KR20210057065A - 간기능 장애의 예측을 위한 micro-rna 시그니처 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대상체의 간기능 장애 위험을 결정하는 in vitro 방법에 관한 것으로, 특히 부분 간 절제 후에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 대상체로부터 샘플을 제공, 상기 샘플에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준 측정하는 단계를 포함하며, 이러한 발현 수준을 적어도 하나의 참조 발현 수준과 비교하거나, 또는 miR-151a 대 miR-192 및/또는 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율을 확인하고 상기 발현 수준 비율을 참조 발현 수준 비율과 비교하고, 상기 비교 결과의 샘플을 적어도 2 개의 클래스 중 하나로 분류하고, 여기서 각 클래스는 적어도 2개의 카테고리 "고위험" 및 "저위험" 중 하나이다.

Description

간기능 장애의 예측을 위한 MICRO-RNA 시그니처

본 발명은, 대상체의 간기능 장애, 특히 간 절제 후, 위험을 결정하는 방법, 구체적으로는 in vitro 방법을 제공하며, 여기서 하나 이상의 선택된 miRNA의 수준은 상기 대상체로부터의 샘플에서 정량화된다.

간 절제술은 다양한 악성 간 질환에서 유일한 치료법이다. 절제 후 간 재생은 간 절제술을 받은 환자의 임상 결과에 대한 주요 결정인자이고 (1), 간 절제 후 간 재생이 불충분하면 수술 후 간기능 장애(liver dysfunction, LD)가 발생되는 것으로 나타났으며, 이는 주요 간 절제 후 최대 30 %의 환자에서 발생한다 (2). 중요한 점은 수술후 LD 환자에게 현재 사용 가능한 치료 옵션이 매우 제한적이며, 대부분이 대증요법이고, 목표 지향적이라는 것이다 (2, 3). 따라서 간 수술 전 적합한 환자 선정을 위한 위험도 계층화는 수술 후 LD 및 수반되는 합병증의 발생을 최소화하기 위한 핵심이다. 또한, 간 절제 후 뿐만 아니라 간기능 장애가 발생할 위험이 있는 환자를 식별하고, 간 재생을 자극하는 치료에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것은 최적의 환자 치료를 제공하는 데 필수적이다. 그러나 현재 사용가능한 마커는 종종 비용이 많이 들고 시간 소모적이며 때로는 침습적이기 때문에, 간기능 장애를 결정하고 수술 후 간 기능 회복을 예측하기 위해 손쉽게 평가할 수 있는 검사의 필요성이 강조되고 있다.

최근 생겨난 증거들은 microRNA (miRNA) 시그니처가 여러 질병에 대한 강력한 진단, 예후 및 치료 반응 바이오마커(biomarker)를 나타낸다는 점을 시사한다 (4). 다른 조직에서 여러 유전자의 발현의 마스터 조절인자로서 miRNA는 세포 발달, 증식, 이동, 생존, 대사, 항상성 및 재생을 포함하여 전사 레벨(transcriptional level)에서 사실상 모든 세포 프로세스를 제어 할 수 있다 (5). 컴퓨터 분석을 기반으로 한 추정치에 따르면 인간 전사체의 50 % 이상이 적어도 하나의 miRNA에 의해 조절된다고 한다 (6). 따라서 비정상적인 miRNA 발현이 신호 전달 경로에 해로운 영향을 미칠 수 있으며 실제로 광범위한 질병과 관련이 있다는 것은 놀라운 일이 아니다 (7-9). 현재까지 거의 2000 개의 miRNA가 확인되었으며 일부는 다양한 악성 질환의 in vitro 진단 및/또는 예후에 대해 이미 검증되어 임상에서 바이오마커로서의 잠재력을 입증했다 (10-12).

일 예로, WO2011/076141A1 및 EP2196543A1은 간세포 암 진단을 위한 microRNA 바이오마커를 제공한다. WO2012/151736A1은 간세포 암종을 진단하거나 간세포 암종과 만성 B형 간염 또는 간경변을 구별하는 데 사용할 수 있는 microRNA 바이오마커를 개시하였다. 일 예로, WO2016/036994A1은 간암 진단을 위해 종양 유전자와 같은 추가적 바이오마커와 조합된 microRNA 프로파일링을 사용한다.

US20170166975A1은 환자 샘플에서 microRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 포함하는 간암 검출용 키트 또는 장치를 개시한다.

CN101418343A는 초기 원발성 간암 환자의 수술 후 간암 재발을 예측하기 위한 키트를 개시한다.

Micro RNA는 악화 보다는 질병에 대한 바이오마커로써 또한 발견되어 왔다. 일 예로써, WO2018/231851A1은 비알코올성 지방간염(NASH) 또는 간 섬유증을 진단하는 방법을 개시하고, 여기서 하나 이상의 microRNA의 수준이 환자 샘플에서 검출된다.

일부 miRNA의 높은 조직-특이적 발현 프로파일 외에도, miRNA는 바이오마커로서 발견되는 여러 다른 유익한 특징도 제공한다. 일 예로 miRNA는 비침습적 방법을 통해 혈액, 소변 및 타액과 같은 생체 유체에서 쉽게 접근할 수 있다. 또한, micro RNA는 높은 안정성과 상대적으로 낮은 복잡도 (예: 생성 후 변형 없음)를 나타내며 신호 증폭을 허용하는 높은 특이성을 가진 다양한 방법으로 쉽게 평가할 수 있어, DNA, RNA 및 단백질을 포함하는 다른 종류의 바이오마커에 비해 우수하다.

또한 Micro RNA는 표적 mRNA의 번역을 조절하는데 사용된다. 일 예로서, US2016089453A1은 간세포에서 mRNA를 변형하기 위한 가이드로 miR-122를 사용하는 RNA 조절제를 개시한다.

이러한 발전에도 불구하고, 구체적으로 수술 후 LD 발병 위험이 있는 환자를 결정하기 위한 신뢰할 수 있는 예측 인자와 치료 옵션은 제한적이다. 따라서, 현재 통용되는 마커가 종종 비싸고 시간 소모적이며 때로 침습적이기 때문에 간기능 장애 발달 위험을 예측하고 간 재생 자극에 대한 치료 반응을 모니터링하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 테스트가 긴급히 필요하다.

본 발명의 목적은, 높은 특이성과 유효성을 지닌 신뢰할 수 있는 간기능 예측용 및 간기능 모니터링용 바이오마커를 제공하는 것으로서 구체적으로 부분 간 절제 후 간기능 및 부분 간 절제 또는 간 재생 자극 후 간기능에 관한 것이다.

상기 문제는 본 발명에 의해 해결되었다.

본 발명에 따르면, 대상체의 간기능 장애 위험을 결정하는 in vitro 방법에 관한 것으로, 상기 간기능 장애는 부분 간 절제 후 위험에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 방법이다.

a) 상기 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계

b) 상기 샘플에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 적어도하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 결정하는 단계

i. 상기 b) 단계의 발현 수준을 적어도 하나의 참조 발현 수준과 비교하는 단계, 또는

ii. 상기 b) 단계에서 결정된 상기 발현 수준에 기초하여 miR-151a 대 miR-192 및/또는 miR-122 대 miR-151a의 비율을 확인하고, 상기 발현 수준 비율을 참조 발현 수준 비율과 비교하는 단계, 및

상기 단계 i) 또는 상기 단계 ii)의 비교 결과로부터 얻은 상기 샘플을 적어도 2 개의 클래스 중 하나로 분류하는 단계, 여기서 상기 각 클래스는 "고위험" 및 "저 위험" 카테고리 중 하나이다.

구체적으로, 본 발명에 제공된 in vitro 방법은 대상체의 간기능 장애 발달 위험을 결정할 수 있게 한다. 바람직하게는, 본 발명에 제공된 in vitro 방법은 부분 간 절제 후 대상체의 간기능 장애 발생 위험을 결정할 수 있게 한다.

구체적으로, 환자의 샘플에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 결정된다. 구체적으로, miR-151a, miR-192 및 miR-122 중 적어도 2 개의 발현 수준이 결정된다. 구체적으로, miR-151a 및 miR-192의 발현 수준이 결정된다. 구체적으로, miR-151a 및 miR-122의 발현 수준이 결정된다. 구체적으로, miR-192 및 miR-122의 발현 수준이 결정된다.

특정 실시예에 따르면, miR-151a, miR-192 및 miR-122의 발현 수준이 결정된다.

구체적으로, 본 발명에서 사용된 상기 miRNA는 hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-192-5p 및 hsa-miR-122-5p로 구성된 군에서 선택된다.

구체적으로, miR-151a의 발현 수준이 감소하면 간기능 장애의 위험이 증가했음을 나타낸다. 구체적으로, miR-122 및/또는 miR-192의 증가된 발현 수준은 증가된 간기능 장애의 위험을 나타낸다.

구체적으로, 간기능 장애의 위험이 증가된 환자의 수술 전 샘플에서는 상기 miR-151a의 발현 수준이 하향 조절된다. 구체적으로, 간기능 장애의 위험이 증가된 환자의 수술 전 샘플에서는 상기 miR-122의 발현 수준 및/또는 miR-192의 발현 수준이 상향 조절된다. 구체적으로, 수술 전 샘플은 부분 간 절제 전에 환자로부터 제공되는 샘플이다.

특정 실시예에 따르면, 상기 단계 i) 또는 상기 단계 ii)의 비교 결과는 "위험 없음" 및 "중위험" 범주의 클래스로 더 분류될 수 있다. 구체적으로, 대상체의 샘플에서 miRNA 발현 수준 또는 발현 수준 비율을 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생하지 않은 대상체의 샘플에서 miRNA 발현 수준 또는 발현 수준 비율과 비교하거나 건강한 대상체의 샘플과 비교하면 대상체의 샘플을 "위험 없음", "저위험", "중위험" 또는 "고위험" 범주 중 하나로 분류하는 것이 가능하다.

구체적으로, 샘플이 "위험 없음" 범주에 속하는 것으로 분류된 대상체는 특히 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 위험이 없거나 매우 낮다. 바람직하게는 위험이 없거나 저위험은 간기능장애가 발생할 위험이 25 % 또는 25 % 미만임을 의미한다. 따라서 샘플이 "저위험" 범주에 속하는 것으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 위험이 낮다. 바람직하게는 저위험은 간기능 장애가 발생할 위험이 25 % 이상에서 최대 50 %까지 발생하는 것을 의미한다. 따라서 샘플이 "중위험" 범주에 속하는 것으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 후 간기능장애가 발생할 위험이 중간이다. 바람직하게는 중위험은 간기능 장애가 발생할 위험이 50 % 이상에서 최대 75 %까지 임을 의미한다. 따라서 샘플이 "고위험" 범주에 속하는 것으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 후 간기능장애가 발생할 위험이 높다. 바람직하게는 고위험은 간기능 장애가 발생할 위험이 75 % 이상임을 의미한다.

구체적으로, 상기 참조 발현 수준은 건강한 대상체 또는 수술 후 간기능 장애가 없는 대상체 또는 이의 그룹 또는 풀(pool)의 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이다.

구체적으로, 참조 발현 수준 비율은 건강한 대상체 또는 수술 후 간기능 장애가 없는 대상체 또는 이의 그룹의 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율이다.

구체적으로, 상기 참조 발현 수준은 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생하지 않은 대상체에서 해당 miRNA의 평균 수준 일 수 있으며, 구체적으로 이러한 대상체로부터 파생된 샘플 풀(pool)에서, 1 이상의 표준 편차에 의한 차이, 구체적으로 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 구체적으로 약 2 표준 편차 이상은 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 위험이 증가했음을 나타낸다. 구체적으로, 부분 간 절제 후 최소 1.3 배 이상 간기능 장애가 발생하지 않은 대상체에서 해당 miRNA의 발현 수준 또는 발현 수준 비율과 비교하여 miRNA 발현 수준 또는 miRNA 발현 수준 비율의 차이는 간기능 장애 발생 위험 증가를 나타낸다.

구체적으로, 1.5 표준 편차 이상, 바람직하게는 2 표준 편차 이상, 구체적으로 약 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 또는 3의 차이는 구체적으로 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 위험이 높다는 것을 나타낸다.

구체적으로, 최소 1 표준 편차 차이는, 구체적으로 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 중위험을 나타낸다.

구체적으로, 1 표준 편차 미만의 차이는, 구체적으로 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 위험이 낮음을 나타낸다.

구체적으로, 상기 해당 참조 발현 수준 또는 참조 발현 수준 비율에 필적하는 miRNA 발현 수준 또는 발현 수준 비율, 구체적으로 수준 또는 비율이 참조 수준 또는 참조 비율과 0.5 표준 편차 이하 차이가 나는 것은 구체적으로 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 위험이 매우 낮음을 나타낸다. 따라서 이러한 샘플은 "무위험" 범주에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 샘플이 "무위험" 범주에 속하는 것으로 분류된 대상체는 샘플이 "저위험" 범주에 속하는 것으로 분류된 대상체보다 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 가능성이 낮다.

LD 위험이 결정될 대상체로부터의 각 샘플과 비교하기 위해 건강한 대상체 또는 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생하지 않은 대상체 또는 건강한 대상체 또는 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생하지 않은 대상체 추출한 샘플 풀(pool)로부터 단일 참조 샘플을 사용하는 것은 본 발명의 실시예에 속한다. 상기 풀은 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 그 이상의 샘플, 구체적으로 다른 개인으로부터 최대 10 개, 100 개 또는 100 개 이상의 샘플로 구성될 수 있다.

본 발명의 특정 실시예에 따르면, "저위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받고, "중위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 전에 간 재생 자극을 받고, "고위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받지 않는다. 구체적으로, "위험 없음"으로 분류된 대상체는 또한 간 재생 사전자극 없이 부분 간 절제를 받는다. 구체적으로 "중위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받지만, 먼저 간 재생을 촉진하기 위한 치료를 받는다. 바람직하게는, 간 재생 자극 후 재생-성공이 평가되고, 상기 대상체의 부분 간 절제 후 간기능 장애 발생 위험이 상기 대상체가 부분 간 절제를 받기 전에 결정된다.

구체적으로 "중위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 전에 치료를 받는데, 상기 치료는 신보조 화학요법, 간문맥 색전술, 단계적 간 절제술을 위한 연관 간 분할 및 문맥결찰(Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectopy, ALPPS), 운동 치료 ("재활") 또는 문맥 고혈압을 감소시키는 약물 치료로 구성된 그룹에서 선택된다. 구체적으로 운동 치료 및/또는 식이 변화는 전반적인 체력과 건강을 개선하여 간 재생에 도움이 될 수 있다. 구체적으로 중위험으로 분류된 대상체를 위한 추가 옵션은 수정된 수술 전략이다. 바람직하게는, 상기 수정된 수술 전략에서, 절제를 필요로 하는 간 부분의 크기는 종양 중심의 열 치료와 조합 치료를 통하여 감소시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 기술된 miRNA 시그니처는 부분 간 절제를 위하여 환자의 수술 후 간기능 장애가 발생할 위험이 낮은 시점을 결정하는 데 사용된다. 특히, "중위험" 으로 분류되어 간절제 전 ALPPS와 같은 치료를 받은 대상체의 샘플은 간 부분 절제를 위한 최적의 시점을 결정할 수 있도록 하나 이상의 시점에서 제공된다. 구체적으로, 샘플을 제공하고 간기능 장애 발생 위험이 2 주에 한 번, 일주일에 한 번, 매일 또는 최소 하루에 두 번 결정된다. 구체적으로, 상기 샘플이 "저위험"으로 분류되면 부분 간 절제를 위한 시점은 최적이다.

구체적으로, "고위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받지 않는다. 구체적으로, 상기 대상체는 간이식, 완화 화학요법, 고주파 절제 또는 경동맥 화학색전술(TACE)을 대신 받는다. 구체적으로, 상기 치료는 종양 부하(load)에 따라 선택된다.

