WO2013150167A2 - Modelo de expresión de microarn como indicador de supervivencia en pacientes de cancer colorrectal metastásico - Google Patents

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Amancio Carnero Moya
Rocio SUAREZ BELTRAN
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Universidad De Sevilla
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Definitions

  • Colorectal cancer commonly known as bowel cancer, is a cancer that comes from uncontrolled cell growth in the colon, rectum or appendix, and originates from epithelial cells that cover the colon or rectum of the gastrointestinal tract .
  • the symptoms and signs of colorectal cancer depend on the location of the tumor in the intestine.
  • CRC is the second most common cause of cancer-related death in the western world (Knijin et al., Discov. Med. 2010 (47): 328-36). It is also the most common malignant tumor in the world (Jemal et al., 2011, CA Cancer J. Clin. 61 (2): 69-90).
  • Metastatic colorectal cancer is therefore a cancer that experiences a spread from the place where it was first started to another place / body organ.
  • Advanced colorectal cancer (advanced CRC or ACC) can be defined as colorectal cancer than in the presentation (or relapse) is both (i) metastatic and (ii) so locally advanced that surgical resection cannot be performed with curative intentions.
  • Metastatic colorectal cancer (MCRC) is thus included in the advanced CRC.
  • colorectal cancer can be divided into several stages, depending on the measures of dissemination of the primary tumor through the layers of the wall of the colon or rectum to adjacent organs, lymph nodes and distant sites, therefore evaluating tumor progression Originally there was the Dukes classification system, which classified patients into one of three categories (Stages A, B, C). Astler-Coller subsequently modified this system to include a fourth stage (stage D) (Astier et al., Ann. Surg. 1954; 139: 846-852); Gunderson and Sosin subsequently transformed it again in 1978.
  • Stage I-IV the American Joint Committee on Cancer
  • AJCC Cancer Staging Manual 7 ed., Springer, New York, NY, 2002.
  • Staging of rectal tumors is carried out with criteria similar to those used for colon tumors.
  • Colon cancers are classified as localized (stage I and stage II), disseminated regionally (stage III) or disseminated at a distance (stage IV).
  • the choice of treatment for a specific patient will be based on considerations that involve the stage of the cancer.
  • the classic options involve surgery and / or therapy through the administration of anticancer drug (s).
  • s anticancer drug
  • auxiliary (chemo) therapy is effective in preventing the spread of metastatic disease that comes from a colorectal cancer that has been surgically removed.
  • auxiliary (chemo) therapy is usually a follow-up treatment for individuals who have undergone surgery.
  • the cytotoxic drugs currently used in the treatment of advanced colorectal cancer (ACC) are mainly fluoropyrimidines (such as 5-fluorouracil), irinotecan and oxaliplatin (Knijin et al., Discov. Med. 2010 (47): 328-36).
  • 5-fluorouracil plus leucovorin 5-FU / LV was the only effective therapeutic regimen with an average total survival time (OS) of approximately 12 months.
  • OS total survival time
  • Treatment with monoclonal antibodies, the so-called “targeted therapy” has added some additional benefit to existing CRC therapies (Knijin et al., Discov. Med. 2010 (47): 328-36).
  • MCRC metastatic colorectal cancer
  • miRNA are short non-coding RNA molecules that function as post-translational regulators of gene expression.
  • CRC post-translational regulators of gene expression.
  • Some studies have examined miRNA expression profiles in colorectal tumors and non-tumor tissues to assess their association with CRC (stages). For example, in the case of US2009 / 0233297A1, the inventors had to identify the miRNAs that are useful for the diagnosis and / or prognosis of colorectal recurrence in patients with stage II or stage III cancer.
  • KRAS has been described as a direct target of the family from the miRNA of let-7, miR-143, miR-146b-3p, miR-18a, and miR-486-5p (Johnson et al. 2005, Cell 120 (5): 635-647).
  • Some studies, such as Slaby et al., Mol. Cancer, 2009, 8: 102 have attempted to enlarge the image by mapping individual factors, such as individual miRNAs in the CRC, on known cell signaling pathways. Such attempts come, however, with the drawback that any given miRNA has a wide variety of different targets (in some estimates approximately 200 targets per average miRNA), and therefore said given miRNA is normally involved in a multiplicity of routes.
  • a goal of the present invention is, therefore, the provision of an easy and reliable in vitro procedure capable of predicting the chemotherapy response of those patients suffering from advanced colorectal cancer.
  • a first objective of the present invention is to overcome some drawbacks associated with the CRC predictive procedures present in the state of the art.
  • the present invention provides a series of procedures and tools useful for predicting the survival of those patients suffering from colorectal cancer, in particular the present invention predicts overall survival or progression-free survival.
  • a further objective of the present invention is to provide appropriate medication for an individual patient suffering from CRC based on the prediction of the success of the treatment.
