CN112867802A - 用于预测肝功能障碍的微小rna特征 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种确定受试者肝功能障碍风险的体外方法,特别是确定在肝部分切除术后受试者肝功能障碍的风险,所述方法包括以下步骤:提供所述受试者的样本,测定所述样本中至少一种miRNA的表达水平,所述miRNA选自由miR‑151a、miR‑192和miR‑122组成的组,并将这些表达水平与至少一个参考表达水平进行比较,或者鉴定miR‑151a与miR‑192和/或miR‑122与miR‑151a的表达水平比值,将所述表达水平比值与参考表达水平比值进行比较,以及根据比较结果,将样本划分为至少两个类别中的一个,其中每个类别是至少两个分类为“高风险”和“低风险”中的一个。
Description
技术领域
本发明提供了一种方法,具体地是一种体外方法,用于确定受试者肝功能障碍的风险,尤其是在肝脏切除后受试者肝功能障碍的风险,其中对来自所述受试者的样本中的一种或多种选定的miRNA的水平进行定量。
背景技术
在许多肝脏恶性肿瘤中,肝脏切除是唯一的根治疗法。切除术后肝脏再生是确定肝切除术患者临床结果的主要决定因素(1),因为肝切除术后肝再生不足会导致术后肝功能障碍(liver dysfunction,LD),肝脏大部分切除后多达30%的患者会出现这种情况(2)。重要的是,目前可用于术后LD患者的治疗方案非常有限,并且这些治疗方案主要是根据症状和以目标为导向(2,3)。因此,在肝脏手术前进行风险分级以优化患者选择是减少术后LD和伴随并发症发生率的关键。此外,既在肝切除术后识别有肝功能障碍风险的患者,并且监测患者对旨在刺激肝脏再生的治疗的反应,对于提供最佳的患者护理而言都是至关重要的。然而,目前可用的标记物大多昂贵、耗时,并且有时还具有侵入性,因此迫切需要一种易于评估的测试,以确定肝功能障碍和预测术后肝功能恢复情况。
新的证据表明微小RNA(microRNA)(miRNA)特征是多种疾病的有效诊断、预后和治疗反应的生物标记物(4)。miRNA作为多种基因在不同组织中表达的主要调控因子,可以在转录水平上控制几乎每个细胞过程,包括细胞发育、增殖、迁移、存活、代谢、稳态和再生(5)。基于计算分析的估计表明,超过50%的人类转录组受至少一种miRNA的调控(6)。因此,这就不奇怪miRNA的异常表达会对信号通路产生有害影响,并且确实与许多各种不同的疾病有关,(7-9)。迄今为止,已鉴定出近2000种miRNA,其中一些已被证实可用于各种恶性疾病的体外诊断和/或预后,证明了它们作为临床生物标记物的潜力(10-12)。
例如,WO2011/076141A1和EP2196543A1提供了用于肝细胞癌诊断的微小RNA生物标记物。WO2012/151736A1公开了可用于诊断肝细胞癌,或者区分肝细胞癌与慢性乙型肝炎或肝硬化的微小RNA生物标记物。例如,WO2016/036994A1利用微小RNA分析与致癌基因等其他生物标记物相结合,用于诊断肝癌。
US20170166975A1公开了一种用于检测肝癌的试剂盒或装置,其包含能够与患者样本中的微小RNA特异性结合的核酸。
CN101418343A公开了一种用于预测早期原发性肝癌患者术后肝癌复发的试剂盒。
还发现微小RNA可作为恶性肿瘤以外疾病的生物标记物。例如,WO2018/231851A1公开了一种诊断非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)或肝纤维化的方法,其中对患者样本中的一种或多种微小RNA的水平进行检测。
除了一些miRNA的高度组织特异性表达谱外,它们还提供了生物标记物中所追求的其他有益特征,例如,通过非侵入性方法,miRNA能够容易地从诸如血液、尿液和唾液等生物流体中获得。此外,它们表现出高稳定性和相对较低的复杂性(例如,无后处理修饰),并且可以通过具有高特异性的各种方法容易地进行评估,这些方法允许信号扩增,使它们优于包括DNA、RNA和蛋白质的其他类型的生物标记物。
微小RNA还被用来调节靶mRNA的翻译。例如,US2016089453A1公开了使用miR-122作导向以修饰肝脏细胞中mRNA的RNA调节剂。
尽管取得了这些进展,但用于确定患者发生LD的风险尤其是在手术后发生LD的风险的治疗方案以及可靠的预测标记物仍然很有限。因此,迫切需要一种易于评估的测试,以预测发生肝功能障碍的风险,并监测对肝再生刺激的治疗反应,特别是因为目前的标记物大多昂贵、耗时,并且有时还具有侵入性。
发明内容
本发明的目的是提供具有高度特异性和有效性的可靠生物标记物,用于预测肝功能障碍,特别是在肝部分切除术后的肝功能障碍,以及用于监测肝功能,特别是在肝部分切除术或肝再生刺激后的肝功能。
通过本发明可解决所述问题。
本发明人已经证明,与在肝部分切除术后未发生肝功能障碍的患者相比,在肝部分切除术后发生肝功能障碍的患者中,特异性miRNA的表达水平显著改变。令人惊讶的是,这些表达水平的变化在患者手术前的血液样本中已经显示出来,因此能够可靠地预测肝功能障碍的发生。此外,甚至可以在手术前准确预测到肝部分切除术后发生肝功能障碍的风险。
本发明提供了一组特定的上调或下调的miRNA,由此可用作有价值的生物标记物,并且是适用于广泛肝脏疾病的诊断和预测特征。
根据本发明,提供了一种确定受试者肝功能障碍风险的体外方法,特别是确定在肝部分切除术后肝功能障碍的风险,所述方法包括以下步骤:
a)提供所述受试者的样本,
b)测定所述样本中至少一种miRNA的表达水平,所述miRNA选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组,并且
i.将b)的表达水平与至少一个参考表达水平进行比较,或
ii.基于在b)中测定的表达水平,鉴定miR-151a与miR-192和/或miR-122与miR-151a的比值(ratio),并将所述表达水平比值与参考表达水平比值进行比较,以及
根据步骤i)或步骤ii)的比较结果,将样本划分为至少两个分类为“高风险”和“低风险”中的一个。
具体地,本文提供的体外方法允许确定受试者发生肝功能障碍的风险。优选地,本文提供的体外方法允许确定受试者在肝部分切除术后发生肝功能障碍的风险。
具体地,测定患者样本中选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组中的至少一种miRNA的表达水平。具体地,测定miR-151a、miR-192和miR-122中的至少两种的表达水平。具体地,测定miR-151a和miR-192的表达水平。具体地,测定miR-151a和miR-122的表达水平。具体地,测定miR-192和miR-122的表达水平。
根据具体实施方式,测定miR-151a、miR-192和miR-122的表达水平。
具体地,本文使用的miRNA选自由hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-192-5p和hsa-miR-122-5p组成的组。
具体地,miR-151a表达水平的降低表明肝功能障碍的风险增加。具体地,miR-122和/或miR-192表达水平的增加表明肝功能障碍的风险增加。
具体地,在肝功能障碍风险增加的患者的手术前样本中,miR-151a的表达水平下调。具体地,在肝功能障碍风险增加的患者的手术前样本中,miR-122和/或miR-192的表达水平上调。具体地,术前样本是来自于在肝部分切除术前的患者提供的样本。
根据具体实施方式,步骤i)或步骤ii)的比较的结果可划分为进一步分类为“无风险”和“中风险”的类别。具体地,将受试者样本中的miRNA表达水平或表达水平比值与在肝部分切除术后未发生肝功能障碍的受试者样本或健康受试者样本中的miRNA表达水平或表达水平比值进行比较,可将受试者样本划分为分类为“无风险”、“低风险”、“中风险”或“高风险”中的一个。
具体地,受试者的样本被划分为属于“无风险”分类,则其没有发生肝功能障碍的风险或发生肝功能障碍的风险非常低,特别是在肝部分切除术后。优选地,没有风险或风险非常低是指发生肝功能障碍的风险为25%或低于25%。受试者的样本被划分为“低风险”分类,则在肝部分切除术后发生肝功能障碍的风险较低。优选地,低风险是指发生肝功能障碍的风险超过25%和至多50%。受试者的样本被划分为“中风险”分类,则在肝部分切除术后发生肝功能障碍的风险为中等。优选地,中风险是指发生肝功能障碍的风险超过50%和至多75%。受试者的样本被划分为“高风险”分类,则在肝部分切除术后发生肝功能障碍的风险很高。优选地,高风险是指发生肝功能障碍的风险超过75%。
具体地,参考表达水平是健康受试者或未发生术后肝功能障碍的受试者或其组或库的选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组中的至少一种miRNA的表达水平。
具体地,参考表达水平比值是健康受试者或未发生术后肝功能障碍的受试者或其组的miR-151a与miR-192的表达水平比值和miR-122与miR-151a的表达水平比值。
具体地,所述参考表达水平可以是肝部分切除术后未发生肝功能障碍的受试者的相应miRNA的平均水平,特别是源自这些受试者的样本库中的相应miRNA的平均水平,其中,差异超过一个标准偏差,具体地约为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6,1.7、1.8、1.9个标准偏差,特别是约为2个标准偏差或更多个,表明肝部分切除术后发生肝功能障碍的风险增加。具体地,与肝部分切除术后未发生肝功能障碍的受试者相应miRNA的表达水平或表达水平比值相比,miRNA表达水平或miRNA表达水平比值的差异为至少1.3倍表明发生肝功能障碍的风险增加。
具体地,差异超过1.5个标准偏差,优选为超过2个标准偏差,特别是约2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或3个标准偏差,表明发生肝功能障碍的风险较高,特别是在肝部分切除术后。
具体地,差异为至少一个标准偏差,表明发生肝功能障碍的风险为中等,特别是在肝部分切除术后。
具体地,差异小于一个标准差,表明发生肝功能障碍的风险较低,特别是在肝部分切除术后。
具体地,miRNA表达水平或表达水平比可与相应的参考表达水平或参考表达水平比值进行比较,特别是其水平或水平比值与参考水平或参考水平比值相差不超过0.5个标准偏差,表明发生肝功能障碍的风险非常低,特别是在肝部分切除术后。因此,这些样本可划分为“无风险”分类。与其样本划分为属于“低风险”分类的受试者相比,其样本划分为属于“无风险”分类的受试者在肝部分切除术后发生肝功能障碍的可能性更小。
在本发明实施方式中,使用健康受试者或肝部分切除术后未发生肝功能障碍的受试者的单个参考样本,或者健康受试者或肝部分切除术后未发生肝功能障碍的样本库,与待确定LD风险的受试者的相应样本进行比较。所述库可以由来自不同个体的2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个样本,具体地,最多可达到10个、100个或超过100个样本。