본 명세서는 대상체의 간 재생 자극의 재생-성공을 모니터링하는 in vitro 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

a) 상기 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 샘플에서 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율을 결정하는 단계

c) 참조샘플에서 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율을 결정하는 단계, 여기서 상기 참조샘플은 상기 대상체의 초기 샘플이다.

d) 상기 b)의 발현 수준 비율을 상기 c)의 발현 수준 비율과 비교하는 단계

e) 단계 d)의 비교 결과로부터 상기 대상체의 샘플을 "재생 성공" 또는 "재생 성공 없음"의 두 범주 중 하나로 분류하는 단계

구체적으로 본 발명에서 제공된 in vitro 방법에 따라 재생 성공이 결정되는 간 재생 자극은 문맥 색전술에 의한 간 비대 유도, 단계적 간 절제술을 위한 연관 간 분할 및 문맥결찰(ALPPS)에 의한 간 비대 유도, 전반적인 건강을 향상시키기 위한 운동 치료 ("재활") 및 문맥 고혈압을 감소시키는 약물 요법으로 이루어진 군에서 선택된다.

구체적으로, 상기 대상체는 간에서 악성 병변, 바람직하게는 전이성 대장암, 간세포 암종 또는 담관 세포 암종, 또는 양성 간 종양, 간 낭종 및/또는 기생충으로 고통 받고 있다. 구체적으로, 상기 대상체는 간에서 양성 또는 악성의 하나 이상의 종양을 앓고 있다. 상기 종양은 모든 조직이나 기관에서 유래한 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 특히 혈소판이 부족한 혈장, 림프, 소변 및 타액 및 생검 프로브(probe)로 구성된 그룹에서 선택된다. 구체적으로, 상기 샘플은 무세포(cell-free) 혈액이다.

구체적인 특정예에 따르면, 상기 샘플의 발현 수준 또는 발현 수준 비율은 분류 모델을 사용한 참조 발현 수준 또는 발현 수준 비율과 비교된다.

구체적으로 분류 모델은 상기 참조와의 비교 결과에서 대상체의 샘플을 적어도 두 개의 클래스 중 하나로 분류한다.

구체적으로 상기 분류 모델은 로지스틱 회귀 모델, 서포트 벡터 머신 모델 및 의사 결정 트리 모델로 구성된 그룹에서 선택된다.

추가적으로 본 발명은 간기능 장애의 위험을 예측하는 임상적으로 유용한 컷오프(cut-off)에 관한 것이고, 특히 부분 간 절제 후에 관한 것이다. 구체적으로, 확률 평점이 0.59 미만인 낮은 엄격(stringency) 컷오프, 구체적으로 0.58, 0.57, 0.56, 0.55, 0.54, 0.53, 0.52, 051 또는 0.50 미만은 간기능장애가 발생할 위험이 낮은 대상체와 낮은 위험으로 부분 간 절제를 받을 수 있는 환자를 식별한다. 바람직하게는 0.58 미만 (P <0.58)의 확률 점수는 환자를 저위험군으로 분류한다. 구체적으로, 확률 평점이 0.58 이상, 특히 0.59, 0.60, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64 또는 0.65 이상인 엄격한 컷오프는 간기능 장애가 발생할 중위험이 있는 환자를 식별한다. 이러한 환자는 수술 전에 최적화되어야 한다. 바람직하게는 0.58 이상의 확률 평점 (P> 0.58)은 환자를 중위험으로 분류한다. 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74 또는 0.75 이상의 확률 평점은 대상체를 고위험 환자로 식별하며, 바람직하게는 상기 환자는 외과적 부분 간 절제를 받지 않아야 한다. 바람직하게는 0.68 이상의 확률 평점(P> 0.68)은 대상체를 간기능 장애가 발생할 고위험으로 분류한다.

특정 실시예에 따르면, 상기 발현 수준은 시퀀싱 기반 방법, 구체적으로 차세대 시퀀싱, 어레이 기반 방법 및 PCR 기반 방법, 특히 정량적(quantitative) PCR 기반 방법으로 구성된 군에서 선택된 방법을 사용하여 결정된다.

구체적으로, miRNA 수준 차이는 정량적 또는 디지털 PCR, DNA/RNA 시퀀싱, 특히 차세대 시퀀싱, 마이크로 어레이, Luminex^TM 발광기반 핵산 분석 또는 기타 혼성화 기반 기술에 의해 결정된다.

보다 구체적으로 본 발명에서는 하기의 부품을 포함하는 부품 키트가 제공된다.

a) 대상체의 시료에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 microRNA의 발현 수준을 검출할 수 있는 검출 시약,

b) 참조 발현 수준

상기 a)의 발현 수준을 상기 b)의 발현 수준과 비교하고 상기 대상체의 샘플을 적어도 2 개 이상의 클래스 중 하나로 분류하기 위한 분류 모델을 포함하는 소프트웨어, 여기서 각 클래스는 부분 간 절제 후 간기능 장애의 적어도 2 개의 "고위험" 및 "저위험" 카테고리 중 하나이다.

본 발명자들은 간기능 장애가 발생하지 않은 환자에 비하여 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생한 환자에서 특정 miRNA의 발현 수준이 현저하게 변화하는 것을 제시하였다. 놀랍게도, 발현 수준에서의 이러한 변화는 수술 전 환자의 혈액 샘플에서 나타났으므로 간기능 장애 발달 예측을 신뢰할 수 있다. 보다 구체적으로 부분 간 절제 후 간기능 장애 발달 위험을 심지어 수술 전에 정확하게 예측할 수 있다.

본 발명은 특이적으로 상향 또는 하향 조절되므로 유익한 바이오마커로 유용하며 광범위한 간 질환에 적용 가능한 진단 및 예측 시그니처를 나타내는 특정 miRNA 세트를 제공한다.

도 1: 간 절제를 받는 환자의 수술 전 microRNA 패턴의 차이. 간기능 장애 환자의 수술 전 혈장에서 다르게 조절된 microRNA의 Volcano 플롯. 혈장 농도 (average log2 counts per million (logCPM)> 5)에 대한 바이오마커 후보군의 컷오프를 식별하기 위해, 효과 크기 (fold change> 1.3) 및 유의 수준 (raw p <0.2)이 암시되었다. 19 개의 microRNA 세트가 확인되었으며, 그 중 12 개는 상향 조절 (빨간색), 7 개는 하향 조절 (파란색)로 확인되었다.
도 2: 간기능 장애를 예측하기 위한 miRNA 쌍의 진단 성능 분석. (A) 랜덤 포레스트 분류 모델에서 miRNA 쌍의 중요성 (가장 중요한 것은 가장 높은 평균 감소 정확도로 맨 위에 있음). (B) miR151a-5p_192-5p(양면 Wilcoxon rank-sum test의 박스 플롯 및 p-값)에 대한 디스커버리 코호트에서 qPCR에 의해 측정된 비율 분포 및 (C) miR122-5p_151a-5p에 대한 디스커버리 코호트에서 qPCR에 의해 측정된 비율 분포 (D) 디스커버리 코호트에서 miR122-5p_151a-5p를 포함하는 로지스틱 회귀 모델에 대한 ROC 곡선(일회성 교차 검증 결과는 회색임) (E) miR151-5p_192-5p를 포함하는 로지스틱 회귀 모델, (F) miRNA 쌍을 모두 포함하는 로지스틱 회귀 모델. (G, H) 성능은 곡선 밑면적(area under curve, AUC)으로 설명되며 분류가 무작위 할당 (AUC = 0.5)에서 크게 벗어나는지 여부는 p-값으로 표시된다. 예측된 대조군과 예측된 LD에 대한 실제 수술후 LD의 백분율은 모델 정의 컷오프 P> 0.59 및 P> 0.68에 대해 분석되었다.
도 3: 상위 2 개 miRNA 비율의 예측 성능은 수술후 LD에 대한 독립적인 연구에서 검증되었다. MiRNA는 24 명의 대상체에서 RT-qPCR에 의해 분석되었으며 그 중 5 명(16.7 %)은 수술 후 부작용을 경험했다. miRNA 쌍 122-5p/151a-5p (A) 및 151a-5p/192-5p (B)의 수술 전 조절이 혈장에서 관찰되었다. (C) 이전에 정의된 다변량 로지스틱 예측 모델의 예측 성능은 ROC 분석을 사용하여 검증되었다. 성능은 곡선 밑면적(area under curve, AUC)으로 설명되며 상기 분류가 무작위 할당 (AUC = 0.5)에서 크게 벗어나는지 여부는 p-값으로 표시된다. 예측 된 대조군과 예측 된 LD에 대한 실제 수술 후 LD의 백분율은 모델 정의 컷오프 P> 0.59 및 P> 0.68 (D, E)에 대해 분석되었다.
도 4: 완전한 데이터 세트를 기반으로 한 microRNA 모델의 성능 평가. 로지스틱 회귀 모델 출력에 대한 2 개의 컷오프 (낮은 엄격성, P = 0.59; 높은 엄격성, P = 0.68)는 수술 후 간기능 장애를 예측하기 위한 성능에 대해 분석되었다.
성과는 민감도(sensitivity, SN), 특이도(specificity, SP), 양성 예측값(positive predictive value, PPV), 음성 예측값(negative predictive value, NPV) 및 오즈비(odds ratio, OR)를 사용하여 설명되었는데, 이는 부정적인 테스트 결과에 비해 긍정적인 테스트 결과와 관계된 수술 후 간기능 장애로 고통받을 오즈비이다.
낮은 엄격성 컷오프(P = 0.59)는 균형 잡힌 PPV 및 NPV 값(각각 0.80 및 0.81)을 산출한 반면, 엄격한 컷오프(P = 0.68)는 허용 가능한 NPV 0.74와 함께 완벽한 PPV 1.0을 산출하였다 (A). 이는 양성 판정을 받은 환자의 100 %가 수술후 LD를 앓고있는 반면, 음성 판정을 받은 74 %는 수술후 LD를 앓지 않았음을 의미한다. 반대로 음성으로 판정된 26 %는 실제로 수술후 LD를 앓고 있었다(패널 A 참조). 이상 반응에 대한 OR는 각각 15.92 (p <0.0001) 및 무한 (p <0.0001)이었다. 표준 간 기능 매개 변수 (B)의 성능과 비교하기 위해 microRNA 모델에 대해 수신기 조작자 특성(receiver operator characteristic, ROC) 곡선 분석을 수행하였다. 기타 부작용에 대한 수술 후 결과에 대한 OR는 두 모델 컷오프(중증 이환율 (C) 및 사망률 (D))에 대해 분석되었다. 수술 후 ICU 기간 (E) 및 입원 기간 (F)은 예측 위험 그룹에서 의미있게 연장되었다. (박스플롯은 이상치(outlier)없이 표시된다. 양측 Wilcoxon 순위 합 검정의 p- 값). ALT, alanine transaminase, 알라닌 트랜스아미나제; AST, aspartate transaminase, 아스파르테이트 트랜스아미나제; GGT, gamma-glutamyltransferase, 감마-글루타밀트랜스퍼라제; ICG-PDR, indocyanine green(ICG) plasma disappearance rate, 인도시아닌 그린 (ICG) 혈장 소실률; ICG R15, 15 분에 ICG 유지율, ICU, intensive care unit, 중환자실.
도 5: MiRNA 쌍은 부분 간 절제 후 간기능 회복을 따르고 ALPPS의 2 번째 단계 후 수술후 LD를 예측한다. (A)는 이 추가 탐색적 연구의 연구 설계를 설명하고 ALPPS의 절차적 알고리즘을 요약하였다. 상기 ALPPS 절차는 Schnitzbauer et al. 에 의해 처음 설명되었고 불충분한 간 잔여물이 있는 경계선 절제 가능한 환자에서 신속한 간 재생이 가능하도록 개발되었다. 간단히 말해서, 상기 ALPPS 절차의 첫 번째 단계에서 간엽을 포함하는 종양을 공급하는 문맥 분기가 선택적으로 결찰되는 반면, 동맥 및 담즙 구조가 보존되고 간 실질이 수술의 초기 단계에서 추가로 절개된다. 이 절차는 며칠 내에 간 재생을 개선한다. 간 재생이라는 이러한 상당한 이점에도 불구하고 결찰된 나머지 간엽을 제거해야 하는 두 번째 수술 절차를 수행해야 한다. miRNA의 수술 전후 역학은 정기적인 부분 간 절제를 받은 7 명의 환자와 8 명의 ALPPS 환자(상세한 내용은 표 3에 나열 됨)를 대상으로 평가되었으며, 반복적으로 수집된 혈장 샘플을 기반으로 miRNA의 세로 측정(longitudinal measurement)을 수행할 수 있다. 채혈 시점은 (A)에 나와 있다. 결합된 쌍 뿐만 아니라 miRNA 쌍의 수술 전후 역학은 (B)에 설명되어 있다. ALPPS의 두 번째 단계에서와 마찬가지로 위축성 간엽만 제거된 miRNA 쌍은 상기 (C)에 설명된 바와 같이 ALPPS의 2 번째 단계 후에 추가 분석되어, 2 번째 수술 후 miRNA 비율의 증가가 거의 사라졌음을 보여준다. 궁극적으로, (D)는 위축성 엽 제거 후 수술후 LD 및 사망률에 따라 계층화된 ALPPS의 2 번째 단계 이전에 결합된 miRNA 쌍의 예측 잠재력을 보여준다. * P <0.05, ** P <0.005.

불충분한 간 재생에서 기인한 수술 후 간기능 장애(liver dysfunction, LD)는 위험한 절제술을 받은 환자의 최대 30 %에서 발생하며, 이로 인해 환자의 이환율과 사망률이 증가한다. 그러나 수술후 LD 발병 위험이 있는 환자를 결정하기 위한 치료 옵션과 신뢰할 수 있는 예측 바이오마커는 여전히 제한적이다. 특히 현재의 마커는 종종 비싸고 시간 소모적이며 때로는 침습적이기 때문에, 수술 후 간기능 회복을 예측하기 위해 쉽게 평가할 수 있는 수술전 테스트의 필요성이 시급하다. microRNA (miRNA) 시그니처는 여러 질병에 대한 효과적 진단, 예후 및 치료 반응 바이오 마커를 나타낸다.

혈청 또는 혈장과 같은 무세포(cell-free) 혈액에 존재하는 혈중 microRNA는 바이오마커의 최소 또는 비침습적 자원으로 최소한의 침습적 검출을 허용하므로 임상 및 연구 저장소(research repository)에 광범위하게 적용될 수 있다.

상기 용어 "샘플"은 일반적으로 조직 또는 기관 샘플, 혈액, 혈청 및 혈장과 같은 무세포 혈액, 혈소판 부족 혈장, 림프, 소변, 타액 및 생검 프로브를 의미한다. 바람직하게는 상기 샘플은 혈장 샘플이다.

특정 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용된 샘플은 수집과정 동안 2 회의 원심분리 단계를 거친 혈소판 부족 혈장(platelet-poor plasma)이다. 구체적으로, 제 1 원심분리 단계는 낮은 속도, 일 예로 약 1,000 g-forces (g)으로 수행되는 반면, 제 2 원심분리 단계는 일 예로 약 10,000 g의 고속으로 수행된다. 이러한 원심 분리는 microRNA의 측정을 방해할 수 있는 아폽토틱 바디(apoptotic body)와 같은 더 큰 세포외 소포체와 혈소판을 완전히 제거하는데 도움이 된다. 혈소판 활성화 예방에 사용되는 선호 항응고제는 CTAD (Sodium-Citrate, Theophyllin, adenosine, dipyridamole) 이다. 구체적으로 CTAD, Sodium-citrate 또는 Potassium-EDTA (K2-EDTA)는 혈소판 활성화 예방에 사용될 수 있다.

구체적으로, 혈소판 부족 혈장(platelet-poor plasma)은 본래 혈소판과 중형 및 대형 세포외 소포체가 없으며, 이는 20,000 g 미만의 원심 분리 속도로 펠렛화된다.

