ES2899203T3 - Firmas de micro-ARN para la predicción de la disfunción hepática - Google Patents

Abstract

Un método in vitro de determinación del riesgo de disfunción hepática de un sujeto después de una resección hepática parcial comprendiendo dicho método las etapas de: a) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto antes de la resección hepática parcial, b) determinar en dicha muestra el nivel de expresión de miR-151a y miR-192, y opcionalmente de miR-122, y i. identificar las proporciones de miR-151a a miR-192, y opcionalmente de miR-122 a miR-151a, en base a los niveles de expresión determinados en b), y comparar dichas proporciones de niveles de expresión con las proporciones de niveles de expresión de referencia, o ii. comparar los niveles de expresión de miR-151a, miR-192 y miR-122 con los niveles de expresión de referencia, y c) clasificar la muestra del resultado de la etapa i) o de la etapa ii) en una de al menos dos clases, en donde cada clase es una de las al menos dos categorías de " riesgo alto " y " riesgo bajo ".

Description

DESCRIPCIÓN

Firmas de micro-ARN para la predicción de la disfunción hepática

Campo de la invención

La presente invención proporciona un método, específicamente un método in vitro, para determinar el riesgo de disfunción hepática de un sujeto, después de una resección hepática, en el que el nivel de uno o más miARN seleccionados se cuantifica en una muestra de dicho sujeto.

Antecedentes de la invención

La resección hepática representa el único tratamiento curativo en muchas neoplasias hepáticas. La regeneración hepática posterior a la resección es el principal determinante para el resultado clínico de los pacientes sometidos a resección hepática (1), ya que se demostró que la regeneración hepática insuficiente después de la resección hepática da como resultado una disfunción hepática postoperatoria (LD), que ocurre en hasta el 30% de los pacientes después de resecciones hepáticas importante (2). Es importante destacar que las opciones de tratamiento disponibles actualmente para los pacientes con LD postoperatoria son muy limitadas, en su mayoría sintomáticas y dirigidas a objetivos (2, 3). Por lo tanto, la estratificación del riesgo para la selección optimizada de pacientes antes de la cirugía hepática es clave para minimizar la incidencia de LD postoperatoria y complicaciones concomitantes. Además, identificar a los pacientes en riesgo de desarrollar disfunción hepática, no solo después de la resección hepática, así como monitorear la respuesta del paciente a los tratamientos que tienen como objetivo estimular la regeneración hepática, es esencial para brindar una atención óptima al paciente. Sin embargo, los marcadores disponibles actualmente son a menudo costosos, consumen tiempo y en ocasiones son invasivos, destacando la necesidad de una prueba fácilmente evaluable para determinar la disfunción hepática y predecir la recuperación postoperatoria de la función hepática.

La evidencia emergente sugiere que las firmas de microARN (miARN) representan potentes biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y respuesta al tratamiento para varias enfermedades (4). Como reguladores maestros de la expresión de múltiples genes en diferentes tejidos, los miARN pueden controlar prácticamente todos los procesos celulares a nivel transcripcional, incluyendo el desarrollo celular, la proliferación, la migración, la supervivencia, el metabolismo, la homeostasis y la regeneración (5). Las estimaciones basadas en análisis computacionales sugieren que más del 50% del transcriptoma humano está regulado por al menos un miARN (6). Por lo tanto, no es sorprendente que la expresión aberrante de miARN pueda tener efectos perjudiciales sobre las vías de señalización y, de hecho, se ha relacionado con una amplia gama de enfermedades (7-9). Hasta la fecha, se han identificado casi 2000 miARN y algunos ya han sido validados para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de diversas enfermedades malignas, demostrando su potencial como biomarcadores en la clínica (10-12).

Por ejemplo, los documentos WO2011/076141A1 y EP2196543A1 proporcionan biomarcadores de microARN para el diagnóstico de cáncer hepatocelular. El documento WO2012/151736A1 describe biomarcadores de microARN que pueden usarse para diagnosticar carcinoma hepatocelular o para distinguir entre carcinoma hepatocelular y hepatitis B crónica o cirrosis. El documento WO2016/036994A1, por ejemplo, utiliza perfiles de microARN en combinación con otros biomarcadores, tales como oncogenes, para el diagnóstico de cáncer de hígado.

El documento US20170166975A1 describe un kit o dispositivo para la detección de cáncer de hígado, que comprende un ácido nucleico capaz de unirse específicamente a microARN en una muestra de paciente.

El documento CN101418343A describe un kit para predecir la recaída postoperatoria del cáncer de hígado de pacientes con cáncer de hígado primario temprano.

Los micro ARN también se han descubierto como biomarcadores de enfermedades distintas de las neoplasias. El documento WO2018/231851A1, por ejemplo, describe un método para diagnosticar esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o fibrosis hepática, en donde los niveles de uno o más microARN se detectan en una muestra de paciente.

Además de los perfiles de expresión altamente específicos de tejido de algunos miARN, también ofrecen otras características beneficiosas buscadas en los biomarcadores, p. ej. los miARN son fácilmente accesibles a partir de biofluidos tales como sangre, orina y saliva a través de métodos no invasivos. Además, presentan una alta estabilidad y una complejidad relativamente baja (p. ej., sin modificaciones posteriores al procesamiento) y pueden evaluarse fácilmente mediante varios métodos con alta especificidad que también permiten la amplificación de la señal, lo que los hace superiores en comparación con otras clases de biomarcadores que incluyen ADN, ARN y proteínas.

También se han utilizado microARN para modular la traducción del ARNm diana. El documento US2016089453A1, por ejemplo, describe agentes moduladores de ARN que utilizan miR-122 como guía para modificar el ARNm en los hepatocitos.

MEGAN E. MCNALLY ET AL, HPB, vol. 15, no. 4, 1 de abril de 2013, pág. 260-264, se relaciona con la desregulación concomitante de los microARN miR-151-3p y miR-126, que se correlaciona con una mejor supervivencia en el colangiocarcinoma resecado.

A pesar de estos avances, las opciones de tratamiento, así como los marcadores predictivos fiables para determinar los pacientes con riesgo de desarrollar LD, en particular después de la cirugía, son limitadas. Por consiguiente, existe una necesidad urgente de una prueba fácilmente evaluable para predecir el riesgo de desarrollar disfunción hepática y controlar la respuesta del tratamiento a la estimulación de la regeneración hepática, específicamente porque los marcadores actuales son a menudo costosos, consumen mucho tiempo y en ocasiones son invasivos.

Sumario

El objetivo de la presente invención es proporcionar biomarcadores fiables, con alta especificidad y validez, para la predicción de disfunción hepática, después de una resección hepática parcial y para la monitorización de la función hepática, en particular tras una resección hepática parcial o estimulación de la regeneración hepática.

El problema se resuelve mediante la presente invención definida en las reivindicaciones adjuntas.

Los inventores han demostrado que los niveles de expresión de miARN específicos se alteran significativamente en pacientes que desarrollaron disfunción hepática después de una resección hepática parcial en comparación con pacientes que no desarrollaron disfunción hepática. Sorprendentemente, estos cambios en los niveles de expresión se mostraron en muestras de sangre derivadas de pacientes antes de la cirugía y, por tanto, permiten una predicción fiable del desarrollo de disfunción hepática. Además, el riesgo de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial se puede predecir con precisión incluso antes de la cirugía.

La presente invención proporciona un conjunto seleccionado de miARN que están específicamente regulados al alza o a la baja y, por tanto, son útiles como biomarcadores valiosos y representan una firma diagnóstica y predictiva aplicable a un amplio intervalo de enfermedades hepáticas.

Según la invención se proporciona un método in vitro para determinar el riesgo de disfunción hepática de un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto,

b) determinar en dicha muestra el nivel de expresión de al menos un miARN, seleccionado del grupo formado por miR-151a, miR-192 y miR-122, y

i. comparar el (los) nivel (s) de expresión de b) con al menos un nivel de expresión de referencia, o

ii. identificar las proporciones de miR-151a a miR-192 y/o de miR-122 a miR-151a en base a los niveles de expresión determinados en b), y comparar dichas proporciones de niveles de expresión con las proporciones de niveles de expresión de referencia, y

clasificar la muestra del resultado de la comparación de la etapa i) o la etapa ii) en una de al menos dos clases, en la que cada clase es una de las al menos dos categorías de "alto riesgo" y "bajo riesgo".

Específicamente, el método in vitro proporcionado en este documento permite determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar disfunción hepática. El método in vitro proporcionado en este documento permite determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial.

Específicamente, en la muestra de un paciente se determina el nivel de expresión de al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-151a, miR-192 y miR-122. Específicamente, se determina el nivel de expresión de al menos dos de miR-151a, miR-192 y miR-122. Específicamente, se determina el nivel de expresión de miR-151a y miR-192. Específicamente, se determina el nivel de expresión de miR-151a y miR-122. Específicamente, se determina el nivel de expresión de miR-192 y miR-122.

Según una realización específica, se determinan los niveles de expresión de miR-151a, miR-192 y miR-122.

Específicamente, los miARN usados en este documento se seleccionan del grupo que consiste en hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-192-5p y hsa-miR-122-5p.

Específicamente, un nivel de expresión disminuido de miR-151a es indicativo de un mayor riesgo de disfunción hepática. Específicamente, un mayor nivel de expresión de miR-122 y/o miR-192 es indicativo de un mayor riesgo de disfunción hepática.

Específicamente, en muestras prequirúrgicas de pacientes con mayor riesgo de disfunción hepática, el nivel de expresión de miR-151a está regulado a la baja. Específicamente, en muestras prequirúrgicas de pacientes con mayor riesgo de disfunción hepática, el nivel de expresión de miR-122 y/o el nivel de expresión de miR-192 está regulado positivamente. Específicamente, las muestras prequirúrgicas son muestras proporcionadas por un paciente antes de la resección hepática parcial.

Según una realización específica, el resultado de la comparación de la etapa i) o de la etapa ii) se puede clasificar en otras clases de las categorías "sin riesgo" y "riesgo medio". Específicamente, comparar los niveles de expresión de miARN o las proporciones de los niveles de expresión en la muestra de un sujeto con los niveles de expresión de miARN o las proporciones de los niveles de expresión en muestras de sujetos que no desarrollaron disfunción hepática después de una resección hepática parcial o con muestras de sujetos sanos permite la clasificación de una muestra de un sujeto en una de las categorías "sin riesgo", " riesgo bajo ", "riesgo medio" o "riesgo alto".

Específicamente, un sujeto, cuya muestra se clasifica como perteneciente a la categoría "sin riesgo", por lo tanto, no tiene riesgo o riesgo muy bajo de desarrollar disfunción hepática, en particular después de una resección hepática parcial. Preferiblemente, ningún riesgo o riesgo muy bajo se refiere a un riesgo del 25% o menos del 25% de desarrollar disfunción hepática. Un sujeto, cuya muestra se clasifica como perteneciente a la categoría de " riesgo bajo ", por lo tanto, tiene un riesgo bajo de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Preferiblemente, riesgo bajo se refiere a un riesgo de más del 25% y hasta el 50% de desarrollar disfunción hepática. Un sujeto, cuya muestra se clasifica como perteneciente a la categoría de "riesgo medio", por lo tanto, tiene un riesgo medio de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Preferiblemente, riesgo medio se refiere a un riesgo de más del 50% y hasta el 75% de desarrollar disfunción hepática. Un sujeto, cuya muestra se clasifica como perteneciente a la categoría de " riesgo alto ", por lo tanto, tiene un alto riesgo de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Preferiblemente, riesgo alto se refiere a un riesgo de más del 75% de desarrollar disfunción hepática.

Específicamente, el nivel de expresión de referencia es el nivel de expresión de al menos un miARN, seleccionado del grupo que consiste en miR-151a, miR-192 y miR-122 de un sujeto sano o un sujeto sin disfunción hepática postoperatoria o un grupo o conjunto de los mismos.

Específicamente, las proporciones de niveles de expresión de referencia son las proporciones de niveles de expresión de miR-151a a miR-192 y de miR-122 a miR-151 a de un sujeto sano o un sujeto sin disfunción hepática postoperatoria o un grupo de los mismos.

Específicamente, dicho nivel de expresión de referencia puede ser el nivel promedio de los miARN correspondientes en sujetos que no desarrollaron disfunción hepática después de una resección hepática parcial, específicamente en un conjunto de muestras derivadas de dichos sujetos, en donde una diferencia de más de una desviación estándar, específicamente por aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, específicamente aproximadamente 2 desviaciones estándar o más, es indicativo de un mayor riesgo de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Específicamente, una diferencia en el nivel de expresión de miARN o en las razones del nivel de expresión de miARN en comparación con los niveles de expresión o las razones de los niveles de expresión de los miARN correspondientes en sujetos que no desarrollaron disfunción hepática después de una resección hepática parcial en al menos 1,3 veces es indicativa de un mayor riesgo. de desarrollar disfunción hepática.

Específicamente, una diferencia de más de 1,5 desviaciones estándar, preferiblemente más de 2 desviaciones estándar, específicamente alrededor de 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 o 3 es indicativa de un riesgo alto de desarrollar disfunción hepática, específicamente después de una resección hepática parcial.

Específicamente, una diferencia de al menos una desviación estándar indica un riesgo medio de desarrollar disfunción hepática, específicamente después de una resección hepática parcial.

Específicamente, una diferencia de menos de una desviación estándar indica un riesgo bajo de desarrollar disfunción hepática, específicamente después de una resección hepática parcial.

Específicamente, los niveles de expresión de miARN o las proporciones de niveles de expresión que son comparables a los niveles de expresión de referencia correspondientes o las proporciones de niveles de expresión de referencia, específicamente qué niveles o proporciones difieren en no más de desviaciones estándar de 0,5 de los niveles de referencia o proporciones de referencia son indicativos de un riesgo muy bajo de desarrollar disfunción hepática, específicamente después de una resección hepática parcial. Por tanto, estas muestras pueden clasificarse como pertenecientes a la categoría "sin riesgo". Un sujeto cuya muestra se clasifica como perteneciente a la categoría de "sin riesgo" tiene menos probabilidades de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial que un sujeto cuya muestra se clasifica como perteneciente a la categoría de " riesgo bajo".

Está dentro de la realización de la invención usar una sola muestra de referencia de un sujeto sano o un sujeto que no desarrolló disfunción hepática después de una resección hepática parcial o un conjunto de muestras derivadas de sujetos sanos o sujetos que no desarrollaron disfunción hepática después de la resección hepáticaresección hepática parcialpara compararla con la muestra respectiva del sujeto cuyo riesgo de LD está por determinar. Dicho conjunto puede consistir en 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más muestras, específicamente hasta 10, 100 o más de 100 muestras de diferentes individuos.

