少hsa-miR-192、或至少hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-29a、或至少hsa-miR-429的表达模式或水平与已经建立的表达模式或水平对比，其中至少任何上述miRNA的过表达指示胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的又另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-103a以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-761、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-548d-3p和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-103a和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-151a-5p以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-761、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-103a、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-548d-3p和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-151a-5p和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-181b以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-761、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-103a、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-548d-3p和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-181b和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-192以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-761、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-103a、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-181b、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-548d-3p和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-192和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-23a以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-761、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-103a、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-181b、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-192、hsa-miR-29a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-548d-3p和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-23a和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-29a以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-761、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-103a、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-181b、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-192、hsa-miR-23a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-548d-3p和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-29a和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，所述筛选对象的体外方法包括：(a)测量至少hsa-miR-429以及以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-761、hsa-miR-33a*、hsa-miR-1257、hsa-miR-103a、hsa-miR-1304、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-181b、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-192、hsa-miR-23a、hsa-miR-151b、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3692、hsa-miR-3133、hsa-miR-4256、hsa-miR-29a、hsa-miR-4313、hsa-miR-3714、hsa-miR-4468、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4801、hsa-miR-4770、hsa-miR-616*、hsa-miR-548d-3p和hsa-miR-93，其中至少hsa-miR-429和以上指定的至少一种生物标志物的过表达指示胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