본 발명에 사용된 용어 "무세포(cell-free)"는 약 90 % 정도까지 세포가 제거된 샘플을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "환자"는 온혈 포유류, 특히 인간을 지칭한다.

상기 용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 처치를 받거나 간암 또는 전이성 결장 직장암과 같은 특정 질환으로 진단된 인간 및 기타 포유류 대상체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

따라서 상기 용어 "치료"는 예방적 및 치료적 처치를 모두 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체 코호트(cohort of individuals)" 또는 "개체 집단(pool of individuals)"은 건강한 개인의 그룹을 지칭하고 구체적으로 상기 개인으로부터 얻은 샘플을 지칭할 수 있다. 코호트 개체수는 다양할 수 있다. 즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 개체를 포함할 수 있고, 일 예로 적어도 10, 25, 50, 100 명 또는 더 큰 대상체 그룹일 수도 있지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 코호트는 또한 500 명 또는 그 이상의 개체로 구성된 대규모 코호트를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "약"은 명시적으로 인용된 값 뿐만 아니라 그로부터의 작은 편차를 포함한다. 따라서, 10 %, 바람직하게는 5 %, 바람직하게는 1 %에 대해 언급된 값으로 부터의 편차는 상기 용어 "약"에 포함된다.

상기 용어 "microRNA 시그니처(signature)"는 효과적이고 확실한 진단, 예후 및 치료반응 바이오 마커를 나타내는 특정 microRNA 발현 프로파일을 의미한다. 본 발명에 사용된 용어 "microRNA 시그니처" 또는 "miRNA 시그니처"는 부분 간 절제 후 간기능 장애가 있는 환자와 없는 환자간의 혈중 miRNA의 발현 프로파일 차이를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에 기재된 상기 miRNA 시그니처는 microRNA인 miR-151a, miR-122 및 miR-192 중 적어도 하나를 포함한다.

본 발명에 사용된 용어 "in vitro 방법"은 살아있는 유기체 외부에서 수행되는 방법을 지칭한다. 구체적으로, 분리된 조직, 기관 또는 세포, 바람직하게는 혈액, 더욱 바람직하게는 혈장과 같은 샘플에서 수행되는 방법을 의미한다. 따라서 이러한 in vitro 방법은 살아있는 유기체에 대하여 수행되지 않는다; 특히 인간에게는 수행되지 않는다.

"간기능 장애(liver dysfunction, LD)" 또는 "간기능 장애(hepatic dysfuction)"와 동의어로 사용되는 용어 "간기능 장애(liver dysfuction)"는 간기능 장애를 의미하는데, 급성 또는 만성 무증상 세포장애로 나타날 수 있지만 다발성 장기 시스템 손상으로 생명을 위협하는 간부전으로 진행될 수 있다. 수술전후 이환율과 사망률은 중요할 수 있다; 간기능(포도당 항상성, 단백질 및 응혈원(procoagulant) 합성, 빌리루빈 대사, 약물 및 내인성 독소의 생체변환)이 모두 손상될 수 있다. 손상 정도와 간외 침범(extrahepatic involvement)의 심각성은 다양할 수 있다. 간 절제 후 불충분한 간 재생은 수술후 LD를 유발하는 것으로 나타났으며, 이는 위중한 간 절제 후 환자의 최대 30 %에서 발생한다. 따라서 간 수술 전에 최적화된 환자 선택을 위한 위험 계층화는 수술후 LD 및 수반되는 합병증의 발생을 최소화하는 핵심요소이다. 수술후 LD가 증가하는 것으로 확인된 대상체는 수술전에 간재생을 돕는 치료를 받거나 LD의 위험증가에 대처하기 위해 수술 후 치료를 조정할 수 있다. 수술 후 치료의 조정은 일 예로 중환자실에 더 오래 머물러 대상체의 간 기능을 면밀히 감독할 수 있음을 의미할 수 있다.

상기 용어 "부분 간 절제(partial liver resection)"또는 "부분 간 절제(partial hepatectomy)"는 간 일부의 외과적 제거를 의미한다. 대부분의 간 절제술은 간 신생물, 양성 종양 또는 악성 종양의 치료를 위해 수행된다. 양성 신생물에는 간세포 선종, 간 혈관종 및 국소 결절 증식이 포함된다. 간에서 가장 흔한 악성 신생물(암)은 전이(metastasis) 이다; 결장직장암에서 유래하는 이 암은 가장 흔하며 외과적 절제에 가장 적합하다. 간에서 가장 흔한 원발성 악성 종양은 간세포 암종이다. 또한 간 절제술은 간내 담석 및 간 또는 기생충 낭종을 치료하기 위한 선택 절차일 수 있다.

간암(hepatic cancer) 및 원발성 간암(primary hepatic cancer)으로도 알려진 원발성 간암(primary liver cancer)은 간에서 시작되는 암이다. 간 전이 또는 2차 간암으로 알려진, 다른 곳에서 간으로 퍼진 암은 간에서 시작되는 암보다 더 흔하다. 본 발명에서 사용되는 용어 "간에 있는 악성 병변"은 원발성 및 2차 간암 모두를 지칭한다. 모든 원발성 간암의 약 75 %를 차지하는 가장 빈번한 간암은 간세포 암종(hepatocellular carcinoma, HCC)이다(선종(adenoma)은 보통 양성이기 때문에 명명된 간암(hepatoma)은 틀린 명칭임). HCC는 간세포(hepatocyte)로 알려진 간의 세포에 의해 형성되는 암으로 악성이 된다. 간세포에 의해 형성되는 또 다른 유형의 암은 미성숙 간세포에 의해 특별히 형성되는 간모세포종(hepatoblastoma)이다. 주로 소아에서 발생하는 희귀한 악성 종양으로 소아암 전체의 약 1 %, 15 세 미만의 모든 원발성 간암의 79 %를 차지한다. 대부분의 간모세포종은 우엽에서 발생된다. 간암은 담관, 혈관 및 면역 세포와 같은 간 내의 다른 구조에서도 형성될 수 있다. 담관암(담관암종 및 담관세포성 낭샘암종)은 원발성 간암의 약 6 %를 차지한다. 또한 간세포 암종과 담관암으로 구성된 변이형 간세포 암종이 있다. 또한 HCC와 담관암종 모두로 구성된 변이형 HCC가 있다. 혈관 종양(혈관육종 및 혈관내피종, 배아육종 및 섬유육종)은 중간엽으로 알려진 일종의 결합조직에서 발생된다. 근육에서 전이된 간암은 평활근육종과 횡문근육종이다. 다른 흔치않은 간암으로는 암육종, 기형종, 난황낭 종양, 유암종(carcinoid tumour) 및 림프종이 있다. 림프종은 일반적으로 간에 광범위 침윤이 있지만, 드문 경우에 간 종괴를 형성할 수도 있다.

간에서 발견되는 많은 암은 실제 간암이 아니고, 신체의 다른 부위에서 간으로 전이된 암이다(2차 간암). 간은 혈관과 림프절 근처에 대사적으로 활성화되고 혈액이 풍부한 여러 기관과 가깝기 때문에, 종종 원 발생 부위는 위장관이다(췌장암, 위암, 결장암 및 주로 충수의 카르시노이드 종양 등). 2차 간암은 또한 유방암, 난소 암, 폐암, 신장 암, 전립선 암에서 기인할 수 있다.

간암의 주요 원인은 B 형 간염, C 형 간염 또는 알코올로 인한 간경변이다. 다른 원인으로는 아플라톡신, 비 알코올성 지방간 질환 및 간흡충이 있다. 가장 흔한 유형은 사례의 80 %를 차지하는 간세포 암종(HCC)과 담관암이다. 덜 흔한 유형에는 점액 낭성 신생물 및 관내유두종 담낭 신생물이 있다.

본 발명에 제공된 방법에 따라 간병변을 앓고있는 환자의 치료 전략이 선택될 수있다. 샘플이 무위험 또는 저위험 범주로 분류된 대상체는 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 위험이 낮기 때문에 부분 간 절제에 적합한 후보이다. 상기 대상체는 LD 위험평가 직후 부분 간 절제를 받거나 부분 간 절제 전에 간 재생 자극을 받을 수 있다.

구체적으로, 샘플이 중위험 또는 고위험으로 분류된 대상체는 LD 위험 평가 직후 부분 간 절제를 받지 않는다. 바람직하게는, 중위험으로 분류된 대상체는 간 재생을 돕는 외과적 또는 약리학적 또는 기타 치료를 받는다. 상기 요법은 신보조 화학요법, 문맥 색전술, 단계적 간 절제술을 위한 연관 간 분할 및 문맥결찰(ALPPS), 운동 치료 ("예비") 또는 문맥 고혈압을 감소시키는 약물 요법일 수 있다. 구체적으로, 상기 요법의 재생-성공은 본 발명에 제공된 방법에 의해 모니터링될 수 있다.

바람직하게는 샘플이 고위험 범주에 속하는 것으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받지 않는다. 바람직하게는, 고위험 대상체는 간 이식, 완화 화학 요법, 고주파 절제 또는 경동맥 화학 색전술(TACE)을 받게 된다.

구체적으로, 특히 부분 간 절제 후 대상체의 간기능 장애 발생 위험은 본 발명에 제공된 방법에 따라 반복적으로 평가될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "재생-성공"은 간기능을 개선하고 부분 간 절제 후 간기능 장애의 위험을 감소시키는 것으로 정의된다. 따라서 간 재생을 모니터링하는 마커는 우선적으로 환자의 임상 결과, 즉 간기능 장애 위험 감소와 관련이 있어야 한다. 중등도의 재생 성공은 간기능 장애 위험을 약 25 %에서 최대 약 50 %까지 감소시킨다. 재생 성공률이 높으면 위험이 50 % 이상 감소한다. 간기능 장애가 발생할 위험이 감소하지 않거나 간기능이 개선되지 않는 것은 재생 성공 없음을 나타낸다. 구체적으로, 간기능은, 일 예로 프로트롬빈 시간(PT/INR), aPTT, 알부민 및 빌리루빈(직간접)을 검출하는 테스트와 같이, 당업계에 공지된 간기능 검사를 사용하여 평가될 수 있다.

구체적으로, 재생-성공은 하기의 순차적 단계를 포함하는 in vitro 방법에 의해 모니터링 된다 :

a) 상기 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 샘플에서 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율을 결정하는 단계

c) 참조 샘플에서 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율을 결정하는 단계, 여기서 상기 참조 샘플은 상기 대상체의 초기 샘플임,

d) 상기 b)의 발현 수준 비율을 상기 c)의 발현 수준 비율과 비교하는 단계

e) 상기 d)단계의 비교 결과로부터 상기 대상체의 샘플을 "재생-성공"또는 "재생 성공 없음"의 두 카테고리 중 하나로 분류하는 단계

본 발명은 부분 간 절제 후 간기능 장애를 예측하는 방법 및 부분 간 절제 또는 간 재생 자극 후 간기능의 모니터링 또는 치료를 받는 대상체에서 치료, 구체적으로 간 종양 부하를 감소시키는 치료를 모니터링하기 위한 방법에서 사용하기 위하여 선택된 miRNA를 제공한다.

구체적으로, 상기 miRNA는 miR-151a, miR-122 및/또는 miR-192 또는 이의 동형 또는 변이체이다. 바람직하게는, 상기 miRNA는 hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-122-5p 및/또는 hsa-miR-192-5p 또는 이의 동형 또는 변이체이다.

간기능 장애가 없는 대상체의 수준과 비교하여 하나 이상의 상기 miRNA 중 수준의 증가 또는 감소의 검출은 대상체에서 간기능 장애가 발생할 위험을 예측하기 위해 사용될 수 있다.

구체적으로, hsa-miR-151a-5p, 또는 이의 동형 또는 변이체의 수준 감소 및/또는 hsa-miR-192-5p 또는 hsa-miR-122-5p 또는 이의 동형 또는 변이체의 수준 증가는 간기능 장애 발생 위험 증가에 대한 특정 지표가 될 수 있다. 상기 miRNA의 증가 또는 감소는 특히 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생한 대상체의 혈액 또는 혈청 수준에서 파생된 데이터를 기반으로 한다.

구체적으로, 부분 간 절제 후 간기능 장애의 위험을 예측하는 임상적으로 유용한 컷오프가 본 발명에 설명된다. 구체적으로, 확률 점수가 0.59 미만, 구체적으로 0.58, 0.57, 0.56, 0.55, 0.54, 0.53, 0.52, 051 또는 0.50 미만인 low stringency 컷오프는 간기능 장애가 발생할 위험이 낮은 대상체와 저위험으로 부분 간 절제를 받을 수 있는 환자를 식별한다. 바람직하게는 0.58 미만 (P <0.58)의 확률 점수는 환자를 저위험으로 분류한다. 구체적으로, 확률 점수가 0.58 이상, 구체적으로 0.59, 0.60, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64 또는 0.65 이상인 엄격한 컷오프는 간기능 장애 발생 중위험을 지닌 환자를 식별하고, 이러한 환자는 수술 전에 최적화되어야 한다. 바람직하게는 0.58 이상의 확률 점수 (P> 0.58)는 환자를 중위험으로 분류한다. 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74 또는 0.75 이상의 확률 점수는 대상체를 고위험 환자로 식별하며, 바람직하게는 외과적 부분 간 절제를 받지 않아야 한다. 바람직하게는 0.68 이상의 확률 점수 (P> 0.68)는 간기능 장애가 발생할 고위험 대상체를 식별한다.

놀랍게도, 본 발명에 설명된 방법을 사용하여 0.68 이상의 확률 점수를 가진 환자의 100 %가 부분 간 절제 후 간기능 장애를 일으켰다. 반면 확률 점수가 0.59 이상인 환자의 80 %만이 간기능 장애를 겪었고, 확률 점수가 0.59 미만인 환자의 약 80 %는 간기능 장애가 발생하지 않았다.

구체적으로, miR-151a, miR-122 및 miR-192로 구성된 그룹에서 선택된 microRNA 쌍 사이의 발현 수준 비율을 측정하여 부분 간 절제 후 간기능 장애 발생 위험 증가를 결정할 수 있다. 구체적으로, 한 쌍의 microRNA (miR1, miR2)에 대해, 발현 값 log₂ (miR1 / miR2)의 log₂ 비율은 Cq 값 (△Cq = Cq_miR2-Cq_miR1)의 차이로 계산되었다. 구체적으로, NGS 분석 (log2 fold change)의 microRNA 쌍에 대한 결과를 qPCR 분석(△Cq)의 결과와 비교하기 위해 선형회귀분석을 수행할 수 있다. 구체적으로 선형 연합(linear association)은 각 계수에 대한 양면 Wald 테스트를 통해 테스트 할 수 있으며 결정 계수를 계산할 수 있다. 상기 대상체의 샘플과 상기 참조 샘플 간의 △Cq 값의 분포와 차이는 양면 Wilcoxon rank-sum test를 이용하여 테스트 할 수 있다.

구체적으로, 대상체의 샘플을 위험 없음, 저위험, 중위험 및 고위험 또는 재생- 성공과 같은 카테고리 중의 하나로 분류하기 위해, 각각 2 개의 마이크로 RNA 쌍은 일변량(univariate) 및 다변량 로지스틱 회귀 모델에 포함된다. 구체적으로, 일회성 교차 검증 전략을 적용할 수 있으며, 적용되는 경우 ROC (수신자 작동 특성) 분석을 통해 평가할 수 있다.