Según una realización específica de la invención, los sujetos clasificados como de " riesgo bajo " se someten a una resección hepática parcial, los sujetos clasificados como de "riesgo medio" se someten a estimulación de la regeneración hepática antes de la resección hepática parcial y los sujetos clasificados como de " riesgo alto ". riesgo "no están sujetos a resección hepática parcial. Específicamente, los sujetos clasificados como "sin riesgo" también se someten a una resección hepática parcial sin estimulación previa de la regeneración hepática. Específicamente, los sujetos clasificados como de "riesgo medio" se someten a una resección hepática parcial, pero primero se les somete a un tratamiento que tiene como objetivo estimular la regeneración del hígado. Preferiblemente, después de la estimulación de la regeneración hepática, se evalúa el éxito de la regeneración y se determina el riesgo del sujeto de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial antes de que el sujeto se someta a resección hepática parcial.

Específicamente, los sujetos clasificados como de "riesgo medio" se someten a un tratamiento antes de la resección hepática parcial, cuyo tratamiento se selecciona del grupo que consiste en quimioterapia neoadyuvante, embolización de la vena porta, partición hepática asociada y ligadura de la vena porta para hepatectomía por etapas (ALPPS), intervención de ejercicio ("prehabilitación") o terapia farmacológica para reducir la hipertensión de la vena porta. Específicamente, la intervención del ejercicio y/o los cambios en la dieta pueden ayudar en la regeneración del hígado al mejorar la condición física y la salud en general. Específicamente, una opción adicional para los sujetos clasificados como de riesgo medio es una estrategia quirúrgica modificada. Preferiblemente, en dicha estrategia quirúrgica modificada, el tamaño necesario de la porción de hígado resecada se reduce mediante la combinación con la ablación térmica de los centros tumorales.

Específicamente, las firmas de miARN descritas en el presente documento se utilizan para determinar un punto de tiempo para la resección hepática parcial en el que el riesgo del paciente de desarrollar disfunción hepática postoperatoria es bajo. Específicamente, las muestras de sujetos que se clasifican como de "riesgo medio" y, por lo tanto, se someten a un tratamiento como el ALPPS antes de la resección hepática, se proporcionan en más de un momento para poder determinar un momento óptimo para la resección hepática parcial. Específicamente, se proporcionan muestras y se determina el riesgo de desarrollar disfunción hepática una vez cada dos semanas, una vez a la semana, diariamente o al menos dos veces al día. Específicamente, una vez que la muestra se clasifica como de " riesgo bajo ", el momento para la resección hepática parcial es óptimo.

Específicamente, los sujetos clasificados como de " riesgo alto " no se someten a una resección hepática parcial. Específicamente, dichos sujetos se someten en cambio a un trasplante de hígado, quimioterapia paliativa, ablación por radiofrecuencia o quimioembolización transarterial (TACE). Específicamente, dicho tratamiento se selecciona en función de la carga tumoral.

A continuación, se proporciona además un método in vitro de seguimiento de la regeneración-éxito de la estimulación de la regeneración hepática de un sujeto después de una resección hepática parcial que comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto,

b) determinar las proporciones del nivel de expresión de miR-151a a miR-192 y de miR-122 a miR-151a en dicha muestra,

c) determinar las proporciones del nivel de expresión de miR-151a a miR-192 y de miR-122 a miR-151a en una muestra de referencia, en donde la muestra de referencia es una muestra anterior del sujeto,

d) comparar las proporciones de nivel de expresión de b) con las proporciones de nivel de expresión de c), y

e) clasificar la muestra de dicho sujeto a partir del resultado de la comparación de la etapa d) en una de dos categorías, "regeneración-éxito" o "sin regeneración-éxito".

Específicamente, la estimulación de la regeneración hepática cuyo éxito de regeneración se determinará de acuerdo con el método in vitro proporcionado en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en inducción de hipertrofia hepática por embolización de la vena porta, inducción de hipertrofia hepática asociando partición hepática y ligadura de la vena porta para hepatectomía en etapas (ALPPS), intervención de ejercicio ("prehabilitación") para mejorar el estado físico general, y terapia farmacológica que reduce la hipertensión de la vena porta.

Específicamente, el sujeto padece lesiones malignas en el hígado, preferiblemente cáncer colorrectal metastásico, carcinoma hepatocelular o carcinoma colangiocelular, o tumores hepáticos benignos, quistes hepáticos y/o parásitos. Específicamente, el sujeto padece uno o más tumores, benignos o malignos, en el hígado. Los tumores pueden originarse en cualquier tejido u órgano.

Según esta descripción, la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, específicamente plasma pobre en plaquetas, linfa, orina y saliva y sondas de biopsia. Específicamente, la muestra es sangre libre de células.

Según una realización específica adicional, los niveles de expresión o las proporciones de los niveles de expresión de la muestra se comparan con los niveles de expresión de referencia o las proporciones de los niveles de expresión utilizando un modelo de clasificación.

Específicamente, un modelo de clasificación clasifica la muestra de un sujeto a partir del resultado de la comparación con la referencia en una de las al menos dos clases.

Específicamente, el modelo de clasificación se selecciona del grupo que consiste en modelos de regresión logística, modelos de máquinas de vectores de soporte y modelos de árboles de decisión.

En el presente documento se describen además valores de corte clínicamente útiles que predicen el riesgo de disfunción hepática, en particular después de una resección hepática parcial. Específicamente, un punto de corte de rigurosidad baja con una puntuación de probabilidad de menos de 0,59, específicamente menos de 0,58, 0,57, 0,56, 0,55, 0,54, 0,53, 0,52, 0,51 o 0,50 identifica sujetos con riesgo bajo de desarrollar disfunción hepática y pacientes que pueden someterse a una resección hepática parcial con riesgo bajo. Preferiblemente, una puntuación de probabilidad de menos de 0,58 (P <0,58) clasifica a un paciente como de riesgo bajo. Específicamente, un punto de corte estricto con una puntuación de probabilidad de más de 0,58, específicamente más de 0,59, 0,60, 0,61,0,62, 0,63, 0,64 o 0,65 identifica a los pacientes con riesgo medio de desarrollar disfunción hepática, dichos pacientes deben optimizarse antes de la cirugía. Preferiblemente, una puntuación de probabilidad de más de 0,58 (P> 0,58) clasifica a un paciente como de riesgo medio. Las puntuaciones de probabilidad superiores a 0,66, 0,67, 0,68, 0,69, 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74 o 0,75 identifican a los sujetos como pacientes de riesgo alto, que preferiblemente no deben someterse a una resección hepática parcial quirúrgica. Preferiblemente, una puntuación de probabilidad superior a 0,68 (P> 0,68) identifica a los sujetos con riesgo alto de desarrollar disfunción hepática.

De acuerdo con una realización específica, los niveles de expresión se determinan utilizando un método seleccionado del grupo que consiste en un método basado en secuenciación, específicamente secuenciación de próxima generación, un método basado en matriz y un método basado en PCR, específicamente un método basado en PCR cuantitativo.

Específicamente, la diferencia en los niveles de miARN se determina mediante PCR cuantitativa o digital, secuenciación de ADN/ARN, específicamente secuenciación de próxima generación, micromatrices, luminiscencia Luminex™ basados en ensayos de ácidos nucleicos u otras técnicas basadas en hibridación.

En el presente documento se describe además un kit de piezas (que no forma parte de la invención reivindicada) que comprende

a) reactivos de detección capaces de detectar el nivel de expresión de al menos un microARN, seleccionado del grupo que consiste en miR-151 a, miR-192 y miR-122, en la muestra de un sujeto,

b) niveles de expresión de referencia,

software que comprende los modelos de clasificación para la comparación de los niveles de expresión de a) con los niveles de expresión de b) y para la clasificación de la muestra del sujeto en una de al menos dos clases, en donde cada clase es una de las al menos dos categorías de " riesgo alto " y " riesgo bajo " de disfunción hepática después de una resección hepática parcial.

Figuras

Figura 1: Diferencias en los patrones de microARN prequirúrgicos en pacientes sometidos a resección hepática. Gráfico de volcán de microARN regulados diferencialmente en plasma prequirúrgico de pacientes con disfunción hepática. Para identificar los puntos de corte de los candidatos a biomarcadores para la concentración plasmática (log2 de cuentas por millón promedio (logCPM)> 5), se implicó el tamaño del efecto (cambio de veces > 1,3) y el nivel de significación (p bruto < 0,2). Se identificó un conjunto de 19 microARN, de los cuales 12 estaban regulados al alza (rojo) y 7 regulados a la baja (azul).

Figura 2: Análisis del rendimiento diagnóstico de pares de miARN para predecir disfunción hepática. (A) Importancia de los pares de miARN en un modelo de clasificación de bosque aleatorio (los más importantes están en la parte superior con la mayor precisión de disminución media). (B) Distribución de las proporciones medidas por qPCR en la cohorte de descubrimiento para miR151a-5p_192-5p (diagramas de caja y valores p de la prueba de suma de intervalos de Wilcoxon de dos lados) y (C) para miR122-5p_151a-5p. (D) Curvas ROC para un modelo de regresión logística que incluye miR122-5p_151a-5p en la cohorte de descubrimiento (los resultados de la validación cruzada de dejar uno fuera están en gris) y (E) un modelo de regresión logística que incluye miR151 -5p_192-5p, y (F) un modelo de regresión logística que incluye ambos pares de miARN. (G, H) El rendimiento se describe mediante el área bajo la curva (AUC) y si la clasificación se desvía significativamente de la asignación aleatoria (AUC = 0,5) se indica mediante el p valor. El porcentaje de LD postoperatorio verdadero en los controles predichos y LD pronosticados se analizaron para ambos puntos de corte definidos por el modelo P > 0,59 y P > 0,68.

Figura 3: El rendimiento predictivo de las dos principales proporciones de miARN se validó en un estudio independiente de LD postoperatorio. Los miARN se analizaron mediante RT-qPCR en 24 sujetos de los cuales 5 (16,7%) experimentaron el resultado adverso después de la cirugía. Se observó en plasma la regulación preoperatoria de los pares de miARN 122-5p/151a-5p (A) y 151a-5p/192-5p (B). (C) El rendimiento predictivo de los modelos de predicción logística multivariante previamente definidos se validó mediante análisis ROC. El rendimiento se describe mediante el área bajo la curva (AUC) y si la clasificación se desvía significativamente de la asignación aleatoria (AUC = 0,5) se indica mediante el p valor. El porcentaje de LD postoperatorio verdadero en los controles predichos y LD predichos se analizaron para ambos puntos de corte definidos por el modelo P > 0,59 y P > 0,68 (D, E).

Figura 4: Evaluación del rendimiento del modelo de microARN sobre la base del conjunto de datos completo. Se analizaron dos puntos de corte (bajo rigor, P = 0,59; y alto rigor, P = 0,68) para el resultado del modelo de regresión logística para determinar su rendimiento para predecir la disfunción hepática postoperatoria. El rendimiento se describió usando la sensibilidad (SN), la especificidad (SP), el p valor predictivo positivo (PPV), el p valor predictivo negativo (NPV) y la razón de probabilidades (OR), que es la razón de probabilidades de sufrir disfunción hepática postoperatoria asociada con un resultado de prueba positivo en comparación con un resultado de prueba negativo. El punto de corte de bajo rigor (P = 0,59) arrojó valores de PPV y NPV equilibrados (0,80 y 0,81, respectivamente), mientras que el punto de corte riguroso (P = 0,68) dio como resultado un PPV perfecto de 1,0, con un VAN aceptable de 0,74 (A). Esto significa que el 100% de los pacientes que dieron positivo sufrieron de LD postoperatoria, mientras que el 74% de los que dieron negativo no sufrió LD postoperatoria. Viceversa, el 26% de los que dieron negativo en la prueba sufrieron de hecho de LD postoperatoria (ver panel A). Las OR para un evento adverso fueron 15,92 (p < 0,0001) e infinitas (p < 0,0001), respectivamente. Se realizó un análisis de la curva de características del operador del receptor (ROC) para el modelo de microARN para comparar su rendimiento con el de los parámetros de función hepática estándar (B). Se analizaron los OR para otros resultados postoperatorios adversos para ambos puntos de corte del modelo: morbilidad grave (C) y mortalidad (D). La estancia postoperatoria en la UCI (E,) y la hospitalización (F) se prolongaron significativamente en nuestros grupos de riesgo previstos (los diagramas de caja se muestran sin valores atípicos; valores p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados). ALT, alanina transaminasa; AST, aspartato transaminasa; GGT, gamma-glutamiltransferasa: ICG-PDR, velocidad de desaparición del plasma con verde de indocianina (ICG); ICG R15, tasa de retención de ICG a los 15 min, UCI, unidad de cuidados intensivos.

Figura 5: Los pares de miARN siguen la recuperación de la función hepática después de una hepatectomía parcial y predicen la LD postoperatoria después de la segunda etapa de ALPPS. (A) ilustra el diseño del estudio de este estudio exploratorio adicional, así como resume el algoritmo de procedimiento de ALPPS. El procedimiento ALPPS fue descrito por primera vez por Schnitzbauer et al. y se ha desarrollado para permitir una rápida regeneración del hígado en pacientes en el límite de la resección con un remanente hepático insuficiente. Brevemente, durante la primera etapa del procedimiento de ALPPS, la rama de la vena porta, que alimenta el lóbulo hepático portador del tumor, se liga selectivamente, mientras que las estructuras arteriales y biliares se conservan y el parénquima hepático se secciona adicionalmente durante esta etapa inicial de la cirugía. Este procedimiento conduce a una mejor regeneración del hígado en el plazo de días. Aun así, después de esta ganancia sustancial de regeneración hepática, debe realizarse un segundo procedimiento quirúrgico en el que es necesario extirpar los lóbulos hepáticos restantes ligados. Se evaluó la dinámica perioperatoria de los miARN en un grupo de 7 pacientes con hepatectomía parcial regular y 8 pacientes con ALPPS (los detalles se enumeran en la tabla 3) para los cuales se pudo realizar la medición longitudinal de los miARN sobre la base de muestras de plasma recolectadas repetidamente. Los puntos de tiempo de la recolección de sangre se dan en (A). La dinámica perioperatoria de los pares de miARN, así como los pares combinados, se ilustran en (B). Como durante la segunda etapa de ALPPS solo se elimina el lóbulo hepático atrófico, los pares de miARN se analizaron adicionalmente después de la segunda etapa de ALPPS como se ilustra en (C), mostrando un aumento casi desaparecido en las proporciones de miARN después de esta segunda operación. En última instancia, (D) ilustra el potencial predictivo de los pares de miARN combinados antes de la segunda etapa de ALLPS como se estratifica según la LD postoperatoria y la mortalidad después de la eliminación del lóbulo atrófico. * P <0,05, ** P <0,005.