根据本发明的具体实施方式,划分为“低风险”的受试者进行肝部分切除术,划分为“中风险”的受试者在肝部分切除术前进行肝再生刺激,划分为“高风险”的受试者不进行肝部分切除术。具体地,划分为“无风险”的受试者也无需先进行刺激肝再生再进行肝部分切除术。具体地,划分为“中风险”的受试者可进行肝部分切除术,但他们要先进行旨在刺激肝再生的治疗。优选地,在刺激肝再生后评估再生成功,并且在受试者进行肝部分切除术前确定受试者在肝部分切除术后发生肝功能障碍的风险。
具体地,划分为“中风险”的受试者在肝部分切除术前进行治疗,其中该治疗选自由新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy)、门静脉栓塞(portal vein embolization)、联合肝脏分割与门静脉支结扎的分步肝切除术(associating liver partition andportal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS)、运动干预(“预康复(prehabilitation)”)或降低门静脉高压(portal vein hypertension)的药物治疗组成的组。具体地,运动干预和/或饮食改变可以通过改善整体健康状况来帮助肝脏再生。具体地,对于划分为中风险的受试者,另一种选择方案是改良的手术策略。优选地,在所述改进的手术策略中,通过结合对肿瘤中心进行热消融来减小所切除肝脏部分的必要尺寸。
具体地,本文所述的miRNA特征用于确定患者发生术后肝功能障碍的风险较低的进行肝部分切除术的时间点。具体地,划分为“中风险”并因此在肝切除术前进行诸如ALPPS等治疗的受试者的样本在多个时间点提供,从而可以确定肝部分切除术的最佳时间点。具体地,每两周一次、每周一次、每天一次或每天至少两次提供样本,并确定发生肝功能障碍的风险。具体地,一旦样本划分为“低风险”,进行肝部分切除术的时间点是最佳的。
具体地,划分为“高风险”的受试者不进行肝部分切除术。具体地,所述受试者转而进行肝移植、姑息性化疗、射频消融或经肝动脉化疗栓塞术(TACE)。具体地,根据肿瘤负荷选择所述治疗。
本文还提供了一种监测受试者肝再生刺激的再生成功性的体外方法,包括以下步骤:
a)提供所述受试者的样本,
b)测定所述样本中miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值,
c)测定参考样本中miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值,其中参考样本是受试者的较早样本,
d)将b)的表达水平比值和c)的表达水平比值进行比较,以及
e)根据步骤d)的比较结果,将所述受试者的样本划分为两个分类为“再生成功”或“未再生成功”中的一个。
具体地,根据本文提供的体外方法确定其再生成功性的肝再生刺激选自由以下组成的组:通过门静脉栓塞诱导肝肥大,通过联合肝脏分割与门静脉支结扎(ALPPS)诱导肝肥大,通过运动干预(“预康复”)改善整体健康以及降低门静脉高压的药物治疗。
具体地,所述受试者患有肝脏恶性病变,或患有良性肝肿瘤、肝囊肿和/或寄生虫,优选为转移性结直肠癌、肝细胞癌或胆管细胞癌。具体地,所述受试者患有肝脏的一种或多种良性或恶性肿瘤。所述肿瘤可起源于任何组织或器官。
根据具体实施方式,样本选自由血液、血清、血浆组成的组,具体地是去血小板血浆、淋巴、尿液和唾液以及活检探针。具体地,所述样本是无细胞血液。
根据另一具体实施方式,使用分类模型将样本的表达水平或表达水平比值与参考表达水平或参考表达水平比值进行比较。
具体地,分类模型根据与参考物的比较结果,将受试者的样本划分为至少两个类别中的一个。
具体地,分类模型选自由逻辑回归模型、支持向量机模型和决策树模型组成的组。
本文还描述了预测肝功能障碍风险的临床上有用的临界值,特别是在肝部分切除术后。具体地,低严格性临界值(stringency cut-off)的概率分数小于0.59,具体地小于0.58、0.57、0.56、0.55、0.54、0.53、0.52、051或0.50表示受试者发生肝功能障碍的风险较低,以及患者可以进行肝部分切除术且风险较低。优选地,将概率分数小于0.58(P<0.58)的患者划分为低风险。具体地,严格性临界值的概率分数大于0.58,具体地大于0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64或0.65表示患者发生肝功能障碍的风险为中等,这些患者应在手术前进行优化。优选地,将概率分数大于0.58(P>0.58)的患者划分为中风险。概率分数高于0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74或0.75表示受试者为高风险患者,优选不进行肝部分切除手术。优选地,概率分数高于0.68(P>0.68)表示受试者发生肝功能障碍的风险较高。
根据具体实施方式,用于测定表达水平的方法选自由基于测序的方法(具体为下一代测序)、基于阵列的方法和基于PCR的方法(具体为基于定量PCR的方法)组成的组。
具体地,miRNA水平的差异通过定量或数字PCR、DNA/RNA测序,具体为下一代测序、微阵列、基于LuminexTM发光的核酸分析或其他基于杂交的技术来确定。
本文还提供了一种试剂盒套件(kit-of-parts),包括:
a)检测试剂,其能够检测受试者样本中至少一种微小RNA的表达水平,所述微小RNA选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组,
b)参考表达水平,
软件,所述软件包括分类模型,用于比较a)的表达水平与b)的表达水平,并将受试者的样本划分为至少两个类别中的一个,其中每个类别是至少两个分类为肝部分切除术后肝功能障碍“高风险”和“低风险”中的一个。
附图说明
图1:肝切除患者术前微小RNA模式的差异。肝功能障碍患者术前血浆中微小RNA差异调控的火山图。为了确定候选生物标记物,将血浆浓度(平均每百万log2计数(logCPM)>5)、效应大小(倍数变化>1.3)以及显著性水平(原始p<0.2)的临界值都纳入考虑。一组19种微小RNA,其中12种表达上调(红色),7种表达下调(蓝色)。
图2:miRNA对预测肝功能障碍的诊断性能分析。(A)miRNA对在随机森林分类模型中的重要性(最重要的miRNA位于顶部,平均下降精度最高)。(B)miR151a-5p_192-5p检测组中qPCR测量的比值分布(双侧威尔科克森(Wilcoxon)秩和检验的箱形图和p值),和(C)miR122-5p_151a-5p检测组中qPCR测量的比值分布。(D)检测组中包括miR122-5p_151a-5p的逻辑回归模型的ROC曲线(留一法交叉验证的结果为灰色),和(E)包括miR151-5p_192-5p的逻辑回归模型,以及(F)包括两种miRNA对的逻辑回归模型。(G,H)通过曲线下面积(AUC)来描述性能,由p值表示分类是否显著偏离随机分配(AUC=0.5)。对于模型定义的临界值P>0.59和P>0.68,分析预测对照组和预测LD组的真实术后LD百分比。
图3:前两种miRNA比值的预测性能在术后LD的独立研究中得到验证。对24例受试者的miRNA进行RT-qPCR分析,其中5例(16.7%)术后出现不良反应。观察术前血浆中miRNA对122-5p/151a-5p(A)和151a-5p/192-5p(B)的调节情况。(C)使用ROC分析验证了先前定义的多变量逻辑预测模型的预测性能。通过曲线下面积(AUC)来描述性能,由p值表示分类是否显著偏离随机分配(AUC=0.5)。对于模型定义的临界值P>0.59和P>0.68(D,E),分析预测对照组和预测LD的真实术后LD百分比。
图4:基于完整数据集的微小RNA模型性能评估。分析逻辑回归模型输出的两个临界值(低严格性,P=0.59;高严格性,P=0.68)预测术后肝功能障碍的性能。利用敏感性(SN)、特异性(SP)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和比值比(OR)来描述性能,比值比是与阳性检测结果相关的术后发生肝功能障碍的几率相比与阴性检测结果相关的术后发生肝功能障碍的几率的比值。低严格性界限(P=0.59)产生了平衡的PPV值和NPV值(分别为0.80和0.81),而严格性临界值(P=0.68)产生了完美的PPV值1.0,可接受的NPV为0.74(a)。这意味着100%的检测阳性患者患有术后LD,而74%的检测阴性患者不会发生术后LD。反之亦然,26%的检测阴性患者确实患有术后LD(见A组)。不良事件的OR分别为15.92(p<0.0001)和无限(p<0.0001)。对微小RNA模型进行受试者工作特征(ROC)曲线分析,以将其性能与标准肝功能参数的ROC曲线进行比较(B)。对两个模型临界值的其他术后不良结果的OR进行了分析:严重发病率(C)和死亡率(D)。在我们预测的风险组中,术后ICU住院时间(E)和住院时间(F)显著延长(示出了无离群值的箱形图;双侧威尔科克森秩和检验的p值)。ALT,丙氨酸转氨酶;AST,天冬氨酸转氨酶;GGT,γ-谷氨酰转移酶:ICG-PDR,吲哚菁绿(ICG)血浆内消失率;ICG R15,ICG 15分钟剩余率,ICU,重症护理病房。
图5:肝部分切除术后肝功能恢复后的miRNA对,以及第二步ALPPS后预测的术后LD。(A)示出了本次附加探索性研究的研究设计,并总结了ALPPS手术的演示。ALPPS手术最早由Schnitzbauer等人阐述,并且已经发展到允许剩余肝脏不足的临界可切除患者快速肝再生。简单来说,在ALPPS手术的第一步中,有选择地结扎供养肿瘤负荷肝叶的门静脉分支,同时保留动脉和胆汁结构,并在手术的初始步骤进一步横切肝实质。该手术能够促使肝脏在几天内再生。尽管如此,在肝再生获得实质性进展后,必须进行第二次手术,其中需要切除结扎的剩余肝叶。对7例常规肝部分切除术患者和8例ALPPS患者(详情见表3)的miRNA的围手术期动力学进行评估,为此miRNA的纵向测量可基于反复采集血浆样本来进行。(A)中给出了进行采血的时间点。(B)示出了miRNA对以及组合miRNA对的围手术期动力学。在ALPPS的第二步中,只有萎缩的肝叶被切除。在ALPPS的第二步后,继续对miRNA对进行分析,如(C)所示,在第二次手术后miRNA比值的增加几乎消失。最后,(D)示出了根据术后LD和切除萎缩肺叶后的死亡率,在ALLPS的第二步之前组合miRNA对的预测潜力。*P<0.05,**P<0.005。
具体实施方式