  • An additional problem to be solved is the provision of a detection system, such as a kit, which may be useful in the methods of the invention.
  • the present invention provides a method of predicting the response of a human subject, in which the subject suffers from colorectal cancer, preferably metastatic colorectal cancer, to chemotherapy.
  • the method comprises the detection, in a sample of said subject, of the expression levels of one or more miRNA selected from the following group: SEQ ID NO: 1 (miR107); SEQ ID NO: 2 (miR337-5p); SEQ ID NO: 3 (miR564); SEQ ID NO: 4 (miR605); SEQ ID NO: 5 (miR889); SEQ ID NO: 6 (miR99a *).
  • the inventors have shown that the levels of one or more of these miRNAs may be indicative of a lack of response, or of the response of a subject.
  • the response is a response to the reduction of tumor burden.
  • the response is an improvement or absence of deterioration of the tumor state.
  • the response is a clinical outcome, such as progression-free survival or overall survival.
  • the method for determining the result is not particularly limited and can be selected from a gene profiling procedure, such as a microarray, and / or a method comprising the PCR, such as Real-time PCR and / or Northern transfer.
  • Real-time PCR is preferred, and values with respect to a reference value indicative of the lack of response can be expressed as -AACt.
  • the subject whose response is to be predicted has undergone tumor surgery, that is, surgical resection of the cancer before the application of the method of the invention. It is possible that at the time of taking the sample from the human subject, the human subject is (i) being treated by chemotherapy, or (ii) is not being treated by chemotherapy, but (ii) is preferred. In this way, the response to chemotherapy after surgery can be predicted.
  • the predictable response to chemotherapy preferably comprises the administration of fluoropyrimidine, alone or in combination with an additional agent.
  • chemotherapy may comprise the administration of oxaliplatin and fluoropyrimidine, or irinotecan and fluoropyrimidine.
  • miRNA expression may be normalized, preferably in relation to the expression of another RNA molecule, such as MammU6.
  • the invention also provides a method for classifying a human subject suffering from metastatic colorectal cancer into one of two groups, in which group 1 comprises subjects identifiable by the method of the invention; and in which group 2 represents the rest of subjects. It is possible to provide personalized therapy to an individual, depending on whether the individual has been classified in group 1 or in group 2.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising fluoropyrimidine and an additional agent, selected from oxaliplatin and irinotecan, to treat a human subject of group 1.
  • the invention provides an antibody for treating a human subject of group 2.
  • the antibody is preferably selected from an antibody directed against VEGF and an antibody directed against EGFR.
  • the antibody directed against VEGF can be bevacizumab
  • the antibody directed against EGFR can be selected from cetuximab and panitumumab.
  • the present invention also provides a kit comprising at least one oligonucleotide (s) capable of hybridizing with any one or more, preferably two or more, and even more preferable with all miRNAs defined as SEQ ID NOs: 1 a 6. It is preferred that said oligonucleotide (s) be capable of doing so under stringent conditions.
  • one or more of said one or more oligonucleotide (s) (DNA preferably) are further defined by the following SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12.
  • said kit additionally comprises a poly T oligonucleotide (DNA) primer. It is also possible that the oligonucleotide (s) are immobilized in spots on a (preferably solid) surface.
  • the kit comprises a microarray.
  • kit is not particularly limited, although its use is preferred in the process of the invention.
  • FIG. 1 Volcano graph of miRNAs differentially expressed between with and without response to chemotherapy.
  • the log2 of the change of times is represented on the x-axis and the negative logarithm of the p-values of the t-test is represented on the y-axis.
  • FIG. 1 Clinical outcome in patients with or without response to chemotherapy according to the expression status of miRNAs.
  • PFS Progression-free survival
  • B overall survival through miRNA expression levels.
  • the solid black line shows patients with miRNA levels above or equal to the average ACt value.
  • the black dotted line shows patients with miRNA levels below the average ACt value.
  • FIG. 3 Clinical outcome in patients with complete response, partial response, stable disease and progressive disease based on miRNA expression levels.
  • A progression-free survival (PFS) and
  • B overall survival through miRNA expression levels.
  • the solid black line shows patients with miRNA levels above or equal to the average ACt value.
  • the dotted black line shows patients with miRNA levels below the average value of
  • Figure 4 Comparison of the average value of ACt in patients with complete response (CR), partial response (PR), stable disease (SD) versus progressive disease. * p value ⁇ 0.05. The top and bottom of the box are always the 25th and 75th percentiles and the band near the middle of the box is always the 50th percentile.
  • the present invention provides a method for predicting the response of a human subject to chemotherapy, in which the subject suffers from advanced colorectal cancer, such as metastatic colorectal cancer (MCRC).