구체적으로, 최적(임상적으로 관련된) 분류 컷오프, 분할표(contingency table) (TP, FP; FN, TN) 및 민감도(SN), 특이성(SP), 양성 예측값(PPV), 음성 예측값 (NPV)과 같은 관련 매개 변수를 식별하기 위해, 정확도(accuracy, ACC), F1 점수 (F1) 및 Matthews 상관 계수(Matthews correlation coefficient, MCC)를 사용할 수 있다. 컷오프는 상기 2 개의 마이크로 RNA 쌍을 포함하는 다변량 로지스틱 회귀 모델을 기반으로 계산할 수 있다. 바람직하게는, 상기 컷오프 최대 MCC 및 PPV = 1 (위양성 FP = 0)이 사용된다.

본 발명에 사용된 용어 "마이크로 RNA(microRNA)" 또는 "miRNA" 또는 "miR"은 코딩 메신저 RNA의 발현에 혼성화하고 이를 조절하는 17 내지 25 개 뉴클레오티드의 비코딩 RNA 분자를 지칭한다. 상기 용어 "miRNA 분자(miRNA molecule)"는 천연 miRNA 분자, 즉 성숙 miRNA (mature miRNA), pre-miRNA, pri-miRNA를 포함하여 miRNA를 나타내는 임의의 핵산 분자를 의미한다.

"miR 전구체(miR precursor)", "pre-miRNA" 또는 "pre-miR"은 miRNA를 포함하는 헤어핀 구조(hairpin structure)를 갖는 비코딩 RNA를 지칭한다. pre-miRNA는 Drosha로 알려진 이중가닥 RNA 특이적 리보뉴클레아제에 의한 1 차 mi-RNA 전사체 또는 "pri-miR"의 절단 산물이다. 상기 전구체는 각각의 폴리 뉴클레오티드의 성숙 동안 발생하기 때문에 각각의 폴리 뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 전구체의 예는 표 1에 나열되어 있으며, 구체적으로 이들은 서열번호(SEQ ID Nos.) 4 내지 6이다.

Table 1: miRNA SEQ IDs

mature ID	mature Sequence	SEQ ID	mature miRNA Accession	precursor-miRNA	precursor miRNA Sequence	SEQ ID	precursor miRNA Accession
hsa- miR- 122-5p	UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG	1	MIMAT0000421	hsa-miR- 122	CCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCUAAACUAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUACUGCUAGGC	4	MI0000442
hsa-miR- 192-5p	CUGACCUAUGAAUUGACAGCC	2	MIMAT0000222	hsa-miR- 192	GCCGAGACCGAGUGCACAGGGCUCUGACCUAUGAAUUGACAGCCAGUGCUCUCGUCUCCCCUCUGGCUGCCAAUUCCAUAGGUCACAGGUAUGUUCGCCUCAAUGCCAGC	5	MI0000234
hsa-miR- 151a-5p	UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU	3	MIMAT0004697	hsa-miR- 151a	UUUCCUGCCCUCGAGGAGCUCACAGUCUAGUAUGUCUCAUCCCCUACUAGACUGAAGCUCCUUGAGGACAGGGAUGGUCAUACUCACCUC	6	MI0000809

성숙 miRNA (서열번호 1 내지 3)의 뉴클레오티드 서열 및 이들 각각의 전구체는 당업계에 공지되어 있으며 mirbase.org/index.shtml의 데이터베이스 miRBase 또는 microrna.sanger.ac.uk/sequences/ftp.shtml.의 Sanger 데이터베이스에서 이용할 수 있다. 또한 상기 뉴클레오티드 서열은 각각의 miRBase 등록 번호에 대한 참조를 포함하여 표 1에 구체적으로 개시되어 있다.

본 발명의 설명에서 나타내는 폴리뉴클레오티드의 문맥에서 본 발명에서 사용된 바와 같이 동일한 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 90 %, 95 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 동일성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상동의 폴리뉴클레오티드의 서열은 1, 2 또는 3 개 이하의 뉴클레오티드에서 표 1의 서열과 다르다.

또한 본 발명의 설명에서 나타내는 폴리뉴클레오티드의 문맥에서 본 발명에서 사용된 바와 같이 동일한 폴리뉴클레오티드는, 각각의 시드 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 해당 pre-miRNA 서열의 1 개, 2 개, 3 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 90 %, 95 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 동일성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 참조 miRNA의 "이소형(isoform) 및 변이체(variant)" ("isomiRs"라고도 함)는 트리밍 변이체 (5' 다이싱 위치가 상기 참조 miRNA 서열의 업스트림 또는 다운스트림인 5' 트리밍 변이체; 3'다이싱 위치는 참조 miRNA 서열의 업스트림 또는 다운스트림), 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 갖는 변이체(참조 miRNA의 3' 말단에 3' 뉴클레오티드 추가; 상기 miRNA 전구체에서 뉴클레오티드를 변경하여 뉴클레오티드 치환), 또는 그의 이소형 및 변이체를 포함하는 상보적 성숙 microRNA 가닥을 포함한다(예를 들어 상기 5' 성숙 microRNA의 경우 보완적인 3' 성숙 microRNA 및 그 반대). 뉴클레오티드 변형과 관련하여, RNA/RNA 결합에 관련된 뉴클레오티드, 즉 5'-시드 영역 및 절단/앵커 측의 뉴클레오티드는 변형에서 제외된다.

본 발명에서 사용된 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어 "miRNA"는 3p 및 5p 가닥 및 이의 이소형 및 변형을 포함한다.

구체적으로, 본 발명에서 사용된 바와 같이 상기 용어 "miR-respective-number-5p"는 이의 상보적인 3p miRNA를 포함하고 그 반대의 경우도 마찬가지이다.

특정 실시예에서, 상기 관심 miRNA는, 바람직하게는 엄격한 조건 하에서, 상기 관심 miRNA와 혼성화하는 뉴클레오티드를 사용하고 상기 혼성화 신호를 측정하여 검출된다.

보다 바람직하게 일 실시예에서, 상기 관심 miRNA 수준은 차세대 시퀀싱에 의해 결정된다. 고처리량(high-throughput) 시퀀싱으로 알려진 상기 용어 "차세대 시퀀싱"(NGS)은 본 발명에서 Sanger 시퀀싱과 같이 이전에 사용된 시퀀싱 방법보다 훨씬 빠르고 저렴하게 DNA 및 RNA 수준을 시퀀싱하고 정량화할 수 있는 다양한 최신 시퀀싱 기술을 설명하는 데 사용된다. 이는 마이크로 및 나노 기술을 기반으로 샘플 크기, 시약 비용을 줄이고 대규모 병렬 시퀀싱 반응을 가능하게 한다. 수백만 개의 샘플을 동시에 시퀀싱 및 분석 가능하도록 고도로 다중화될 수 있다. NGS에는 1 차, 2 차, 3 차 및 후속 차세대 시퀀싱 기술이 포함된다. 비제한적인 예는 나노 포어 또는 반도체 기술(예: Oxford Nanopore Technologies, 영국) 또는 Illumina smallRNA-Seq 플랫폼(Luo S., 2012, Methods Mol Biol. 822: 183-8) 또는 Thermo Fisher의 이온 토런트(Ion Torrent)와 같은 전자 검출 기반 방법이다.

구체적으로 NGS는 수천 또는 수백만 개의 시퀀싱 반응을 병렬로 수행하는 고처리량 시퀀싱 기술을 의미한다. 서로 다른 NGS 플랫폼은 다양한 분석 화학을 사용하지만, 이들은 모두 다수의 템플릿에서 동시에 실행되는 다수의 시퀀싱 반응에서 서열 데이터를 생성하는데, 여기서 특정 DNA 또는 RNA, 특히 miRNA에서 파생된 서열의 수는 생물학적 샘플의 RNA 수준과 관련이 있다. 일반적으로 스캐너를 사용하여 서열 데이터를 수집한 다음, 생물 정보학적으로 조립 및 분석한다. 따라서 시퀀싱 반응은 병렬로 수행, 판독, 조립 및 분석된다; 일 예로 Behjati S 및 Tarpey, P., 2013 (Arch. Di. Child Educ Pract Ed 2013, 98, 236-238); Head S. et al., 2015 (Biotechniques, 56 (2), 61-passim) 참조

일부 NGS 방법은 템플릿 증폭이 필요하고 일부는 필요하지 않다. 증폭을 필요로 하는 방법은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) (일 예로, U.S. Pat. No. 6,258,568; Roche에 의해 상품화 됨); Solexa/Illumina 플랫폼(일 예로, U.S. Pat. No. 6,833,246, 7,115,400 및 6,969,488); 및 Supported Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD) 플랫폼(Applied Biosystems; 일 예로, U.S. Pat. No. 5,912,148 및 6,130,073). 증폭을 필요로 하지 않는 방법, 일 예로 단일-분자 시퀀싱 방법은 나노포어 시퀀싱, HeliScope (U.S. Pat. No. 7,169,560; 7,282,337; 7,482,120; 7,501,245; 6,818,395; 6,911,345; 및 7,501,245); 합성에 의한 실시간 시퀀싱 (일 예로, U.S. Pat. No. 7,329,492 참조); 제로 모드 도파관 (ZMW)을 사용하는 단일 분자 실시간(single molecule real time, SMRT) DNA 시퀀싱 방법; 및 다른 방법들을 포함하고, U.S. Pat. No. 7,170,050; 7,302,146; 7,313,308; 및 7,476,503, US 20130274147; US20140038831; 및 Metzker, Nat Rev Genet 11 (1): 31-46 (2010) 을 포함한다. 대안으로, 하이브리드화 기반 서열 방법 또는 기타 고처리량 방법, 일예로 마이크로 어레이 분석, NANOSTRING, ILLUMINA 또는 기타 시퀀싱 플랫폼을 사용할 수도 있다.

구체적으로, Small RNA 시퀀싱 라이브러리는 CleanTag SmallRNA 라이브러리 준비 키트(TriLink, USA)와 같이 당업계에 잘 알려진 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성될 수 있다. 일반적으로 RNA는 먼저 DNA로 역전사된 다음 PCR 증폭된다. PCR 증폭은 작은 RNA 시퀀싱을 위해 Illumina의 바코드 프라이머와 같이, 바코드 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 시퀀싱 전에 PCR 생성물은 당업계에 잘 알려진 프로토콜을 사용하여 정제된다. 일 예로, PCR 산물은 Qiagen의 QiaQuick 프로토콜을 사용하여 정제할 수 있으며, 이후에 일 예로 모세관 전기 영동과 같은 적절한 방법으로 크기를 확인할 수 있다.

구체적으로, 차세대 시퀀싱은, 일 예로 Illumina NextSeq 500과 같은 적절한 플랫폼에서 수행될 수 있다. 시퀀싱 판독은 일반적으로 어댑터 트리밍, 품질 검사 및 추가 사용을 준비하기 위해 당업계에 잘 알려진 생물정보학 방법에 따라 편집된다.

더 바람직한 실시예에서, 상기 관심 miRNA의 수준은 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 결정된다. PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 널리 사용된다. 여기에는 정량 실시간 PCR, 반정량 PCR, 다중 PCR, 디지털 PCR 또는 이의 조합이 포함된다. 구체적으로 바람직한 실시예에서, 상기 miRNA의 수준은 정량 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 결정된다. qRT-PCR을 사용하여 miRNA의 수준을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 miRNA를 cDNA로 역전사하는 것이 선행된다.

본 발명의 유용한 PCR 방법에 있어서, 상기 프라이머는 일반적으로 성숙 miRNA 분자를 기반으로 하지만 혼성화 거동(hybridization behavior)을 최적화하기 위한 화학적 변형을 포함할 수 있다.

qRT-PCR 방법은 miRNA의 절대 발현 수준을 결정할 수 있다. 대안으로, qRT-PCR 방법은 miRNA의 상대적인 양을 결정할 수 있다. 상기 miRNA의 상대적인 양은 miRNA의 수준을 하나 이상의 내부 표준 핵산 서열 수준으로 정규화함으로써 결정될 수 있다. 일반적으로 이러한 내부 표준 핵산 서열은 분석된 혈액 또는 혈청 샘플에서 일정한 수준을 가져야한다. 일 예로, 내부 표준 핵산 서열은 glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH), beta-actin (ACTB)과 같은 mRNA 또는 5S 및 18S ribosomal RNA, RNU48, RNU44 및 RNU6와 같은 비코딩 RNA와 같이 구성적으로 전사된 RNA 핵산 서열일 수 있다. 또한 miR-23a-3p, miR-23b-3p, miR-15-5p 또는 miR-16-5p와 같이 혈청 또는 혈장에서 일정하고 높은 수준을 갖는 miRNA는 상대적 정량화를 위한 기준으로 사용될 수 있다. 또한 RNA 분리 또는 cDNA 합성 중에 등몰량으로 추가된 합성 RNA 서열은 특정 miRNA의 상대적 정량화를 위한 기준으로 사용할 수 있다.

대신에, 2개의 miRNA 간의 상대적 로그 차이를 계산하여 자체 정규화 miRNA 쌍을 형성 할 수 있다. 따라서 참조 miRNA에 대한 필요성을 피할 수 있다.

본 발명에서 유용한 실시간 PCR 정량화 방법의 개요는 Schmittgen et al., 2008, Methods.January; 44(1): 31-38 에 게시되어 있다.

miRNA 검출용 프라이머는 시중에서 구입할 수 있는데, 일 예로, Exiqon의 microRNA LNA ?? PCR 프라이머 세트이다.

miRNA는 상대적으로 짧은 분자이기 때문에, 역전사 및 증폭 전에 아데노신 단량체를 가닥에 추가하여(폴리아데닐화로 알려진 기술) 길이를 늘리는 것이 유용할 수 있다. 간단히 말해, 상기 RNA는 적합한 시약(예: Trizol 시약)에 의해 샘플에서 추출되고, ATP 및 폴리 (A) 중합 효소의 존재하에 폴리아데닐화 되고, 폴리 (T) 어댑터 및 5' RACE 서열을 사용하여 cDNA로 역전사되고, miRNA의 3' 말단 및 역 RACE 프라이머에서 유래된 정방향 프라이머를 사용하여 증폭된다. 이 기술의 개선 사항에는 3' 말단(A, C 또는 G로 구성하지만 T는 구성하지 않으므로 상기 polyA 서열의 어느 곳에서나 프라이밍을 제외하고 상기 miRNA 서열에서 프라이밍을 시행)에 뉴클레오티드가 있는 RACE 프라이머 또는 화학적 변형 유무에 관계없이 2, 3, 4 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 사용하여 특정 microRNA의 3' cDNA 말단에 고정된 RACE 프라이머를 설계하는 것이 포함된다.

또한 상기 miRNA의 검출은 당업계에 공지된 다른 방법, 일 예로 딥시퀀싱 방법, bead-based 정량화와 같이 WO2011/14476에 기술된 방법, 일 예로 Illumina 비드 어레이, 하이드로겔 입자 기반 정량화, 일 예로 마이크로어레이 기술에 의한 Firefly^TM, 일 예로 Invitrogen에서 제공하는 Ncode ?? human miRNA 어레이, Affymetrix, Agilent에서 제공하는 칩 어레이 또는 LNA-backbone 캡처 프로브 (miRCURY LNA ?? 어레이)를 사용하는 마이크로 어레이, 일 예로 Exiqon에 의해 달성될 수 있다.

miRNA 수준의 차이는 또한 Panomics와 같은 다중화학발광 기반 핵산 분석, 또는 microRNA-상보적 조절 부위가 있는 리포터 단백질을 포함하는 리포터 플라스미드 분석("바이오 센서"), 또는 당업계에 공지된 기타 혼성화 기반 기술을 사용하여 결정될 수 있다.

"참조 수준", "참조 비율", "참조 샘플", "대조군" 또는 "대조 샘플"은 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있는 용어이며, 실험 샘플, 즉, LD 발생의 위험 또는 재생 성공이 결정되는 대상체의 샘플과의 비교를 위해 사용되는 샘플 또는 표준으로 이해되어야 한다. 상기 대조군은 건강한 대상체 또는 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생하지 않은 대상체로부터 얻은 샘플을 포함 할 수 있다. 추가적으로, 대조군은 표준 참조 값 또는 값의 범위, 즉 상기 샘플에서 안정되게 발현된 miRNA, 일 예로 내인성 대조군 U6 snRNA 일 수 있다.