术后肝功能障碍(LD)是由于肝再生不足而引起的,在肝脏大部分切除的患者中发生率高达30%,同时还会增加患者的发病率和死亡率。尽管如此,用于确定患者在手术后发生LD的风险的治疗方案以及可靠的预测标记物仍然很有限。因此,迫切需要一种易于评估的术前检测来预测术后肝功能恢复情况,特别是因为目前的标记物往往昂贵,耗时,有时还具有侵入性。微小RNA(miRNA)特征是多种疾病的有效诊断、预后和治疗反应的生物标记物。
在无细胞血液(例如血清或血浆)中循环的微小RNA是一种微创或无创的生物标记物来源,允许微创检测,因此在临床和研究中具有广泛的适用性。
术语“样本”一般是指组织或器官样本、血液、血清和血浆等无细胞血液、去血小板血浆、淋巴、尿液、唾液和活检探针。优选地,所述样本是血浆样本。
根据具体实施方式,本文使用的样本是去血小板血浆,其在收集过程中经历了两次离心步骤。具体地,第一次离心步骤在较低的速度下进行,例如约1.000g-力(g),而第二次离心步骤在较高的速度下进行,例如约10.000g。这样的离心有助于确保完全去除血小板和诸如凋亡小体等较大的细胞外小泡,它们可能会干扰微小RNA的测定。用于防止血小板激活的优选抗凝剂为CTAD(柠檬酸钠、茶碱、腺苷、潘生丁(dipyridamole))。具体地,CTAD、柠檬酸钠或EDTA钾(K2-EDTA)可用于防止血小板激活。
具体地,去血小板血浆基本上不含血小板和中等或较大的细胞外小泡,它们在低于20,000g的离心速度下便形成颗粒。
如本文所用,术语“无细胞”是指缺少任何细胞的程度达到约90%的样本。
如本文所用,术语“受试者”或“个体”或“患者”应指温血哺乳动物,特别是人类。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗或被诊断患有特定疾病(例如但不限于肝癌或转移性结直肠癌)的人类和其他哺乳动物受试者。
因此,术语“治疗”意味着包含预防性和治疗性两种治疗。
如本文所用,术语“个体组”或“个体库”应指健康个体的组,并且具体地是指从所述个体采集的样本。组中个体的数量可以变化,即它可以包括2、3、4、5、6、7或更多个体,然而它也可以是更大的受试者组,例如但不限于至少10、25、50、100或更多个体。根据本发明的实施方式,组还可以包括500或更多个体的大组。
如本文所用,术语“大约”包含明确阐述的值以及与其具有小偏差的值。因此,与所述值相差10%,优选5%,优选1%的偏差均包含在术语“大约”中。
术语“微小RNA特征”是指特定的微小RNA表达谱,代表有效和可靠的诊断、预后和治疗反应生物标记物。如本文所用,术语“微小RNA特征”或“miRNA特征”是指在肝部分切除术后发生和没有肝功能障碍的患者之间循环miRNA表达谱的差异。具体地,本文所述的miRNA特征包括miR-151a、miR-122和miR-192中的至少一种微小RNA。
本文所使用的术语“体外方法”是指在活体体外进行的方法。具体地,它是指在诸如离体组织、器官或细胞,优选为血液,甚至更优选为血浆等样本上进行的方法。因此,这种体外方法不在活体上进行;尤其是不在人体上进行。
术语“肝功能障碍”与“LD”或“肝脏功能障碍”同义,是指肝脏的功能障碍,可表现为急性或慢性亚临床细胞紊乱,但可发展为危及生命的肝功能衰竭,并损害多器官系统。围手术期的发病率和死亡率可能很高;肝功能(葡萄糖稳态、蛋白质和促凝剂合成、胆红素代谢、药物和内源性毒素的生物转化)都可能受损。损伤程度和肝外受累的严重程度是可变的。肝切除术后肝再生不足可导致术后LD,肝脏大部分切除后多达30%的患者会出现这种情况。因此,在肝脏手术前进行风险分级以优化患者选择是减少术后LD和伴随并发症发生率的关键。发现是术后LD发生率升高的受试者可在术前接受有助于肝再生的治疗,或者调整他们的术后护理以应对LD风险的增加。例如,术后护理的调整可能意味着留在重症护理病房的时间更长,以便密切监视受试者的肝功能。
术语“肝部分切除术”或“部分肝切除术”是指手术切除部分肝脏。大多数肝切除术是为了治疗肝脏肿瘤而进行,无论肿瘤是良性还是恶性。良性肿瘤包括肝细胞腺瘤、肝血管瘤和局灶性结节增生。最常见的肝脏恶性肿瘤(癌症)是转移瘤;那些由结直肠癌引起的肿瘤最为常见,也是最适合通过手术切除的。肝脏最常见的原发性恶性肿瘤是肝细胞癌。肝切除术也可能是治疗肝内胆结石和肝囊肿或肝寄生囊肿的首选治疗方法。
原发性肝癌,又称为肝癌和原发肝癌,是始发于肝脏的癌症。从别处扩散到肝脏的癌症称为肝转移或继发性肝癌,相比始发于肝脏的癌症更为常见。本文所使用的术语“肝脏中的恶性病变”指原发性和继发性肝癌。最常见的肝癌是肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)(也称为肝细胞瘤,但这是一个误称,因为腺瘤通常是良性的),约占所有原发性肝癌的75%。HCC是由肝细胞(liver cell,也称为肝脏细胞(hepatocyte))形成的一种恶性肿瘤。另一种由肝细胞形成的癌症是肝母细胞瘤,它是由未成熟的肝细胞特异性形成的。这是一种罕见的恶性肿瘤,主要发病于儿童,约占儿童所有癌症的1%,占15岁以下所有原发性肝癌的79%。大多数肝母细胞瘤形成于右叶。肝癌也可以由肝脏内的其他结构形成,例如胆管、血管和免疫细胞。胆管癌(胆管细胞型肝癌(cholangiocarcinoma)和胆管细胞囊腺癌(cholangiocellular cystadenocarcinoma))约占原发性肝癌的6%。还有一种肝细胞癌变型,包括HCC和胆管细胞型肝癌。血管肿瘤(血管肉瘤(angiosarcoma)和血管内皮瘤(hemangioendothelioma)、胚胎肉瘤(embryonal sarcoma)和纤维肉瘤(fibrosarcoma))由一种称为间质的结缔组织产生。由肝脏肌肉产生的癌症是平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。其他不太常见的肝癌包括癌肉瘤、畸胎瘤、卵黄囊肿瘤、类癌肿瘤和淋巴瘤。淋巴瘤通常向肝脏弥漫性浸润,但在罕见的情况下也可能形成肝脏肿块。
在肝脏中发现的许多癌症并非真正的肝癌,而是从身体其他部位扩散至肝脏的癌症(继发性肝癌)。通常起源于胃肠道,因为肝脏靠近许多代谢活跃、血液丰富的器官,并且靠近血管和淋巴结(如胰腺癌、胃癌、结肠癌和主要位于阑尾的类癌肿瘤)。继发性肝癌也可能起源于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、前列腺癌。
肝癌的主要病因是由于乙型肝炎、丙型肝炎或酒精引起的肝硬化。其他原因包括黄曲霉毒素、非酒精性脂肪肝和肝吸虫。最常见的类型是肝细胞癌(HCC,占80%)和胆管癌。不太常见的类型包括胰腺粘液性囊性肿瘤(mucinous cystic neoplasm)和胆管内乳头状胆管肿瘤(intraductal papillary biliary neoplasm)。
根据本文提供的方法,可以根据患有的肝脏病变选择治疗策略。样本被划分为分类为无风险或低风险的受试者进行肝部分切除术的良好候选者,因为他们在肝部分切除术后发生肝功能障碍的风险较低。所述受试者可在评估LD风险后直接进行肝部分切除,或在肝部分切除术前进行肝再生刺激。
具体地,样本被划分为中风险或高风险的受试者在评估LD风险后不直接进行肝部分切除术。优选地,划分为中风险的受试者进行有助于肝再生的治疗、手术或药物治疗或其他治疗。所述治疗可以是新辅助化疗、门静脉栓塞、联合肝分割和分期肝切除门静脉结扎(ALPPS)、运动干预(“预康复”)或降低门静脉高压的药物治疗。具体地,可以通过本文提供的方法来监测所述治疗的再生成功性。
优选地,样本被划分为属于高风险分类的受试者不进行肝部分切除术。优选地,高风险受试者进行肝移植、姑息性化疗、射频消融或经肝动脉化疗栓塞术(TACE)。
具体地,根据本文提供的方法可以重复评估受试者发生肝功能障碍的风险,特别是在肝部分切除术后。
本文所用的术语“再生成功性”定义为在肝部分切除术后改善肝功能和降低肝功能障碍的风险。因此,优选地,监测肝再生的标记物应与患者的临床结果相关,即降低肝功能障碍的风险。适度的再生成功可将肝功能障碍的风险降低约25%至约50%。高再生成功性可将风险降低50%以上。发生肝功能障碍的风险没有降低和/或肝功能没有改善表明再生没有成功。具体地,可以使用本领域已知的肝功能测试来评估肝功能,例如检测凝血酶原时间(PT/INR)、aPTT、白蛋白和胆红素(直接和间接)的测试。
具体地,通过体外方法监测再生成功性,所述体外方法包括以下连续步骤:
a)提供所述受试者的样本,
b)测定所述样本中miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值,
c)测定参考样品中miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值,其中参考样本是受试者的较早样本,
d)将b)的表达水平比值和c)的表达水平比值进行比较,以及
e)根据步骤d)的比较结果,将所述受试者的样本划分为两个分类为“再生成功”或“未再生成功”中的一个。
本发明提供了用于预测肝部分切除术后肝功能障碍,以及用于监测肝部分切除术后或肝再生刺激后肝功能,或者用于监测正在接受治疗的受试者的治疗(具体地是降低肝肿瘤负荷的治疗)的所选miRNA。
具体地,所述miRNA是miR-151a、miR-122和/或miR-192或其异构体或变体。优选地,所述miRNA是hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-122-5p和/或hsa-miR-192-5p或其异构体或变体。
将一种或多种所述miRNA的水平与无肝功能障碍的受试者的水平进行比较,检测得到水平的增加或减少可用于预测受试者发生肝功能障碍的风险。
具体地,测定hsa-miR-151a-5p或其异构体或变体水平的降低和/或hsa-miR-192-5p或hsa-miR-122-5p或其异构体或变体水平的增加可以是发生肝功能障碍风险增加的特异指标。具体地,所述miRNA的增加或减少是基于在肝部分切除术后发生肝功能障碍的受试者的血液或血清中的水平数据。
本文还描述了预测肝功能障碍风险的临床上有用的临界值,特别是在肝部分切除术后。具体地,低严格性临界值的概率分数小于0.59,具体地小于0.58、0.57、0.56、0.55、0.54、0.53、0.52、051或0.50表示受试者发生肝功能障碍的风险较低,以及患者可以进行肝部分切除术且风险较低。优选地,将概率分数小于0.58(P<0.58)的患者划分为低风险。具体地,严格性临界值的概率分数大于0.58,具体地大于0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64或0.65表示患者发生肝功能障碍的风险为中等,这些患者应在手术前进行优化。优选地,将概率分数大于0.58(P>0.58)的患者划分为中风险。概率分数高于0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74或0.75表示受试者为高风险患者,优选不进行肝部分切除手术。优选地,概率分数高于0.68(P>0.68)表示受试者发生肝功能障碍的风险较高。