Descripción detallada

La disfunción hepática (LD) postoperatoria como resultado de una regeneración hepática insuficiente ocurre en hasta el 30% de los pacientes sometidos a resección hepática mayor, lo que aumenta concomitantemente la morbilidad y la mortalidad del paciente. Aún así, las opciones de tratamiento, así como los biomarcadores predictivos confiables para determinar los pacientes con riesgo de desarrollar LD después de la cirugía, son limitadas. Por consiguiente, existe una necesidad urgente de una prueba preoperatoria fácilmente evaluable para predecir la recuperación postoperatoria de la función hepática, específicamente porque los marcadores actuales son a menudo costosos, consumen mucho tiempo y en ocasiones son invasivos. Las firmas de microARN (miARN) representan potentes biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y respuesta al tratamiento para varias enfermedades.

Los microARN circulantes en sangre libre de células, como el suero o el plasma, son una fuente mínima o no invasiva de biomarcadores que permiten una detección mínimamente invasiva y, por lo tanto, una amplia aplicabilidad en clínicas y depósitos de investigación.

El término "muestra" generalmente se refiere a una muestra de tejido u órgano, sangre, sangre libre de células como suero y plasma, plasma pobre en plaquetas, linfa, orina, saliva y sondas de biopsia. Preferiblemente, la muestra es una muestra de plasma.

Según una realización específica, la muestra utilizada aquí es plasma pobre en plaquetas, que se ha sometido a dos etapas de centrifugación durante el proceso de recogida. Específicamente, la primera etapa de centrifugación se realiza a una velocidad más baja, por ejemplo alrededor de 1,000 g de fuerza (g), mientras que la segunda etapa de centrifugación se realiza a alta velocidad, por ejemplo alrededor de 10,000 g. Tal centrifugación ayuda a asegurar la eliminación completa de plaquetas y vesículas extracelulares más grandes, como cuerpos apoptóticos, que podrían interferir con la medición de microARN. El tipo preferido de anticoagulante que se usa para prevenir la activación plaquetaria es CTAD (citrato de sodio, teofilina, adenosina, dipiridamol). Específicamente, se puede usar CTAD, citrato de sodio o EDTA de potasio (K2-EDTA) para prevenir la activación plaquetaria.

Específicamente, el plasma pobre en plaquetas está esencialmente libre de plaquetas y vesículas extracelulares medianas y grandes, que sedimentan a velocidades de centrifugación por debajo de 20,000 g.

El término "libre de células", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra que carece de células en una extensión de aproximadamente el 90%.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" o "individuo" o "paciente" se referirá a un mamífero de sangre caliente, en particular a un ser humano.

El término "paciente" incluye seres humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico o se les diagnostica una enfermedad específica, como, pero sin limitarse a, cáncer hepático o cáncer colorrectal metastásico.

Por tanto, el término "tratamiento" pretende incluir tanto el tratamiento profiláctico como el terapéutico.

Como se usa en el presente documento, el término "cohorte de individuos" o "conjunto de individuos" se referirá a un grupo de individuos sanos y puede referirse específicamente a las muestras recibidas de dichos individuos. El número de individuos de una cohorte puede variar, es decir, puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más individuos, sin embargo, también puede ser un grupo más grande de sujetos, como por ejemplo, pero no limitado a al menos 10, 25, 50, 100 o más personas. Según la realización de la invención, la cohorte también puede comprender grandes cohortes de 500 o más individuos.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" abarca los valores citados explícitamente, así como pequeñas desviaciones de los mismos. Por consiguiente, el término "aproximadamente" engloba una desviación del valor citado del 10%, preferiblemente del 5%, preferiblemente del 1%.

El término "firma de microARN" se refiere a perfiles de expresión de microARN específicos que representan biomarcadores de respuesta al tratamiento, pronóstico y diagnóstico potentes y sólidos. Como se usa en este documento, el término "firma de microARN" o "firma de miARN" se refiere a diferencias en el perfil de expresión de miARN circulantes entre pacientes con y sin disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Específicamente, la firma de miARN descrita en este documento comprende al menos uno de los microARN miR-151a, miR-122 y miR-192.

El término " método in vitro "como se usa en el presente documento se refiere a métodos realizados fuera de un organismo vivo. Específicamente, se refiere a métodos realizados en muestras tales como tejidos, órganos o células aislados, preferiblemente sangre, incluso más preferiblemente plasma. Por tanto, dicho método in vitro, no se realiza en el organismo vivo; particularmente no se realiza en humanos.

El término "disfunción del hígado", utilizado como sinónimo de "LD" o "disfunción hepática", se refiere a un mal funcionamiento del hígado, que puede manifestarse como una alteración celular subclínica aguda o crónica, pero que puede progresar a insuficiencia hepática potencialmente mortal con compromiso de múltiples órganos y sistemas. La morbilidad y la mortalidad perioperatorias pueden ser importantes; La función hepática (homeostasis de la glucosa, síntesis de proteínas y procoagulantes, metabolismo de la bilirrubina y biotransformación de fármacos y toxinas endógenas) puede verse afectada. El grado de deterioro y la gravedad de la afectación extrahepática pueden variar. Se demostró que la regeneración hepática insuficiente después de la resección hepática da como resultado una LD postoperatoria, que ocurre en hasta el 30% de los pacientes después de resecciones hepáticas importantes. Por lo tanto, la estratificación del riesgo para la selección optimizada de pacientes antes de la cirugía hepática es clave para minimizar la incidencia de LD postoperatoria y complicaciones concomitantes. Los sujetos identificados con un aumento de la LD postoperatoria pueden someterse a tratamientos que ayuden a la regeneración del hígado antes de la cirugía o su cuidado postoperatorio puede ajustarse para hacer frente al mayor riesgo de LD. El ajuste de los cuidados postoperatorios puede significar, por ejemplo, una estancia más prolongada en la unidad de cuidados intensivos para permitir una estrecha supervisión de la función hepática de los sujetos.

El término "resección hepática parcial" o "hepatectomía parcial" se refiere a la extirpación quirúrgica de una parte del hígado. La mayoría de las hepatectomías se realizan para el tratamiento de neoplasias hepáticas, benignas o malignas. Las neoplasias benignas incluyen adenoma hepatocelular, hemangioma hepático e hiperplasia nodular focal. Las neoplasias malignas (cánceres) de hígado más comunes son las metástasis; los que surgen del cáncer colorrectal se encuentran entre los más comunes y los más susceptibles de resección quirúrgica. El tumor maligno primario más común del hígado es el carcinoma hepatocelular. La hepatectomía también puede ser el procedimiento de elección para tratar los cálculos biliares intrahepáticos y los quistes hepáticos o parasitarios del hígado.

El cáncer de hígado primario, también conocido como cáncer de hígado y cáncer de hígado primario, es un cáncer que comienza en el hígado. El cáncer que se ha diseminado desde otra parte al hígado, conocido como metástasis hepática o cáncer de hígado secundario, es más común que el que se origina en el hígado. El término "lesiones malignas en el hígado", como se usa en el presente documento, se refiere tanto al cáncer de hígado primario como al secundario. El cáncer de hígado más frecuente, que representa aproximadamente el 75% de todos los cánceres de hígado primarios, es el carcinoma hepatocelular (HCC) (también llamado hepatoma, que es un nombre inapropiado porque los adenomas suelen ser benignos). El HCC es un cáncer formado por células hepáticas, conocidas como hepatocitos, que se vuelven malignas. Otro tipo de cáncer formado por células hepáticas es el hepatoblastoma, que está formado específicamente por células hepáticas inmaduras. Es un tumor maligno poco común que se desarrolla principalmente en niños y representa aproximadamente el 1% de todos los cánceres en niños y el 79% de todos los cánceres de hígado primarios menores de 15 años. La mayoría de los hepatoblastomas se forman en el lóbulo derecho. El cáncer de hígado también se puede formar a partir de otras estructuras dentro del hígado, como el conducto biliar, los vasos sanguíneos y las células inmunitarias. El cáncer de las vías biliares (colangiocarcinoma y cistadenocarcinoma colangiocelular) representa aproximadamente el 6% de los cánceres hepáticos primarios. También existe un tipo de variante de HCC que consiste tanto en HCC como en colangiocarcinoma. Los tumores de los vasos sanguíneos (angiosarcoma y hemangioendotelioma, sarcoma embrionario y fibrosarcoma se producen a partir de un tipo de tejido conectivo conocido como mesénquima. Los cánceres producidos a partir de los músculos del hígado son el leiomiosarcoma y el rabdomiosarcoma. Otros cánceres de hígado menos comunes incluyen carcinosarcomas, teratomas, saco vitelino). tumores, tumores carcinoides y linfomas. Los linfomas suelen tener infiltración difusa en el hígado, pero también pueden formar una masa hepática en raras ocasiones.

Muchos cánceres que se encuentran en el hígado no son verdaderos cánceres de hígado, sino cánceres de otros sitios del cuerpo que se han diseminado al hígado (cáncer de hígado secundario). Con frecuencia, el sitio de origen es el tracto gastrointestinal, ya que el hígado está cerca de muchos de estos órganos ricos en sangre y metabólicamente activos cerca de los vasos sanguíneos y los ganglios linfáticos (tal como el cáncer de páncreas, el cáncer de estómago, el cáncer de colon y los tumores carcinoides principalmente del apéndice). El cáncer de hígado secundario también puede originarse en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de próstata.

La principal causa de cáncer de hígado es la cirrosis por hepatitis B, hepatitis C o alcohol. Otras causas incluyen aflatoxinas, enfermedad del hígado graso no alcohólico y trematodos hepáticos. Los tipos más comunes son el carcinoma hepatocelular (HCC), que representa el 80% de los casos, y el colangiocarcinoma. Los tipos menos comunes incluyen la neoplasia quística mucinosa y la neoplasia biliar papilar intraductal.

De acuerdo con el método proporcionado en el presente documento, se puede seleccionar la estrategia de tratamiento de pacientes que padecen lesiones hepáticas. Los sujetos cuya muestra se clasifica en la categoría sin riesgo o de bajo riesgo son buenos candidatos para la resección hepática parcial, ya que su riesgo de desarrollar disfunción hepática después de la resección hepática parcial es bajo. Dichos sujetos pueden someterse a una resección hepática parcial directamente después de la evaluación del riesgo de LD o someterse a estimulación de la regeneración del hígado antes de la resección hepática parcial.

Específicamente, los sujetos cuya muestra se clasifica como de riesgo medio o alto no se someten a una resección hepática parcial directamente después de la evaluación del riesgo de LD. Preferiblemente, los sujetos clasificados como de riesgo medio se someten a terapia, quirúrgica o farmacológica u otra, que ayuda a la regeneración del hígado. Dicha terapia puede ser quimioterapia neoadyuvante, embolización de la vena porta, asociación de partición hepática y ligadura de la vena porta para hepatectomía por etapas (ALPPS), intervención con ejercicio ("prehabilitación") o terapia farmacológica que reduce la hipertensión de la vena porta. Específicamente, el éxito de la regeneración de dicha terapia se puede controlar mediante el método proporcionado en el presente documento.

Preferiblemente, los sujetos cuya muestra se clasifica como perteneciente a la categoría de riesgo alto no se someten a una resección hepática parcial. Preferiblemente, los sujetos de riesgo alto se someten a trasplante de hígado, quimioterapia paliativa, ablación por radiofrecuencia o quimioembolización transarterial (TACE).

Específicamente, el riesgo de un sujeto de desarrollar disfunción hepática, en particular después de una resección hepática parcial, puede evaluarse repetidamente de acuerdo con el método proporcionado en el presente documento.

El término "éxito de la regeneración", como se usa en el presente documento, se define como la mejora de la función hepática y la disminución del riesgo de disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Por tanto, un marcador que monitorice la regeneración hepática debería estar relacionado preferentemente con el resultado clínico de un paciente, es decir, la reducción del riesgo de disfunción hepática. El éxito de la regeneración moderada reduce el riesgo de disfunción hepática en aproximadamente un 25% hasta aproximadamente un 50%. El alto éxito de la regeneración da como resultado una reducción del riesgo de más del 50%. Ninguna reducción en el riesgo de desarrollar disfunción hepática y/o ninguna mejora de la función hepática es indicativo de que no hay éxito en la regeneración. Específicamente, la función hepática se puede evaluar usando pruebas de función hepática conocidas en la técnica, tal como por ejemplo pruebas que detectan el tiempo de protrombina (PT/INR), aPTT, albúmina y bilirrubina (directa e indirecta).

Específicamente, el éxito de la regeneración es monitoreado por un método in vitro que comprende las etapas secuenciales de:

a) proporcionar una muestra de dicho sujeto,

b) determinar las proporciones del nivel de expresión de miR-151a a miR-192 y de miR-122 a miR-151a en dicha muestra,

c) determinar las proporciones del nivel de expresión de miR-151a a miR-192 y de miR-122 a miR-151a en una muestra de referencia, en la que la muestra de referencia es una muestra anterior del sujeto,

d) comparar las proporciones de nivel de expresión de b) con las proporciones de nivel de expresión de c), y

e) clasificar la muestra de dicho sujeto a partir del resultado de la comparación del paso d) en una de dos categorías, "regeneración-éxito" o "sin regeneración-éxito", como se define en la invención reivindicada.

La presente divulgación se refiere a miARN seleccionados para su uso en un método para la predicción de disfunción hepática después de una resección hepática parcial y para la monitorización de la función hepática tras una resección hepática parcial o estimulación de la regeneración hepática o para monitorizar el tratamiento en sujetos sometidos a terapia, específicamente el tratamiento para reducir la carga tumoral hepática.

Específicamente, dichos miARN son miR-151a, miR-122 y/o miR-192 o isoformas o variantes de los mismos. Preferiblemente, dichos miARN son hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-122-5p y/o hsa-miR-192-5p o isoformas o variantes de los mismos.

La detección de un aumento o disminución del nivel de uno o más de dichos miARN en comparación con el nivel en sujetos sin disfunción hepática puede usarse para predecir el riesgo de desarrollar disfunción hepática en un sujeto.