상기 참조 수준은 건강한 대상체, 즉 부분 간 절제 후 LD가 발생하지 않은 대상체 및/또는 수술, 약물치료, 식이 요법 또는 생활방식 개입 후의 대상체의 샘플에서 해당 miRNA의 평균 수준으로 결정될 수 있다. 대안으로, 샘플 풀이나 문헌에 공개된 참고 문헌을 사용할 수도 있다.

상기 miRNA 수준의 차이는 본 발명에 기재된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.

구체적으로, 분류 모델을 이용하여 샘플의 발현 수준 또는 발현 수준 비율을 상기 참조 발현 수준 또는 발현 수준 비율과 비교할 수 있다. 분류 기술 (또는 분류기)은 부분 간 절제 후 간기능 장애가 있거나 없는 환자의 microRNA 발현 수준과 같은 입력 데이터 세트에서 분류 모델을 구축하는 체계적인 접근 방식이다. 예로는 로지스틱 회귀 모델, 지원 벡터 머신 모델, 의사 결정 트리 모델, 규칙 기반 분류기, 신경망 및 나이브 베이즈 분류기가 있다. 각 기법은 학습 알고리즘을 사용하여 입력 데이터의 속성 집합과 클래스 레이블 간의 관계에 가장 적합한 모델을 식별한다. 학습 알고리즘에 의해 생성된 상기 모델은 입력 데이터에 잘 맞아야 하며 이전에 본 적이 없는 데이터의 클래스 레이블을 올바르게 예측해야 한다. 따라서 학습 알고리즘의 주요 목표는 우수한 일반화 기능을 갖춘 모델, 즉 이전의 미확인 데이터의 클래스 레이블을 정확하게 예측하는 모델을 구축하는 것이다.

로지스틱 회귀 모델은 로지스틱 모델의 매개 변수를 추정한다. 로지스틱 모델은 사건 확률의 로그 오즈(log-odds)가 독립 변수 또는 예측 변수의 선형 조합인 모델이다. 입력 측면에서 출력 확률을 모델링하고 컷오프 값을 선택하고 컷오프 보다 확률이 큰 input을 하나의 클래스로, 컷오프 보다 낮은 확률을 다른 하나의 클래스로 분류하여 하나의 분류기를 만드는 데 사용할 수 있다.

지원 벡터 머신(Support Vector Machine, SVM)은 분류 및 회귀 분석에 사용되는 데이터를 분석하는 관련 학습 알고리즘이 있는 지도 학습 모델이다. 각각 두 개 이상의 범주 중 하나 또는 다른 하나의 범주에 속하는 것으로 표시된, 일련의 훈련 예제가 주어지면, SVM 훈련 알고리즘은 하나의 범주 또는 다른 하나의 범주에 새 예제를 할당하는 모델을 구축하여 비확률적 2진 선형 분류기로 만든다. 지원 벡터 머신은 고차원 또는 무한 차원 공간에서 초평면 또는 초평면 집합을 구성하며, 이는 분류, 회귀 또는 이상치 감지와 같은 기타 작업에 사용할 수 있다. 일반적으로 마진이 클수록 분류기의 일반화 오류가 낮아 지므로, 모든 클래스(소위 기능 마진)의 가장 가까운 훈련 데이터 포인트까지 가장 큰 거리를 갖는 초평면에 의해 우수한 분리가 달성된다.

계산 복잡도 및 통신 복잡도 이론에서 상기 의사 결정 트리 모델은 알고리즘 또는 통신 프로세스가 기본적으로 의사 결정 트리, 즉 일부 수량의 비교, 즉 단위 계산 비용이 할당되는 비교에 기반한 분기 작업 시퀀스로 간주되는 계산 또는 통신 모델이다. 단일 비교 계산에 허용되는 작업의 복잡도와 분기 방식에 따라 의사 결정 트리 모델의 여러 변형이 도입되었다. 의사 결정 트리 모델은 특정 클래스의 계산 문제 및 알고리즘에 대한 계산 복잡성의 하한을 설정하는 데 유용하다: 최악의 경우 계산 복잡도의 하한은 주어진 계산 문제에 대해 가능한 모든 입력에 대한 의사 결정 트리 중 가장 큰 깊이에 비례한다. 의사 결정 트리 모델로 표현 된 문제 또는 알고리즘의 계산 복잡도를 의사 결정 트리 복잡도 또는 쿼리 복잡도이라고 한다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 기재된 방법은 대상체를 모니터링하는데, 구체적으로 간 재생의 자극에 대한 대상체의 반응을 측정하는데 유용하다.

본 발명에 기재된 방법은 화학 요법, 면역 요법, 문맥 색전술, 단계적 간 절제술을 위한 연관 간 분할 및 문맥결찰(ALPPS)과 같은 요법의 치료 및 치료 성공을 모니터링하거나 운동 치료("예비"), 식이 요법 또는 문맥 고혈압을 줄이는 약물 요법과 같은 기타 치료 옵션을 모니터링 하는데 사용할 수 있다.

화학요법은 암세포를 파괴하는 약물 치료이다. 간암에서 전신 화학요법으로 효과적인 약물의 예로는 독소루비신(Adriamycin), 5-플루오로우라실 및 시스플라틴이 있다. 그러나 이러한 약물조차도 종양의 작은 부분만 축소하고 반응이 오래 지속되지 않는 경우가 많다. 약물의 조합으로도 대부분의 연구에서 전신 화학요법은 환자가 더 오래 사는데 도움이 되지 않았다. 그 대안으로 화학요법은 간동맥 주입(hepatic artery infusion, HAI)이라는 과정을 통하여 간에 직접 전달될 수 있다. HAI는 전신 화학요법보다 종양에 더 많은 화학요법을 적용하지만 부작용을 증가시키지 않는다. 간동맥 주입을 통해 투여되는 화학 요법의 예로는 플록수리딘(floxuridine, FUDR), 시스플라틴, 미토마이신 C 및 독소루비신이 있다.

문맥 정맥 색전술(PVE)은 부분 간 절제 전에 수술 후 남아있을 간 분절(segment)의 크기를 늘리기 위해 사용되는 기술이다. 이 요법은 문맥 혈액을 미래의 잔여 간(future liver remnant, FLR) 분절(segment)로 리디렉션하여 비대를 초래한다. PVE는 상기 FLR이 필수 기능을 지원하기에는 너무 작거나 크기가 제한적이고 복잡한 수술 후 과정과 관련이 있을 때 제안된다. 적절하게 적용하면, PVE가 수술 후 이환율을 줄이고 근치적 절제술을 받을 수 있는 환자 수를 증가시키는 것으로 나타났다. 수술 전 문맥 색전술은 문맥 혈액을 비종양 보유 간으로 리디렉션하여 FLR의 비대를 유발하는 안전한 영상유도 절차이다.

단계적 간 절제술을 위한 연관 간 분할 및 문맥결찰(ALPPS)은 최근 전통적으로 절제 불가능한 간 종양에 대한 구제 요법으로 발전했다. 상기 ALPPS 절차는 Schnitzbauer et al. (27) 에 의해 처음 설명되었고 빠른 간 재생이 가능하도록 개발되었으며, 바람직하게는 간 질환 부위의 완전한 사전 절제를 허용할만큼 충분한 잔여 간을 보유하지 않은 경계선 수술 가능 환자에서 가능하다. 구체적으로 미래의 간 잔류물(FLR)이 부족한 우 간엽 종양 환자에게 포문을 열었다. 상기 절차는 2 단계로 수행된다. 구체적으로, 첫 번째 단계에서 간을 포함하는 종양에 영양을 공급하는 문맥 가지가 선택적으로 결찰되는 반면, 동맥 및 담즙 구조가 보존되고 이러한 초기 수술 단계에서 간 실질이 추가로 절개된다. 이 단계가 성공하면 며칠 내에 간 재생과 간 성장으로 이어진다. 특히 간이 충분히 재생되면 결찰된 나머지 간엽을 제거하기 위해 두 번째 수술 단계가 수행된다. 이 과정의 주요 단점은 높은 이환율과 사망률이며, 절제술의 상기 두 번째 단계를 수행할 수 있을 만큼 간기능장애의 위험이 낮을 시점을 결정하는 신뢰할 수 있는 예측 마커가 시급하게 필요하다는 것이다.

구체적으로, 본 발명에 기재된 바와 같이 제공된 샘플은 본 발명에 기재된 miRNA 시그니처를 사용하는 in vitro 방법을 사용하는 "치료 성공" 또는 "치료 성공 없음"으로 분류 될 수 있다. 따라서, 예를 들어 ALPPS, PVE 또는 화학 요법과 같은 방법에 따른 간 재생 성공은 부분 간 절제 전에 결정될 수 있다. 구체적으로, 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생할 위험이 낮은 시점을 결정할 수 있다.

문맥 고혈압은 문맥계라는 정맥계 내에서 혈압이 증가하는 것이다. 위, 장, 비장 및 췌장에서 나오는 정맥은 문맥으로 합쳐져 더 작은 혈관으로 분기되어 간을 통과한다. 간 손상으로 인해 간 혈관이 막히면 혈액이 간을 통해 제대로 흐를 수 없다. 결과적으로 문맥계에서 높은 압력이 발생한다. 문맥 고혈압을 감소시키는 치료 옵션에는 내시경 정맥류 결찰(EVL), 프로프라놀롤 또는 나돌롤과 같은 비 선택적 β차단제(NSBB) 사용이 포함되며, 문맥 혈류 감소를 통해 문맥 압력을 감소시킨다. 이의 작용 메커니즘은 β-1 수용체를 통한 심장 출력 감소와 β-2 수용체를 차단하여 비장 혈관 수축을 유발하여 무저항 α-1 활동을 유발하는 것을 포함한다. 후자는 가장 중요한 효과이므로 NSBB (선택적 β-차단제와는 반대로)를 사용하는 것이 필수적이다 (Khurram and Guadalupe, World J Gastroenterol. 2012 Mar 21; 18 (11): 1166-1175).

일반적으로 간 재생은 전반적인 건강을 개선하기 위한 운동 증가("예비 활동")와 단백질, 나트륨 및 알코올 섭취를 줄이는 식이 변화와 같은 생활방식 변화에 의해 자극될 수도 있다.

보다 구체적으로 본 발명에서 하기를 포함하는 부품 키트(kit-of-parts)가 추가로 제공된다.

a) 대상체의 샘플에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 microRNA의 발현 수준을 검출할 수 있는 검출 시약,

b) 참조 발현 수준

c) 상기 a)의 발현 수준을 상기 b)의 발현 수준과 비교하고 대상체의 샘플을 2 개 이상의 클래스 중 하나로 분류하기 위한 분류 모델을 포함하는 소프트웨어, 여기서 각 클래스는 부분 간 절제 후 간기능 장애의 "고위험" 및 "저위험" 범주 중 하나이다.

구체적으로, 본 발명에 제공되는 상기 부품 키트는 RNA 추출, cDNA 합성 및 특정 microRNA 표적 서열, 구체적으로 적어도 miR-151a, miR-192 또는 miR-122의 형광-기반 증폭을 위한 시약을 포함하는 qRT-PCR 키트 일 수 있다. 형광 리포터 프로브는 상기 프로브에 상보적인 서열을 포함하는 상기 DNA만을 감지한다; 따라서 리포터 프로브를 사용하면 특이성이 크게 증가하고 다른 dsDNA가 있는 경우에도 상기 기술을 수행할 수 있다. 서로 다른 색상의 라벨을 사용하는 형광 프로브는 상기 동일한 튜브에서 여러 표적 서열을 모니터링하기 위해 다중 분석에 사용될 수 있다. 이러한 형광 리포터 분자에는 Molecular Beacons, FRET Hybridization Probes, Scorpion Primers® 또는 TaqMan® Probes와 같은 검출 시약으로서의 서열 특이적 프로브가 포함된다. qRT-PCR을 사용하여 miRNA를 검출하는 다양한 방법은 Arya et al. (Expert Rev Mol Diagn. 2005 Mar; 5 (2): 209-19) 및 Navarro et al. (Clin Chim Acta. 2015 Jan 15; 439: 231-50)와 같이 당업자에게 알려져 있다.

구체적으로, 본 발명에 제공된 부품 키트는 특정 microRNA 서열용 캡처 프로브, microRNA 라벨링 및 혼성화를 위한 화학 물질, 혼성화 반응의 엄격성과 특이성을 높이기 위한 세척 버퍼가 있는 고밀도 또는 저밀도 어레이를 포함하는 마이크로 어레이 키트 일 수 있다. microRNA 표지는 일 예로 Lucigen의 Biotin-16-UTP와 같은 비오틴 프로브를 사용하여 달성 할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 제공된 상기 부품 키트는 차세대 시퀀싱에 적합한 시퀀싱 라이브러리를 얻기 위하여 microRNA에 대한 5' 및 3' 어댑터 결찰, 역전사 및 PCR 증폭에 필요한 시약을 포함하는 차세대 시퀀싱 키트 일 수 있다.

본 발명은 하기의 항목을 추가로 포함한다 :

1. 구체적으로 부분 간 절제 후, 대상체의 간기능 장애 위험을 결정하는 in vitro 방법으로서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다 :

a) 상기 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계

b) 상기 샘플에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 결정하는 단계, 및

i. 상기 b)의 발현 수준을 적어도 하나의 참조 발현 수준과 비교, 또는

ii) 상기 b)에서 결정된 발현 수준을 기준으로 miR-151a 대 miR-192 및 / 또는 miR-122 대 miR-151a의 비율을 확인하고, 상기 발현 수준 비율을 참조 발현 수준 비율과 비교,

c) 상기 단계 i) 또는 상기 단계 ii)의 결과로부터 샘플을 적어도 2 개의 클래스 중 하나로 분류하며, 여기서 각 클래스는 적어도 2개의 범주 "고위험" 및 "저위험" 중 하나 이다.

2. 상기 항목 1의 in vitro 방법에서, miR-151a, miR-192 및 miR-122의 발현 수준이 결정되고,

3. 상기 항목 1 또는 2의 in vitro 방법에서, "무위험" 및 "중위험" 범주의 분류를 포함하고

4. 상기 항목 1 내지 3 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, 상기 참조 발현 수준은 건강한 대상체 또는 수술 후 간기능장애가 없는 대상체 또는 이의 그룹의 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준이다.

5. 상기 항목 1 내지 3 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, 참조 발현 수준 비율은 건강한 대상체 또는 수술 후 간기능장애가 없는 대상체 또는 이의 그룹의 의 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율이다.

6. 상기 항목 1 내지 5 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, "저위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받고, "중위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 전에 간 재생 자극을 받고 "고위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받지 않는다.

7. 상기 항목 6의 in vitro 방법에 있어서, "중위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 전에 치료를 받으며, 상기 치료는 신보조 화학요법, 문맥 색전술, 단계적 간 절제술을 위한 연관 간 분할 및 문맥결찰(ALPPS), 운동 치료("예비") 또는 문맥 고혈압을 감소시키는 약물 치료로 구성된 그룹에서 선택된다.

8. 항목 6의 in vitro 방법에 있어서, "고위험"으로 분류된 대상체는 간 이식, 완화 화학 요법, 고주파 절제 또는 경동맥 화학 색전술 (TACE)을 받는다.