  • advanced colorectal cancer CRC or advanced ACC
  • CRC metastatic colorectal cancer
  • MCRC metastatic colorectal cancer
  • the diagnosis of colorectal cancer can be carried out by tumor biopsy, and the extent of the disease is then determined usually by CT scanning or other imaging tests.
  • the stage of colon cancer is determined, preferably based on the TNM system that is determined by the amount in which the initial tumor has spread, and if the lymph nodes are affected and, if there is metastasis, how much has developed .
  • the TNM staging system which places patients in one of four stages (Stage I-IV), as developed by the American Joint Committee on Cancer (AJCC Cancer Staging Manual, 7a edition) is preferably used to define the stage or severity of the CRC in a particular subject or to classify a particular subject into a particular group (I-IV).
  • the TNM system evaluates the primary tumor (T), regional lymph nodes (N) and distant metastasis (M).
  • TNM tumor-nodu-metastasis staging system of cancer, based on advances in understanding current and prognostic cancer prognostic advances clinic.
  • TNM tumor-nodu-metastasis
  • staging can be used as described in the NCCN Guidelines Version 2.2012 Staging Colon Cancer, available for example online at NCCN (www.nccn.org).
  • the TNM categories reflect very similar results for rectal and colon cancer. Therefore, these two diseases share the same staging system (Gunderson et al., J Clin Oncol. January 10, 2010; 28 (2): 256-63).
  • the procedure can be carried out in subjects with any stage of colorectal cancer, although it is preferred that it be carried out in patients with an advanced stage, such as with patients. of the group comprising any of stages II, III or IV, and preferably with patients of the group comprising any of stages III or IV, and most preferably, with patients suffering from stage IV colorectal cancer.
  • the profile determined by the present invention is rather predictive rather than prognostic and diagnostic.
  • Metastatic colorectal cancer is defined as a type of advanced colorectal cancer, and the method of the invention is preferably carried out with subjects suffering from advanced colorectal cancer.
  • the subjects whose response is predicted are human subjects suffering from CRC.
  • the terms "human subject”, “subject” and “patient” are therefore used interchangeably in this specification.
  • One or more as also used herein includes one and the individual specification of any number that is more than one, such as two, three, four, five, six, etc.
  • “More than one” or “some” as used herein includes the individual specification of any number that is more than one, such as two, three, four, five, six, etc.
  • the method of the invention comprises the detection, in a sample from a human subject, of the expression levels of one or more particular miRNAs.
  • samples include different types of tissue samples, as well as biological fluids, such as blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, peritoneal fluid, feces.
  • said samples are tissue samples and most preferably, said tissue samples originate from CRC tumor tissue of the individual whose response is to be predicted and can originate from biopsies, preferably from surgical resection.
  • the term “comprising” is used in the context of this document to indicate that additional members may be optionally present in addition to the members of the list introduced by the term “comprising”. It is contemplated, however, as a specific embodiment of the present invention that the term “comprising” encompasses the possibility that no additional members are present, that is, for the purposes of this embodiment "comprising” it should be understood that it has the meaning of "consisting of”.
  • the present inventors have investigated the association between the expression profile of miRNA and colorectal cancer in patients receiving chemotherapy after surgery, which allows its use as a predictive factor in progression-free survival and overall survival of patients suffering from colorectal cancer. , as well as predictive factors for the success of chemotherapy (response to chemotherapy). In a particular embodiment, patients suffer from stage IV colorectal cancer.
  • microRNAs are single-stranded RNAs of ⁇ 22-nucleotides (approx. 18-25 nucleotides) and negatively regulate (inhibit) gene expression by inhibiting translation or excision of mRNA.
  • miRNAs are posttranscriptional regulators that bind complementary sequences in transcripts of target messenger RNAs (mRNAs), resulting in repression of translation or degradation of the target and gene silencing.
  • mRNAs target messenger RNAs
  • the understanding of the molecular details of the action of the miRNAs of the invention is not critical, since the detected levels of the indicator miRNAs only allow the process of the invention to be carried out.
  • the present invention relates to a method that involves the use of the set of miRNAs consisting of: SEQ ID NO: 1 (miR107); SEQ ID NO: 2 (m ⁇ R337-5p); SEQ ID NO: 3 (miR564); SEQ ID NO: 4 (miR605); SEQ ID NO: 5 (miR889); SEQ ID NO: 6 (miR99a * ).
  • the invention relates to the use of any subset of these miRNAs.
  • Table 1B Location of miRNAs.
  • Example 3 the inventors provide evidence by univariate and multivariate analysis that there is a overlapping set of miRNAs whose determination is predictive of both the clinical outcome of a subject undergoing chemotherapy and the response of the tumor burden of a subject to chemotherapy, see Example 3.
  • Example 1 the inventors provide evidence of the predictive power of the miRNAs of the invention.