Específicamente, medir una disminución en el nivel de hsa-miR-151a-5p, o isoformas o variantes de las mismas, y/o un aumento en el nivel de hsa-miR-192-5p o hsa-miR-122-5p, o isoformas o variantes de los mismos, puede ser un indicador específico de un mayor riesgo de desarrollar disfunción hepática. Dicho aumento o disminución de miARN se basa específicamente en datos derivados de niveles sanguíneos o séricos en sujetos que desarrollaron disfunción hepática después de una resección hepática parcial.

En el presente documento se describen además valores de corte clínicamente útiles que predicen el riesgo de disfunción hepática, en particular después de una resección hepática parcial. Específicamente, un punto de corte de rigurosidad baja con una puntuación de probabilidad de menos de 0,59, específicamente menos de 0,58, 0,57, 0,56, 0,55, 0,54, 0,53, 0,52, 0,51 o 0,50 identifica sujetos con riesgo bajo de desarrollar disfunción hepática y pacientes que pueden someterse a una resección hepática parcial con bajo riesgo. Preferiblemente, una puntuación de probabilidad de menos de 0,58 (P <0,58) clasifica a un paciente como de riesgo bajo. Específicamente, un punto de corte estricto con una puntuación de probabilidad de más de 0,58, específicamente más de 0,59, 0,60, 0,61,0,62, 0,63, 0,64 o 0,65 identifica a los pacientes con riesgo medio de desarrollar disfunción hepática, dichos pacientes deben optimizarse antes de la cirugía. Preferiblemente, una puntuación de probabilidad de más de 0,58 (P> 0,58) clasifica a un paciente como de riesgo medio. Las puntuaciones de probabilidad superiores a 0,66, 0,67, 0,68, 0,69, 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74 o 0,75 identifican a los sujetos como pacientes de alto riesgo, que preferiblemente no deben someterse a una resección hepática parcial quirúrgica. Preferiblemente, una puntuación de probabilidad superior a 0,68 (P> 0,68) identifica a los sujetos con riesgo alto de desarrollar disfunción hepática.

Sorprendentemente, utilizando el método descrito en el presente documento, el 100% de los pacientes con una puntuación de probabilidad superior a 0,68 desarrollaron disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Mientras que solo el 80% de los pacientes con una puntuación de probabilidad superior a 0,59 desarrollaron disfunción hepática y alrededor del 80% de los sujetos con una puntuación de probabilidad inferior a 0,59 no desarrollaron disfunción hepática.

Específicamente, se puede determinar un mayor riesgo de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial midiendo las proporciones de los niveles de expresión entre pares de micro ARN seleccionados del grupo que consiste en miR-151a, miR-122 y miR-192. Específicamente, para un par de microARN (miR1, miR2), las proporciones de log² de valores de expresión log² (miR1/miR2) se calcularon por diferencia en sus valores de Cq (ACq = CqmiR²-CqmiR¹). Específicamente, para comparar los resultados de los pares de microARN de los análisis de NGS (log2 cambio veces) con los resultados de los análisis de qPCR (ACq), se pueden realizar análisis de regresión lineal. Específicamente, la asociación lineal se puede probar mediante una prueba de Wald de dos lados para el coeficiente respectivo y se puede calcular el coeficiente de determinación. La distribución y las diferencias de los valores de ACq entre la muestra del sujeto y la muestra de referencia se pueden probar utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados.

Específicamente, para la clasificación de la muestra de un sujeto en una de las categorías sin riesgo, riesgo bajo, riesgo medio y riesgo alto o regeneración-éxito y sin regeneración-éxito, cada uno de los dos pares de micro ARN se incluye en una variable univariante y modelo de regresión logística multivariante. Específicamente, se puede aplicar una estrategia de validación cruzada de dejar uno fuera y, si se aplica, evaluar mediante un análisis de características operativas del receptor (ROC).

Específicamente, para identificar puntos de corte de clasificación óptimos (clínicamente relevantes), tablas de contingencia (TP, FP; FN, TN) y parámetros asociados como sensibilidad (SN), especificidad (SP), valor de predicción positivo (PPV), valor de predicción negativo (NPV), la precisión (ACC), la puntuación F1 (F1) y el coeficiente de correlación de Matthews (MCC) se pueden utilizar. Los puntos de corte se pueden calcular en función del modelo de regresión logística multivariante que incluye los 2 pares de micro ARN. Preferiblemente, se utilizan los límites máximos de MCC y PPV = 1 (falsos positivos FP = 0).

Como se usa en el presente documento, el término "microARN" o "miARN" o "miR" designa una molécula de ARN no codificante de entre 17 y 25 nucleótidos que hibrida y regula la expresión de un ARN mensajero codificante. El término "molécula de miARN" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que represente el miARN, incluidas las moléculas de miARN naturales, es decir, miARN maduro, pre-miARN, pri-miARN.

"Precursor de miR", "pre-miARN" o "pre-miR" designa un ARN no codificante que tiene una estructura de horquilla, que contiene un miARN. Un pre-miARN es el producto de la escisión de una transcripción de mi-RNA primaria, o "primiR" por la ribonucleasa específica de RNA de doble hebra conocida como Drosha. Los precursores pueden ser formas de los respectivos polinucleótidos a medida que se producen durante la maduración de los respectivos polinucleótidos. Específicamente, los ejemplos de dichos precursores se enumeran en la Tabla 1, específicamente son de SEQ ID Nos. 4 a 6.

Tabla 1: SEQ ID de miARN

Las secuencias de nucleótidos de miARN maduros (SEQ ID Nos 1 a 3) y sus respectivos precursores se conocen en la técnica y están disponibles en la base de datos miRBase en mirbase.org/index.shtml o en la base de datos Sanger en microrna.sanger.ac.uk/sequences /ftp.shtml. Las secuencias de nucleótidos también se describen específicamente en la tabla 1, incluida la referencia al número de acceso de miRBase respectivo.

Polinucleótidos idénticos como se usan aquí en el contexto de un polinucleótido a detectar en el contexto de la presente invención pueden tener una secuencia de ácido nucleico con una identidad de al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% con un polinucleótido que comprende o que consta de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID Nos.

1 a 3. Específicamente, las secuencias de polinucleótidos idénticos difieren de las secuencias de la tabla 1 en no más de 1, 2 o 3 nucleótidos.

Además, los polinucleótidos idénticos a los que se utilizan en el presenta documento en el contexto de un polinucleótido a detectar en el contexto de la presente invención pueden tener una secuencia de ácido nucleico con una identidad de al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% a un polinucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID Nos. 4 a 6 que incluyen uno, dos, tres o más nucleótidos de la secuencia de pre-miARN correspondiente en el extremo 5 'y/o el extremo 3' de la respectiva secuencia de semillas.

A los efectos de la divulgación, las "¡soformas y variantes" (que también se denominan "isomiR") de un miARN de referencia incluyen variantes de recorte (variantes de recorte 5 'en las que el sitio de corte 5' está aguas arriba o aguas abajo de la secuencia de miARN de referencia; Variantes de recorte 3 ': el sitio de corte 3' está aguas arriba o aguas abajo de la secuencia de miARN de referencia), o variantes que tienen una o más modificaciones de nucleótidos (adición de nucleótidos 3 'al extremo 3' del miARN de referencia; sustitución de nucleótidos cambiando nucleótidos del precursor de miARN), o la hebra de microARN madura complementaria que incluye sus isoformas y variantes (por ejemplo, para un microARN maduro 5 'dado, el microARN maduro complementario 3' y viceversa). Con respecto a la modificación de nucleótidos, los nucleótidos relevantes para la unión de ARN/ARN, es decir, la región semilla 5 'y los nucleótidos en el lado de escisión/anclaje, están exentos de modificación.

Como se usa en el presente documento, si no se indica lo contrario, el término "miARN" abarca las cadenas 3p y 5p y también sus isoformas y variantes.

Específicamente, el término "miR-número-respectivo-5p" como se usa en la presente memoria descriptiva también abarca su miARN 3p complementario y viceversa.

En realizaciones específicas, los miARN de interés se detectan usando un nucleótido que hibrida, preferiblemente en condiciones rigurosas, con dicho miARN de interés y midiendo la señal de hibridación.

En una realización preferida, el nivel de miARN de interés se determina mediante secuenciación de próxima generación. El término "secuenciación de próxima generación" (NGS), también conocida como secuenciación de alto rendimiento, se utiliza en el presente documento para describir una serie de diferentes tecnologías modernas de secuenciación que permiten secuenciar y cuantificar los niveles de ADN y ARN de manera mucho más rápida y económica que los métodos de secuenciación utilizados anteriormente, tal como la secuenciación de Sanger. Se basa en micro y nanotecnologías para reducir el tamaño de la muestra, los costes de los reactivos y permitir reacciones de secuenciación masivamente paralelas. Puede ser altamente multiplexado, lo que permite la secuenciación y el análisis simultáneos de millones de muestras. NGS incluye tecnologías de secuenciación de primera, segunda, tercera y posteriores generaciones. Ejemplos no limitativos son las tecnologías de nanoporos o semiconductores (por ejemplo, Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido) o la plataforma Illumina smallRNA-Seq (Luo S., 2012, Methods Mol Biol.

822: 183-8) o métodos basados en la detección de electrones como Ion Torrent de Thermo Fisher.

Específicamente, NGS se refiere a una tecnología de secuenciación de alto rendimiento que realiza miles o millones de reacciones de secuenciación en paralelo. Aunque las diferentes plataformas NGS utilizan diferentes químicas de ensayo, todas generan datos de secuencia a partir de un gran número de reacciones de secuenciación que se ejecutan simultáneamente en un gran número de moldes, donde el número de secuencias derivadas de un ADN o ARN específico, específicamente miARN, se correlaciona con el Nivel de ARN en una muestra biológica. Típicamente, los datos de la secuencia se recopilan mediante un escáner y luego se ensamblan y analizan bioinformáticamente. Así, las reacciones de secuenciación se realizan, leen, ensamblan y analizan en paralelo; ver, p. ej. Behjati S y Tarpey, P., 2013 (Arch.Di Child Educ Pract Ed 2013, 98, 236-238); Head S. et al., 2015 (Biotechniques, 56 (2), 61-passim).

Algunos métodos NGS requieren amplificación de plantilla y otros no. Los métodos que requieren amplificación incluyen pirosecuenciación (p. ej., Pat. EE.UU. No. 6,258,568; comercializado por Roche); la plataforma Solexa/lllumina (p. ej., Pat. EE.UU. Nos. 6,833,246, 7,115,400, y 6,969,488); y la plataforma de detección y ligadura de oligonucleótidos compatibles (SOLiD) (Applied Biosystems; p. ej., Pat. EE.UU. Nos. 5,912,148 y 6,130,073). Los métodos que no requieren amplificación, p. ej., métodos de secuenciación de una sola molécula, incluyen secuenciación de nanoporos, HeliScope (Pat. ^{E E . U u .} Nos. 7,169,560; 7,282,337; 7,482,120; 7,501,245; 6,818,395; 6,911,345; y 7,501,245); secuenciación en tiempo real por síntesis (ver, p. ej.o, U.S. Pat. No. 7,329,492); métodos de secuenciación de ADN en tiempo real de una sola molécula (SMRT) que utilizan guías de onda de modo cero (ZMW); y otros métodos, incluyendo aquellos descritos en Pat. EE.UU. Nos. 7,170,050; 7,302,146; 7,313,308; y 7,476,503, US 20130274147; US20140038831; y Metzker, Nat Rev Genet 11 (1): 31-46 (2010).). Alternativamente, también se pueden usar métodos de secuencia basados en hibridación u otros métodos de alto rendimiento, p. ej., análisis de micromatrices, NANOSTRING, ILLUMINA u otras plataformas de secuenciación.

Específicamente, se pueden generar pequeñas bibliotecas de secuenciación de ARN usando kits de preparación de bibliotecas bien conocidos en la técnica, tales como el kit de preparación de bibliotecas CleanTag SmallRNA (TriLink, EE. UU.). Normalmente, el ARN se transcribe primero en sentido inverso en ADN seguido de amplificación por PCR. La amplificación por PCR se puede realizar utilizando cebadores con código de barras, como los cebadores con código de barras de Illumina para la secuenciación de ARN pequeño. Antes de la secuenciación, los productos de PCR se purifican usando protocolos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los productos de PCR se pueden purificar utilizando el protocolo QiaQuick de Qiagen y posteriormente se pueden comprobar el tamaño mediante métodos adecuados, tal como p. ej. electroforesis capilar.

Específicamente, la secuenciación de próxima generación se puede realizar en cualquier plataforma adecuada, como p. ej. IlluminaNextSeq 500. Las lecturas de secuenciación normalmente se recortan con el adaptador, se comprueba la calidad y se editan de acuerdo con métodos bioinformáticos bien conocidos en la técnica para prepararlos para su uso posterior.

En una realización preferida adicional, el nivel de los miARN de interés se determina mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los métodos de PCR son bien conocidos en la técnica y ampliamente usados. Incluyen PCR cuantitativa en tiempo real, PCR semicuantitativa, PCR multiplex, PCR digital o cualquier combinación de las mismas. En una realización particularmente preferida, los niveles de miARN se determinan mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los métodos para determinar los niveles de miARN usando qRT-PCR son conocidos en la técnica y normalmente están precedidos por la transcripción inversa de un miARN en un ADNc.

En los métodos de PCR útiles en la presente invención, los cebadores se basan normalmente en la molécula de miARN madura, pero pueden incluir modificaciones químicas para optimizar el comportamiento de hibridación.

Los métodos de qRT-PCR pueden determinar un nivel absoluto de expresión de un miARN. Alternativamente, los métodos de qRT-PCR pueden determinar la cantidad relativa de un miARN. La cantidad relativa de un miARN se puede determinar normalizando el nivel del miARN al nivel de una o más secuencias estándar internas de ácido nucleico. En general, tales secuencias de ácido nucleico estándar interno deberían tener un nivel constante en la muestra de sangre o suero analizada. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico estándar interno pueden ser secuencias de ácido nucleico de ARN transcritas constitutivamente tales como ARNm como gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (GAPDH), beta-actina (ACTB) o ARN no codificante como ARN ribosómico 5S y 18S, RNU48, RNU44 y RNU6. Además, los miARN que tienen niveles altos y constantes en suero o plasma, tales como miR-23a-3p, miR-23b-3p, miR-15-5p o miR-16-5p, pueden usarse como referencias para la cuantificación relativa. Además, las secuencias de ARN sintéticas añadidas en una cantidad equimolar durante el aislamiento de ARN o la síntesis de ADNc pueden usarse como referencias para la cuantificación relativa de miARN específicos.