9. 하기의 단계를 포함하는, 대상체의 간 재생 자극의 재생-성공을 모니터링하는 in vitro 방법 :

a) 상기 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계

b) 상기 샘플에서 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율 결정하는 단계

c) 참조 샘플에서 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율을 결정하는 단계, 여기서 상기 참조 샘플은 상기 대상체의 초기 샘플이다.

d) 상기 b)의 발현 수준 비율을 상기 c)의 발현 수준 비율과 비교하는 단계

e) 상기 단계 d)의 비교 결과로부터 상기 대상체의 샘플을 "재생 성공" 또는 "재생 성공 없음"의 두 범주 중 하나로 분류하는 단계

10. 상기 항목 9의 in vitro 방법에 있어서, 상기 간 재생 자극은 문맥 색전술에 의한 간 비대 유도, 단계적 간 절제술을 위한 연관 간 분할 및 문맥결찰(ALPPS)을 시행함으로써 간 비대 유도, 전반적 건강개선을 위한 운동 치료("예비") 및 문맥 고혈압을 감소시키는 약물 요법으로 구성된 그룹에서 선택된다.

11. 상기 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, 상기 대상체는 간 악성 병변, 바람직하게는 전이성 결장직장암, 간세포 암종 또는 담관 세포 암종, 또는 양성 간 종양, 간 낭종 및/또는 기생충 질환을 지니고 있다.

12. 상기 항목 1 내지 11 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 특히 혈소판이 부족한 혈장, 림프, 소변, 타액 및 생검 프로브로 구성된 군에서 선택된다.

13. 상기 항목 1 내지 12 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, 상기 샘플의 발현 수준 또는 발현 수준 비율은 분류 모델을 사용하여 참조 발현 수준 또는 발현 수준 비율과 비교된다.

14. 상기 항목 1 내지 13 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, 분류 모델은 상기 참조와의 비교 결과로부터 대상체의 샘플을 적어도 2 개 이상의 클래스 중 하나로 분류한다.

15. 상기 항목 13 또는 14 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, 상기 분류 모델은 로지스틱 회귀 모델, 지원 벡터 머신 모델 및 의사 결정 트리 모델로 구성된 그룹에서 선택된다.

16. 상기 항목 1 내지 15 중 어느 하나의 in vitro 방법에 있어서, 상기 발현 수준은 시퀀싱 기반 방법, 구체적으로 차세대 시퀀싱, 어레이 기반 방법 및 PCR 기반 방법, 구체적으로 정량적(quantitative) PCR 기반 방법으로 구성된 그룹에서 선택된 방법을 사용하여 결정된다.

17. 하기를 포함하는 부품 키트

a) 대상체의 샘플에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 microRNA의 발현 수준을 검출 할 수 있는 검출 시약,

b) 참조 발현 수준

c) 상기 a)의 발현 수준을 상기 b)의 발현 수준과 비교하고 상기 대상체의 샘플을 적어도 2 개 이상의 클래스 중 하나로 분류하기 위한 분류 모델을 포함하는 소프트웨어, 여기서 각 클래스는 구체적으로 부분 간 절제 후 간기능 장애의 "고위험"및 "저위험" 범주 중 하나이다.

본 명세서에 기술된 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며 이를 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 다른 실시예들이 본 발명에 따라 설명되었다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한 본 명세서에 설명되고 예시된 기술에 대해 많은 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 상기 실시예는 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예

비편향적이고 체계적인 접근 방식으로 차세대 시퀀싱을 사용하여, 간 절제 후 수술후 LD로 고통받는 21 명의 환자와 27 개의 일치 대조군의 수술전 혈장에서 554 개의 miRNA를 검출하였다. 그 후, miRNA 151a-5p, 192-5p 및 122-5p를 포함하는 miRNA 시그니처가 간 절제 후 수술후 LD가 발생하는 환자와 높은 상관 관계가 있는 것이 발견되었다. 수술후 LD의 예측 가능성은 24 명의 환자로 구성된 독립적인 검증 코호트에서 실시간 PCR을 사용하여 확인되었다. 궁극적으로, 151a-5p 대 192-5p 및 122-5p 대 151a-5p의 2개의 miRNA 비율의 회귀 모델은 수술후 LD, 중증 이환율, 장기간의 중환자실 입원은 물론 입원 및 수술 전 사망률을 주목할만한 정확도로 예측하여 수술후 LD의 확립된 마커를 능가하였다.

간 절제 후 잠재적으로 치명적 수술 후 임상 결과를 예측하는 임상적 관련성을 고려할 때, 이 데이터는 부분 간 절제를 받는 환자의 선택을 지원하는 새로운 miRNA 기반 바이오마커의 임상적 유용성을 보여준다. 이러한 바이오마커를 사용하면 개별 환자의 특정 위험 프로필에 맞추어 치료 및 수술 전략을 조정할 수 있다.

재료 및 방법

연구 대상(Study population)

처음에는 비엔나 의과 대학에서 간 절제를 받은 환자의 디스커버리 코호트가 2012 년 2 월부터 전향적으로 모집되었다. 간세포 암종(HCC), 담관 세포 암종(CCC) 또는 전이성 결장 직장 암종(mCRC) 환자는 포함 대상으로 간주되었다. 그 후, 수술후 LD 및 임상 결과에 대한 miRNA의 상당한 예측 가능성을 관찰함에 따라, 본 발명자들은 간 절제를 받는 전향 환자군에서 탐색 결과를 검증하였다.

모든 환자에서 기준 특성, 수술적 절제 정도(<3 segments = minor, ≥3 segments = major, according to the IHPBA Brisbane 2000 nomenclature (13)), 수술중 특성, 수술전 간 기능 및 손상 변수를 전향적으로 기록하였다.

본 연구는 헬싱키 선언에 따라 기관 윤리위원회의 승인을 받았으며 모든 환자가 서면 동의를 제공하였다. 또한 임상 시험 레지스트리 (ClinicalTrials.gov Identifiedr: NCT01700231 및 NCT02113059)에 임상 시험이 등록되었다.

수술 후 합병증의 정의 및 분류

환자들은 비엔나 의과 대학에서 수술 후 90 일 동안 추적 관찰을 받았다. 수술 후 결과는 전향적으로 문서화 되었다. 수술후 LD는 국제 간수술 연구그룹(ISGLS) (14)에서 발표한 기준에 따라 진단되었다. 간단히 말해서, LD는 수술후 일수(POD) 5 일 또는 그 이후의 혈청 빌리루빈 및 프로트롬빈 시간의 비정상 값으로 정의되었다. 구체적으로, 수술 전 혈청 빌리루빈 또는 프로트롬빈 시간이 비정상적인 경우, POD 5 일 후 2 연속일째에 수술 후 편차와 악화가 수술후 LD로 확인되었다. 더욱이, POD 5 일 이전에 정상적인 혈청 빌리루빈 또는 프로트롬빈 시간 값에 도달했거나 좋은 임상 성능으로 인해 조기 퇴원하여 더 이상의 혈액 수집이 없는 환자는 "LD 없음"으로 간주되었다.

수술 후 이환 환자의 분류를 위해 Dindo et al.에 의해 주어진 개요가 적용되었다. 따라서 수술 후 합병증의 정도를 기록하고 I에서 V까지 등급을 매겼다. 여러 합병증의 경우, 가장 심각한 합병증이 분류에 사용되었다. 또한 수술 후 입원 기간과 중환자실(ICU) 입원 기간을 기록하였다. 결국 수술 후 90 일 이내 사망은 수술 후 사망률로 분류되었다(16).

수술 전 간 기능 평가

간 기능은 indocyanine green (ICG)-clearance (17)를 사용하여 간 절제 전에 일상적으로 평가되었다. 25mg의 ICG 시약을 20ml의 등장액에 용해시키고 체중의 0.25mg/kg의 용량을 환자에게 정맥 내 투여하였다. 순환계에서 컬러 시약의 농도는 펄스 분광법을 사용하여 평가되었다. 최종적으로 1 분 이내에 제거된 ICG 시약의 양(= 혈장 소실률 (PDR))과 15 분 후 순환에서 검출된 시약의 남은 양(R15)을 현재 환자 코호트에서 측정하였다.

혈중(circulating) miRNA의 측정

수술 전에 앞서 설명한대로 혈장의 세심한 준비가 수행되었다 (18, 19). 간단히, 혈액을 미리 냉각된 CTAD 튜브로 끌어와 30 분 이내에 처리하였다. 1,000 g 및 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리를 통해 고형 혈액 성분으로부터 혈장을 분리하고, 10,000 g 및 4 ℃에서 10 분 동안 추가 원심분리 단계를 거쳤다. 최종적으로 혈장은 추가 분석까지 -80 ℃에 보관되었다.

RNA 추출

상기 miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany)를 적용하여 작은 RNA를 포함한 전체 RNA를 혈장에서 분리하였다. 냉동 혈장 샘플을 실온에서 해동하고 12,000 g에서 5 분 동안 원심 분리하여 무세포(cell-free) 성분에서 잠재적 잔해를 분리하였다. 200 μl의 혈장을 3 개의 합성 스파이크-인 컨트롤(Exiqon, Denmark)의 혼합을 포함하는 1ml Qiazol과 볼텍싱(vortexing)하여 혼합하였다. 실온에서 10 분 동안 배양한 후, 클로로포름 200 μl를 첨가하고 볼텍싱으로 강하게 혼합하였다. 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 g에 원심분리 후, 650 μl의 수상을 흡입하였다. 글리코겐(Ambion, USA)을 최종 농도 50 μg/ml가 되도록 첨가하였다. 그 다음 샘플을 실리카 컬럼으로 옮기고 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAcube 액체 처리 로봇을 사용하여 추가로 처리하였다. RNA는 750 μl 에탄올로 침전시키고, RPE-buffer로 삼중 세척 한 다음, 30 μl nuclease free water에서 RNA를 용출하고 -80 ℃에서 보관하였다.

Small RNA 시퀀싱

제조업체의 권장 사항에 따라 CleanTag SmallRNA 라이브러리 준비 키트(TriLink, USA)를 사용하여 Small RNA 시퀀싱 라이브러리를 생성하였다. 2 μl total RNA를 28 ℃에서 1 시간 동안 연속 3 '및 5' 어댑터 결찰에 사용한 다음, 65 ℃에서 20 분 동안 사용하였다. 낮은 RNA 양을 위해 어댑터를 1:12로 미리 희석하였다. 역전사는 50 ℃에서 1 시간 동안 수행되었다. PCR 증폭은 small RNA 시퀀싱을 위해 바코드가 있는 Illumina 프라이머를 사용하여 수행되었다: 변성(denaturation) (98 ℃, 10s), 어닐링(annealing) (60 ℃, 30s) 및 신장(elongation) (72 ℃, 15s)의 26 주기가 사용되었다. PCR 산물은 QiaQuick 프로토콜(Qiagen, Germany)을 사용하여 정제하고, 크기는 DNA 1000 Chip (Agilent, USA)을 사용하여 모세관 전기 영동으로 확인하였다. 상기 ~ 145 bp 피크 농도는 등 몰량의 DNA를 pooling 하기 위한 기초로 사용되었다. 상기 pool을 18 내지 50 bp의 템플릿 삽입물을 선택하기 위하여 겔 정제하였다. 시퀀싱은 Illumina NextSeq 500, 50주기의 single-end 읽기(Illumina, USA)에서 수행되었다. fastq 형식의 시퀀싱 읽기는 어댑터 트리밍 및 품질 검사(fastQC 파일 생성)이다. Bowtie2를 사용하여 인간 성숙 miRNA (miRBase v21)에 대한 정렬을 위해 품질 필터링된 판독(phred> 30)을 사용하였다. 매핑된 결과(mapped reads)는 게놈 정렬(Bowtie2, GRCh37)을 통해 교차 검사되었다. 성숙 miRNA 읽기를 계수하고(isomiR 서열이 요약됨) 매핑된 결과의 총계에 대한 백만 당 계수(CPM)로 표준화 되었다. CPM 값은 통계 분석에 사용되었다 (아래 참조).

qPCR 분석

qPCR 분석은 이전 기술과 같이 수행하였다(20). 간략하게, Universal cDNA Synthesis Kit II (Exiqon, Denmark)를 사용하여 총 RNA 2μl를 cDNA로 역전사하였다. cDNA는 Exilent SYBR® Green masermix 및 LNA 변형 프라이머 쌍(Exiqon, Denmark)을 사용하여 qPCR 증폭을 위해 1:50으로 사전 희석되었다. qPCR 증폭은 96-well 또는 384-well 형식의 LC480-II (Roche Diagnostics, Germany)에서 실행되었다. Cq-값은 2 번째 파생 방법을 사용하여 결정되었다. RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR 증폭의 견고성은 합성 스파이크-인 대조군(Exiqon, Denmark)의 조합을 사용하여 평가되었다. miR-23a-3p 및 miR-451a의 비율을 사용하여 용혈을 평가 하였다(21). 참고로, 용혈 또는 높은 분석 차이로 인해 실패한 샘플은 없다.

통계 분석

범주형 변수에 대한 상기 디스커버리 코호트와 상기 검증 코호트 간의 환자 특성 차이는 카이 제곱 검정으로, 연속 변수에 대해서는 Wilcoxon rank sum test로 테스트 하였다.

LD가 있는 환자 그룹과 LD가 없는 환자 그룹(log2 fold 변화)간에 차별적으로 발현된 microRNA의 정규화 및 계산은 R 패키지 edgeR을 사용하여 수행되었다. 우도비 테스트(likelihood ratio test)를 통해 유의한 차이가 확인되었다. P-값은 Benjamini-Hochberg 방법에 따라 잘못된 발견 비율을 기반으로 복수 테스트를 위해 조정되었다. 평균 풍부도의 log2 counts per million (logCPM)> 5, fold change> 1.3 및 raw p <0.2를 갖는 microRNA가 잠재적인 바이오마커 후보로 간주되었다. qPCR 분석을 위해 microRNA는 쌍으로 자체 정규화 되었다: 한 쌍의 microRNA (miR1, miR2)에 대해 발현 값의 log2 비율 log2(miR1/miR2)는 Cq 값(△Cq = CqmiR2-CqmiR1)의 차이로 계산되었다. NGS 분석(log2 fold change)의 microRNA 쌍에 대한 결과를 qPCR 분석(△Cq)의 결과와 비교하기 위해, 선형 회귀 분석을 수행하였다. 선형 연관성은 각 계수에 대한 양면 Wald 테스트로 수행되었으며 결정 계수(R²)가 계산되었다. 대조군과 LD 그룹 간의 △Cq 값의 분포 및 차이는 박스플롯으로 표시되고 양면 Wilcoxon rank sum test를 사용하여 테스트 하였다.

LD가 있는 환자와 LD가 없는 환자의 분류에서 가장 중요한 변수(microRNA 쌍)를 식별하기 위해 Random Forest 분석(R 패키지 random Forest 표준 설정 및 grewing 10,001 tree)을 수행하였다. 분류를 위해, 각각의 가장 유익한 2 개의 microRNA 쌍은 일변량 및 다변량 로지스틱 회귀 모델에 포함되었다. LOOCV (leave-one-out cross validation) 전략을 적용하고 수신자 작동 특성(ROC) 분석 (R 패키지 ROCR)에 의해 평가하였다. 상기 ROC 곡선밑면적(AUC)을 결정하고 무작위 할당(AUC = 0.5)에서 유의한 편차를 테스트하였다. 이러한 로지스틱 회귀 분류 모델의 성능은 ROC 분석을 사용하여 독립된 검증 코호트에서 평가되었다. 최적의(임상적으로 관련된) 분류 컷오프를 식별하기 위해, 다양한 컷오프 분할표 (TP, FP; FN, TN) 및 관련 매개변수(민감도(SN), 특이성(SP), 양성 예측값(PPV), 음성 예측값(NPV), 정확도(ACC), F1 점수(F1), Matthews 상관 계수(MCC))는 상기 디스커버리 코호트에서 학습된 2 개의 microRNA 쌍을 포함하는 다변량 로지스틱 회귀 모델을 기반으로 계산되었다. 2 개의 컷오프는 1) 최대 MCC 및 2) PPV = 1 (위양성 FP = 0) 및 최대 MCC에 의해 선택되었다. 상기 선택된 모델과 이러한 기준을 적용하면 discovery set, validation set 및 combined set에 대해 동일한 컷오프가 발생하였다. 분류 성능을 다른 임상 매개 변수와 비교하기 위해 상기 combined set가 사용되었다. ROC 분석 및 AUC를 사용하여 상기 2 개의 microRNA 쌍 모델의 성능을 다른 간기능 매개 변수와 비교하였다. 상기 2 개의 각각의 컷오프에 대해, 중증 이환율을 가진 간기능 장애 환자 부분의 차이 및 예측된 대조군과 예측된 간기능 장애 사이의 사망률은 양면 Fisher exact test로 테스트되었고 오즈비(OR)가 결정되었다.