令人惊讶的是,使用本文所述的方法,100%的概率分数高于0.68的患者在肝部分切除术后出现肝功能障碍。而概率分数高于0.59的患者中只有80%发生肝功能障碍,概率分数低于0.59的受试者中约80%没有发生肝功能障碍。
具体地,通过测定微小RNA对之间的表达水平比值可以确定肝部分切除术后发生肝功能障碍的增加风险,所述微小RNA选自由miR-151a、miR-122和miR-192组成的组。具体地,对于一对微小RNA(miR1,miR2),表达值的log2比值,log2(miR1/miR2)通过它们的Cq值差异计算得到(ΔCq=CqmiR2-CqmiR1)。具体地,为了比较由NGS分析得到的微小RNA对结果(log2倍变化)以及由qPCR分析得到的结果(ΔCq),可以进行线性回归分析。具体地,可以通过相应系数的双侧渥得(Wald)检验法对线性关联进行检验,而测定系数可通过计算得到。受试者样本和参考样本之间ΔCq值的分布和差异可使用双侧威尔科克森秩和检验法来进行检验。
具体地,为了将受试者的样本划分为分类为无风险、低风险、中风险和高风险,或再生成功和未再生成功中的一种类别,两对微小RNA对中的每一对都包含在单变量和多变量逻辑回归模型中。具体地,可以应用留一法交叉验证策略,如果应用,则通过受试者工作特征(ROC)分析来评估。
具体地,为了确定最佳(临床相关)分类临界值,可以使用列联表(TP、FP、FN、TN)和相关参数,例如敏感性(SN)、特异性(SP)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、准确性(ACC)、F1分数(F1)和马修斯相关系数(MCC)。基于包含2种微小RNA对的多变量逻辑回归模型可以计算得到临界值。优选地,使用最大MCC和PPV=1(假阳性FP=0)时的临界值。
如本文所用,术语“微小RNA”或“miRNA”或“miR”表示17至25个核苷酸之间的非编码RNA分子,其与编码信使RNA杂交并调节其表达。术语“miRNA分子”是指代表miRNA的任何核酸分子,包括天然miRNA分子,即成熟miRNA、前miRNA(pre-miRNA)、初级miRNA(pri-miRNA)。
“miR前体”、“前miRNA”或“前miR”表示具有发夹结构的非编码RNA,其包含miRNA。前miRNA是初级miRNA转录物或“pri-miRNA”被双链RNA特异性核糖核酸酶(称为Drosha)切割的产物。前体可以是相应聚核苷酸在相应聚核苷酸的成熟过程中出现的各种形式。具体地,所述前体的示例列于表1中,具体地,所述前体的示例为SEQ ID No.4至6。
表1:miRNA SEQ ID
成熟miRNA(SEQ ID No 1-3)及其相应前体的核苷酸序列为本领域已知,并且可从miRBase数据库(mirbase.org/index.shtml)或者桑格(Sanger)数据库(microrna.sanger.ac.uk/sequences/ftp.shtml)获得。表1中还具体公开了这些核苷酸序列,包括对相应miRBase登录号的引用。
在本发明上下文中待检测的聚核苷酸的上下文中所使用的相同聚核苷酸可具有与包含或由SEQ ID No.1至3中任一个的核苷酸序列组成的聚核苷酸至少90%、95%、97%、98%或99%的相似性。具体地,相同聚核苷酸的序列与表1序列相差不超过1、2或3个核苷酸。
此外,在本发明上下文中待检测的聚核苷酸的上下文中所使用的相同聚核苷酸可具有与包含或由SEQ ID No.4至6中任一个的核苷酸序列组成的聚核苷酸至少90%、95%、97%、98%或99%的相似性,所述聚核苷酸在相应种子序列5’端和/或3’端包含相应前miRNA序列的一个、两个、三个或更多核苷酸。
为了本发明的目的,参考miRNA的“异构体和变体”(也被称为“isomiR”)包括剪接变体(5’剪接变体,其中5’切割位点位于参考miRNA序列的上游或下游;3’剪接变体:3’切割位点位于参考miRNA序列的上游或下游),或具有一个或多个核苷酸修饰的变体(参考miRNA的3’端加上的3’核苷酸;通过改变miRNA前体的核苷酸进行核苷酸替换),或互补的成熟微小RNA链,包括其异构体和变体(例如,给定5’成熟微小RNA的互补3’成熟微小RNA,或者相反)。关于核苷酸修饰,与RNA/RNA结合相关的核苷酸,即5’种子区和裂解/锚定侧的核苷酸不受修饰。
如本文所用,如果没有另外说明,术语“miRNA”包括3p和5p链及其异构体和变体。
具体地,如本文在说明书中所用,术语“miR-相应数字-5p”也包含其互补的3pmiRNA,反之亦然。
在具体实施方式中,使用与待检测的目标miRNA杂交的核苷酸并测量杂交信号来检测所述目标miRNA,优选地在严格条件下进行杂交检测。
在优选的实施方式中,目标miRNA的水平通过下一代测序测定。术语“下一代测序”(NGS),也称为高通量测序,在本文中用于描述许多不同的现代测序技术,这些现代测序技术能够比以前使用的测序方法(例如桑格测序)更快且更便宜地对DNA和RNA进行测序并量化其水平。它基于微米和纳米技术,减少样本的大小,试剂成本,并且能够大规模进行平行测序反应。它可以高度复用,允许同时测序并分析数以百万计的样本。NGS包括第一代、第二代、第三代以及随后的下一代测序技术。非限制性的示例为纳米孔或半导体技术(例如,英国牛津纳米孔技术公司)或依诺米那(Illumina)smallRNA Seq平台(Luo S.,2012,MethodsMol Biol.822:183-8)或基于例如Thermo Fisher’s Ion Torrent等方法的电子检测。
具体地,NGS指的是一种高通量测序技术,它并行地执行数千或数百万个测序反应。尽管不同的NGS平台使用不同的分析化学方法,但它们都从大量的测序反应生成序列数据,这些大量的测序反应在大量模板上同时运行,其中特定DNA或RNA(特别是miRNA)的序列数量与生物样品中的RNA水平相关。通常,使用扫描仪采集序列数据,然后对其进行组装和生物信息学分析。由此可以并行地执行、读取、组装和分析测序反应;参见Behjati S和Tarpey,P.,2013(Arch.Di.Child Educ Pract Ed 2013,98,236-238);Head S.et al.,2015(Biotechniques,56(2),61-passim)。
有些NGS方法需要扩增模板,有些则不需要。扩增所需的方法包括焦磷酸测序(例如,由罗氏公司商业化的,专利号为6,258,568的美国专利);Solexa/依诺米那平台(例如,专利号为6,833,246、7,115,400和6,969,488的美国专利);以及支持寡核苷酸连接和检测(Supported Oligonucleotide Ligation and Detection,SOLiD)平台(应用生物系统公司;例如,专利号为5,912,148和6,130,073的美国专利)。不需要扩增的方法,例如单分子测序方法,包括纳米孔测序、HeliScope测序(专利号为7,169,560;7,282,337;7,482,120;7,501,245;6,818,395;6,911,345;以及7,501,245的美国专利);通过合成的实时测序(参见,例如,专利号为7,329,492的美国专利);使用零模式波导(ZMW)的单分子实时(SMRT)DNA测序方法;以及其他方法,包括专利号为7,170,050;7,302,146;7,313,308;和7,476,503的美国专利;US 20130274147;US20140038831;以及Metzker,Nat Rev Genet 11(1):31-46(2010)中描述的方法。或者,也可以使用基于杂交的测序方法或其他高通量方法,例如微阵列分析、NANOSTRING、依诺米那或其他测序平台。
具体地,小RNA测序文库可以使用本领域已知的文库制备试剂盒产生,例如CleanTag SmallRNA文库制备试剂盒(美国TriLink)。通常,RNA首先被逆转录成DNA,然后进行PCR扩增。PCR扩增可以使用条形码引物来进行,例如用于小RNA测序的依诺米那条形码引物。在测序之前,使用本领域已知的方案纯化PCR产物。例如,PCR产物可以使用凯杰(Qiagen)的QiaQuick方案进行纯化,并且随后可以通过合适的方法(例如毛细管电泳)进行大小检测。
具体地,下一代测序可以在任何合适的平台上执行,例如依诺米那NextSeq 500。测序读取结果通常根据本领域公知的生物信息学方法进行剪接、质量检查和编辑以备进一步使用。
在另一优选的实施方式中,通过聚合酶链式反应(PCR)来测定目标miRNA的水平。PCR方法为本领域所周知且被广泛使用。它们包括实时定量PCR、半定量PCR、多重PCR、数字PCR或其任何组合。在具体优选的实施方式中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)测定miRNA的水平。使用qRT-PCR测定miRNA水平的方法为本领域已知,并且通常先将miRNA逆转录为cDNA。
在本发明中有用的PCR方法中,引物通常是基于成熟的miRNA分子,但可以包括化学修饰以优化杂交行为。
qRT-PCR方法可测定miRNA的绝对表达水平。或者,qRT-PCR方法可以测定miRNA的相对量。可以通过将miRNA的水平归一化为一种或多种内参核酸序列的水平来确定miRNA的相对量。一般来说,这种内参核酸序列在所分析的血液或血清样本中应具有固定水平。例如,内参核酸序列可以是组成型转录的RNA核酸序列,例如类似甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)的mRNA,或者非编码RNA,例如5S和18S核糖体RNA、RNU48、RNU44和RNU6。此外,在血清或血浆中具有恒定且高水平的miRNA,例如miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-15-5p或miR-16-5p可以用作相对定量的参考。此外,在RNA分离或cDNA合成过程中,以等摩尔量添加的合成RNA序列可作为特定miRNA相对定量的参考。
或者,可以计算两种miRNA之间的相对对数差来形成自归一化的miRNA对。由此可以避免对参考miRNA的需要。
在Schmittgen et al.,2008,Methods.January;44(1):31–38中概述了可用于本发明的实时PCR定量方法。
用于检测miRNA的引物可市售购买得到,例如微小RNA形式的Exiqon LNATMPCR引物集。