Alternativamente, la diferencia logarítmica relativa entre dos miARN se puede calcular para formar pares de miARN autonormalizados. De este modo se puede evitar la necesidad de miARN de referencia.

Se proporciona una descripción general de los métodos de cuantificación de PCR en tiempo real útiles en la presente invención por Schmittgen et al., 2008, Methods. Enero; 44 (1): 31-38.

Los cebadores para la detección de miARN están disponibles comercialmente, p. ej. como conjuntos de cebadores de PCR microARN LNA™ de Exiqon.

Dado que los miARN son moléculas relativamente cortas, puede ser útil alargarlos agregando monómeros de adenosina a la hebra (una técnica conocida como poliadenilación) antes de la transcripción inversa y la amplificación. Brevemente, el ARN puede extraerse de la muestra mediante un reactivo adecuado (p. ej., reactivo Trizol), poliadenilarse en presencia de ATP y poli (A) polimerasa, transcribirse de forma inversa en ADNc usando un adaptador de poli (T) y secuencia 5 'RACE, y amplificarse usando un cebador directo derivado del extremo 3 'del miARN y un cebador RACE inverso. Las mejoras de esta técnica incluyen el diseño del cebador RACE con un nucleótido en su extremo 3 '(que constituye una A, C o G, pero no una T, para excluir el cebado en cualquier parte de la secuencia poliA y reforzar el cebado en la secuencia de miARN) o cebadores RACE que están anclados en el extremo 3 'del ADNc de un microARN específico usando 2, 3, 4 o más nucleótidos con o sin modificación química.

La detección de un miARN también se puede lograr mediante otros métodos conocidos en la técnica, p. ej., los descritos en el documento WO2011/14476, como por el método de secuenciación profunda, cuantificación basada en perlas, p. ej., matrices de perlas de Illumina, cuantificación basada en partículas de hidrogel, p. ej. Firefly™, mediante tecnología de micromatrices, p. ej. la matriz de miARN humano Ncode™ disponible de Invitrogen, matrices de chips disponibles de Affymetrix, Agilent, o micromatrices que emplean sondas de captura de estructura principal de LNA (matrices miRCURY LNA ™), p. ej., de Exiqon.

La diferencia en los niveles de miARN también se puede determinar usando ensayos de ácidos nucleicos basados en quimioluminiscencia multiplex tales como Panomics, o ensayos de plásmidos informadores ("biosensores") que contienen proteínas informadoras con sitios reguladores complementarios de microARN, u otras técnicas basadas en hibridación conocidas en la técnica.

"Nivel de referencia", "relación de referencia", "muestra de referencia", "control" o "muestra de control" son términos que pueden usarse indistintamente en el presente documento, y deben entenderse como una muestra o estándar usado para comparar con la muestra experimental, es decir, la muestra del sujeto cuyo riesgo de desarrollar LD o éxito - regeneración se va a determinar. El control puede incluir una muestra obtenida de un sujeto sano o un sujeto que no desarrolló disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Además, un control también puede ser un valor de referencia estándar o un intervalo de valores, es decir, tal como miARN expresados estables en las muestras, por ejemplo, el U6 snARN de control endógeno.

El nivel de referencia se puede determinar como el nivel promedio de los correspondientes miARN en una muestra de un sujeto sano, un sujeto que no desarrolló LD después de una resección hepática parcial y/o un sujeto después de una intervención quirúrgica, farmacológica, dietética o de estilo de vida. Como alternativa, también se puede utilizar un conjunto de muestras o una referencia descrita en la literatura.

La diferencia en los niveles de miARN se puede determinar mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

Específicamente, el nivel de expresión o las proporciones del nivel de expresión de una muestra se pueden comparar con el nivel de expresión de referencia o las proporciones del nivel de expresión utilizando un modelo de clasificación. Una técnica de clasificación (o clasificador) es un enfoque sistemático para construir modelos de clasificación a partir de un conjunto de datos de entrada, tales como los niveles de expresión de microARN de pacientes con y sin disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Los ejemplos incluyen modelos de regresión logística, modelos de máquinas de vectores de soporte, modelos de árboles de decisión, clasificadores basados en reglas, redes neuronales y clasificadores Bayes ingenuos. Cada técnica emplea un algoritmo de aprendizaje para identificar el modelo que mejor se ajusta a la relación entre el conjunto de atributos y la etiqueta de clase de los datos de entrada. El modelo generado por un algoritmo de aprendizaje debe ajustarse bien a los datos de entrada y predecir correctamente las etiquetas de clase de los datos que nunca antes ha visto. Por lo tanto, un objetivo clave del algoritmo de aprendizaje es construir modelos con buena capacidad de generalización, es decir, modelos que predigan con precisión las etiquetas de clase de datos previamente desconocidos.

Un modelo de regresión logística está estimando los parámetros de un modelo logístico. Un modelo logístico es aquel en el que las probabilidades logarítmicas de la probabilidad de un evento son una combinación lineal de variables independientes o predictoras. Modela la probabilidad de salida en términos de entrada y puede usarse para hacer un clasificador eligiendo un valor de corte y clasificando entradas con probabilidad mayor que el corte como una clase y probabilidad menor que el corte como la otra.

Las máquinas de vectores de soporte (SVM) son modelos de aprendizaje supervisado con algoritmos de aprendizaje asociados que analizan los datos utilizados para el análisis de clasificación y regresión. Dado un conjunto de ejemplos de entrenamiento, cada uno marcado como perteneciente a una u otra de dos o más categorías, un algoritmo de entrenamiento de SVM crea un modelo que asigna nuevos ejemplos a una categoría u otra, convirtiéndolo en un clasificador lineal binario no probabilístico. Una máquina de vectores de soporte construye un hiperplano o un conjunto de hiperplanos en un espacio de dimensión alta o infinita, que se puede utilizar para clasificación, regresión u otras tareas como la detección de valores atípicos. Intuitivamente, una buena separación se logra mediante el hiperplano que tiene la mayor distancia al punto de datos de entrenamiento más cercano de cualquier clase (el llamado margen funcional), ya que en general, cuanto mayor es el margen, menor es el error de generalización del clasificador.

En las teorías de complejidad computacional y complejidad de la comunicación, el modelo de árbol de decisión es el modelo de computación o comunicación en el que un algoritmo o proceso de comunicación se considera básicamente un árbol de decisión, es decir, una secuencia de operaciones de ramificación basada en comparaciones de algunas cantidades, siendo las comparaciones asignadas al costo computacional unitario. Se han introducido varias variantes de modelos de árboles de decisión, dependiendo de la complejidad de las operaciones permitidas en el cálculo de una única comparación y la forma de ramificación. Los modelos de árboles de decisión son fundamentales para establecer límites inferiores para la complejidad computacional para ciertas clases de problemas y algoritmos computacionales: el límite inferior para la complejidad computacional en el peor de los casos es proporcional a la mayor profundidad entre los árboles de decisión para todas las entradas posibles para un problema computacional dado. La complejidad de cálculo de un problema o un algoritmo expresado en términos del modelo del árbol de decisión se denomina complejidad del árbol de decisión o complejidad de la consulta.

Según una realización adicional, el método descrito en el presente documento es útil para controlar a un sujeto, específicamente para medir la respuesta de un sujeto a la estimulación de la regeneración hepática.

El método descrito en este documento se puede usar para monitorear terapias y el éxito del tratamiento de terapias tales como quimioterapia, inmunoterapia, embolización de la vena porta, asociación de partición hepática y ligadura de la vena porta para hepatectomía en etapas (ALPPS) u otras opciones de terapia como la intervención con ejercicio ("prehabilitación"), dieta o terapia farmacológica para reducir la hipertensión de la vena porta.

La quimioterapia es un tratamiento con medicamentos para destruir las células cancerosas. Ejemplos de fármacos eficaces como quimioterapia sistémica en el cáncer de hígado son la doxorrubicina (Adriamicina), el 5-fluorouracilo y el cisplatino. Pero incluso estos medicamentos reducen solo una pequeña parte de los tumores y, a menudo, las respuestas no duran mucho. Incluso con combinaciones de fármacos, en la mayoría de los estudios la quimioterapia sistémica no ha ayudado a los pacientes a vivir más tiempo. Alternativamente, la quimioterapia se puede administrar directamente al hígado en un proceso llamado infusión de la arteria hepática (HAI). La HAI aplica más quimioterapia al tumor que la quimioterapia sistémica, pero no aumenta los efectos secundarios. Los ejemplos de quimioterapia administrada mediante infusión en la arteria hepática incluyen floxuridina (FUDR), cisplatino, mitomicina C y doxorrubicina.

La embolización de la vena porta (PVE) es una técnica que se utiliza antes de la resección hepática parcial para aumentar el tamaño de los segmentos hepáticos que quedarán después de la cirugía. Esta terapia redirige la sangre portal a segmentos del futuro remanente hepático (FLR), lo que resulta en hipertrofia. La PVE está indicada cuando el FLR es demasiado pequeño para soportar la función esencial o cuando tiene un tamaño marginal y se asocia con un curso postoperatorio complicado. Cuando se aplica de manera apropiada, se ha demostrado que la EVP reduce la morbilidad postoperatoria y aumenta el número de pacientes elegibles para la resección con intención curativa. La embolización preoperatoria de la vena porta es un procedimiento seguro guiado por imágenes que causa hipertrofia de la FLR al redirigir la sangre portal al hígado no portador de tumores.

La asociación de la partición hepática y la ligadura de la vena porta para la hepatectomía en etapas (ALPPS) se ha desarrollado recientemente como una terapia de rescate para los tumores hepáticos tradicionalmente no resecables. El procedimiento ALPPS fue descrito por primera vez por Schnitzbauer et al. (27) y se ha desarrollado para permitir una rápida regeneración del hígado, preferiblemente en pacientes operables límite que no tienen suficiente hígado remanente para permitir la resección inicial completa de la parte enferma del hígado. Específicamente, ha abierto una ventana a los pacientes con tumor del lóbulo hepático derecho con remanente hepático futuro insuficiente (FLR). El procedimiento se realiza en dos etapas. Específicamente, en una primera etapa, las ramas de la vena porta, que alimentan al hígado portador del tumor, se ligan selectivamente, mientras que las estructuras arteriales y biliares se conservan y el parénquima hepático se secciona adicionalmente durante este paso inicial de la cirugía. Si tiene éxito, este procedimiento conduce a la regeneración y al crecimiento del hígado en unos pocos días. Específicamente, una vez que el hígado se ha regenerado suficientemente, se realiza un segundo procedimiento quirúrgico para eliminar los lóbulos hepáticos restantes ligados. Los principales inconvenientes de este procedimiento son las altas tasas de morbilidad y mortalidad, y se necesitan con urgencia marcadores predictivos confiables para determinar cuándo el riesgo de disfunción hepática es lo suficientemente bajo como para realizar la segunda etapa de la resección.

Específicamente, las muestras proporcionadas como se describe en este documento se pueden clasificar en "éxito del tratamiento" o "sin éxito del tratamiento" empleando el método in vitro utilizando las firmas de miARN como se describe en este documento. Por tanto, el éxito de la regeneración hepática siguiendo métodos tales como, por ejemplo, ALPPS, PVE o quimioterapia se puede determinar antes de la resección hepática parcial. Específicamente, se pueden determinar los momentos en los que el riesgo de desarrollar disfunción hepática después de una resección hepática parcial es bajo.

La hipertensión portal es un aumento de la presión arterial dentro de un sistema de venas llamado sistema venoso portal. Las venas que provienen del estómago, el intestino, el bazo y el páncreas se fusionan con la vena porta, que luego se ramifica en vasos más pequeños y viaja a través del hígado. Si los vasos del hígado están bloqueados debido a un daño hepático, la sangre no puede fluir correctamente a través del hígado. Como resultado, se desarrolla una alta presión en el sistema portal. Las opciones de tratamiento que reducen la hipertensión de la vena porta incluyen la ligadura endoscópica de las várices (EVL), el uso de bloqueadores beta no selectivos (NSBB) como propranolol o nadolol, que disminuyen la presión portal a través de una reducción del flujo sanguíneo portal. Su mecanismo de acción implica la disminución del gasto cardíaco a través de los receptores p-1 y causa vasoconstricción esplácnica al bloquear los receptores p-2, lo que da lugar a una actividad a-1 sin oposición. Este último es el efecto más importante y, por lo tanto, es esencial que se utilicen NSBB (a diferencia de los bloqueadores p selectivos) (Khurram y Guadalupe, World J Gastroenterol. 21 de marzo de 2012; 18 (11): 1166-1175).

En general, la regeneración del hígado también se puede estimular mediante cambios en el estilo de vida, como un aumento del ejercicio para mejorar el estado físico general ("prehabilitación") y cambios en la dieta que reducen la ingesta de proteínas, sodio y alcohol.

En el presente documento se describe además un kit de piezas que comprende

a) reactivos de detección capaces de detectar el nivel de expresión de al menos un microARN, seleccionado del grupo formado por miR-151a, miR-192 y miR-122, en la muestra de un sujeto,

b) niveles de expresión de referencia,

c) software que comprende los modelos de clasificación para la comparación de los niveles de expresión de a) con los niveles de expresión de b) y para la clasificación de la muestra del sujeto en una de al menos dos clases, en donde cada clase es una de las al menos dos categorías " riesgo alto"y"riesgo bajo "de disfunción hepática después de una resección hepática parcial.

Específicamente, el kit de partes descrito en el presente documento puede ser un kit de qRT-PCR que comprende reactivos para extracción de ARN, síntesis de ADNc y amplificación basada en fluorescencia de secuencias diana de microARN específicas, específicamente al menos miR-151a, miR-192 o miR-122. Las sondas informadoras fluorescentes detectan solo el ADN que contiene la secuencia complementaria a la sonda; por lo tanto, el uso de la sonda indicadora aumenta significativamente la especificidad y permite realizar la técnica incluso en presencia de otro dsDNA. Usando etiquetas de diferentes colores, se pueden usar sondas fluorescentes en ensayos multiplex para monitorear varias secuencias diana en el mismo tubo. Estas moléculas indicadoras fluorescentes incluyen sondas específicas de secuencia como reactivos de detección tales como balizas moleculares, sondas de hibridación FRET, sondas Scorpion Primers® o TaqMan®. El experto en la técnica conoce varios métodos de detección de miARN usando qRT-PCR, como en Arya y col. (Experto Rev Mol Diagn,2005 Mar; 5 (2): 209-19) y Navarro y col. (Clin Chim Acta,15 de enero de 2015; 439: 231-50).