분석은 SPSS (버전 23.0) 및 R (버전 3.4.1)을 사용하여 수행되었다: p-값 <0.05는 중요한 것으로 간주되었다.

실시예 1: 디스커버리 코호트에서 수술 후 간기능 장애에 대한 예측 miRNA 패널 설정

2012 년 2 월부터 2016 년 4 월 사이에 간 절제술을 받은 mCRC, HCC 또는 CCC 환자 총 48 명이 본 발명의 디스커버리 코호트에 포함되었다. 대표적인 코호트를 도달하기 위해 수술후 LD를 앓고있는 21 명의 환자를 기본 특성, 간기능 및 간 절제술의 범위를 기준으로 수술후 LD가 없는 27 명의 환자에 매칭하였다. 그 후 추가로 24 명의 환자가 전향적이고 임상적으로 관련된 검증 코호트 역할을 하였다. 환자 특성은 표 2에 나와 있으며 상기 디스커버리 코호트와 상기 검증 코호트간에 비교되었다. 참고로, 상기 디스커버리 코호트의 선택지를 고려할 때, 상기 디스커버리 코호트에서 위험한 간 절제술을 받은 환자 수가 상당히 많았으며, 이는 상당히 더 나쁜 ICG-클리어런스 및 감마-글루타밀 트랜스펩티다제 값과 유사했다.

Table 2: Patient Demographics
	Entire Cohort (N=72)	Evaluation Cohort (N=48)	Validation Cohort (N=24)
Parameter	Median (range) N (%)	Median (range) N (%)	Median (range) N (%)	p-value
Gender				0.721
Male	50 (69.4%)	32 (66.7%)	18 (75.0%)
Female	22 (30.6%)	16 (33.3%)	6 (25.0%)
Age(years)	66 (35-89)	65 (36-89)	66 (35-86)	0.693
Hepatic Resection				<0.001
Minor (< 3 segments)	16 (22.2%)	4 (8.3%)	12 (50.0%)
Major (≥ 3 segments)	56 (77.8%)	44 (91.7%)	12 (50.0%)
Tumor Type				0.117
CRCLM	27(37.5%)	16 (33.3%)	11 (45.8%)
HCC	22(30.6%)	16 (33.3%)	6 (25.0%)
CCC	21(29.2%)	16(33.3%)	5 (20.8%)
Other	2 (2.8%)	0 (0.0%)	2 (8.3%)
Cofactors
Neoadjuvant CTx	24 (33.3%)	16 (33.3%)	8 (33.3%)	0.904
Steatosis (%)	8 (0-100)	5 (0-40)	10 (0-100)	0.209
Steatohepatitis	16 (22.2%)	10 (20.8%)	6 (25.0%)	0.447
Fibrosis	33 (45.8%)	19 (39.5%)	14 (58.3%)	0.418
Cirrhosis	7 (9.7%)	4 (8.3%)	3 (12.5%)	0.847
Intraoperative RBC	9 (11.1%)	7 (14.6%)	1 (4.2%)	0.399
Preoperative Parameters
PDR(%)	22.1 (9.9-39.4)	20.0 (9.9-34.8)	24.0 (16.2-39.4)	0.017
R15(%)	4.0 (0.3-22.7)	5.0 (0.5-22.7)	2.6 (0.3-17.0)	0.056
Platelets(x103/μl)	234 (86-492)	236 (86-492)	228 (113-470)	0.872
SB(mg/dl)	0.58 (0.15-3.17)	0.57 (0.15-3.17)	0.64 (0.27-1.54)	0.256
PT(%)	101 (40-137)	102 (40-137)	100 (61-132)	0.201
AP(U/l)	99 (45-707)	104 (49-707)	79 (45-418)	0.053
GGT(U/l)	69 (16-1576)	32 (17-224)	48 (16-699)	0.043
AST(U/l)	30 (14-224)	33 (9-318)	27 (14-67)	0.065
ALT(U/l)	32 (9-318)	84 (18-1576)	27 (13-66)	0.164
Albumin(g/l)	42.5 (31.5-48.5)	42.6 (31.5-47.3)	42.3 (34.0-48.5)	0.848
Morbidity				0.838
No Morbidity	32 (44.4%)	21 (43.8%)	11 (45.8%)
Grade I	7 (9.7%)	4 (8.3%)	3 (12.5%)
Grade II	11 (15.3%)	7 (14.6%)	4 (16.7%)
Grade III	13 (18.1%)	9 (18.8%)	4 (16.7%)
Grade IV	4 (5.6%)	2 (4.1%)	2 (8.3%)
Grade V	5 (6.9%)	5 (10.4%)	0 (0.0%)
Liver Dysfunction ISGLS				0.102
No Liver Dysfunction	46 (63.9%)	27 (56.3%)	19 (79.2%)
ISGLS A	6 (8.3%)	5 (10.4%)	1 (4.2%)
ISGLS B	7 (9.7%)	4 (8.3%)	3 (12.5%)
ISGLS C	13 (18.1%)	12 (25.0%)	1 (4.2%)
Postoperative Stay
ICU (days)	1(0-15)	1 (0-15)	1 (0-12)	0.103
Total Hospitalization (days)	10(3-61)	11 (4-50)	9 (3-61)	0.298
CRCLM=colorectal cancer liver metastases, HCC=hepatocellular carcinoma, CCC=cholangiocellular carcinoma, CTx=chemotherapy, RBC=red blood cells, PDR=plasma disappearance rate, R15=retention rate at 15 minutes, SB=serum bilirubin, PT=prothrombin time, AP=alkaline phosphatase, GGT=gamma-glutamyl transpeptidase, AST=aspartate aminotransferase, ALT=alanine aminotransferase, ISGLS=international study group on liver surgery, ICU=intensive care unit.

수술 후 간기능 장애와 관련된 miRNA의 초기 식별을 위해, 차세대 시퀀싱을 사용하는 비편향적이고 체계적 접근 방식을 목표로 하였다. 따라서 수술 전 상기 디스커버리 코호트 내 모든 환자의 혈장내 miRNA 프로필을 분석하여 LD가 발생한 환자와 간 회복이 지연되지 않는 환자간에 miRNA 프로필이 다른지 확인하였다. 분석된 모든 혈장 샘플에서 총 554 개의 miRNA가 검출되었다. 잠재적인 바이오마커 후보를 식별하기 위해, 혈장 풍부도(평균 log2 count per million (logCPM)> 5), 효과 크기(fold change> 1.3) 및 유의 수준(p <0.2)에 대한 컷오프가 수반되었다. 도 1에 제시된 바와 같이, 19 개의 miRNA 세트가 상기 분석에 남아 있으며, 그 중 12 개는 LD 환자의 수술전 혈장에서 상향 조절(오른쪽)되었고 7 개는 하향 조절(왼쪽) 되었다.

그 후, 차세대 시퀀싱과 qPCR 기반 miRNA 검출간의 분석 가변성을 분석하고 자체 정규화 miRNA 쌍을 형성하기 위해 2 개의 miRNA 간의 상대적 로그 차이를 계산하여, 참조 miRNA의 필요성을 회피하였다. 상기 6 개의 상위 miRNA와 결과적으로 15 개의 miRNA 쌍이 이러한 분석을 위해 검토되었다. 데이터 세트(차세대 시퀀싱 대 qPCR 기반 miRNA) 간의 높은 일치성이 관찰되었다. 수술 후 부정적 결과에 대한 우수한 예측 성과를 달성하기 위해 miRNA 쌍의 중요성은 랜덤 포레스트 모델링을 사용하여 분석되었다(도 2A). 두 개의 최상위 miRNA 쌍(151a-5p/192-5p, 122-5p/151a-5p)은 LD가 발생한 개체와 대조군 사이에 유의한 수술전 차이가 확인되었다(도 2B, C). 상기 성능은 곡선밑면적(AUC)으로 설명되며 상기 분류가 무작위 할당(AUC = 0.5)에서 크게 벗어나는지 여부는 p-값으로 표시된다. ROC 분석에 의해 측정된 다변량 모델의 진단 성능은 miRNA 쌍 122-5p_151a-5p (도 2D)은 0.66, miRNA 쌍 151a-5p_192-5p (도 2E)은 0.75, 2개의 miRNA 쌍(도 2F)의 조합을 사용하는 로지스틱 회귀 모델은 0.76의 AUC로 추정되었다.

다음으로, 수술후 LD를 예측하기 위해 2개의 임상적으로 유용한 컷오프를 정의하였다. 따라서 수술 전에 최적화해야 하거나 간 절제술을 받지 않아야 할 환자를 식별하기 위하여 엄격한 컷오프 (컷오프 P> 0.68) 뿐만 아니라 매우 낮은 위험으로 간 절제술을 받을 수 있는 환자를 식별하기 위해 낮은 엄격성 컷오프(컷오프 P> 0.59)가 정의되었다. 예측된 대조군과 예측된 LD에 대한 실제 수술후 LD의 백분율은 모델 정의 컷오프 P> 0.59 및 P> 0.68에 대해 분석되었다. 둘 다 수술후 LD의 상당한 증가와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(p = 0.00045, 도 2G 및 p = 0.00054, 도 2H). 구체적으로, 확률 점수가 0.68 이상인 환자의 100 %에서 부분 간 절제 후 간기능 장애가 발생하였다. 확률 점수가 0.59 이상인 환자의 80 %만이 간기능 장애를 겪었는데, 확률 점수가 0.59 미만인 환자의 약 80 %는 간기능 장애가 발생하지 않았다. 이 결과는 Probability Score P> 0.68이 환자를 간기능 장애의 "고위험"으로 분류하기에 좋은 컷오프이고 P> 0.59의 확률 점수는 환자를 간기능 장애의 "중위험"으로 분류하기에 좋은 컷오프임을 보여준다.

실시예 2: 독립적 검증 코호트에서 발견된 miRNA 비율의 검증

상기 확인된 miRNA 비율의 임상적 유용성을 확인하기 위해, 2 개의 miRNA 쌍의 예측 성능이 수술후 LD의 30 %의 자연 발생률을 반영하여, 24 명의 환자, 즉 수술후 LD가 없는 19 명 및 수술후 LD가 있는 5 명의 환자로 구성되는 독립된 전향적 검증 코호트에서 검증되었다. 상기 miRNA 쌍 122-5p/151a-5p에 대한 도 3A 및 miRNA 쌍 151a-5p/192-5p에 대한 도 3B에 제시된 바와 같이, 이미 이 작은 샘플 사이즈 내에 있는 대조군에 비해 LD 환자에서 차별적으로 조절된 miRNA에 대한 강한 경향이 있었다. ROC 분석에 의해 측정된 다변량 모델의 진단 성능은 2 개의 miRNA 쌍에 대해 0.80의 우수한 AUC를 보여주었다 (도 3C). 또한, 상기 2개의 컷오프가 컷오프 P> 0.59 (p = 0.018 (도 3D)) 및 컷오프 P> 0.68 (p = 0.036 (도 3E))에 대한 수술후 LD를 각각 예측할 수 있다는 것이 검증되었다.

실시예 3: 발견된 miRNA 비율과 수술후 LD에 대한 다른 예측 인자의 비교

다음으로 miRNA 기반 예측 모델의 성능을 결합된 데이터 세트(N = 72)에서 평가하였다. 따라서 2 개 컷오프의 진단 성능은 민감도(SN), 특이성(SP), 양성 예측값(PPV), 음성 예측값(NPV) 및 오즈비(OR)를 사용하여 설명되었다. 상기 낮은 엄격성 컷오프(> 0.59)는 균형잡힌 PPV 및 NPV 값(각각 0.80 및 0.81)을 산출한 반면, 상기 엄격 컷오프(> 0.68)는 허용 가능한 NPV 0.74 (도 4A)와 1.0의 PPV를 나타냈는데, 양성 판정을 받은 모든 환자는 수술후 LD를 앓고 있는 반면, 음성 판정을 받은 환자의 74 %는 수술후 LD를 앓지 않았다. 반대로 음성으로 판정된 환자의 26 %는 실제로 수술후 LD를 앓고 있었다. 이상 반응에 대한 OR는 각각 15.92 (p <0.0001) 및 무한 (p <0.0001)이었다. 표준 간기능 매개변수의 성능과 비교하기 위해 microRNA 모델에 대해 ROC (수신자 조작자 특성) 곡선 분석을 수행하였다. ROC 곡선 분석은 상기 miRNA 모델에 대해 수행되었으며 표준 간기능 매개변수의 ROC 곡선과 비교되었다 (도 4B). 상기 miRNA 모델에서 AUC 0.76이 관찰되었으며, 이는 ICG 혈장 소실 및 리텐션 속도뿐만 아니라 알라닌 트랜스아미나제(ALT), 아스파테이트 트랜스아미나제(AST) 및 감마-글루타밀트랜스퍼라제(GGT)와 같은 표준 혈액 파라미터를 포함한 다른 파라미터의 AUC를 초과하였다. 마지막으로 2개의 컷오프 모델에 대해 수술 후 다른 불리한 결과에 대한 OR을 분석하였다. 심각한 이환율에 대한 OR는 두 컷오프 모두에 대한 중요성에 도달하였다 (도 4C). 심각한 이환율에 대한 OR는 두 컷오프 모두에 대한 중요성에 도달하였다 (도 4C). 사망률에 대한 OR이 낮은 엄격성 컷오프에 대해 중요한 것으로 밝혀졌고, 높은 엄격성 컷오프는 동일한 추세를 보여 주지만 유의미하지 않았다 (도 4D). 또한, 본 발명의 컷오프를 충족하는 환자는 ICU에서 훨씬 더 오래 머무르고 장기간 입원 상태를 유지하는 것으로 나타났다 (도 4E, F).

비편향적이고 체계적인 접근법으로 차세대 시퀀싱을 사용하여 간 절제 전에 환자의 혈장에서 554 개의 miRNA가 검출되었다. 그 중 3 개의 miRNA 151a-5p, 192-5p 및 122-5p로 구성된 시그니처가 확인되었으며, 간 절제 후 수술후 LD가 발생한 환자를 수술 전에 구체적으로 감지하였다. 특히, 151a-5p 대 192-5p 및 122-5p 대 151a-5p의 상기 2개의 miRNA 비율의 회귀 모델은 수술후 LD, 중증 이환율, 장기 ICU 뿐만 아니라 입원 및 심지어 수술전 사망률을 뛰어난 정확도로 참조 miRNA 필요 없이 안정적으로 예측하는 것으로 밝혀졌다. 간 절제 후 치명적일 수 있는 수술 후 임상 결과를 예측하는 임상적 관련성을 고려할 때, 본 발명에서 제시된 상기 데이터는 처음 부분 간 절제술을 받을 환자 선택을 보조하는 miRNA 기반 바이오마커의 임상적 유용성을 입증한다.