由于miRNA是相对较短的分子,因此在逆转录和扩增之前通过向链中添加腺苷单体(一种称为聚腺苷酸化的技术)来延长它们将会是有用的。简言之,RNA可通过适当试剂(例如Trizol试剂)从样品中提取,在ATP和聚(A)聚合酶存在下进行聚腺苷酸化,使用聚(T)接头和5’RACE序列逆转录成cDNA,并使用miRNA 3’端的正向引物和反向RACE引物进行扩增。该技术的改进包括设计的RACE引物在3’端带有核苷酸(由A、C或G,构成,但不是T,从而避免在聚A序列的任何地方上起始,并强制在miRNA序列上起始),或者使用具有或没有化学修饰的2、3、4或更多个核苷酸将其锚定在特定微小RNA的3’cDNA端的RACE引物。
miRNA的检测也可通过本领域已知的其他方法实现,例如WO2011/14476中描述的那些方法,例如通过深度测序方法,基于微珠的定量法(例如依诺米那珠阵列),基于水凝胶颗粒的定量法(例如FireflyTM),通过微阵列技术(例如Invitrogen提供的NcodeTM人类miRNA阵列,昂飞公司(Affymetrix)、安捷伦公司(Agilent)提供的芯片阵列,或采用LNA主干捕获探针的微阵列(miRCURY LNATM阵列),例如,由Exiqon提供的微阵列。
miRNA水平的差异也可以使用基于多重化学发光的核酸分析来确定,例如Panomics,或者包含具有微小RNA互补调控位点的报告蛋白的报告质粒分析(“生物传感器”),或者其他本领域已知的基于杂交的技术。
术语“参考水平”、“参考比值”、“参考样本”、“对照组”或“对照样本”可在本文中互换使用,并且应理解为用于与实验样本进行比较的样本或标准本,即待确定其发生LD风险或再生成功性的受试者样本。对照组可包括从健康受试者或肝部分切除术后未发生肝功能障碍的受试者身上采集的样本。此外,对照组也可以是标准参考值或值范围,例如,在样本中稳定表达的miRNA,例如内源性对照U6 snRNA。
参考水平可确定为健康受试者、肝部分切除术后未发生LD的受试者和/或手术、药理学、饮食或生活方式干预后的受试者样本中相应miRNA的平均水平。作为替代方案,也可以使用样本库或文献中公开的参考水平。
miRNA水平的差异可通过本文所述的任何方法来确定。
具体地,可以使用分类模型将样本的表达水平或表达水平比值与参考表达水平或参考表达水平比值进行比较。分类技术(或分类器)是一种根据输入数据集建立分类模型的系统方法,输入数据集例如是肝部分切除术后有肝功能障碍和没有肝功能障碍患者的微小RNA表达水平。示例包括逻辑回归模型、支持向量机模型、决策树模型、基于规则的分类器、神经网络和朴素贝叶斯分类器。每种技术都采用学习算法来识别最适合输入数据的属性集和类别标签之间关系的模型。由学习算法生成的模型应该既能很好地拟合输入数据,又能正确地预测前所未见的数据类别标签。因此,学习算法的关键目标是建立具有良好泛化能力的模型,即能够准确预测先前未知数据的类别标签的模型。
逻辑回归模型是对逻辑模型参数的评估。逻辑模型是一个事件概率的对数概率是独立变量或预测变量的线性组合的模型。它根据输入对输出概率进行建模,通过选择临界值,将概率大于临界值的输入分为一类,概率小于临界值的输入分为另一类,从而形成分类器。
支持向量机(SVM)是一种具有相关学习算法的监督学习模型,用于分析用于分类和回归分析的数据。给定一组训练样本,每个样本被标记为属于两个或更多个分类中的一个或另一个,SVM训练算法就能建立一个模型,将新的实例分配到一个分类或另一个分类,使其成为一个非概率的二元线性分类器。支持向量机在高维或无限维空间中构造一个超平面或一组超平面,可用于分类、回归或异常点检测等任务。直观地说,一个好的分离是通过超平面来实现的,这个超平面到任何类别中最接近的训练数据点的距离最大(称为函数间隔),因为通常间隔越大,分类器的泛化误差就越低。
在计算复杂度和通信复杂度理论中,决策树模型是一种计算或通信模型,其中算法或通信过程基本上被视为决策树,即基于某些量的比较的一系列分支操作,被指定为单位计算成本的比较。根据计算单个比较所允许的操作复杂度和分支的方式,引入了决策树模型的几种变体。决策树模型有助于确定某些类别的计算问题和算法的计算复杂度下限:最坏情况下的计算复杂度下限与给定计算问题的所有可能输入的决策树中的最大深度成正比。根据决策树模型表示的问题或算法的计算复杂度称为决策树复杂度或查询复杂度。
根据另一实施方式,本文所述的方法可用于监测受试者,特别是用于测定受试者对肝再生刺激的响应。
本文所述的方法可用于监测治疗和治疗方法的成功性,例如化疗、免疫治疗、门静脉栓塞、联合肝分割和分期肝切除门静脉结扎(ALPPS)或其他治疗方案,例如运动干预(“预康复”),降低门静脉高压的饮食或药物治疗。
化疗是用药物破坏癌细胞的治疗方法。用作肝癌的全身化疗药物有多柔比星(阿霉素)、5-氟尿嘧啶和顺铂。但即使是这些药物也只能缩小一小部分肿瘤,而且这种反应通常不会持续很久。在大多数研究中,即使是联合用药的全身化疗也不能延长患者的寿命。或者,化疗可以通过肝动脉灌注(HAI)的方法直接进入肝脏。HAI相比全身化疗对肿瘤产生更强的化疗作用,但不会增加副作用。经肝动脉灌注化疗的示例包括氟尿苷(FUDR)、顺铂、丝裂霉素C和多柔比星。
门静脉栓塞术(PVE)是一种在肝部分切除术前使用以增加术后保留肝段大小的技术。这种疗法将门静脉血重新定向到将来存留肝脏(future liver remnant,FLR)的部分,导致肥大。当FLR太小而不能支持基本功能或边缘尺寸且伴有复杂的术后过程时,指示进行PVE。如果应用得当,PVE已被证明可以降低术后发病率并增加能够进行治疗性切除的患者数量。术前门静脉栓塞术是一种安全的图像引导手术,通过将门静脉血重新定向到非肿瘤负荷的肝脏部分而导致FLR肥大。
联合肝分割和分期肝切除门静脉结扎(ALPPS)是近年来发展起来的一种挽救性治疗方法,用于治疗传统上不可切除的肝肿瘤。ALPPS手术最早由Schnitzbauer等人(27)阐述,并且已经发展到允许快速肝再生,并且已经发展到允许快速肝再生,优选是对于存留肝脏不足以允许完全预先切除肝脏病变部分的临界可切除患者。特别是为那些肝右叶肿瘤且存留肝脏(FLR)不足的患者提供了一个新的治疗途径。该手术分两步执行。具体地,在第一步中,有选择地结扎供养肿瘤负荷肝脏的门静脉分支,同时保留动脉和胆汁结构,并在手术的初始步骤进一步横切肝实质。如果成功的话,这个手术能够使肝脏在几天内再生和生长。具体地,等到肝脏再生充分,就进行第二步手术切除结扎的剩余肝叶。这种手术的主要缺点是具有较高发病率和死亡率,因此迫切需要可靠的预测标记物来确定肝功能障碍的风险何时低到足以进行第二步切除。
具体地,采用使用如本文所述的miRNA特征的体外方法可以将如本文所述提供的样本划分为“治疗成功”或“未治疗成功”。因此,可以在肝部分切除术之前,确定在例如ALPPS、PVE或化疗等方法后的肝再生成功性。具体地,可以确定在肝部分切除术后发生肝功能障碍风险较低的时间点。
门静脉高压是指在一个称为门静脉系统的静脉系统内血压升高。来自胃、肠、脾和胰腺的静脉汇入门静脉,然后门静脉分支成较小的血管,流经肝脏。如果肝内血管因肝损伤而阻塞,血液就不能正常流经肝脏。结果是门静脉系统中形成高压。降低门静脉高压的治疗方法包括内镜下静脉曲张结扎术(EVL),使用非选择性β受体阻滞剂(NSBB),例如普萘洛尔(propranolol)或纳多洛尔(nadolol),它们通过减少门静脉血流量来降低门静脉压力。其作用机制涉及通过β-1受体降低心输出量,并通过阻断β-2受体引起内脏血管收缩,从而产生无对抗性的α-1活性。后者是最重要的作用,因此必须使用NSBB(与选择性β受体阻滞剂相反)(Khurram and Guadalupe,World J Gastroenterol.2012Mar 21;18(11):1166–1175)。
一般来说,生活方式的改变也能刺激肝再生,例如增加运动以改善整体健康(“预康复”)以及减少蛋白质、钠和酒精摄入的饮食改变。
本文还提供了一种试剂盒套件,包括
a)检测试剂,其能够检测受试者样本中至少一种微小RNA的表达水平,所述微小RNA选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组,
b)参考表达水平,
c)软件,包括分类模型,用于比较a)的表达水平与b)的表达水平,并将受试者的样本划分为至少两个类别中的一个,其中每个类别是至少两个分类为肝部分切除术后肝功能障碍“高风险”和“低风险”中的一个。
具体地,本文提供的试剂盒套件可以是qRT-PCR试剂盒,其包含用于RNA提取、cDNA合成以及基于荧光的对特定微小RNA靶序列进行扩增的试剂,具体地所述微小RNA至少是miR-151a、miR-192或miR-122。荧光报告探针仅检测含有与探针互补序列的DNA;因此,使用报告探针可显著提高特异性,并且即使在其他双链DNA存在的情况下也能执行该技术。通过使用不同颜色的标记,荧光探针可用于多重分析,以监测同一试管中的多个靶序列。这些荧光报告分子包括作为检测试剂的序列特异性探针,例如分子信标、FRET杂交探针、蝎子引物(Scorpion)或探针。使用qRT-PCR检测miRNA的各种方法为本领域技术人员已知,例如Arya等人的研究(Expert Rev Mol Diagn.2005Mar;5(2):209-19)和Navarroet al.(Clin Chim Acta.2015Jan 15;439:231-50)。
具体地,本文所提供的试剂盒套件可以是微阵列试剂盒,其包括高密度或低密度阵列,所述阵列具有用于特定微小RNA序列的捕获探针、用于微小RNA标记和杂交的化学品以及用于增加杂交反应严格性和特异性的洗涤缓冲液。可以使用生物素探针(例如Lucigen的Biotin-16-UTP)来实现微小RNA标记。
具体地,本文所提供的试剂盒套件可以是下一代测序试剂盒,其包含将5’接头和3’接头连接到微小RNA、逆转录和PCR扩增所需的试剂,以获得适用于下一代测序的测序文库。
本发明还包括以下项目:
1.一种确定受试者肝功能障碍风险的体外方法,特别是确定在肝部分切除术后受试者肝功能障碍的风险,所述方法包括以下步骤:
a)提供所述受试者的样本,
b)测定所述样本中至少一种miRNA的表达水平,所述miRNA选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组,并且
i.将b)的表达水平与至少一个参考表达水平进行比较,或
ii.基于在b)中测定的表达水平,鉴定miR-151a与miR-192和/或miR-122与miR-151a的比值,并将所述表达水平比值与参考表达水平比值进行比较,以及
c)根据步骤i)或步骤ii)的结果,将样本划分为至少两个类别中的一个,其中每个类别是至少两个分类为“高风险”和“低风险”中的一个。
2.根据项目1所述的体外方法,其中测定miR-151a、miR-192和miR-122的表达水平。
3.根据项目1或2所述的体外方法,包括进一步划分为分类为“无风险”和“中风险”。
4.根据项目1至3中任一项所述的体外方法,其中所述参考表达水平为至少一种miRNA的表达水平,所述miRNA选自由健康受试者或无术后肝功能障碍受试者或其组合的miR-151a、miR-192和miR-122组成的组。