Específicamente, el kit de partes descrito en el presente documento puede ser un kit de micromatrices que comprende una matriz de alta o baja densidad con sondas de captura para secuencias de microARN específicas, productos químicos para el etiquetado e hibridación de microARN y tampones de lavado para aumentar la rigurosidad y especificidad de la hibridación. reacción. El marcaje de microARN se puede lograr usando sondas de biotina como, por ejemplo, Biotin-16-UTP de Lucigen.

Específicamente, el kit de partes descrito en el presente documento puede ser un kit de secuenciación de próxima generación que comprende los reactivos necesarios para la ligación del adaptador 5 'y 3' a microARN, la transcripción inversa y la amplificación por PCR para obtener bibliotecas de secuenciación adecuadas para la secuenciación de próxima generación.

Los ejemplos descritos en el presente documento son ilustrativos de la presente invención y no pretenden ser limitaciones de la misma. Se han descrito diferentes realizaciones de la presente invención según la presente invención. Por consiguiente, debe entenderse que los ejemplos son solo ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplos

Utilizando la secuenciación de próxima generación como un enfoque sistemático imparcial, se detectaron 554 miARN en el plasma preoperatorio de 21 pacientes que padecían LD postoperatoria después de la resección hepática y 27 controles emparejados. Posteriormente, se detectó una firma de miARN, que comprende los miARN 151a-5p, 192-5p y 122-5p, que se correlacionó altamente con los pacientes que desarrollaron LD postoperatoria después de la resección hepática. El potencial predictivo de LD postoperatoria se confirmó posteriormente mediante PCR en tiempo real en una cohorte de validación independiente de 24 pacientes. En última instancia, un modelo de regresión de las dos proporciones de miARN 151a-5p a 192-5p y 122-5p a 151a-5p predijo de manera confiable LD postoperatoria, morbilidad severa, estadía prolongada en la unidad de cuidados intensivos, así como hospitalización e incluso mortalidad antes de la cirugía con una precisión notable, superando así los marcadores establecidos de LD postoperatoria.

Dada la relevancia clínica de predecir el resultado clínico postoperatorio potencialmente fatal después de la resección hepática, estos datos demuestran la utilidad clínica de un nuevo biomarcador basado en miARN para respaldar la selección de pacientes sometidos a hepatectomía parcial. Estos biomarcadores permiten adaptar el tratamiento y las estrategias quirúrgicas al perfil de riesgo específico de cada paciente.

Materiales y métodos

Población de estudio

Inicialmente, se reclutó prospectivamente una cohorte de descubrimiento de pacientes sometidos a resección hepática en la Universidad Médica de Viena a partir de febrero de 2012. Los pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma colangiocelular (CCC) o carcinoma colorrectal metastásico (mCRC) se consideraron elegibles para la inclusión. Posteriormente, como observamos un potencial predictivo significativo de los miARN para la LD postoperatoria y el resultado clínico, validamos nuestros resultados exploratorios en un conjunto prospectivo de pacientes sometidos a resección hepática.

Se registraron prospectivamente características basales, extensión de la resección quirúrgica (<3 segmentos = menor, >3 segmentos = mayor, según la nomenclatura IHPBA Brisbane 2000 (13)) y las individualidades intraoperatorias, así como las variables preoperatorias de la función hepática y el daño en todos los pacientes. El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional y de acuerdo con la Declaración de Helsinki y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Además, el ensayo se registró en un registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01700231 y NCT02113059).

Definición y clasificación de las complicaciones postoperatorias

Los pacientes fueron seguidos durante un período postoperatorio de 90 días en la Universidad Médica de Viena. El resultado postoperatorio se documentó de forma prospectiva. La LD postoperatoria se diagnosticó siguiendo los criterios emitidos por el International Study Group of Liver Surgery (ISGLS) (14). Brevemente, la LD se definió por los valores anormales de bilirrubina sérica y el tiempo de protrombina en o después del día postoperatorio (POD) 5. Es de destacar que, en caso de bilirrubina sérica preoperatoria anormal o tiempo de protrombina, una desviación postoperatoria y un deterioro en dos días posteriores a la POD 5 se identificó como LD postoperatoria. Además, los pacientes que alcanzaron valores normales de bilirrubina sérica o tiempo de protrombina antes de POD 5, o fueron dados de alta temprano debido a un buen desempeño clínico y, por lo tanto, no tuvieron más extracción de sangre, se consideraron "sin LD".

Para la clasificación de pacientes con morbilidad postoperatoria, el esquema proporcionado por Dindo et al. (15) se aplicó. En consecuencia, se registró el grado de complicaciones postoperatorias y se calificó de I a V. En caso de complicaciones múltiples, se utilizó la más grave para a clasificación. Además, se registró la duración de la hospitalización postoperatoria y la estancia en la unidad de cuidados intensivos (UCI). En última instancia, la muerte dentro de los 90 días posteriores a la cirugía se clasificó como mortalidad postoperatoria (16).

Evaluación de la función hepática preoperatoria

La función hepática se evaluó de forma rutinaria antes de la resección hepática mediante el aclaramiento de verde de indocianina (ICG) (17). Se disolvieron 25 mg de reactivo ICG en 20 ml de líquido isotónico y se administró por vía intravenosa al paciente una dosis de 0,25 mg/kg de peso corporal. La concentración del reactivo de color en la circulación se evaluó mediante espectrometría de pulsos. Finalmente, la cantidad de reactivo ICG aclarado dentro del primer minuto (= velocidad de desaparición del plasma (PDR)), así como la cantidad restante de reactivo detectado en la circulación después de 15 minutos (R15), se midieron en la presente cohorte de pacientes.

Medición de miARN circulantes

Antes de la operación, se realizó una preparación meticulosa de plasma como se describió anteriormente (18, 19). Brevemente, se extrajo sangre en tubos CTAD previamente enfriados y se procesó en 30 minutos. El plasma se separó de los componentes sólidos de la sangre mediante centrifugación a 1000 g y 4 °C durante 10 minutos, seguido de una etapa de centrifugación adicional durante 10 minutos a 10000 g y 4 °C. Finalmente, el plasma se almacenó a -80 °C hasta su posterior análisis.

Extracción de ARN

Se aplicó el miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania) para aislar el ARN total, incluidos los ARN pequeños, del plasma. Las muestras de plasma congeladas se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 12000 g durante 5 minutos para separar los posibles desechos del componente libre de células. Se mezclaron 200 pl de plasma mediante agitación con vórtex con 1 ml de Qiazol que contenía una mezcla de tres controles sintéticos de adición (Exiqon, Dinamarca). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añadieron 200 pl de cloroformo y se mezclaron vigorosamente mediante agitación con vórtex. Después de centrifugar a 12000 g durante 15 minutos a 4 °C, se aspiraron 650 pl de fase acuosa. Se añadió glucógeno (Ambion, EE.UU.) hasta una concentración final de 50 pg/ml. A continuación, las muestras se transfirieron a columnas de sílice y se procesaron posteriormente utilizando el robot de manipulación de líquidos QIAcube de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se precipitó con 750 pl de etanol, se lavó tres veces con tampón RPE, seguido de elución de ARN en 30 pl de agua libre de nucleasas y se almacenó a -80 °C.

Secuenciación de ARN pequeño

Se generaron pequeñas bibliotecas de secuenciación de ARN utilizando el kit de preparación de bibliotecas CleanTag SmallRNA (TriLink, EE. UU.) De acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se utilizaron dos pl de ARN total para la ligadura secuencial del adaptador 3 'y 5' a 28 °C durante 1 hora, seguido de 65 °C durante 20 minutos. Los adaptadores se prediluyeron 1:12 para tener en cuenta la baja abundancia de ARN. La transcripción inversa se realizó a 50 °C durante 1 hora. La amplificación por PCR se realizó utilizando cebadores Illumina con código de barras para la secuenciación de ARN pequeño: se utilizaron 26 ciclos de desnaturalización (98 °C, 10 s), hibridación (60 °C, 30 s) y elongación (72 °C, 15 s). Los productos de PCR se purificaron utilizando el protocolo QiaQuick (Qiagen, Alemania) y se comprobó el tamaño mediante electroforesis capilar utilizando el chip DNA 1000 (Agilent, EE. UU.). La concentración máxima de ~ 145 pb se utilizó como base para agrupar cantidades equimolares de ADN. El conjunto se purificó en gel para seleccionar insertos de plantilla entre 18 y 50 pb. La secuenciación se realizó en un IlluminaNextSeq 500, lecturas de un solo extremo con 50 ciclos (Illumina, EE. UU.). Las lecturas de secuenciación en formato fastq se recortaron con el adaptador y se verificó la calidad (generación de archivos fastQC). Se usaron lecturas filtradas de calidad (phred> 30) para la alineación contra miARN maduros humanos (miRBase v21) usando Bowtie2. Las lecturas mapeadas se verificaron mediante alineaciones del genoma (Bowtie2, GRCh37). Se contaron las lecturas de miARN maduras (se resumieron las secuencias de isomiR) y se normalizaron como recuentos por millón (CPM) al número total de lecturas mapeadas. Los valores de CPM se utilizaron para el análisis estadístico (ver más abajo).

Análisis de qPCR

Los análisis de qPCR se realizaron como se describió previamente (20). Brevemente, se sometieron a transcripción inversa 2 pl de ARN total en ADNc usando el Universal cDNA Synthesis Kit II (Exiqon, Dinamarca). El ADNc fue prediluido 1:50 para la amplificación de qPCR usando el masermix Exilent SYBR® Green y pares de cebadores modificados con LNA (Exiqon, Dinamarca). Las amplificaciones de qPCR se realizaron en un LC480-II (Roche Diagnostics, Alemania) en formato de 96 o 384 pocillos. Los valores de Cq se determinaron utilizando el método de la segunda derivada. La robustez de la extracción de ARN, la síntesis de ADNc y la amplificación de qPCR se evaluó utilizando combinaciones de controles sintéticos de punta (Exiqon, Dinamarca). La hemólisis se evaluó utilizando las proporciones de miR-23a-3p y miR-451a (21). Es de destacar que ninguna muestra falló debido a hemólisis o alta varianza analítica.

Análisis estadístico

Las diferencias en las características de los pacientes entre la cohorte de descubrimiento y la cohorte de validación para las variables categóricas se probaron mediante la prueba de chi-cuadrado y para las variables continuas mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.

Normalización y cálculo de microARN expresados diferencialmente entre grupos de pacientes con LD versus sin LD (log2 cambios de veces) se realizaron utilizando el paquete aristaR, Se identificaron diferencias significativas mediante pruebas de razón de verosimilitud. Los p-valores se ajustaron para pruebas múltiples basadas en la tasa de descubrimiento falso según el método Benjamini-Hochberg. Los microARN con una abundancia promedio de log2 cuentas por millón (logCPM) > 5, cambio de veces > 1,3 y p en bruto < 0,2 se consideraron como posibles candidatos a biomarcadores. Para los análisis de qPCR, los microARN se autonormalizaron por pares: para un par de microARN (miR1, miR2), las proporciones de log² de valores de expresión log2(miR1/miR2) se calcularon por diferencia en sus valores de Cq (ACq = CqmiR²-CqmiR¹). Para comparar los resultados de los pares de microARN de los análisis de NGS (log2 cambio de veces) con los resultados de los análisis de qPCR (ACq), se realizaron análisis de regresión lineal. La asociación lineal fue probada por una prueba de Wald bilateral para el coeficiente respectivo y el coeficiente de determinación (R2) fue calculado. La distribución y las diferencias de los valores de ACq entre el grupo de control y el grupo LD se mostraron mediante diagramas de caja y se probaron utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados.

Se realizaron análisis de bosque aleatorios (paquete R randomForest con configuraciones estándar y árboles de crecimiento 10,001) para identificar las variables más importantes (pares de microARN) en la clasificación de pacientes con LD versus sin LD. Para la clasificación, cada uno de los 2 pares de microARN más informativos se incluyeron en un modelo de regresión logística univariante y multivariado. Se aplicó una estrategia de validación cruzada de dejar uno fuera (LOOCV) y se evaluó mediante un análisis de características operativas del receptor (ROC) (paquete R ROCR). Se determinó el área bajo la curva ROC (AUC) y se probó la desviación significativa de una asignación aleatoria (AUC = 0,5). El rendimiento de estos modelos de clasificación de regresión logística se evaluó en una cohorte de validación independiente utilizando análisis ROC. Identificar puntos de corte de clasificación óptimos (clínicamente relevantes), para diferentes puntos de corte, tablas de contingencia (TP, FP; FN, TN) y parámetros asociados (incluyendo sensibilidad (SN), especificidad (SP), el valor de predicción positivo (PPV), el valor de predicción negativo NPV, la precisión (ACC), la puntuación F1 (F1), el coeficiente de correlación de Matthews (MCC)) se calcularon en función del modelo de regresión logística multivariante que incluye los 2 pares de microARN aprendidos en la cohorte de descubrimiento. Se seleccionaron dos puntos de corte 1) por MCC máximo y 2) PPV = 1 (falsos positivos FP = 0) y MCC máximo. La aplicación del modelo seleccionado y estos criterios dio como resultado los mismos límites para el conjunto de descubrimiento, el conjunto de validación y el conjunto combinado. Para comparar el rendimiento de la clasificación con otros parámetros clínicos, se utilizó el conjunto combinado. Utilizando análisis de ROC y AUC, el rendimiento de este modelo de 2 pares de microARN se comparó con otros parámetros de la función hepática. Para los dos puntos de corte respectivos, la diferencia en la proporción de pacientes con disfunción hepática, con morbilidad grave y mortalidad entre los controles previstos y la disfunción hepática prevista se probaron mediante la prueba exacta de Fisher bilateral y se determinaron los odds ratios (OR).

Los análisis se realizaron usando SPSS (versión 23.0) y R (versión 3.4.1); Los p-valores <0,05 se consideraron significativos.