  • miRNA In a standardized nomenclature system, the names are assigned to miRNA experimentally as follows: the prefix “mir” is followed (by a hyphen and) a number, where the latter can indicate the order of nomenclature.
  • the "mir-” in lower case refers to the pre-miRNA, while a “miR-” in uppercase refers to the mature form.
  • MiRNAs with almost identical sequences, except one or two nucleotides, indicate additional lowercase letters, for example miR99a *.
  • Pre-miRNAs that lead to 100% identical mature miRNAs that are located in different places in the genome are indicated by an additional numeric suffix separated by a hyphen.
  • hsa-miR-123 is a human miRNA (Homo sapiens). Because in the context of this document, all individualized miRNAs are human miRNAs, the prefix "hsa-" is sometimes omitted. When two microRNAs originate from opposite arms of the same pre-miRNA, they are denoted with a suffix - 3p or -5p, such as for example miR337-5p. When relative expression levels are known, an asterisk after the name indicates a miRNA expressed at low levels with respect to the miRNA on the opposite arm of a hairpin, for example miR99a *.
  • miRNA genes are found in intergenic regions or are oriented in the opposite direction to adjacent genes and are therefore thought to be transcribed as independent units. Their genes are usually transcribed by RNA polyrase II and processed transcripts, exported from the nucleus and further processed by specific machinery, as is well known in the art (see for example. He et al., Nat. Rev. Genet. Jul 2004; 5 (7): 522-31). The miRNA sequences can be accessed at http://www.mirbase.org.
  • miRNAs are often only expressed at low or even undetectable levels. These miRNAs have limited value for the prognosis, at best.
  • the miRNAs referred to in the present invention are however normally detectable in 50% or more, such as 60% or more, 70% or more or 80% or more of patients of both groups compared (R (patients showing response to chemotherapy "responders") and NR (patients who show no response to chemotherapy "non-responders")
  • R patients showing response to chemotherapy "responders”
  • NR patients who show no response to chemotherapy "non-responders
  • the difference in the expression of miRNAs was considered for evaluation when at least 50% of patients in both groups compared (R and NR) were detected
  • This threshold was chosen because it represents at least half of the patients, as shown in the examples, the expression of miR-107 , miR-337-5p, miR-564, miR-605, miR-889 and miR-99a *, were detected in 92.8% of the subjects studied, which evidences the adequacy
  • miRNA i.e. very short and well-defined RNA
  • indicator factors have the advantage of easy and reliable detection, unlike some known methods, such as those described in US 201 10039269 A1, for example, which relies on messenger RNAs (mRNAs) to assess the survival of the CRC patient.
  • miRNA messenger RNAs
  • the miRNA indicators of the process of the present invention are one or more of those selected from the group consisting of those defined by the following SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 1 (miR 07); SEQ ID NO: 2 (miR337-5p); SEQ ID NO: 3 (miR564); SEQ ID NO: 4 (m ⁇ R605); SEQ ID NO: 5 (miR889); SEQ ID NO: 6 (miR99a *).
  • the inventors have shown that these miRNAs are predictive indicators of the response of a subject suffering from CRC to chemotherapy (see, for example, Example 3, Figure 5).
  • the procedure involves comparing the expression levels of said miRNAs with the expression levels of said miRNAs in a reference sample or with the average expression levels of said miRNAs.
  • "reference sample” is understood as the sample used to determine the variation of the expression levels of the miRNAs of the present invention.
  • the reference value is obtained from the signal provided using a tissue sample obtained from an individual who is a non-respondent.
  • the samples are taken from the same tissue of several non-responders and combined, such that the reference value reflects the average value of said molecules in the population of non-responders.
  • Reference value is the expression level of a miRNA of the invention in the reference sample.
  • the reference value indicative of the non-response for each specific miRNA must be known before carrying out the process of the present invention. It is preferred that the reference sample be of the same tissue and / or obtained by the same procedure (options described above) as the sample from which the individual's response is to be predicted. It is preferred that the sample originates from the same stage or severity of the CRC as the sample from which the individual's response is to be predicted. Thus, if the response of a patient suffering from CRC with a type IV cancer (which is a preferred way of carrying out the invention) is to be predicted, then the reference sample would also be that of a nonresponding patient. suffering from type IV CRC or stage IV. The answer may refer to the characteristics of the subject's tumors. Alternatively but not mutually exclusive, the answer may refer to the clinical outcome of the subject.
  • R and NR can be made based on the change in the size of the lesion.
  • “Response” can be defined as a decrease in the total tumor burden (defined as the sum of the tumor areas of lesions measured two-dimensionally), taking as reference the values corresponding to the initial value, without the appearance of a new injury.