5.根据项目1至3中任一项所述的体外方法,其中参考表达水平比值是健康受试者或无术后肝功能障碍受试者或其组合的miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值。
6.根据项目1至5中任一项所述的体外方法,其中,将划分为“低风险”的受试者接受肝部分切除术,划分为“中风险”的受试者在肝部分切除术前接受肝再生刺激,划分为“高风险”的受试者不进行肝部分切除术。
7.根据项目6所述的体外方法,其中划分为“中风险”的受试者在肝部分切除术前接受治疗,所述治疗选自新辅助化疗、门静脉栓塞、联合肝分割和分期肝切除门静脉结扎(ALPPS)、运动干预(“预康复”)或降低门静脉高压的药物治疗组成的组。
8.根据项目6所述的体外方法,其中划分为“高风险”的受试者接受肝移植、姑息性化疗、射频消融或经动脉化疗栓塞术(TACE)。
9.一种监测受试者肝再生刺激的再生成功性的体外方法,包括以下步骤:
a)提供所述受试者的样本,
b)测定所述样本中miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值,
c)测定参考样本中miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值,其中参考样本是受试者的较早样本,
d)将b)的表达水平比值和c)的表达水平比值进行比较,以及
e)根据步骤d)的比较结果,将所述受试者的样本划分为两个分类为“再生成功”或“未再生成功”中的一个。
10.根据项目9所述的体外方法,其中所述肝再生刺激选自由以下组成的组:通过门静脉栓塞诱导肝肥大,通过联合肝脏分割与门静脉支结扎(ALPPS)诱导肝肥大,通过运动干预(“预康复”)改善整体健康以及降低门静脉高压的药物治疗。
11.根据项目1至10中任一项所述的体外方法,其中所述受试者患有肝脏恶性病变或患有良性肝肿瘤、肝囊肿和/或寄生虫,优选地,所述肝脏恶性病变为转移性结直肠癌、肝细胞癌或胆管细胞癌。
12.根据项目1至11中任一项所述的体外方法,其中所述样本选自由血液、血清、血浆组成的组,具体地,所述样本为去血小板血浆、淋巴、尿液、唾液以及活检探针。
13.根据项目1至12中任一项所述的体外方法,其中使用分类模型将样本的表达水平或表达水平比值与参考表达水平或参考表达水平比值进行比较。
14.根据项目1至13中任一项所述的体外方法,其中分类模型根据与参照物的比较结果,将受试者的样本划分为两个类别中的一个。
15.根据项目13或14中任一项所述的体外方法,其中所述分类模型选自由逻辑回归模型、支持向量机模型和决策树模型组成的组。
16.根据项目1至15中任一项所述的体外方法,其中用于测定表达水平的方法选自由以下组成的组:基于测序的方法,具体地为下一代测序、基于阵列的方法和基于PCR的方法,具体地为基于定量PCR的方法。
17.一种试剂盒套件,包括:
a)检测试剂,其能够检测受试者样本中至少一种微小RNA的表达水平,所述微小RNA选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组,
b)参考表达水平,
c)软件,包括分类模型,用于比较a)的表达水平与b)的表达水平,并将受试者的样本划分为至少两个类别中的一个,其中每个类别是至少两个分类为肝功能障碍“高风险”和“低风险”中的一个,特别是在肝部分切除术后的肝功能障碍。
本文所描述的示例是本发明的示例性说明,并不旨在对本发明进行限制。根据本发明意见对本发明的不同实施例进行了描述。在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可以对本文描述和示例的技术进行许多修改和变化。因此,应当理解,这些示例仅作示例性说明性,而并非限制本发明的范围。
实施例
采用下一代测序技术作为无偏系统方法,在21例肝切除术后LD患者和27例对照组的术前血浆中检测到554中miRNA。随后,检测到与肝切除术后发生LD患者高度相关的miRNA特征——包括miRNA 151a-5p、192-5p和122-5p。随后,术后LD的预测潜力在24名患者的独立验证组中通过实时PCR得到证实。最终,151a-5p与192-5p以及122-5p与151a-5p两个miRNA比值的回归模型能可靠地预测术后LD、严重发病率、延长留在重症护理病房的时间以及住院时间,甚至手术前死亡率,具有显著的准确性,因此优于已有的术后LD标记物。
鉴于预测肝切除术后可能致命的术后临床结果的临床相关性,该数据证明了一种新的基于miRNA的生物标记物在协助选择接受肝部分切除术的患者方面的临床实用性。这些生物标记物可以根据个体患者的特定风险状况调整治疗和手术策略。
材料和方法
研究人群
最初,从2012年2月开始,在维也纳医科大学前瞻性地招募了一组接受肝脏切除术的患者。入选条件为患有肝细胞癌(HCC)、胆管细胞癌(CCC)或转移性结直肠癌(mCRC)的患者。随后,当我们观察到miRNA对术后LD和临床结果的显著预测潜力时,我们在一组接受肝切除术的前瞻性患者中验证了我们的探索结果。
前瞻性记录所有患者的基线特征、手术切除程度(根据IHPBA 布里斯班(Brisbane)2000命名法(13),<3段=小部分,≥3段=大部分)、术中个体特征以及肝功能和损伤的术前变量。
本研究经机构伦理委员会批准,符合赫尔辛基宣言,对所有患者均书面征得同意。此外,该试验在临床试验注册处注册(ClinicalTrials.gov标识符:NCT01700231和NCT02113059)。
术后并发症的定义和分类
在维也纳医科大学对患者进行了90天的术后随访。前瞻性记录术后结果。术后LD的诊断符合国际肝脏外科研究小组(ISGLS)发布的标准(14)。简单来说,LD由术后第5天(POD)的血清胆红素和凝血酶原时间两方面的异常值来定义。值得注意的是,在术前血清胆红素或凝血酶原时间异常的情况下,POD 5后两天出现的术后偏差和恶化被确定为术后LD。此外,在POD 5之前血清胆红素或凝血酶原时间达到正常值的患者,或由于临床表现良好提前出院因而没有进一步采血的患者,将其认为是“无LD”。
对于术后发病的患者的分类,应用Dindo等人(15)提出的大纲。据此,记录术后并发症的程度,并分级成Ⅰ级至Ⅴ级。对于多发性并发症的情况,以最严重的并发症作为分级依据。此外,记录术后住院时间和留在重症护理病房(ICU)的时间。最后,手术后90天内的死亡病例划分为术后死亡(16)。
术前肝功能评估
使用吲哚菁绿(ICG)清除率对肝切除术前肝功能进行常规评估(17)。将25mg ICG试剂溶于20ml等渗液中,并按0.25mg/kg体重的剂量向患者进行静脉注射。使用脉冲光谱法评估循环中显色剂的浓度。最后,测量本专利患者组中,第一分钟内清除的ICG试剂量(=血浆内消失率(PDR)),以及15分钟后在循环中检测到的剩余试剂量(R15)。
循环miRNA的测定
在手术前,如前所述(18,19)仔细制备血浆。简单地说,将血液吸至预冷的CTAD管,并在30分钟内处理。在4℃下1000g离心10分钟,然后在4℃下10000g再额外离心10分钟,从而将血浆从固体血液成分中分离出来。最后,将血浆储存在-80℃下,留待进一步分析。
RNA提取
应用miRNeasy微型试剂盒(德国凯杰)从血浆中分离总RNA,包括小RNA。冷冻血浆样本在室温下解冻,并在12000g下离心5分钟以将无细胞成分与潜在碎片分离。通过涡流将200μl血浆与1ml Qiazol混合,Qiazol中含有三种合成的添加对照品(丹麦Exiqon)的混合物。在室温下孵育10分钟后,加入200μl氯仿并通过涡流剧烈混合。在4℃下12000g离心15分钟后,吸取650μl水相。将糖原(美国Ambion)添加至终浓度为50μg/ml。然后将样本转移至硅胶柱,并根据生产商的操作方法使用QIAcube移液工作站作进一步处理。用750μl乙醇沉淀RNA,用RPE缓冲液洗涤三次,然后在30μl无核酸酶水中洗脱RNA,–80℃储存备用。
小RNA测序
根据生产商的建议方案,使用CleanTag小RNA文库制备试剂盒(美国TriLink)生成小RNA测序文库。使用2μl总RNA在28℃下与3’接头和5’接头连续连接1小时,然后在65℃下再连接20分钟。接头预先按1:12稀释以降低RNA丰度。在50℃下进行逆转录1小时。采用条形码依诺米那引物对小RNA序列进行PCR扩增:变性(98℃,10s)、退火(60℃,30s)和延伸(72℃,15s),上述周期循环26次。PCR产物用QiaQuick方法(德国凯杰)纯化,用DNA 1000芯片(美国安捷伦公司)毛细管电泳进行大小检测。将约145bp的峰值浓度为基础汇集等摩尔量DNA。对DNA库进行凝胶纯化以筛选18-50bp之间的模板插入物(template insert)。在依诺米那NextSeq 500上进行测序,单端读取50个周期(美国依诺米那)。对fastq格式的序列读取结果进行裁剪和质量检查(生成fastQC文件)。利用Bowtie2,用高质量筛选读取结果(phred>30)与人类成熟miRNA(miRBase v21)进行比对。通过基因组比对(Bowtie2,GRCh37)对图谱读取结果进行交叉检查。对成熟miRNA读取结果进行计数(总结isomiR序列),并将其归一化为每百万计数(CPM)作为图谱读取结果的总数。CPM值用于统计分析(见下文)。
qPCR分析
如前所述进行qPCR分析(20)。简单来说,使用Universal cDNA合成试剂盒II(丹麦Exiqon)将2μl总RNA逆转录成cDNA。将cDNA按1:50预稀释,使用ExilentGreenmasermix和LNA修饰引物对(丹麦Exiqon)以进行qPCR扩增。在96孔或384孔的LC480-II(德国罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))上进行qPCR扩增。用二阶导数法测定Cq值。利用合成的添加对照品(丹麦Exiqon)的组合,对RNA提取、cDNA合成和qPCR扩增的稳健性进行评估。用miR-23a-3p与miR-451a(21)的比值评估溶血性。值得注意的是,没有样本由于溶血或高分析方差而失败。
统计分析
检测组和验证组患者之间特征差异的分类变量的采用卡方检验法进行检验,而连续变量则采用威尔科克森秩和检验法进行检验。
利用edgeR包对LD患者组与无LD患者组之间差异表达的微小RNA进行归一化和计算(log2倍变化)。通过似然比检验法确定显著性差异。根据Benjamini-Hochberg方法,基于错误发现率调整多重检验的P值。将平均丰度为每百万分log2计数(logCPM)>5,倍数变化>1.3,原始p<0.2的微小RNA认为是潜在的候选生物标记物。对于qPCR分析,微小RNA成对自归一化:对于一对微小RNA(miR1,miR2),表达值的log2比值,log2(miR1/miR2)通过它们的Cq值差异计算得到(ΔCq=CqmiR2-CqmiR1)。为了比较由NGS分析得到的微小RNA对结果(log2倍变化)以及由qPCR分析得到的结果(ΔCq),进行了线性回归分析。通过相关系数的双侧渥得检验法对线性关联进行检验,并计算出测定系数(R2)。对照组和LD组之间ΔCq值的分布和差异通过箱形图表示,并使用双侧威尔科克森秩和检验法进行检验。