구체적으로, 간 질환의 초기 단계에서 간 기능의 임상 평가 및 정량화는 여전히 어렵다. 그러나 광범위 간 절제와 같은 특정 스트레스 요인이 작용하면 간기능이 약간 감소하더라도 주요 관련성이 될 수 있다. 여러 가지 침습적 및 비 침습적 테스트가 개발되었지만 일상적인 임상 적용에 사용되는 방법은 거의 없다. 사용 가능한 예측 변수의 주요 단점은 가용성, 높은 비용 및 침습성이다 (22). 간 정맥압구배 (HVPG)는 간세포 암종 환자 (23-25)의 수술 후 임상 결과를 예측하는데 가치가 있는 것으로 나타났지만 침습성으로 인하여 고위험 환자용으로 남아 있다. 간 기능을 평가하기 위해 덜 침습적이고 잘 확립된 다른 마커는 간의 동적 기능 평가에 의존한다. 이러한 맥락에서 여러 그룹은 ICG 제거가 수술후 LD 및 이환율을 예측하는 데 중요하다는 것을 문서화하였다 (26). 본 발명에 제시된 상기 데이터는 본 명세서에 설명된 상기 miRNA 시그니처가 진단 정확도 측면에서 ICG를 훨씬 능가한다는 것을 보여준다. 중요한 것은 ICG 클리어런스 테스트 및 대부분의 다른 간기능 평가는 miRNA 시그니처 평가와 비교할 때 상당히 비싸고 시간 소모적이라는 것이다. 또한, 이러한 환자의 정밀 의학 도구로서 혈장의 장점은 간단하고 최소 침습적이며 쉽게 접근할 수 있는 방법을 허용한다는 점이다.

종합하면 miRNA 시그니처가 확인되었으며, 이는 간 절제 후 임상 결과를 현저한 정확도로 예측하여 수술후 LD의 확립된 마커를 능가한다.

이 새로운 마커는 수술에 따른 잇점이 없거나 잠재적으로 치명적 합병증으로 고통받을 수 있는 환자를 식별할 수 있는 개선된 전략을 제공한다. 이를 통해 쉽고 효율적 비용의 비침습적 방식으로 개별 환자의 특정 위험 프로필에 맞게 수술전략을 조정할 수 있다. 이것은 간 종양이 있는 환자의 간 수술을 개인화하여 치료 효과 및 환자의 삶의 질을 높이고 의료 비용을 획기적으로 줄일 수 있는 길을 열 수 있다.

실시예 4: 수술 시점 선택을 안내하기 위하여 간 절제 후 간 기능 회복의 동적 모니터링.

간 절제 후 수술후 결과에 대한 miRNA 비율의 예측 가능성을 검증한 후, 간기능과의 연관성을 평가하기 위해 수술 후 miRNA 쌍의 동적 변화를 결정하였다. 따라서 3 개 환자 그룹의 일치된 코호트가 연구에 포함되었다: 1: 수술 후 간기능 장애가 없는 일반 간 절제술을 받은 환자 (N = 7); 2: 수술 후 간기능 장애가 있는 일반 간 절제술을 받은 환자 (N = 8); 3: 촉진된 수술 후 간 재생과 함께 ALPPS 절차를 겪고 있는 환자 (N = 8, 도 5A의 절차에 대한 세부 사항 및 하기의 설명 참조). 환자 그룹에 대한 자세한 내용은 아래 표 3에 나와 있다.

miRNA 쌍은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가되었고, miRNA 시그니처는 수술 전 및 수술 후 1 일 및 5 일에, 각각 POD1 및 POD5에, 결정되었다. 모든 환자에서, 복합된 간기능장애 확률(p)뿐만 아니라 miRNA 쌍은 간 절제 후에 비슷한 수준 (도 5B)으로 크게 변화하였으며, 대부분의 환자는 수술 후 5 일까지 일반 간기능 회복 환자와 유사하게 회복된 것으로 나타났다.

miRNA 쌍의 동적 변화 외에도, 수술 후 절대 값을 사용하여 상기 ALPPS 절차의 2 번째 단계를 위한 최적의 시점을 결정할 수 있는지 여부를 결정해야 했다. 상기 ALPPS 절차는 Schnitzbauer et al. (27) 에 의해 처음 설명되었고 선제적 완전 절제를 하기에 충분한 잔여 간을 보유하지 못하는 수술 가능의 경계에 있는 환자에서 신속한 간 재생이 가능하도록 개발되었다. 상기 절차 단계는 도 5A에 나와 있다. 간단히 설명하면, 상기 ALPPS 절차의 1 단계 동안 간을 포함하는 종양에 영양을 공급하는 문맥 가지가 선택적으로 결찰되는 반면, 동맥과 담즙 구조가 보존되고 간 실질이 수술의 초기 단계 동안 추가로 횡절단된다. 상기 절차는 며칠 내에 대규모 간 재생 촉진으로 이어진다. 이와 같은 상당한 간 재생 증폭 후에, 결찰된 나머지 간엽을 제거하기 위해 2 번째 수술 절차를 수행해야 한다 (도 5A, 2 단계 참조). 상기 절차의 가장 큰 단점은 높은 이환율과 사망률이며, 상기 절제술의 2번째 단계를 수행하기에 충분할 만한 재생 시점을 결정하는 것이 주요 논점이었다. 따라서 상기 ALPPS 절차를 받은 8 명의 환자를 대상으로 miRNA 비율의 동적 변화를 분석한 결과, 상기 1 단계 (상기 참조) 도중 및 이후에 일반적 간 절제에서와 유사한 변화를 보인 반면, 수술의 2 번째 단계 (결찰/위축성 엽 제거) 동안 miRNA 쌍은 수술직후 거의 변하지 않은 상태로 유지되는 것으로 관찰되었다 (2 단계, Pre와 POD1의 차이는 유의하지 않음, 도 5C).

궁극적으로, 도 5의 (D)는 위축성 엽 제거 후 수술후 LD 및 사망률에 따라 계층화된 ALPPS의 2 번째 단계 이전에 결합된 상기 miRNA 쌍의 예측 잠재력을 보여준다. 참고로, ALPPS 절차의 2 단계 이후에 수술후 LD가 발생한 모든 환자는 나머지 환자와 비교하여 상기 miRNA 시그니처의 명확한 변화와 그 결과 복합된 간기능 장애 확률을 나타냈다 (P = 0.054, 그림 5D). 더 중요한 것은 상기 절차의 2 단계 후에 사망한 2명의 환자 모두 2차 수술 전에 가장 높은 miRNA 비율을 보여 주었다는 것이다 (도 5D).

요약하면, 상기 그룹 (noLD, LD, ALPPS)간에 miRNA 쌍의 수술 전후 시간 경과에서 작은 차이만 관찰되었다. 따라서 수술 외상에 대한 급성 반응으로 (수술 후 1 일째) miRNA 쌍은 향후 임상개발과 관계없이, 모든 환자에서 상당히 균일하게 악화되는 것으로 보인다. 그러나 수술 후 간기능이 회복됨에 따라, 간기능 장애의 위험이 높은 환자를 제외하고는, miRNA 쌍은 수술 후 5 일까지 거의 정상화에 이르는 것으로 보인다. 상기 문맥에서 상기 ALPPS 모델의 데이터가 특히 중요하다. 간 조직의 가장 심각한 파괴가 발생하는 첫 번째 수술에서와 마찬가지로 miRNA 쌍은 크게 악화되었다. 그러나 위축성 간엽이 제거된 상기 절차의 2 단계에서는 거의 차이가 없었다 (도 5A). 이는 ALPPS의 1 단계 동안에 간기능의 현저한 초기 감소가 miRNA 쌍에 의해 반영된 반면에, 2 단계 동안에는 제한된 기능만 가진 위축성 엽이 제거되면 약간의 변화만 발생함을 시사한다.

참고로, 상기 ALPPS 모델은 본 연구의 아마도 가장 흥미롭고 임상적으로 관련된 데이터를 생성하기 위해 본 발명에서도 사용되었다. 특히, 수술 후 miRNA 쌍의 수준이 간 수술을 위한 최적의 시점을 정의할 수 있는가 하는 점이 평가되었다. miRNA 쌍의 측면에서 ALPPS의 첫 번째 단계 이후에 잘 회복되지 않은 환자는 miRNA 쌍이 기준선 수준으로 돌아가지 않았음을 의미하며, 실제로 ALPPS의 2 번째 단계 이후에는 매우 좋지 않은 환자였다. 실제로, 2 단계 이후 간기능 장애를 앓고 있는 3 명의 환자는 miRNA 쌍 값이 가장 높았고, 더 중요한 것은 "너무 작은 크기 증후군(too small for size syndrome)"으로 인해 사망한 2 명의 환자가 본 발명의 ALPPS 코호트에서 가장 높은 2 개의 값을 가졌다는 것이다.

이러한 데이터는 본 발명에 기재된 순환 miRNA의 시그니처가 간 절제를 위한 최적 시점을 결정하는 데 도움이 될 수 있음을 보여준다. 이것은 ALPPS에 국한되지 않는다. 또한 본 발명에 기재된 상기 miRNA 시그니처는 문맥 색전술/결찰 후 또는 고위험 환자에서 광범위한 수술전 화학요법 후 수술의 최적 시점을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

Table 3: Characteristics of Matched Patients in Exploratory Study
	ALPPS (N=8)	Major Liver Resection (N=7)
Parameter	Median (range) N (%)	Median (range) N (%)
Gender
Male	5 (62.5%)	5 (71.5%)
Female	3 (37.5%)	2 (28.5%)
Age(years)	61 (49-79)	60 (56-82)
Tumor Type
CRCLM	7	7
HCC	1	0
Cofactors
Neoadjuvant CTx	6 (75%)	7 (100%)
Steatosis (%)	0 (0)	7.5 (0-60)
Steatohepatitis	0 (0%)	1 (14%)
Intraoperative RBC	1 (12.5%)	2 (28.6%)
Preoperative Parameters
PDR(%)	16 (15-17)	21 (14-26)
R15(%)	9.5 (8-10)	6.4 (1.9-11.5)
SB(mg/dl)	0.6 (0.3-2)	0.5 (0.4-2.4)
AP(U/l)	112 (80-298)	102 (51-165)
GGT(U/l)	104.5 (55-399)	46 (16-75)
AST(U/l)	31.5 (25-55)	29 (18-49)
ALT(U/l)	36 (20-56)	20 (16-50)
Albumin(g/l)	29.5 (27.9-44.1)	28.4 (14.5-37.9)
CRCLM=colorectal cancer liver metastases, HCC=hepatocellular carcinoma, CTx=chemotherapy, RBC=red blood cells, PDR=plasma disappearance rate, R15=retention rate at 15 minutes, SB=serum bilirubin, PT=prothrombin time, AP=alkaline phosphatase, GGT=gamma-glutamyl transpeptidase, AST=aspartate aminotransferase, ALT=alanine aminotransferase.

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Claims (17)

1. 대상체의 간기능 장애 위험을 결정하는 in vitro 방법에 관한 것으로, 상기 간기능 장애는 부분 간 절제 후 위험에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 방법.
   a) 상기 대상체로부터의 샘플을 제공하는 단계
   b) 상기 샘플에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 결정하는 단계, 및
   i. 상기 b)의 발현 수준을 적어도 하나의 참조 발현 수준과 비교하는 단계, 또는
   ii. 상기 b)에서 결정된 발현 수준을 기준으로 miR-151a 대 miR-192 및/또는 miR-122 대 miR-151a의 비율을 확인하는 단계 및 상기 발현 수준 비율을 참조 발현 수준 비율과 비교하는 단계,
   c) 상기 단계 i) 또는 상기 단계 ii)의 결과로부터 상기 샘플을 적어도 2 개의 클래스 중의 하나로 분류하는 단계, 여기서 각 클래스는 적어도 2 개의 범주 "고위험" 및 "저위험" 중 하나이다.
2. 제 1항에 있어서, miR-151a, miR-192 및 miR-122의 상기 발현 수준이 결정되는 것인 in vitro 방법
3. 제 1항 또는 2항에 있어서, "무위험" 및 "중위험" 범주의 클래스를 더 포함하는 것인 in vitro 방법
4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 발현 수준은 건강한 대상체 또는 수술 후 간기능 장애가 없는 대상체 또는 이의 그룹의 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준인 것인 in vitro 방법
5. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 발현 수준 비율은 건강한 대상체 또는 수술 후 간기능 장애가 없는 대상체 또는 이의 그룹의 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율인 것인 in vitro 방법
6. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, "저위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받고, "중위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 전에 간 재생 자극을, "고위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제를 받지 않는 것인 in vitro 방법
7. 제 6항에 있어서, "중위험"으로 분류된 대상체는 부분 간 절제 전에 치료를 받으며, 상기 치료는 신보조 화학요법, 문맥 색전술, 단계적 간 절제술을 위한 연간 간 분할 및 정맥 결찰(ALPPS), 운동 치료 ("예비") 또는 문맥 고혈압을 감소시키는 약물 치료로 구성된 군에서 선택되는 것인 in vitro 방법
8. 제 6항에 있어서, "고위험"으로 분류된 대상체는 간이식, 완화 화학요법, 고주파 절제 또는 경동맥 화학색전술 (TACE)을 받는 것인 in vitro 방법
9. 대상체의 간 재생 자극의 재생-성공을 모니터링하는 in vitro 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함하는 방법.
   a) 상기 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계
   b) 상기 샘플에서 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율 결정하는 단계
   c) 참조 샘플에서 miR-151a 대 miR-192 및 miR-122 대 miR-151a의 발현 수준 비율을 결정하는 단계, 여기서 상기 참조 샘플은 상기 대상체의 초기 샘플이다.
   d) 상기 b)의 발현 수준 비율을 상기 c)의 발현 수준 비율과 비교하는 단계
   e) 상기 단계 d)의 비교 결과로부터 상기 대상체의 샘플을 "재생 성공" 또는 "재생 성공 없음"의 두 범주 중 하나로 분류하는 단계
10. 제 9항에 있어서, 상기 간 재생 자극은 문맥 색전술에 의한 간 비대 유도, 단계적 간 절제술을 위한 연관 간 분할 및 문맥결찰(ALPPS)에 의한 간 비대 유도, 전반적 건강 개선을 위한 운동 치료 ("예비") 및 문맥 고혈압을 감소시키는 약물 요법으로 구성된 군에서 선택되는 것인 in vitro 방법
11. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 악성 병변으로 고생하는 것이고, 바람직하게는 전이성 결장직장암, 간세포 암종 또는 담관 세포 암종에 관한 것이며, 또는 양성 간 종양, 간 낭종 및/또는 기생충 질환을 지니고 있는 것인 in vitro 방법
12. 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 특히 혈소판 부족 혈장, 림프, 소변, 타액 및 생검 프로브로 구성된 군에서 선택되는 것인 in vitro 방법
13. 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플의 발현 수준 또는 발현 수준 비율은 분류 모델을 사용하여 상기 참조 발현 수준 또는 발현 수준 비율과 비교하는 것인 in vitro 방법
14. 제 1항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 분류 모델은 상기 참조와의 비교 결과로부터 대상체의 샘플을 적어도 2 개 이상의 클래스 중 하나로 분류하는 것인 in vitro 방법
15. 제 13항 또는 14항에 있어서, 상기 분류 모델은 로지스틱 회귀 모델, 지원 벡터 머신 모델 및 의사 결정 트리 모델로 구성된 군에서 선택되는 것인 in vitro 방법
16. 제 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 수준은 시퀀싱 기반 방법, 구체적으로 차세대 시퀀싱, 어레이 기반 방법 및 PCR 기반 방법, 구체적으로 정량적 (quantitative) PCR 기반 방법으로 구성된 군에서 선택된 방법을 사용하여 결정되는 것인 in vitro 방법
17. 하기를 포함하는 부품 키트
    a) 대상체의 샘플에서 miR-151a, miR-192 및 miR-122로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 microRNA의 발현 수준을 검출할 수 있는 검출 시약,
    b) 참조 발현 수준,
    c) 상기 a)의 발현 수준을 상기 b)의 발현 수준과 비교하고 상기 대상체의 샘플을 적어도 2 개 이상의 클래스 중 하나로 분류하기 위한 분류 모델을 포함하는 소프트웨어, 여기서 각 클래스는 구체적으로 부분 간 절제 후 간기능장애의 "고위험" 및 "저위험" 범주 중 하나이다.

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