  • the response may be> 5% decrease in total tumor burden, such as> 10% decrease in total tumor burden,> 15% decrease in total tumor burden, ⁇ 20% of decrease in total tumor burden, ⁇ 25% decrease in total tumor burden, ⁇ 30% decrease in total tumor burden,> 35% decrease in total tumor burden,> 40% decrease in the total tumor load, ⁇ 45% decrease in the total tumor load or ⁇ 50% decrease in the total tumor load, each defined as the sum of the tumor areas of the lesions measured two-dimensionally.
  • the response is defined as> 30% decrease in the total tumor burden (defined as the sum of the tumor areas of the lesions measured two-dimensionally), taking as reference the values corresponding to the initial values, without the appearance of a new lesion.
  • NR lack of response
  • no response is defined as ⁇ 30% decrease in the tumor area of one or more measurable lesions, or the appearance of at least one new lesion. This normally includes an increase, such as> 20% increase in the area of one or more measurable lesions or the appearance of at least one new lesion.
  • the inventors have shown that, when the response is defined as a decrease in the total tumor load, the expression levels of one or more miRNAs as defined in SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 are good indicators predictive of such response.
  • said expression levels indicate a decrease in the total tumor burden if: (i) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 1 have increased; and / or (i) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 2 have increased; and / or (v) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 5 have decreased; and / or (vi) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 6 have increased with reference to a control value indicating lack of response. This applies particularly if the response is defined as ⁇ 30% decrease in total tumor burden.
  • Response refers to the clinical outcome of the subject
  • the “Response” can be expressed as overall survival or progression-free survival.
  • the survival of cancer patients is adequately expressed generally by means of the Kaplan-Meier curves, which have received their designation from Edward L. Kaplan and Paul Meier who described them first (Kaplan, Meier: Amer. Statist Assn. 53: 457-481).
  • the Kaplan-Meier estimator is also known as the product limit estimator. It is used to estimate the survival function from the life time data.
  • a graphical representation of the Kaplan-Meier estimate of the survival function is a series of horizontal stages of decreasing magnitude that, when a sufficiently large sample is taken, approximates the true survival function of this population.
  • the estimator can be used of Kaplan-Meier to measure the fraction of patients alive over a period of time after starting chemotherapy.
  • the expected clinical outcome may be survival (overall / progression-free) in months / years from the time the sample is taken. It can be survival for a certain period of time from the sampling, such as, for six months or more, one year or more, two years or more, three years or more, four years or more, five years or more , six years or more.
  • “survival” may refer to "overall survival” or "progression-free survival”.
  • the response is based on the clinical outcome, specifically "global survival” (OS).
  • OS global survival
  • Global survival denotes the possibilities of a CRC patient to remain alive in a group of individuals suffering from cancer. The decisive question is whether the individual dies or lives at any given time. The inventors have shown that all miRNAs of the invention are indicators of overall survival.
  • the result of the procedure of the invention is an indicator of overall survival if one or more of the following facts are observed: (i) miRNA levels such as defined in SEQ ID NO: 1 have increased; and / or (i) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 2 have increased; and / or (iii) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 3 have increased; and / or (iv) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 4 have decreased; and / or (v) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 5 have decreased; and / or (vi) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 6 have increased, each with respect to the average value, where the average value is calculated from all miRNA expression values such and as illustrated in example 4B.
  • Example 4B provides the average value determined by the present inventors. In this way, the average values provided in Example 4 B can be used in this embodiment of the invention.
  • the response is based on the clinical outcome, specifically "progression-free survival” (PFS).
  • PFS progression-free survival
  • the decisive issue in this embodiment is whether the individual suffering from CRC shows a decrease in tumor burden (as described above) at any given time.
  • the miRNA values of the invention are indicators of non-response if one or more of the following are observed: (i) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 1 have increased; and / or (ii) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 2 have increased; and / or (iv) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 4 have decreased; and / or (vi) miRNA levels as defined in SEQ ID NO: 6 have increased, each with reference to the average value (see Example 4 B), where the average value is calculated from all the expression values of the respective miRNAs.
  • the invention provides a method of predicting the complete response and / or partial response of a human subject to chemotherapy, in which the subject suffers from metastatic colorectal cancer, and in which the method comprises detecting, in a sample of a subject, the expression levels comprising one or more miRNAs of the invention.
  • the inventors provide evidence that the expression levels of one or more miRNAs can be used as defined in SEQ ID NOs: 1, 2, 4 as indicators, and that the result is an indicator of the complete response or the partial response of a human subject if one or more of the following facts are observed: (i) miRNA levels as indicated in SEQ ID NO: 1 have increased; and / or (ii) miRNA levels as indicated in SEQ ID NO: 2 have increased; and / or (iv) miRNA levels as indicated in SEQ ID NO: 4 have decreased, with respect to an indicator reference value of progressive disease.
  • the present invention provides reference values for progressive disease, as determined by the authors, in Example 4 C.