本发明的第二方面涉及一种用于诊断怀疑患有胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的对象的体外方法，其包括本发明第一方面或其任何优选实施方式的任何方法中的步骤a)和b)，以及可选地包括(c)通过临床检查确认胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的存在。
本发明的第三方面涉及一种用于获得用于体外诊断胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的有用数据的方法，其包括本发明第一方面或其任何优选实施方式的任何方法中的步骤a)和b)。
本发明的第四方面涉及一种用于将对象分类为健康对象或患有胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的对象的体外方法，其包括本发明第一方面或其任何优选实施方式的任何方法中的步骤a)和b)。
本发明的第五方面涉及一种用于在患有胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的对象中监控其对疗法的反应或监控其的胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)进程的体外方法，其包括本发明第一方面或其任何优选实施方式的任何方法中的步骤a)和b)。
本发明的第六方面涉及一种用于治疗患有胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的对象的方法，该方法包括本发明第一方面或其任何优选实施方式的任何方法中的步骤a)和b)，和(c)治疗被诊断患有胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的患者。优选地，通过外科手术、化学疗法或放射来治疗患者。
在该方法的一种优选实施方式中，根据本发明第一至第六方面中任一方法或其任何优选实施方式中的任一种，胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。
在该方法的另一种优选实施方式中，根据本发明第一至第五方面中任一方法或其任何优选实施方式中的任一种，所述生物样品选自待筛选对象的肿瘤样品或微创生物样品，例如血浆样品、血液样品、脑脊液(CSF)样品或血清样品。
在该方法的另一种优选实施方式中，根据本发明第一至第五方面中任一方法或其任何优选实施方式中的任一种，所述对象是人类对象。
本发明的第七方面涉及包含生物标志物检测试剂的试剂盒用于确定如本发明第一方面的方法或其任何优选实施方式中提及的任何生物标志物或任何生物标志物组合的差异表达水平，以对胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)，优选胰腺导管腺癌的风进行体外诊断的用途，其中任何这些生物标志物的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)。
本发明第七方面的优选实施方式涉及试剂盒在体外诊断胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的风险中的用途，其中所述试剂盒包含有生物标志物检测试剂，用于测定至少hsa-miR-33a*和/或至少hsa-miR-320a和/或至少hsa-let-7e以及可选的以下至少一种或多种miRNA的差异表达水平：hsa-let-7c、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-1257、hsa-miR-1304、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-3145-3p、hsa-miR-3692、hsa-miR-3714、hsa-miR-4256、hsa-miR-429、hsa-miR-4313、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4642、hsa-miR-4666-3p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4801、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-616*、hsa-miR-761和hsa-miR-93。
本发明第七方面的另一种优选实施方式涉及试剂盒用于体外诊断胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤(IPMN)的风险的用途，所述试剂盒包含有生物标志物检测试剂，用于测定从待筛选的对象的分离的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a的差异表达水平。
本发明的第八方面涉及包含生物标志物检测试剂的试剂盒，所述生物标志物检测试剂用于确定选自以下一种或多种miRNA的差异表达水平：hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a。
在本发明第八方面的优选实施方式中或对于根据本发明第七方面或其任何优选实施方式的试剂盒的用途，这类试剂选自以下的全部或至少一种：i)针对如任何所述方面或优选实施方式中所定义的miRNA或miRNA组合的特异性引物，其能够产生与引物相连的miRNA序列；ii)从i)的与引物相连的miRNA序列产生cDNA的逆转录工具；iii)能够扩增源自如i)中定义的与引物相连的miRNA的cDNA的工具，如引物；iv)转录扩增后的cDNA以产生有义靶RNA的工具；和v)能够检测iv)所述的有义靶RNA的miRNA反义探针群。
另一方面，值得一提的是，本发明优选在从患者获得的血浆或血清样品中进行。另一方面，重要的是要强调，从血液中获取血清或血浆制剂包括由技术人员执行的几个步骤：在血清的情况下，通过在室温下静置血液使血液凝结，通过离心去除凝块来分离设计为血清的上清液。在血浆的情况下，还需要离心。此外，在离心过程之后，重要的是立即将液体组分(血清或血浆)转移到干净的管中。处理时将样品保持在2至8℃。如果不立即分析血清或血浆，应将其分成等分试样，在-80℃或更低温度下储存并运输。避免冻融循环是很重要的，因为这对许多血清成分是有害的。溶血、黄疸或脂血症的样品可能使某些测试无效。
另一方面，重要的是要注意，现在用于诊断胰腺癌的公认标准方法基于本申请中已经描述的图像技术(CT或MRI)与MRCP和EUS-FNA的组合。然而，所述标准方法的敏感度不足以评估IPMN的恶性程度或在发育异常的早期阶段检测胰腺癌，并且需要工具来对通过使用所述技术获得的诊断进行确认。因此，本发明的优选实施方式涉及在对象中检测和/或确认IPMN或检测和/或确认的胰腺癌的方法，该方法包括以下步骤：a)对对象执行图像技术和/或活检，以及b)测量从对象获得的生物样品中上述发明的miRNA的表达水平，所述miRNA的表达水平大于从没有IPMN或胰腺癌的对象获得的对照样品中的所述miRNA的表达水平。例如，有时在步骤a)期间获得的图像的清晰度不足以区分胰腺炎和胰腺癌，因此，需要步骤b)来确认患者患有胰腺癌(和用于排除胰腺炎)。
