CN111494632B - miR-16-5p作为靶点在调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤中的用途 - Google Patents

miR-16-5p作为靶点在调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miR‑16‑5p作为靶点在调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤中的用途，属于医药用途技术领域。本发明研究发现，miR‑16‑5p参与了槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的过程，miR‑16‑5p的表达情况会对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的效果产生关键影响，过表达miR‑16‑5p会明显抑制槲皮素和EGCG联用对STZ损伤胰岛细胞的保护效果；而下调miR‑16‑5p表达则会提高槲皮素和EGCG联用对STZ损伤胰岛细胞的保护效果。因此，miR‑16‑5p可以作为槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的靶点miRNA，通过对miR‑16‑5p进行调控，可以更好的发挥槲皮素和EGCG联用对胰岛细胞损伤的保护作用。

Description

miR-16-5p作为靶点在调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞 损伤中的用途
技术领域
本发明涉及miRNA的医药用途技术领域，具体涉及miR-16-5p作为靶点在调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤中的用途。
背景技术
糖尿病是一种因机体内胰岛素绝对不足、且以高血糖为主要特征的内分泌代谢性疾病，这是世界范围内最常见的流行性疾病之一，而其中约90％以上为2型糖尿病患者。2型糖尿病患者的发病与体内的高血糖和高血脂关系密切，机体长期处于高血糖和高血脂状态易引发胰岛β细胞产生氧化应激以及内质网应激，这将会造成胰岛β细胞功能障碍。2型糖尿病发生的众多条件中，胰岛β细胞功能障碍是其中的必要条件，同时造成胰岛β细胞分泌胰岛素能力下降的关键因素是胰岛β细胞凋亡，因而在2型糖尿病的发病机制中β细胞凋亡起着不可忽视的作用。
槲皮素与EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)在水果和蔬菜中含量较高，是较为常见的两种黄酮类物质。研究发现，植物天然成分之间的交互作用会促使其活性发生协同增强的作用。发明人在前期研究中以链脲佐菌素(STZ)诱导的NIT-1小鼠胰岛β肿瘤细胞为实验模型，研究了槲皮素与EGCG联用对β细胞凋亡的保护作用，结果发现槲皮素和EGCG具有较好的协同抑制胰岛细胞凋亡的效果，表明槲皮素与EGCG对NIT-1胰岛β细胞具有保护作用。但是，对于能够调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的作用靶点，目前还缺少相关的研究。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供miR-16-5p作为靶点在调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤中的用途。本发明研究发现，miR-16-5p的表达情况对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤具有关键影响，因此，miR-16-5p可以作为槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的靶点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供miR-16-5p作为靶点在制备调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤效果的药物中的用途。
优选的，所述miR-16-5p的核苷酸序列为UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG。
优选的，所述胰岛细胞损伤是由链脲佐菌素诱导的。
本发明的第二方面，提供促进miR-16-5p表达的物质在制备抑制槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤效果的药物中的用途。
优选的，所述促进miR-16-5p表达的物质为miR-16-5p mimics。
本发明的第三方面，提供抑制miR-16-5p表达的物质在制备促进槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤效果的药物中的用途。
优选的，所述抑制miR-16-5p表达的物质为miR-16-5p inhibitor。
本发明的有益效果：
本发明首次研究发现，miR-16-5p参与了槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的过程，miR-16-5p的表达情况会对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的效果产生关键影响，过表达miR-16-5p会明显抑制槲皮素和EGCG联用对STZ损伤胰岛细胞的保护效果；而下调miR-16-5p表达则会提高槲皮素和EGCG联用对STZ损伤胰岛细胞的保护效果。因此，miR-16-5p可以作为槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的靶点miRNA，通过对miR-16-5p进行调控，可以更好的发挥槲皮素和EGCG联用对胰岛细胞损伤的保护作用。
附图说明：
图1：转染miR-16-5p mimics对NIT-1细胞存活率的影响。
图2：两个梯度转染后的荧光显微镜观察图；其中，A：转染试剂与miR-16-5pmimics用量为0.375μL+0.375μL；B:转染试剂与miR-16-5p mimics用量为0.5μL+0.5μL。
图3：转染miR-16-5p mimics对NIT-1细胞miR-16-5p的影响。
图4：过表达miR-16-5p对槲皮素和EGCG协同保护STZ损伤胰岛细胞存活率的影响。
图5：转染miR-16-5p inhibitor对NIT-1细胞miR-16-5p的影响。
图6：下调miR-16-5p的表达对槲皮素和EGCG协同保护STZ损伤胰岛细胞存活率的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，发明人课题组已对槲皮素与EGCG联用对β细胞凋亡的保护作用进行了研究，发现槲皮素和EGCG具有较好的协同抑制胰岛细胞凋亡的效果。