  • CR Complete Response
  • PR Partial Response
  • Progressive Disease At least a 20% increase in the sum of diameters of the target lesions, taking as a reference the smallest sum in the study (this includes the initial value of the sum if this is the smallest of the study). In addition to the relative increase of 20%, the sum must also demonstrate an absolute increase of at least 5 mm. (Note: the appearance of one or more new lesions is also considered progression).
  • Stable Disease Neither a sufficient decrease to qualify as PR nor a sufficient increase to qualify as PD, taking as reference the smallest sum of diameters during the study.
  • the method for determining the result that is, the determination of the level of expression of the miRNAs need not be limited in particular and can be selected from a gene profiling procedure, such as a microarray and / or a procedure comprising the PCR, such as real-time PCR; and / or the Northern transfer.
  • Quantitative real-time PCR is a technique for quantifying sensitive and reproducible gene expression that can be used in particular for the expression of the miRNA profile in cells and tissues. Any procedure may be used for the evaluation of the results of the RT-PCR and the AACt procedure may be preferred. The AACt procedure is described in detail in Livak et al.
  • a target gene here: the miRNA of interest
  • an endogenous control gene are included (as described below) for the amplification of the PCR from aliquots (usually serial dilutions) Normally several replicates of each diluted concentration are used to derive the effectiveness of the amplification.
  • the efficiency of the PCR amplification can be defined as the amplification percentage (from 0 to 1)
  • software normally measures the number of cycles of each sample in which the fluorescence crosses an arbitrary line (PCR amplification indicator), the threshold. This crossing point is the Ct value.
  • Ct of a nucleic acid from the miRNA of the gene of interest is divided by the Ct d the nucleic acid from the endogenous control in the same sample to normalize the variation in the quantity and quality of the RNA between different samples and obtain the relative expression (with respect to the endogenous control) of each of the "subject sample” and of the "control sign".
  • this is carried out in duplicate, triplicate, quadruplicate and similarly, respectively.
  • An ACt value of the control can be adequately obtained by calculating the average of the ACt values obtained from samples of a control group of several individuals with which the values of the "subject sample” are to be compared.
  • the control group (from which the average value is calculated) consists of individuals suitable for the respective purposes (for comparison).
  • a suitable control group is for a specific purpose (for example, in the case of Example 4 A, the control group consists of unanswered subjects, in the case of Example 4 B, the group of the control consists of all subjects and in Example 4 C, the control group consists of subjects with progressive disease or partial response.
  • the present invention can be practiced by omitting the determination of the ACt value of the control group, that is, determine (only) the ACt value of the "subject sample” and then subsequently comparing this with the respective average ACt value of the control indicated in Example 4 (A, B, C, respectively).
  • ⁇ calculations express relative expression in the context of the "sample of the subject” versus the "control sample” (or the average of the control samples described above).
  • the amount of target miRNA, normalized to an endogenous reference and with respect to a control sample (average), is provided by: 2-AAC ⁇ .
  • the first value for example, the subject
  • the second ACt value for example (average) control
  • the value of 2 "( ⁇ ⁇ ) will be ⁇ 1. This implies that the expression relative in the second sample was reduced with respect to the first sample. Taking the negative inverse of 2 "(AACT) will change the times of expression reduction. Details of the ⁇ calculation procedure can also be found in: Applied Biosystems user Bulletin No. 2 (P / N 4303859).
  • a microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a cell with a thin silicon film) that evaluates large amounts of biological material, in this case, a large number of different miRNAs or, preferably, their transcripts of reverse DNA, which are detectable by specific immobilized probes on the solid substrate.
  • a Northern blot involves the use of electrophoresis to separate RNA samples by size and subsequent detection with a probe complementary to (part of) the target sequence of the RNA of interest.
  • an expression ratio of the miRNAs is considered significant, as detectable by the RT-PCR analysis in real time, 0.9 or less, such as 0.8 or less, or 0.75 or less.
  • the subject to whom the response is to be predicted has undergone tumor surgery, that is, surgical resection of the cancer before the application of the method of the invention.
  • the options for surgery include, but are not limited to, (a) partial colectomy (the surgeon removes only part of the colon) (b) leocolectomy (ileus removed) (c) abdominal-perineal resection (surgical operation in which the anus, rectum and sigmoid colon are removed), (d) proctosigmoidectomy (the diseased section is removed of the rectum and sigmoid colon), (e) total abdominal colectomy (removes the entire colon but preserves the rectum and anus), (f) total proctocolectomy (operation of the large intestine that involves the removal of the rectum and colon). It is not excluded that other treatments such as radiation are used in conjunction with surgery.
  • the human subject is (i) being treated with chemotherapy or (ii) is not being treated with chemotherapy.
  • Option ( ⁇ i) is preferred.