通过进行随机森林分析(标准设置的randomForestR包,建立10001个决策树)以确定在LD患者与无LD患者分类中最重要的变量(微小RNA对)。为了进行分类,两对信息量最大的微小RNA对中的每一对都包含在单变量和多变量逻辑回归模型中。采用留一法交叉验证(LOOCV)策略,并通过受试者工作特征(ROC)分析(ROCR R包)进行评估。测定ROC曲线下面积(AUC),并检验与随机分配的显著偏差(AUC=0.5)。使用ROC分析在独立验证组中评估这些逻辑回归分类模型的性能。为了确定最佳(临床相关)分类临界值,基于包含在检测组中学习到的2种微小RNA对的多变量逻辑回归模型,对不同临界值列联表(TP、FP、FN、TN)和相关参数(包括敏感性(SN)、特异性(SP)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、准确度(ACC)、F1分数(F1)、马修斯相关系数(MCC)进行计算。由1)最大MCC以及2)PPV=1(假阳性FP=0)与最大MCC选择两个临界点。应用选定的模型和这些条件,从而使检测组、验证组和组合组的临界值相同。为了将分类性能与其他临床参数进行比较,使用了组合组。采用ROC分析和AUC,将这2种微小RNA对模型的性能与其他肝功能参数进行比较。对于两个不同的临界值,采用双侧Fisher精确检验法检测预测对照组和预测肝功能障碍组之间肝功能障碍患者比例、严重发病率和死亡率的差异,并确定比数比(OR)。
使用SPSS(23.0版)和R语言(3.4.1版)进行分析;p值<0.05被认为具有显著性。
实施例1:在检测组中建立用于术后肝功能障碍的预测性miRNA组
在2012年2月至2016年4月期间,共有48名接受了肝切除术的mCRC、HCC或CCC患者被纳入我们的检测组。为了获得具有代表性的组,21例术后LD患者根据基本特征、肝功能和肝切除程度与27例无术后LD患者进行配对。随后,另外24名患者作为前瞻性临床相关验证组。患者特征如表2所示,并在检测组和验证组之间进行了比较。值得注意的是,考虑到检测组的选择,在检测组中进行肝脏大部分切除的患者数量明显增多,同时ICG清除率和γ-谷氨酰转肽酶值明显降低。
CRCLM=结直肠癌肝转移,HCC=肝细胞癌,CCC=胆管细胞癌,CTx=化学疗法,RBC=血红细胞,PDR=血浆内消失率,R15=15分钟剩余率,SB=血清胆红素,PT=凝血酶原时间,AP=碱性磷酸酶,GGT=γ-谷氨酰转移酶,AST=天冬氨酸转氨酶,ALT=丙氨酸转氨酶,ISGLS=国际肝脏外科研究小组,ICU=重症护理病房。
对于与术后肝功能障碍相关的miRNA的初步鉴定,其目的是采用下一代测序进行无偏系统方法。因此,我们对检测组中所有患者的术前血浆中的miRNA谱进行了分析,以确定发生LD的患者与没有延迟肝脏恢复的患者之间的miRNA谱是否存在差异。在所分析的全部血浆样本中共检测到554种miRNA。为了确定潜在的候选生物标记物,将血浆丰度(平均每百万log2计数(logCPM)>5)、效应大小(倍数变化>1.3)和显著性水平(p<0.2)的临界值都纳入考虑。如图1所示,经过分析保留了19种miRNA,在LD患者术前血浆中有12种上调(右侧),7种下调(左侧)。
随后,对下一代测序和基于qPCR的miRNA检测之间的分析变化进行了分析,并计算了两种miRNA之间形成自归一化miRNA对的相对对数差异,从而避免了对参考miRNA的需要。在这次分析中将六种位于顶部的miRNA,即15种miRNA对纳入考虑。观察到数据集之间(下一代测序与基于qPCR的miRNA检测)具有高度一致性。使用随机森林模型分析了miRNA对于实现良好地预测术后阴性结果性能的重要性(图2A)。鉴定出两种排名靠前的miRNA对(151a-5p/192-5p,122-5p/151a-5p)在发生LD个体和对照组之间存在显著的术前差异(图2B,C)。通过曲线下面积(AUC)来描述性能,由p值表示分类是否显著偏离随机分配(AUC=0.5)。通过ROC分析测量的多变量模型的诊断性能评估,miRNA对122-5p_151a-5p的AUC为0.66(图2D),miRNA对151a-5p_192-5p的AUC为0.75(图2E),使用两种miRNA对结合的逻辑回归模型的AUC为0.76(图2F)。
接下来,定义两个临床上有用的临界值来预测术后LD。因此,定义了一个低严格性临界值,以确定可以进行肝切除术且风险较低的患者(临界值P>0.59),定义了一个严格性临界值,以确定应在手术前进行优化或不进行肝切除术的患者(临界值P>0.68)。对于模型定义的两个临界值P>0.59和P>0.68,分析了预测对照组和预测LD组的真实术后LD百分比。两者均发现与术后LD的显著性增加有关(p=0.00045,图2G以及p=0.00054,图2H)。具体来说,100%的概率分数高于0.68的患者在肝部分切除术后出现肝功能障碍。而概率分数高于0.59的患者中只有80%出现肝功能障碍,概率分数低于0.59的受试者中约80%没有发生肝功能障碍。这些结果表明概率分数P>0.68是将患者划分为发生肝功能障碍“高风险”的良好临界值,概率分数P>0.59是将患者划分为发生肝功能障碍“中风险”的良好临界值。
实施例2:在独立验证组中验证所发现的miRNA比值
为了证实所鉴定的miRNA比值的临床实用性,在一个独立前瞻性验证组中对2种miRNA对的预测性能进行验证,该验证组包括24名患者,19名无术后LD,5名有术后LD,反映了30%的术后LD自然发生率。即使在如此小的样本量内,相比于对照组,在图3A(miRNA对122-5p/151a-5p)和图3B(miRNA对151a-5p/192-5p)中存在着趋向LD患者中差异调节miRNA的强烈趋势。通过ROC分析测量的多变量模型的诊断性能显示,2种miRNA对的AUC为0.80(图3C)。此外,也验证了这两个临界值能够分别预测术后LD,临界值P>0.59的p=0.018(图3D),临界值P>0.68的p=0.036(图3E)。
实施例3:所发现的miRNA比值与其他术后LD预测物的比较
接下来,与数据集(N=72)结合评估基于miRNA的预测模型的性能。为此,利用敏感性(SN)、特异性(SP)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和比数比(OR)来说明这两个临界值的诊断性能。低严格性临界值(>0.59)产生了平衡的PPV值和NPV值(分别为0.80和0.81),而严格性临界值(>0.68)产生了1.0的PPV值,可接受的NPV值为0.74(图4A),表明所有检测阳性患者都患有术后LD,74%的检测阴性患者不会患有术后LD。反之亦然,26%的检测阴性患者确实患有术后LD。不良事件的OR分别为15.92(p<0.0001)和无限(p<0.0001)。对微小RNA模型进行受试者工作特征(ROC)曲线分析,比较其与标准肝功能参数的性能。对miRNA模型进行ROC曲线分析,并与标准肝功能参数的ROC曲线进行比较(图4B)。miRNA模型的AUC为0.76,超过了包括ICG血浆内消失率、剩余率以及丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和γ-谷氨酰转移酶(GGT)等标准血液参数在内的其他参数的AUC。最后,对两个临界值模型的手术后其他不良结果的OR进行了分析。两个临界点的严重发病率的OR都达到显著性水平(图4C)。尽管发现低严格性临界值的死亡率OR具有显著性,而在高严格性临界值中虽然显示出相同的趋势,但并不显著(图4D)。此外,还发现,符合我们的临界值的患者留在ICU的时间明显更长,住院时间也更长(图4E,F)。
采用下一代测序技术作为无偏系统方法,在肝切除术前患者血浆中检测到554种miRNA。其中,一种由3个miRNA 151a-5p、192-5p和122-5p组成的特征被识别出来,这些miRNA特征在手术前在肝切除术后会发生术后LD的患者身上就能被特异性检测出来。特别是,151a-5p与192-5p以及122-5p与151a-5p这两种miRNA比值的回归模型被发现能够可靠地预测术后LD、严重发病率、延长ICU以及住院时间,甚至手术前的死亡率,具有显著的准确性,并且不需要参考miRNA。鉴于预测肝切除术后可能致命的术后临床结果的临床相关性,本文提供的数据首次证明了基于miRNA的生物标记物在协助选择接受肝部分切除术的患者方面的临床实用性。
特别是,在肝病的早期阶段,肝功能的临床评估和量化仍然具有挑战性。然而,如果某些应激因素(例如大创伤肝切除术(extensive liver resection))起作用,即使是轻微的肝功能减退也可能成为主要的相关因素。虽然已经开发出一些侵入性和非侵入性的检测,但只有少数能够进入常规临床应用。这些可用预测物的主要缺点在于可用性、成本高和具有侵入性(22)。虽然肝静脉压力梯度(HVPG)显示出在预测HCC患者术后临床结果上的价值(23-25),但由于其侵入性,对于高风险患者而言仍然有所保留。其他微创且成熟建立的评估肝功能的标记物依赖于对肝脏的动态功能评估。在这种情况下,多个研究小组证明了ICG清除率对预测术后LD和发病率的重要性(26)。本文提供的数据表明本文所描述的miRNA特征在诊断准确性方面远远优于ICG。重要的是,相比于miRNA特征的评估,ICG清除测试和大多数其他肝功能评估相当昂贵且耗时。此外,在这些患者中,血浆作为精密医疗工具的优势使其成为一种简单微创、容易获得的方法。
综上所述,鉴定出能够非常准确地预测肝切除术后临床结果的miRNA特征,从而优于已有的术后LD标记物。
这些新的标记物提供了一个改进的策略以鉴别出不会受益于手术,甚至可能患上潜在的致命并发症的患者。因此,它们使得能够以一种简单、低成本和无创的方式,针对个别患者的特定风险状况,定制手术策略。这将为肝癌患者的个性化肝脏手术开辟道路,从而提高治疗效果,提高患者生活质量,并且显著降低医疗费用。
实施例4:动态监测肝切除术后肝功能恢复情况以指导手术时间点的选择。
在验证了miRNA比值在预测肝切除术后结果方面的潜力后,测定术后miRNA对的动态变化,以评估其与肝功能的关系。因此,本研究纳入了3个患者组的配对组:1:常规肝切除术后无肝功能障碍的患者(N=7);2:常规肝切除术后肝功能障碍的患者(N=8);3:接受ALPPS手术后肝再生增强的患者(N=8,请参见图5A和下面描述中的手术细节)。患者组的具体情况请见下表3。
如实施例1所述对miRNA对进行评估,并分别在术前以及术后第1天(POD1)和第5天(POD5)测定miRNA特征。在所有患者中观察到,在肝切除术后,miRNA对以及合并肝功能障碍的概率(p)发生显著变化,达到相当水平(图5B),并且它们大多数在术后第5天常规肝功能恢复的同时也恢复。