本文说明性描述的发明可以在缺少本文未具体公开的任何要素、限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括/包含(comprising/including/containing)”等应当被广泛地理解而不受限制。另外，这里使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种改进。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方式和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的本发明的改进和变形，并且这些修改和变化被认为在本发明的范围内。
在本文中广泛和一般地描述了本发明。落入通用公开内容中的较窄的种类和亚组分类中的每种也构成本发明的一部分。无论是否在本文中具体叙述了去除的材料，这都包括本发明的一般描述以及从该类中去除任何主题的附带条件或否定限制。
其他实施方式在以下权利要求和非限制性实施例内。另外，当描述本发明的特征或方面的组合的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以该组合的任何个体成员或组合成员的子类的形式描述。
实施例
材料和方法
-患者和样品采集
本研究预期包括从2008年2月至2013年1月的共165名来自巴塞罗那医院的患者。我们从所有对象中获得了胰腺样品。在采集样品之前，这些对象都没有接受化学疗法或放射疗法。初始集合的18个外科宏观切除的胰腺组织样品(11个PDAC；4个IPMN；3个健康对照(H))用于全基因组miRNA谱分析。正常胰腺样品(H)对应于一些PDAC和IPMN损伤的邻近非肿瘤组织或对应于因其他原因(即，壶瘤腹或囊腺瘤)进行手术的患者的健康组织。候选miRNA的验证通过定量逆转录酶PCR(qRT)进行-PCR)在另外2个独立群体中进行：含52个组织样品(24个PDAC；7个IPMN；6个CP(慢性胰腺炎)，15个H)的训练集合；和含95个内窥镜超声扫描引导下的细针穿刺(EUS-FNA)样品(60个PDAC；9个IPMN；26个H)的测试集合。使用标准22G针进行FNA。在操作过程中始终将胰腺组织保持在干冰上，并将所有样品在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至RNA分离。包括在该研究中的参与者的临床病理学特征详述于下表4中。
Figure BDA0001920106910000211
表4.患者的临床病理学特征
本研究经巴塞罗那医院伦理委员会批准，并根据赫尔辛基宣言获得所有患者的书面知情同意书。
-miRNA提取
根据制造商的方案，使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)从冷冻的宏观切除组织或针抽出物中分离总RNA。最终洗脱体积为30μL。使用NanoDrop 1000Spectrophotometer(Wilmington，DE，USA)评估RNA浓度和纯度，并通过Bioanalyzer 2100(Agilent，CA，USA)确定RNA性质。
-通过下一代测序(NGS)进行全基因组miRNA分析
起始量为1μg总RNA，根据制造商的推荐执行制备方案。在15％Novex TBE-UreaPAGE凝胶上从总RNA中分离小RNA。将表示条带大小为18至30个核苷酸(nt)的区域切下并片段化，将RNA在0.3M NaCl中洗脱并在Spin X柱上纯化。将5'-衔接子在20℃下连接6小时。在15％Novex TBE-Urea PAGE凝胶(Invitrogen，CA，USA)上分离具有连接的5'-衔接子的小RNA。将40至60nt的条带切下并片段化，将RNA在0.3M NaCl中洗脱并在Spin X柱上纯化。将3'-衔接子在20℃下连接6小时。在10％Novex TBE-Urea PAGE凝胶上分离具有连接的5'-和3'-衔接子的小RNA，将70至90nt的条带切下并片段化，将RNA在0.3M NaCl中洗脱并在SpinX柱上清洗。然后添加GlycoBlue和乙醇，接着在-80℃下沉淀30分钟，并以14000rpm离心25分钟。将RNA沉淀物溶解在4.5μL无RNA酶的水中。进行逆转录和扩增，并在6％Novex TBEPAGE凝胶上分离cDNA。将扩增的cDNA条带切下并片段化；将RNA在凝胶洗脱缓冲液中洗脱，并在Spin X柱上纯化。然后添加糖原和乙醇进行沉淀，然后在14000rpm和4℃下离心20分钟。将cDNA沉淀溶解在10μl重悬缓冲液中。用定量实时PCR评估产生的cDNA文库以确保可接受的质量并确认正确添加了衔接子。cDNA的高通量测序是以在Illumina基因组分析仪IIx(Illumina，CA，USA)上运行的单端读取实验进行的。使用Illumina GA管道软件版本1.5.1进行图像分析和碱基调用。将前25个碱基中两个或更多个碱基上纯化度(chastity)小于0.6的序列过滤除去。
-通过实时qRT-PCR分析miRNA表达
使用TaqMan miRNA测定(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA，USA)通过单重qRT-PCR评估在高通量测序中鉴定的最具鉴别力的miRNA的表达。两步方案涉及用miRNA特异性引物进行逆转录，然后用TaqMan探针进行实时PCR。简而言之，在每个以7.5μL的终体积(2.5μLRNA，0.075μL的100mM dNTP，0.5μL Multiscribe逆转录酶(50UμL-1)，0.75μL 10×RT缓冲液，0.095μL RNA酶抑制剂(20UμL-1)，1.5μL茎环RT引物，和20.8μL无核酸酶的水)进行的逆转录反应中使用5ng总RNA，并在16℃下孵育30分钟；42℃下30分钟；85℃下5分钟；保持在4℃下。在10μL PCR混合物包含2μL cDNA，5μL不含AmpErase UNG的TaqMan 2X通用PCR Universal PCR Master Mix和0.5μL TaqMan 20X微小RNA测定。将PCR反应在384孔光学板中孵育，并如下在Viia7实时PCR系统(Applied Biosystems Inc.)上运行：95℃下10分钟；和50个95℃下15秒和60℃下1分钟的循环。所有样品一式两份扩增。