在前期研究的基础上，为更好的发挥槲皮素和EGCG联用对胰岛细胞损伤的保护作用，发明人进一步对参与槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的miRNA进行了深入研究。结果意外的发现，miR-16-5p参与了槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的过程，miR-16-5p的表达情况会对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的效果产生关键影响。本发明分别考察了过表达miR-16-5p对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的作用，以及下调miR-16-5p表达对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的作用。结果发现，过表达miR-16-5p会明显抑制槲皮素和EGCG联用对STZ损伤胰岛细胞的保护效果；而下调miR-16-5p表达则会提高槲皮素和EGCG联用对STZ损伤胰岛细胞的保护效果。因此，miR-16-5p可以作为槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的靶点miRNA。由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：小鼠NIT-1胰岛β细胞购自美国模式菌种收集中心(ATCC，USA)；槲皮素(98％)、EGCG(99％)均购自美国Sigma-Aldrich公司；miR-16-5p mimics购自上海吉玛公司。
实施例1：过表达miR-16-5p对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞的影响
为研究miR-16-5p参与槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的作用，我们采用转染miR-16-5p mimics的方法过表达miR-16-5p的表达，观察其对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的影响。
1.miR-16-5p的过表达：
利用Lipofectamine 2000(thermo scientific)试剂将100nM miR-16-5pmimic(上海吉玛)和阴性对照(NC)(上海吉玛)瞬时转染至NIT-1细胞中。首先通过MTT实验摸索转染试剂毒性，根据转染试剂说明书，转染试剂：miR-16-5p mimics用量体积比为1：1，设置4个梯度，分别为0.375μL+0.375μL，0.5μL+0.5μL，0.625μL+0.625μL，0.75μL+0.75μL。结果如图1所示，在前两个梯度下均无细胞毒性。
选择前两个梯度进行荧光显微镜观察，转染荧光标记的阴性对照(FAM-NC)(上海吉玛)以确定是否成功转染至细胞中。如图2所示，结果表明，均有绿色荧光产生，根据减少使用试剂用量原则，接下来实验选择第一梯度进行，miR-16-5mimic和转染试剂的使用体积为0.375μL。通过qRT-PCR技术进一步验证miR-16-5p mimics的表达情况，结果如图3所示，miR-16-5p mimics较NC比，miR-16-5p表达量提高16倍左右，证明转染成功。
2.MTT法检测过表达miR-16-5p对槲皮素和EGCG协同保护STZ损伤胰岛细胞存活率的影响：
试验设5个处理组，分别为：
CK：空白对照，不对NIT-1细胞做任何处理；
S：采用6mmol/L的STZ对NIT-1细胞做损伤处理；
SQE：采用6mmol/L的STZ+15μmol/L槲皮素+15μmol/L EGCG对NIT-1细胞进行处理；
SQE-NC：采用6mmol/L的STZ+15μmol/L槲皮素+15μmol/L EGCG对转染FAM-NC的NIT-1细胞进行处理；
SQE-mimics：采用6mmol/L的STZ+15μmol/L槲皮素+15μmol/L EGCG对转染miR-16-5mimic使miR-16-5p过表达的NIT-1细胞进行处理。
各组处理24h后，采用MTT法检测胰岛细胞的存活率。具体检测方法参照“槲皮素与EGCG对链脲佐菌素诱导的NIT-1细胞损伤的保护作用及机理研究”(王璐，山东农业大学硕士学位论文，2018年)。
试验结果见图4。由图4可以看出，6mmol/L STZ损伤处理显著降低了存活率，当15μmol/L槲皮素和15μmol/LEGCG联用时显著提高了胰岛β细胞存活率(P<0.05)，转染negativecontrol组不影响其存活率，但过表达miR-16-5p后明显抑制了槲皮素和EGCG联用对细胞活力的促进作用。
实施例2：下调miR-16-5p表达对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞的影响
为进一步研究下调miR-16-5p对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的作用，我们拟采用转染miR-16-5p inhibitor(上海吉玛)的方法下调miR-16-5p的表达，观察其对槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤的影响。
转染miR-16-5p inhibitor的方法同实施例1，转染后通过qRT-PCR技术进一步验证miR-16-5p inhibitor的表达情况，结果如图5所示，miR-16-5p inhibitor抑制35％左右，证明转染成功。
MTT法检测下调miR-16-5p表达对槲皮素和EGCG协同保护STZ损伤胰岛细胞存活率的影响，具体如下：
试验设5个处理组，分别为：
CK：空白对照，不对NIT-1细胞做任何处理；
S：采用6mmol/L的STZ对NIT-1细胞做损伤处理；
SQE：采用6mmol/L的STZ+15μmol/L槲皮素+15μmol/L EGCG对NIT-1细胞进行处理；
SQE-NC：采用6mmol/L的STZ+15μmol/L槲皮素+15μmol/L EGCG对转染FAM-NC的NIT-1细胞进行处理；
SQE-inhibitor：采用6mmol/L的STZ+15μmol/L槲皮素+15μmol/L EGCG对转染miR-16-5inhibitor使miR-16-5p表达下调的NIT-1细胞进行处理。
各组处理24h后，采用MTT法检测胰岛细胞的存活率。试验结果见图6，由图6可以看出，6mmol/L STZ损伤处理显著降低了存活率，当15μmol/L槲皮素和15μmol/LEGCG联用时显著提高了胰岛β细胞存活率(P<0.05)，转染negative control组与槲皮素和EGCG联用组存活率无显著性差异，当转染miR-16-5p inhibitor后，存活率有所升高。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> miR-16-5p作为靶点在调控槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤中的用途
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> miR-16-5p
<400> 1
uagcagcacg uaaauauugg cg 22

Claims (4)

1.抑制miR-16-5p表达的物质在制备促进槲皮素和EGCG协同保护胰岛细胞损伤效果的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制miR-16-5p表达的物质为miR-16-5p inhibitor。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miR-16-5p的核苷酸序列为UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胰岛细胞损伤是由链脲佐菌素诱导的。
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