除了miRNA对的动态变化外,还需要确定它们在术后的绝对值是否可以用来确定ALPPS第二步手术的最佳时间点。ALPPS手术最早由Schnitzbauer等人阐述(27),并且已经发展到允许剩余肝脏不足的临界可切除患者快速肝再生。手术步骤如图5A所示。简单来说,在ALPPS手术的第1步,选择性地结扎供养肿瘤负荷肝脏的门静脉分支,同时保留动脉和胆汁结构,并在手术的初始步骤进一步横切肝实质。该手术能够促使肝脏在几天内大量再生。在肝再生获得实质性进展后,必须进行第二次手术切除结扎的剩余肝叶(如图5A第2步所示)。这种手术的主要缺点是具有较高发病率和死亡率,并且在确定何时再生足够进行第二步切除上一直存在着很大的争议。因此,我们分析了8例接受ALPPS手术患者的miRNA比值的动态变化,并且观察到,尽管它们在第1步期间和之后的表现与常规肝切除术的相似(见上文),在手术的第二步(切除结扎/萎缩的肝叶)中,miRNA对在手术后基本保持不变(第2步,术前和术后POD1之间的差异不显著,图5C)。
最后,图5(D)说明了在ALLPS的第二步之前,组合miRNA对在对术后LD和切除萎缩叶后死亡率进行分层上的预测潜力。值得注意的是,与其他患者相比,所有在ALPPS手术第2步后发生术后LD的患者的miRNA特征以及产生的合并肝功能障碍概率都发生了明显变化(P=0.054,图5D)。更重要的是,在第2步手术后死亡的两名患者在第2步手术前都显示出最高的miRNA比值(图5D)。
总的来说,组(无LD、LD、ALPPS)间miRNA对在围手术期只有很小差异。因此,作为手术创伤的急性反应(术后第1天),miRNA对似乎在所有患者中都会均匀恶化,而与他们进一步的临床发展无关。然而,随着术后肝功能的恢复,miRNA对似乎也密切随之恢复正常,直到术后第5天,但存在高风险肝功能障碍的患者除外。在这种情况下,ALPPS模型的数据具有特殊的意义。在第一次手术中,肝组织破坏最严重,miRNA对明显恶化。然而,在第2步手术中,当萎缩的肝叶被切除时,几乎没有差异(图5A)。这表明在ALPPS的第1步中,肝功能最初的显著降低可通过miRNA对来反映,而在第2步中,当切除萎缩的仅有有限功能的肝叶时,只发生微小的变化。
值得注意的是,ALPPS模型也被用于生成大概是本研究最有趣的临床相关数据。特别是,评估术后miRNA对的水平是否能够确定肝脏手术的最佳时间点。我们观察到,在第一步ALPPS后miRNA对没有很好恢复(即miRNA对没有恢复到基线水平)的患者在第二步ALPPS后确实表现很差。事实上,第2步后发生肝功能障碍的3名患者具有最高的miRNA对值,更重要的是,随后死于“尺寸过小综合征(too small for size syndrome)”的2名患者的miRNA对值是ALPPS组中最高的。
这些数据表明本文所描述的循环miRNA的特征可以帮助确定肝切除的最佳时间点。这不仅限于ALPPS。本文所述的miRNA特征也可用于门静脉栓塞/结扎后,或用于确定高风险患者术前大创伤化疗(extensive preoperative chemotherapy)后进行手术的最佳时间点。
CRCLM=结直肠癌肝转移,HCC=肝细胞癌,CTx=化学疗法,RBC=血红细胞,PDR=血浆内消失率,R15=15分钟剩余率,SB=血清胆红素,PT=凝血酶原时间,AP=碱性磷酸酶,GGT=γ-谷氨酰转移酶,AST=天冬氨酸转氨酶,ALT=丙氨酸转氨酶。
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<130> TM001P
<160> 6
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-122-5p
<400> 1
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-192-5p
<400> 2
cugaccuaug aauugacagc c 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-151a-5p
<400> 3
ucgaggagcu cacagucuag u 21
<210> 4
<211> 85
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-122
<400> 4
ccuuagcaga gcuguggagu gugacaaugg uguuuguguc uaaacuauca aacgccauua 60
ucacacuaaa uagcuacugc uaggc 85
<210> 5
<211> 110
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-192
<400> 5
gccgagaccg agugcacagg gcucugaccu augaauugac agccagugcu cucgucuccc 60
cucuggcugc caauuccaua ggucacaggu auguucgccu caaugccagc 110
<210> 6
<211> 90
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsa-miR-151a
<400> 6
uuuccugccc ucgaggagcu cacagucuag uaugucucau ccccuacuag acugaagcuc 60
cuugaggaca gggaugguca uacucaccuc 90
Claims (17)
1.一种确定受试者肝功能障碍风险的体外方法,特别是确定在肝部分切除术后受试者肝功能障碍的风险,所述方法包括以下步骤:
a)提供所述受试者的样本,
b)测定所述样本中至少一种miRNA的表达水平,所述miRNA选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组,并且
i.将b)的表达水平与至少一个参考表达水平进行比较,或
ii.基于在b)中测定的表达水平,鉴定miR-151a与miR-192和/或miR-122与miR-151a的比值,并将所述表达水平比值与参考表达水平比值进行比较,以及
c)根据步骤i)或步骤ii)的结果,将样本划分为至少两个类别中的一个,其中每个类别是至少两个分类为“高风险”和“低风险”中的一个。
2.根据权利要求1所述的体外方法,其中测定miR-151a、miR-192和miR-122的表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的体外方法,包括进一步划分“无风险”和“中风险”的分类。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外方法,其中所述参考表达水平为至少一种miRNA的表达水平,所述miRNA选自由健康受试者或无术后肝功能障碍受试者或其组合的miR-151a、miR-192和miR-122组成的组。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的体外方法,其中参考表达水平比值是健康受试者或无术后肝功能障碍受试者或其组合的miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的体外方法,其中,将划分为“低风险”的受试者接受肝部分切除术,划分为“中风险”的受试者在肝部分切除术前接受肝再生刺激,划分为“高风险”的受试者不进行肝部分切除术。
7.根据权利要求6所述的体外方法,其中划分为“中风险”的受试者在肝部分切除术前接受治疗,所述治疗选自新辅助化疗、门静脉栓塞、联合肝分割和分期肝切除门静脉结扎(ALPPS)、运动干预(“预康复”)或降低门静脉高压的药物治疗组成的组。
8.根据权利要求6所述的体外方法,其中划分为“高风险”的受试者接受肝移植、姑息性化疗、射频消融或经动脉化疗栓塞术(TACE)。
9.一种监测受试者肝再生刺激的再生成功性的体外方法,包括以下步骤:
a)提供所述受试者的样本,
b)测定所述样本中miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值,
c)测定参考样本中miR-151a与miR-192的表达水平比值以及miR-122与miR-151a的表达水平比值,其中参考样本是受试者的较早样本,
d)将b)的表达水平比值和c)的表达水平比值进行比较,以及
e)根据步骤d)的比较结果,将所述受试者的样本划分为两个分类为“再生成功”或“未再生成功”中的一个。
10.根据权利要求9所述的体外方法,其中所述肝再生刺激选自由以下组成的组:通过门静脉栓塞诱导肝肥大,通过联合肝脏分割与门静脉支结扎(ALPPS)诱导肝肥大,通过运动干预(“预康复”)改善整体健康以及降低门静脉高压的药物治疗。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的体外方法,其中所述受试者患有肝脏恶性病变或患有良性肝肿瘤、肝囊肿和/或寄生虫,优选地,所述肝脏恶性病变为转移性结直肠癌、肝细胞癌或胆管细胞癌。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的体外方法,其中所述样本选自由血液、血清、血浆组成的组,具体地,所述样本为去血小板血浆、淋巴、尿液、唾液以及活检探针。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的体外方法,其中使用分类模型将样本的表达水平或表达水平比值与参考表达水平或参考表达水平比值进行比较。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的体外方法,其中分类模型根据与参照物的比较结果,将受试者的样本划分为两个类别中的一个。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的体外方法,其中所述分类模型选自由逻辑回归模型、支持向量机模型和决策树模型组成的组。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的体外方法,其中用于测定表达水平的方法选自由以下组成的组:基于测序的方法,具体地为下一代测序、基于阵列的方法和基于PCR的方法,具体地为基于定量PCR的方法。
17.一种试剂盒套件,包括:
a)检测试剂,其能够测定受试者样本中至少一种微小RNA的表达水平,所述微小RNA选自由miR-151a、miR-192和miR-122组成的组,
b)参考表达水平,
c)软件,所述软件包括分类模型,用于比较a)的表达水平与b)的表达水平,并将受试者的样本划分为至少两个类别中的一个,其中每个类别是至少两个分类为肝功能障碍“高风险”和“低风险”中的一个,特别是在肝部分切除术后的肝功能障碍。
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