将扩增数据相对于内源对照RNU6B标准化。由自动阈值计算Ct值。模板对照均未展示出任何扩增。对每个样品计算所选miRNA的相对表达水平为-Δct值[-ΔCt＝-(靶miRNA的Ct-内源对照miRNA的Ct)]。
-数据分析
来自高通量测序的数据以FASTQ格式获得，每个测序泳道一个数据文件。随后使用FASTX-Toolkit修剪和移除测序衔接子，不允许对衔接子鉴定的错配。剩余的测序数据进一步折叠，按相同序列分组并计数。进一步处理测序数据以鉴定来自miRBase(版本18)数据库的miR。它还通过数据库RefSeq和Rfam评估与其他实体的序列比对。将序列数据与智人hg18基因组参考比对，允许一个错配。用R(版本2.13.0)，使用Bioconductor 2.8版中提供的DESeq包1.4.1计算从miRBase鉴定得到的miR的差异表达(DE)。将计数数据按估计的尺寸因数标准化，并且分析已知miR的组间差异表达(倍数变化)，即肿瘤样品和正常样品的标准化计数数据之间的比率。使用Benjamini和Hochberg方法对多重检验进行P值修正。只有在以错误发现率(FDR)修正的P值<0.05时，miR的倍数变化才被认为是显著的。
实施例1.通过NGS分析的miRNA表达谱区分IPMN、PDAC和正常胰腺
-概述
图1给出了研究设计的流程图。这是使用下一代测序研究PDAC和IPMN中miRNA表达谱的首次研究之一。该研究分两个主要步骤进行：全基因组miRNA谱化以发现新的潜在生物标志物，以及通过qRT-PCR在两个独立的样品组中验证最显著的结果。我们关注那些通常在IPMN和PDAC中失调的miRNA，目的是找到用于检测两种肿瘤病变的良好候选生物标志物，因为IPMN病变具有高度恶性风险。
-结果
我们首先使用基因组分析仪(Illumina公司)分析了11个PDAC组织、4个IPMN组织和3个健康胰腺组织的miRNome。通过执行下一代测序技术，我们发现18个样品中总共有1733种miRNA。图2A中描绘了在PDAC患者和健康个体之间具有最高显著倍数变化的50种miRNA的表达谱，并且图2B中表示了IPMN中对比健康胰腺中最显著失调的50种miRNA。然后根据miRNA表达，进行BGA图以在视觉上表示患有PDAC或IPMN的患者和对照之间的接近度。如图2C所示，NGS测序样品的miRNA表达谱可以在PDAC、IPMN和健康组之间进行分类。
使用DESeq程序包进行初步比较分析，我们发现与健康对照相比，PDAC样品和IPMN样品中分别有607种和396种miRNA显著失调(FDR<0.05)。此外，PDAC和IPMN中有相同的325种miRNA显著失调(图3A)。在这些通常失调的miRNA中，有107种miRNA的倍数变化大于2，平均计数超过400。接下来，为了选择一组miRNA进行进一步的实验验证，我们考虑了那些四分间距对数最大为1.4的miRNA，以确保选择那些显示出较少组内分散的miRNA。总共40种miRNA满足上述所有标准(FDR<0.05，FC>2，平均计数>400且组内IQRlog<＝1.4)并且通常在PDAC和IPMN中上调(表5)。图3B中的NGS数据的火山图以图形方式描绘了差异miRNA表达分析的这些结果。总之，NGS数据允许鉴定了若干种能够区分恶性前病变IPMN与健康胰腺、区分PDAC组织与健康胰腺以及区分IPMN与PDAC的miRNA。
实施例2.通过qRT-PCR对基于组织的miRNA表达的验证再现了大部分NGS结果。
为了确认NGS结果，我们首先通过在来自训练集合的52个样品(24个PDAC、7个IPMN、6个CP、15个H)中使用TaqMan qRT-PCR分析了所述40种选定的miRNA的表达。我们能够验证PDAC样品中31种miRNA的上调(23种p<0.05，8种p<0.1)，并且IPMN样品中24种miRNA也被上调(18种p<0.05，6种p<0.1)(表2)。
通过qRT-PCR分析的40种miRNA中没有一种在所分析的慢性胰腺炎组织和健康胰腺之间展示出显著表达差异(数据未显示)。接下来，为了证实此前的结果，我们采用了qRT-PCR，进一步研究了另一个独立集合的95个EUS-FNA胰腺样品(测试集合)中的训练集合中验证的31种miRNA的表达。我们证实，与26名健康对照相比，60名PDAC患者中30种miRNA的表达模式显著上调(30种p<0.05)。关于IPMN组(n＝9)，与健康组(n＝26)相比，我们验证了30种miRNA过表达(26种p<0.05，4种p<0.1)。这些实验的结果在表5中示出，并在图4中示意性地示出。
总体而言，2个不同群体中的qRT-PCR分析证实了大部分NGS结果。我们鉴定并验证 了30种在PDAC和IPMN病变中表达显著增加的miRNA。
实施例3.在测试集合中验证的几种miRNA展示出区分PDAC患者和对照的高准确 性。
关于区分PDAC患者与对照组的辨别能力，在测试集合中验证的30种miRNA所呈现的ROC曲线下面积(AUC)范围为0.69(95％CI：0.75-0.64)到1(95％CI：1-0.99)。具体而言，这30种miRNA中的13种(miR-93、miR-16、miR-548d-3p、miR-320a、miR-4468、miR-3120-3p、miR-4713-5p、miR-103a、miR-155、miR-4770、miR-181a、miR-221和miR-151b)在区分PDAC患者与健康对照中具有高准确性，其中AUC超过0.9(表3)。图5示出了具有对PDAC患者的最高辨别能力的8种miRNA的ROC曲线。最后，值得强调的是miR-93的性能，miR-93是单一的基于组织的miRNA，其在PDAC中有显著改变，在区分癌组织与正常胰腺方面具有出色的灵敏度和特异性。
Figure BDA0001920106910000251
表5. 40种高度区分PDAC或IPMN与健康组织的微小RNA的列表。微小RNA选自NGS数据并且其值在随后的验证阶段中获得。
Figure BDA0001920106910000261
表6.在测试集合中分析的所有miRNA的受试者工作特征(ROC)曲线分析。
序列表
<110> 先进标志物探索公司
<120> 鉴定胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤的体外方法
<130> 902189
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-33a*
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 1
caauguuucc acagugcauc ac 22

Claims (10)