  • the following sequence of steps is preferred: (a) patients undergoing colorectal cancer surgery, (b) after surgery, a recent tumor sample is taken for miRNA analysis, (c) ( optional) patients are treated by chemotherapy, such as with fluoropyrimidine-based chemotherapy plus oxaliplatin or irinotecan. Isolation of the sample from the living subject as such is also not a part of the invention. Surgery of a living human body as such is not also a part of the invention.
  • the procedure for predicting a response according to the present invention is preferably an in vitro procedure.
  • step (b) normally comprises: (b1) RNA (total) or miRNA (total) extraction from the recent tumor sample, and procedures suitable for this purpose are not particularly limited.
  • step (b2) that is, the detection of the levels of the miRNAs of interest among the RNA extracted in (b1).
  • Chemotherapy the response to which it is to be anticipated, can be any type of chemotherapy suitable for treating colorectal cancer patients.
  • Chemotherapy is understood as cancer treatment with an antineoplastic drug or with a combination of such drugs. Without pretending to be linked to any particular theory, it is understood that chemotherapy normally acts by eliminating rapidly dividing cells, which is one of the main properties of most cancer cells.
  • chemotherapy preferably comprises the administration of fluoropyrimidine compounds, which are thought to act as antimetabolites. Examples of fluoropyrimidine compounds are capecitabine, floxuridine, and fluorouracil (5-FU), which is the most preferred in the present invention.
  • Said fluoropyrimidine can be administered alone or in combination with an additional agent, therefore, the combination with an additional agent is preferred.
  • the additional agent may be a molecule capable of interacting with DNA, such as in the inhibition of DNA synthesis and / or in preventing DNA unwinding.
  • chemotherapy may comprise the administration of oxaliplatin and fluoropyrimidine, or irinotecan and fluoropyrimidine. It is thought that the cytotoxicity of oxaliplatin (US 4,169,846) results in the inhibition of DNA synthesis in cancer cells. In vivo studies have shown that oxaliplatin has antitumor activity against colon carcinoma because of its cytotoxic effect (not directed).
  • Irinotecan on the other hand is a semisynthetic analogue of the natural camptothecin alkaloid, which is thought to act by preventing the unwinding of DNA by inhibiting the topoisomerase 1. In this way, oxaliplatin and irinotecan are thought to exert their function by intervening with DNA.
  • the method of the present invention can be applied with samples of individuals of any sex, that is, male or female, and of any age.
  • the individuals subjected to the process of the present invention are individuals from groups known for their greater predisposition to CRC, such as male subjects and / or individuals 50 years of age or older, or preferably 60 years of age or plus. It can also be carried out with individuals at any stage of the CRC, although advanced CRC is preferably preferred, metastatic CRC. Even more preferred is the use of the method of the present invention to predict chemotherapy treatment of a subject suffering from CRC in stage IV.
  • miRNA expression can be normalized in relation to an endogenous control.
  • the endogenous control is preferably the endogenous expression (ie, in the same individual) of another nucleic acid, preferably an RNA, such as any one selected from mRNA, miRNA, nucleolar RNA, rRNA and the like. It is highly preferred that said RNA be known to be stably expressed.
  • Stable expression means any expression that is known to be expressed independently of variable factors such as age, cell type, disease, sex, physiological status, or response to external conditions, or the like. Genes that are stably expressed are also known as maintenance genes.
  • this nucleic acid can be chosen from small nucleolar RNAs, preferably MammU6.
  • RNAs such as RNU44, RNU48, RNU24, RNU43, RNU6B, RNU19, and Z30 can also be used for normalization, as well as the miRNA of genes (let-7a, miR-10b, miR-16, miR-21 and look- 26b).
  • RUN44 and RUN48 can be particularly useful.
  • miRNAase 16 All nucleotide sequences of the miRNAs can be accessed online in the miRBase (miRBase 16), which is the main online depository of all sequences and annotations of microRNAs (Kozormara et al., Nuc ⁇ . Acids Res. ( 2011) 39 (suppl 1)). Nucleotide sequences of other human RNAs, such as small nucleolar RNAs can be found online at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (assembly GRCh37 (GCA_000001405.6) from the Genome Reference Consortium) . Additional molecules suitable for normalization are described in Davoren et al., BMC Mol Biol.
  • RNA can be used in the process of the invention. It is also possible that more than one different RNA is used for normalization, such as two or more, three or more and / or up to five different RNAs.
  • the reference value is obtained by normalization with respect to the same nucleic acid as the value from which the patient's response is to be predicted. For illustration purposes only: if the reference value is obtained by normalization of the expression of a specific miRNA (s) of the invention with respect to the expression of MammU6, then, in the patient of which it is to be predicted In response, the expression value is also obtained by normalization of the expression of a specific miRNA (s) of the invention with respect to MammU6 expression.
  • one or more miRNAs can be used as a negative control.
  • a non-human origin is mainly preferred.
  • the invention also provides a method for classifying a human subject suffering from metastatic colorectal cancer into one of two groups.