Ejemplo 1: Establecimiento del panel de miARN predictivo para disfunción hepática postoperatoria en la cohorte de descubrimiento

Un total de 48 pacientes con mCRC, HCC o CCC que se sometieron a resección hepática entre febrero de 2012 y abril de 2016 se incluyeron en nuestra cohorte de descubrimiento. Para lograr una cohorte representativa, se emparejaron 21 pacientes que padecían LD postoperatoria en función de las características básicas, la función hepática y la extensión de la resección hepática a 27 pacientes sin LD postoperatoria. Posteriormente, 24 pacientes adicionales sirvieron como una cohorte de validación prospectiva y clínicamente relevante. Las características de los pacientes se muestran en la Tabla 2 y se compararon entre el descubrimiento y la cohorte de validación. Es de destacar que, dada la selección de la cohorte de descubrimiento, hubo un número significativamente mayor de pacientes sometidos a resección hepática importante en la cohorte de descubrimiento, que fue acompañado por valores significativamente peores de aclaramiento de ICG y gamma-glutamil transpeptidasa.

Tabla 2: Datos demográficos de los pacientes

Cohorte completa Cohorte de evaluación Cohorte de validación (N

(N = 72) (N = 48) = 24)

_Parámetro Mediana (intervalo) N Mediana (intervalo) N Mediana (rango p-(%) (%) intervalo N (%) valor

Género 0,721

Hombre 50 (69,4%) 32 (66,7%) 18 (75,0%)

Mujer 22 (30,6%) 16 (33,3%) 6 (25,0%)

Edad (años) 66 (35-89) 65 (36-89) 66 (35-86) 0,693 Tabla 2: Datos demográficos de los pacientes

Cohorte completa Cohorte de evaluación Cohorte de validación (N (N = 72) (N = 48) = 24)

Parámetro Mediana (intervalo) N Mediana (intervalo) N Mediana (rango p-(%) (%) intervalo N (%) valor Resección hepática <0,001 Menor (<3 segmentos) 16 (22,2%) 4 (8,3%) 12 (50,0%)

Mayor (> 3 segmentos) 56 (77,8%) 44 (91,7%) 12 (50,0%)

Tipo de tumor 0,117

CRCLM 27 (37,5%) 16 (33,3%) 11 (45,8%)

HCC 22(30,6%) 16 (33,3%) 6 (25,0%)

CCC 21(29,2%) 16 (33,3%) 5 (20,8%)

Otro 2 (2,8%) 0 (0,0%) 2 (8,3%) Cofactores

CTx neoadyuvante 24 (33,3%) 16 (33,3%) 8 (33,3%) 0,904 Esteatosis (%) 8 (0-100) 5 (0-40) 10 (0-100) 0,209 Esteatohepatitis 16 (22,2%) 10 (20,8%) 6 (25,0%) 0,447 Fibrosis 33 (45,8%) 19 (39,5%) 14 (58,3%) 0,418 Cirrosis 7 (9,7%) 4 (8,3%) 3 (12,5%) 0,847 RBC intraoperatorio 9 (11,1 %) 7 (14,6%) 1 (4,2%) 0,399 Parámetros

preoperatorios

PDR (%) 22,1 (9,9-39,4) 20,0 (9,9-34,8) 24,0 (16,2-39,4) 0,017 R15 (%) 4,0 (0,3-22,7) 5,0 (0,5-22,7) 2,6 (0,3-17,0) 0,056 Plaquetas (x103/ gl) 234 (86-492) 236 (86-492) 228 (113-470) 0,872 SB (mg/dl) 0,58 (0,15-3,17) 0,57 (0,15-3,17) 0,64 (0,27-1,54) 0,256 PT (%) 101 (40-137) 102 (40-137) 100 (61-132) 0,201 AP (U/I) 99 (45-707) 104 (49-707) 79(45-418) 0,053 GGT (U/I) 69 (16-1576) 32 (17-224) 48 (16-699) 0,043 AST (U/I) 30 (14-224) 33 (9-318) 27 (14-67) 0,065 Tabla 2: Datos demográficos de los pacientes

Cohorte completa Cohorte de evaluación Cohorte de validación (N

(N = 72) (N = 48) = 24)

_Parámetro Mediana (intervalo) N Mediana (intervalo) N Mediana (rango p-(%) (%) intervalo N (%) valor ALT (U/I) 32 (9-318) 84 (18-1576) 27(13-66) 0,164 Albúmina (g/I) 42,5 (31,5-48,5) 42,6 (31,5-47,3) 42,3 (34,0-48,5) 0,848 Morbilidad 0,838 Sin morbilidad 32 (44,4%) 21 (43,8%) 11 (45,8%)

Grado I 7 (9,7%) 4 (8,3%) 3 (12,5%)

Grado II 11 (15,3%) 7 (14,6%) 4 (16,7%)

Grado III 13 (18,1%) 9 (18,8%) 4 (16,7%)

Grado IV 4 (5,6%) 2 (4,1%) 2 (8,3%)

Grado V 5 (6,9%) 5 (10,4%) 0 (0,0%) Disfunción hepática

_ISGLS 0,102

Sin disfunción hepática 46 (63,9%) 27 (56,3%) 19 (79,2%)

ISGLS A 6 (8,3%) 5 (10,4%) 1 (4,2%)

ISGLS B 7 (9,7%) 4 (8,3%) 3 (12,5%)

ISGLS C 13 (18,1%) 12 (25,0%) 1 (4,2%)

Estancia

postoperatoria

UCI (días) 1(0-15) 1 (0-15) 1 (0-12) 0,103 Hospitalización total

_(días) 10(3-61) 11 (4-50) 9 (3-61) 0,298

CRCLM = metástasis hepática de cáncer colorrectal, HCC = carcinoma hepatocelular, CCC = carcinoma colangiocelular, CTx = quimioterapia, RBC = glóbulos rojos, PDR = tasa de desaparición del plasma, R15 = tasa de retención a los 15 minutos, SB = bilirrubina sérica, PT = tiempo de protrombina , AP = fosfatasa alcalina, GGT = gamma-glutamil transpeptidasa, AST = aspartato aminotransferasa, ALT = alanina aminotransferasa, ISGLS = grupo de estudio internacional sobre cirugía hepática, UCI = unidad de cuidados intensivos.

Para la identificación inicial de los miARN asociados con la disfunción hepática postoperatoria, se apuntó a un enfoque sistemático imparcial utilizando la secuenciación de próxima generación. En consecuencia, se analizaron los perfiles de miARN en plasma de todos los pacientes dentro de la cohorte de descubrimiento antes de la cirugía para determinar si los perfiles de miARN difieren entre los pacientes que desarrollan LD y aquellos sin recuperación hepática retrasada. Se detectaron un total de 554 miARN en todas las muestras de plasma analizadas. Para identificar posibles candidatos a biomarcadores, se impusieron límites para la abundancia de plasma (promedio log2 recuento por millón (logCPM) > 5), el tamaño del efecto (cambio de veces > 1,3) y el nivel de significancia (p < 0,2). Como se muestra en la Figura 1, un conjunto de 19 miARN permanecieron en el análisis, de los cuales 12 estaban regulados al alza (lado derecho) y 7 regulados a la baja (lado izquierdo) en el plasma preoperatorio de pacientes con LD.

Posteriormente, se analizó la variabilidad analítica entre la secuenciación de próxima generación y la detección de miARN basada en qPCR y se calcularon las diferencias logarítmicas relativas entre dos miARN para formar pares de miARN autonormalizados, evitando así la necesidad de un miARN de referencia. Seis de los miARN superiores y, en consecuencia, 15 pares de miARN se consideraron para este análisis. Se observó una alta concordancia entre los conjuntos de datos (secuenciación de próxima generación frente a miARN basados en qPCR). La importancia de los pares de miARN para lograr un excelente rendimiento predictivo de resultados postoperatorios negativos se analizó utilizando modelos forestales aleatorios (Figura 2A). Se identificaron dos pares de miARN mejor clasificados (151a-5p/192-5p, 122-5p/151a-5p) con diferencias preoperatorias significativas entre los individuos que desarrollan LD y los controles (Figura 2B, C). El rendimiento se describe mediante el área bajo la curva (AUC) y si la clasificación se desvía significativamente de la asignación aleatoria (AUC = 0,5) se indica mediante el p valor. El rendimiento diagnóstico de un modelo multivariado medido por análisis ROC estimó un AUC de 0,66 para el par de miARN 122-5p_151a-5p (Figura 2D), 0,75 para el par de miARN 151a-5p_192-5p (Figura 2E) y 0,76 para un modelo de regresión logística utilizando la combinación de ambos pares de miARN (Figura 2F).

A continuación, se definieron dos puntos de corte clínicamente útiles para predecir la LD postoperatoria. En consecuencia, se definió un punto de corte de bajo rigor para identificar a los pacientes que pueden someterse a una resección hepática con un riesgo muy bajo (punto de corte P > 0,59), así como un punto de corte riguroso, para identificar a los pacientes que deben optimizarse antes de la cirugía o no se sometieron a resección hepática (punto de corte P > 0,68). El porcentaje de LD postoperatorio verdadero en los controles predichos y LD pronosticados se analizaron para ambos puntos de corte definidos por el modelo P > 0,59 y P > 0,68. Se encontró que ambos estaban asociados con un aumento significativo en la LD postoperatoria (p = 0,00045, Figura 2G y p = 0,00054, Figura 2H). Específicamente, el 100% de los pacientes con una puntuación de probabilidad superior a 0,68 desarrollaron disfunción hepática después de una resección hepática parcial. Mientras que solo el 80% de los pacientes con una puntuación de probabilidad superior a 0,59 desarrollaron disfunción hepática y alrededor del 80% de los sujetos con una puntuación de probabilidad inferior a 0,59 no desarrollaron disfunción hepática. Estos resultados muestran que una puntuación de probabilidad P > 0,68 es un buen punto de corte para clasificar a los pacientes como de " riesgo alto" de desarrollar disfunción hepática y una puntuación de probabilidad de P > 0,59 es un buen punto de corte para clasificar a los pacientes como de "riesgo medio" de desarrollar disfunción hepática.

Ejemplo 2: Validación de las proporciones de miARN descubiertas en una cohorte de validación independiente

Para confirmar la utilidad clínica de las proporciones de miARN identificados, se validó el rendimiento predictivo de los 2 pares de miARN en una cohorte de validación prospectiva independiente compuesta por 24 pacientes, 19 sin LD y 5 con LD postoperatoria, lo que refleja la incidencia natural de 30% de LD postquirúrgico. Como se muestra en la Figura 3A para el par de miARN 122-5p/151 a-5p y en la Figura 3B para el par de miARN 151 a-5p/192-5p, hubo una fuerte tendencia hacia miARN regulados diferencialmente en pacientes con LD en comparación con los controles que ya estaban dentro de este pequeño tamaño de la muestra. El rendimiento diagnóstico de un modelo multivariado medido por análisis ROC mostró un excelente AUC de 0,80 para los 2 pares de miARN (Figura 3C). Además, se validó que los dos puntos de corte fueron capaces de predecir la LD postoperatoria para el punto de corte P > 0,59 con p = 0,018 (Figura 3D) y para el punto de corte P > 0,68 con p = 0,036 (Figura 3E), respectivamente.

Ejemplo 3: Comparación de las proporciones de miARN descubiertas con otros predictores de LD postoperatoria

A continuación, se evaluó el rendimiento del modelo de predicción basado en miARN en el conjunto de datos combinado (N = 72). Por lo tanto, el rendimiento diagnóstico de los dos puntos de corte se ilustró mediante la sensibilidad (SN), la especificidad (SP), el valor predictivo positivo (PPV), el valor predictivo negativo (NPV) y la razón de impares (OR). El punto de corte de bajo rigor (> 0,59) arrojó valores de PPV y NPV equilibrados (0,80 y 0,81, respectivamente, mientras que el punto de corte riguroso (> 0,68) dio como resultado un PPV de 1,0, con un NPV aceptable de 0,74 (Figura 4A), lo que indica que todos los pacientes que dieron positivo sufrieron de LD postoperatoria, mientras que el 74% de los pacientes que dieron negativo no sufrieron LD postoperatoria. Viceversa, el 26% de los pacientes que dieron negativo en la prueba sufrieron de hecho LD postoperatoria. Los OR para un evento adverso fueron 15,92 (p < 0,0001) e infinito (p < 0,0001), respectivamente. Se realizó un análisis de la curva de características del operador del receptor (ROC) para el modelo de microARN para comparar su rendimiento con el de los parámetros de función hepática estándar. Se realizó un análisis de curva ROC para el modelo de miARN y se comparó con las curvas ROC de los parámetros de función hepática estándar (Figura 4B). Se observó un AUC de 0,76 para el modelo de miARN, que excedió el AUC de otros parámetros, incluyendo la desaparición del plasma ICG y la tasa de retención como bien l como parámetro sanguíneo estándar como alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST) y gamma-glutamiltransferasa (GGT). Finalmente, se analizaron los OR para otros resultados postoperatorios adversos para ambos modelos de corte. Los OR de morbilidad grave alcanzaron significación para ambos puntos de corte (Figura 4C). Si bien se encontró que el OR para la mortalidad era significativo para el límite de rigurosidad baja, el límite de rigurosidad alta, aunque muestra la misma tendencia, no fue significativo (Figura 4D). Además, se encontró que los pacientes que cumplían con nuestros límites permanecían significativamente más tiempo en la UCI y permanecían hospitalizados durante un tiempo prolongado (Figura 4E, F).

Utilizando la secuenciación de próxima generación, como un enfoque sistemático imparcial, se detectaron 554 miARN en el plasma de los pacientes antes de la resección hepática. De ellos, se identificó una firma, que consta de 3 miARN 151a-5p, 192-5p y 122-5p, que detectaba específicamente a los pacientes antes de la cirugía que desarrollaron LD postoperatoria después de la resección hepática. En particular, se encontró que un modelo de regresión de las dos proporciones de miARN 151a-5p a 192-5p y 122-5p a 151a-5p predice de manera confiable la LD postoperatoria, la morbilidad severa, la UCI prolongada, así como la estadía hospitalaria e incluso la mortalidad antes de la cirugía. con una precisión notable y sin necesidad de un miARN de referencia. Dada la relevancia clínica de predecir el resultado clínico postoperatorio potencialmente fatal después de la resección hepática, los datos presentados en este documento demuestran la utilidad clínica de los biomarcadores basados en miARN para respaldar la selección de pacientes que se someten a una hepatectomía parcial por primera vez.