1.用于确定至少hsa-miR-33a*的差异表达水平的生物标志物检测试剂在制备用于人类对象的体外诊断胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）的试剂盒中的用途，其中，至少hsa-miR-33a*的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含用于确定从待筛选的对象分离出的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*和以下至少一种或多种miRNA的差异表达水平的试剂：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-1257、hsa-miR-1304、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-320a、hsa-miR-3714、hsa-miR-429、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-761和hsa-miR-93。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含用于确定从待筛选的对象分离出的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a的差异表达水平的试剂。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于筛选具有发展胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）风险的对象的体外方法，所述方法包括：（a）测量从待筛选对象分离出的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*的表达模式或水平；和（b）将待筛选对象的所述至少hsa-miR-33a*的表达模式或水平与已经建立的表达模式或水平对比，其中至少hsa-miR-33a*的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于筛选具有发展胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）风险的对象的体外方法，所述方法包括：（a）测量从待筛选对象分离出的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a的表达模式或水平；和（b）将待筛选对象的所述表达模式或水平与已经建立的表达模式或水平对比，其中至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a的过表达指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于筛选具有发展胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）风险的对象的体外方法，所述方法包括：（a）测量从待筛选对象分离出的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*和以下至少一种或多种miRNA的表达模式或水平：hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-103a、hsa-miR-1257、hsa-miR-1304、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-29a、hsa-miR-3120-3p、hsa-miR-3133、hsa-miR-320a、hsa-miR-3714、hsa-miR-429、hsa-miR-4468、hsa-miR-4639-5p、hsa-miR-4713-5p、hsa-miR-4714-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-761和hsa-miR-93；和（b）将待筛选对象的所述表达模式或水平与已经建立的表达模式或水平对比，其中至少hsa-miR-33a*和至少一种（a）中指出的miRNA的过表达，指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于筛选具有发展胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）风险的对象的体外方法，所述方法包括：（a）测量从待筛选对象分离出的生物样品中获得的至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a的表达模式或水平；和（b）将待筛选对象的所述至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a的表达模式或水平与已经建立的表达模式或水平对比，其中至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-16和hsa-miR-320a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-181a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-155、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151b、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-23a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-320a和hsa-miR-151a、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-21和hsa-let7e、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-23a和hsa-miR-21、或至少hsa-miR-33a*和hsa-miR-93和hsa-miR-320a的过表达，指示胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤（IPMN）。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
9.根据权利要求2至7中任一项所述的用途，其特征在于，所述生物样品选自待筛选对象的肿瘤样品或微创生物样品。
10.根据权利要求2至7中任一项所述的用途，其特征在于，所述生物样品选自待筛选对象的血浆样品、血液样品、脑脊液样品或血清样品。
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