Específicamente, en las primeras etapas de la enfermedad hepática, la evaluación clínica y la cuantificación de la función hepática sigue siendo un desafío. Sin embargo, incluso una función hepática levemente disminuida puede ser de gran relevancia si entran en juego ciertos factores estresantes, tal como una resección hepática extensa. Si bien se han desarrollado varias pruebas invasivas y no invasivas, solo unas pocas han encontrado su camino hacia la aplicación clínica de rutina. Los principales inconvenientes de los predictores disponibles son la disponibilidad, los altos costos y la invasividad (22). Si bien se ha demostrado que el gradiente de presión venosa hepática (HVPG) es valioso para predecir el resultado clínico postoperatorio en pacientes con HCC (23-25), permanece reservado para pacientes de alto riesgo debido a su invasividad. Otros marcadores menos invasivos y bien establecidos para evaluar la función hepática se basan en la evaluación funcional dinámica del hígado. En este contexto, múltiples grupos han documentado que el aclaramiento de ICG es vital para predecir la LD y la morbilidad postoperatorias (26). Los datos presentados en este documento muestran que las firmas de miARN descritas en este documento superan con creces al ICG en términos de precisión diagnóstica. Es importante destacar que las pruebas de depuración de ICG y la mayoría de las demás evaluaciones de la función hepática son bastante caras y requieren mucho tiempo, en comparación con la evaluación de firmas de miARN. Además, la ventaja del plasma como herramienta para la medicina de precisión en estos pacientes permite un método simple, mínimamente invasivo y de fácil acceso.

En conjunto, se identificaron las firmas de miARN, que predicen el resultado clínico después de la resección hepática con una precisión notable, superando así los marcadores establecidos de LD postoperatoria.

Estos nuevos marcadores proporcionan una estrategia mejorada para identificar a los pacientes que no se beneficiarán de la cirugía o que incluso pueden sufrir complicaciones potencialmente letales. De ese modo, permiten adaptar las estrategias quirúrgicas al perfil de riesgo específico de cada paciente de una manera fácil, rentable y no invasiva. Esto podría marcar el camino para personalizar la cirugía hepática en pacientes con tumores hepáticos y, por lo tanto, aumentar la efectividad terapéutica, la calidad de vida del paciente y reducir drásticamente los costos de atención médica.

Ejemplo 4: Monitoreo dinámico de la recuperación de la función hepática después de la resección hepática para guiar la selección de puntos temporales para la cirugía.

Después de la validación del potencial predictivo de las proporciones de miARN para el resultado postoperatorio después de la resección hepática, se determinaron los cambios dinámicos de los pares de miARN después de la cirugía para evaluar su asociación con la función hepática. En consecuencia, se incluyó en el estudio una cohorte emparejada de 3 grupos de pacientes: 1: pacientes con resección hepática regular sin disfunción hepática postoperatoria (N = 7); 2: pacientes con resección hepática regular con disfunción hepática postoperatoria (N = 8); 3: pacientes sometidos al procedimiento ALPPS con una regeneración hepática postoperatoria aumentada (N = 8, ver detalles sobre el procedimiento en la figura 5A y en la descripción a continuación). Los detalles de los grupos de pacientes se proporcionan en la Tabla 3 a continuación.

Los pares de miARN se evaluaron como se describe en el Ejemplo 1, y las firmas de miARN se determinaron preoperatoriamente, así como en el primer y quinto día postoperatorio, POD1 y POD5, respectivamente. Se observó que en todos los pacientes, los pares de miARN, así como la probabilidad combinada de disfunción hepática (p) cambiaron significativamente después de la resección hepática a un nivel comparable (figura 5B), y que la mayoría de ellos se recuperaron hasta el día 5 del postoperatorio en paralelo con un tratamiento regular de la recuperación de la función hepática.

Además de los cambios dinámicos de los pares de miARN, se debía determinar si su valor absoluto después de la cirugía podría usarse para determinar el momento óptimo para la segunda etapa del procedimiento ALPPS. El procedimiento ALPPS fue descrito por primera vez por Schnitzbauer et al. (27) y se ha desarrollado para permitir una rápida regeneración del hígado en pacientes operables en el límite que no tienen suficiente hígado remanente para permitir una resección inicial completa. Las etapas del procedimiento se ilustran en la figura 5A. Brevemente, la etapa 1 del procedimiento ALPPS, las ramas de la vena porta, que alimentan el hígado portador del tumor, se ligan selectivamente, mientras que las estructuras arteriales y biliares se conservan y el parénquima hepático se secciona adicionalmente durante este paso inicial de la cirugía. Este procedimiento conduce a una regeneración del hígado enormemente aumentada en unos pocos días. Después de esta ganancia sustancial de regeneración hepática, se debe realizar un segundo procedimiento quirúrgico para eliminar los lóbulos hepáticos restantes ligados (como se ilustra en la figura 5A, etapa 2). El mayor inconveniente de este procedimiento son las altas tasas de morbilidad y mortalidad, y ha sido objeto de un gran debate determinar cuándo la regeneración ha sido suficiente para realizar la segunda etapa de la resección. En consecuencia, se analizaron los cambios dinámicos de las proporciones de miARN en 8 pacientes sometidos al procedimiento ALPPS y se observó que, si bien se comportaron de manera similar a las resecciones hepáticas regulares durante y después de la etapa 1 (ver arriba), durante la segunda etapa de la cirugía (la eliminación del lóbulo ligado/atrófico) los pares de miARN permanecieron prácticamente sin cambios directamente después de la cirugía (etapa 2, la diferencia entre Pre y POD1 no es significativa, Figura 5C).

En última instancia, (D) de la Figura 5 ilustra el potencial predictivo de los pares de miARN combinados antes del segundo paso de ALLPS según se estratifica según la LD postoperatoria y la mortalidad después de la eliminación del lóbulo atrófico. Es de destacar que todos los pacientes que desarrollaron LD postoperatoria después de la etapa 2 del procedimiento ALPPS mostraron cambios claros en la firma de miARN y la probabilidad de disfunción hepática combinada resultante en comparación con los pacientes restantes (P = 0,054, Figura 5D). Más importante aún, los dos pacientes que murieron después de la etapa 2 del procedimiento mostraron la relación de miARN más alta antes de la segunda operación (Figura 5D).

En resumen, solo se observaron pequeñas diferencias en el curso temporal perioperatorio de los pares de miARN entre los grupos (noLD, LD, ALPPS). Por lo tanto, como reacción aguda al trauma operatorio (en el día 1 postoperatorio), los pares de miARN parecen empeorar de manera bastante uniforme en todos los pacientes, independientemente de su desarrollo clínico posterior. Sin embargo, a medida que la función hepática se recupera después de la cirugía, los pares de miARN parecen seguir de cerca y normalizarse hasta el día 5 del postoperatorio, con la excepción de los pacientes con alto riesgo de disfunción hepática. En este contexto, los datos del modelo ALPPS son de especial interés. Al igual que durante la primera operación, donde tiene lugar la destrucción más significativa del tejido hepático, los pares de miARN empeoraron significativamente. Sin embargo, casi no hubo diferencia durante el paso 2 del procedimiento, cuando se extrae el lóbulo hepático atrófico (Fig. 5A). Esto sugiere que la sorprendente reducción inicial de la función hepática durante la etapa 1 de ALPPS se refleja en pares de miARN, mientras que durante la etapa 2, cuando se elimina el lóbulo atrófico con función limitada, solo se producen cambios menores.

Es de destacar que el modelo ALPPS también se utilizó aquí para generar los datos presuntamente más interesantes y clínicamente relevantes de este estudio. En particular, se evaluó si los niveles postoperatorios de pares de miARN pueden definir el momento óptimo para la cirugía hepática. Se observó que los pacientes que no se recuperaron bien después de la primera etapa de ALPPS en términos de pares de miARN, lo que significa que los pares de miARN no volvieron a los niveles iniciales, fueron de hecho aquellos que lo hicieron muy mal después de la segunda etapa de ALPPS. De hecho, los 3 pacientes que sufrieron disfunción hepática después de la segunda etapa tuvieron los valores más altos de pares de miARN y, lo que es más importante, los 2 pacientes que murieron posteriormente debido al "síndrome demasiado pequeño para el tamaño" tuvieron los 2 valores más altos de nuestra cohorte ALPPS.

Estos datos muestran que la firma de los miARN circulantes descritos en este documento puede ayudar a determinar el momento óptimo para la resección del hígado. Esto no se limita a ALPPS. Las firmas de miARN descritas en este documento también pueden ser útiles después de la embolización/ligadura de la vena porta o para determinar el momento óptimo de la cirugía después de una quimioterapia preoperatoria extensa en pacientes de riesgo alto.

Tabla 3: Características de los pacientes emparejados en el estudio exploratorio

ALPPS (N = 8) Resección mayor de hígado (N = 7)

Parámetro Mediana (intervalo) N (%) Mediana (intervalo) N (%)

Género

Hombre 5 (62,5%) 5 (71,5%)

Mujer 3 (37,5%) 2 (28,5%)

Edad (años) Tipo de tumor 61 (49-79) 60 (56-82)

CRCLM 7 7

HCC 1 0

Cofactores

CTx neoadyuvante 6 (75%) 7 (100%)

Tabla 3: Características de los pacientes emparejados en el estudio exploratorio

ALPPS (N = 8) Resección mayor de hígado (N = 7) Parámetro Mediana (intervalo) N (%) Mediana (intervalo) N (%)

Esteatosis (%) 0 (0) 7,5 (0-60)

Esteatohepatitis 0 (0%) 1 (14%)

RBC intraoperatorio 1 (12,5%) 2 (28,6%)

Parámetros preoperatorios

PDR (%) 16 (15-17) 21 (14-26)

R15 (%) 9,5 (8-10) 6,4 (1,9-11,5)

SB (mg/dl) 0,6 (0,3-2) 0,5 (0,4-2,4)

AP (U/I) 112 (80-298) 102 (51-165)

GGT (U/I) 104,5 (55-399) 46 (16-75)

AST (U/I) 31,5 (25-55) 29 (18-49)

ALT (U/I) 36 (20-56) 20 (16-50)

Albúmina (g/l) 29,5 (27,9-44,1) 28,4 (14,5-37,9)

CRCLM = metástasis hepática de cáncer colorrectal, HCC = carcinoma hepatocelular, CTx = quimioterapia, RBC = glóbulos rojos, PDR = tasa de desaparición del plasma, R15 = tasa de retención a los 15 minutos, SB = bilirrubina sérica, PT = tiempo de protrombina, AP = fosfatasa alcalina, GGT = gamma-glutamil transpeptidasa, AST = aspartato aminotransferasa, ALT = alanina aminotransferasa.

Referencias

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4. Hackl M, Heilmeier U, Weilner S, Grillari J. Circulating microRNAs as novel biomarkers for bone diseases - Complex signatures for multifactorial diseases? Mol Cell Endocrinol 2016;432:83-95.

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6. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res 2009;19:92-105.

7. Lecellier CH, Dunoyer P, Arar K, Lehmann-Che J, Eyquem S, Himber C, Saib A, et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science 2005;308:557-560.

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9. van Rooij E, Sutherland LB, Liu N, Williams AH, McAnally J, Gerard RD, Richardson JA, et al. A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro de determinación del riesgo de disfunción hepática de un sujeto después de una resección hepática parcial comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto antes de la resección hepática parcial,

b) determinar en dicha muestra el nivel de expresión de miR-151a y miR-192, y opcionalmente de miR-122, y i. identificar las proporciones de miR-151a a miR-192, y opcionalmente de miR-122 a miR-151a, en base a los niveles de expresión determinados en b), y comparar dichas proporciones de niveles de expresión con las proporciones de niveles de expresión de referencia, o

ii. comparar los niveles de expresión de miR-151a, miR-192 y miR-122 con los niveles de expresión de referencia, y

c) clasificar la muestra del resultado de la etapa i) o de la etapa ii) en una de al menos dos clases, en donde cada clase es una de las al menos dos categorías de " riesgo alto " y " riesgo bajo ".

2. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde en la etapa (b)(i) se determinan los niveles de expresión de miR-151a, miR-192 y miR-122.

3. El método in vitro de la reivindicación 1 o 2, que comprende otras clases de las categorías "sin riesgo" y "riesgo medio".

4. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el nivel de expresión de referencia es el nivel de expresión de al menos un miARN, seleccionado del grupo que consiste en miR-151a, miR-192 y miR-122 de un sujeto sano o de un sujeto sin disfunción hepática postoperatoria o de un grupo de los mismos.

5. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las proporciones de niveles de expresión de referencia son las proporciones de niveles de expresión de miR-151a a miR-192 y de miR-122 a miR-151a de un sujeto sano o de un sujeto sin disfunción hepática postoperatoria o de un grupo de los mismos.

6. Un método in vitro de seguimiento de la regeneración-éxito de la estimulación de la regeneración hepática de un sujeto después de una resección hepática parcial, que comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto,

b) determinar las proporciones del nivel de expresión de miR-151a a miR-192 y de miR-122 a miR-151a en dicha muestra

c) determinar las proporciones del nivel de expresión de miR-151a a miR-192 y de miR-122 a miR-151a en una muestra de referencia, en donde la muestra de referencia es una muestra anterior del sujeto,

d) comparar las proporciones de nivel de expresión de b) con las proporciones de nivel de expresión de c), y e) clasificar la muestra de dicho sujeto a partir del resultado de la comparación de la etapa d) en una de dos categorías, "regeneración-éxito" o "sin regeneración-éxito".

7. El método in vitro de la reivindicación 6, en donde la estimulación de la regeneración hepática se selecciona del grupo que consiste en la inducción de la hipertrofia hepática por embolización de la vena porta, inducción de la hipertrofia hepática asociando partición hepática y ligadura de la vena porta para hepatectomía en etapas (ALPPS), intervención de ejercicio ("prehabilitación") para mejorar el estado físico general y la terapia farmacológica para reducir la hipertensión de la vena porta.

8. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el sujeto padece lesiones malignas en el hígado, preferiblemente cáncer colorrectal metastásico, carcinoma hepatocelular o carcinoma colangiocelular, o tumores hepáticos benignos, quistes hepáticos y/o parásitos.

9. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la muestra de sangre se selecciona del grupo que consiste en suero, plasma y plasma pobre en plaquetas.

10. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde los niveles de expresión o las proporciones de los niveles de expresión de la muestra se comparan con el nivel de expresión de referencia o las proporciones del nivel de expresión usando un modelo de clasificación.

11. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde un modelo de clasificación clasifica la muestra de un sujeto a partir del resultado de la comparación con la referencia en una de las al menos dos clases.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en donde el modelo de clasificación se selecciona del grupo que consiste en modelos de regresión logística, modelos de máquina de vectores de soporte y modelos de árbol de decisión.

13. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde los niveles de expresión se determinan usando un método seleccionado del grupo que consiste en un método basado en secuenciación, específicamente secuenciación de próxima generación, un método basado en matriz y un método basado en PCR, específicamente un método cuantitativo basado en PCR.