  • Group 1 comprises the subjects identifiable by the method of the invention as detailed above that show any one or more of: response, partial response, complete response, survival; and in which group 2 represents the rest of the subjects. It is possible to provide personalized therapy to an individual, depending on whether the individual is classified in group 1 or group 2.
  • a personalized therapy can be selected which can be particularly beneficial for the patient, whose treatment is provided in addition to the primary, primary or initial treatment, that is, surgery. Said additional treatment may be called auxiliary therapy.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a fluoropyrimidine and an additional agent, selected from oxaliplatin and irinotecan, to treat a human subject from group 1.
  • a pharmaceutical composition comprising a fluoropyrimidine and an additional agent, selected from oxaliplatin and irinotecan, to treat a human subject from group 1.
  • the invention thus provides a method of patient selection (group 1) that may be particularly beneficial for the administration of said therapy.
  • an alternative treatment such as an antibody-based treatment, may not be justified in group 1 patient subjects.
  • the invention provides a therapeutic antibody for treating a human subject of group 2.
  • the antibody is preferably selected from an antibody directed against VEGF and an antibody directed against EGFR.
  • the antibody is preferably a monoclonal, human or humanized antibody.
  • Targeted antibody-based therapies are not technically chemotherapy.
  • a useful antibody directed against VEGF can be bevacizumab, and the antibody directed against EGFR can be selected between cetuximab and panitumumab.
  • These antibodies are known to be suitable in CRC cases, but the criteria according to the state of the art by which patients are selected to receive both (1) chemotherapy and (2) antibody-based targeted therapy are still poor since Often unsatisfactory.
  • a determination of the status of the KRAS gene from both the primary tumor status and a site of metastasis should be part of the preparation of a pretreatment with an antibody directed against EGFR for all patients diagnosed with colorectal cancer metastatic, based on studies of the results that indicate that the state of the tumor produced by the KRAS gene is very predictive with respect to the results with therapies directed against EGFR, that is, the benefits of EGFR inhibitor therapy were restricted to patients with tumors characterized by the natural KRAS gene.
  • the present invention also provides a kit comprising at least one oligonucleotide (s) capable of hybridizing with any one of two or more, and preferably all miRNAs defined as SEQ ID NOs: 1 to 6 In Table A3 the embodiments are provided particular of said oligonucleotides.
  • the kit is based on the predictive power of the process of the present invention.
  • the reference indicator value for the lack of response of each specific miRNA can be determined before carrying out the process of the present invention.
  • the reference indicator value for the non-response (and / or an indicator reference value for the response) can be provided with the kit.
  • the expression of each target miRNA can be calculated, that is, with respect to, said endogenous control molecules exemplified above.
  • the endogenous control can thus also be included in the kit.
  • said oligonucleotide (s) have a GC content between 30% and 70%, preferably between 38 and 65%. This is also carried out in such a way that the oligonucleotide (s) hybridizes with two corresponding or less, and preferably without corresponding, with respect to the miRNA to be determined.
  • oligonucleotide Whenever it refers to the hybridization of the oligonucleotide (s), it is preferred that said oligonucleotide (s) is capable of doing so under stringent conditions.
  • Rigor is a term used in hybridization experiments. The rigor reflects the degree of complementarity between the oligonucleotide and the nucleic acid (which is in this case the miRNA to be detected), the most rigorous, the highest percentage of homology between the probe and the nucleic acid that binds to the filter The skilled person knows well that temperature and salt concentrations have a direct effect on the results obtained. It is recognized that the hybridization results are related to the number of degrees below the Tf (melting temperature) of the DNA at which the experiment is carried out.
  • the stringent conditions are defined as a wash with 0.1X SSC (saline-sodium citrate buffer (SSC) at 65 ° C. (SSC is usually provided as a 20X stock solution, consisting of 3 M sodium and 300 mM trisodium citrate (adjusted to pH 7.0 with HCI)).
  • SSC saline-sodium citrate buffer
  • SSC is usually provided as a 20X stock solution, consisting of 3 M sodium and 300 mM trisodium citrate (adjusted to pH 7.0 with HCI)
  • SEQ ID NOs are further defined by the following SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12. Details are given in Table A3.
  • the kit is selected from (a) a kit suitable for PCR, (b) a kit suitable for Northern Blot Transfer and (c) a kit suitable for microarray analyzes. Can be combined any of two or more of these embodiments, such that the kit may comprise, for example, both of (a) and (c).
  • kits for PCR this PCR is usually the real-time quantitative PCR PCR (RQ-PCR), a technique for quantifying sensitive and reproducible gene expression.
  • the kit additionally comprises a polyT oligonucleotide primer in addition to the kit oligonucleotide (s).
  • the polyT oligonucleotide primer can be used together with the oligonucleotide (s) of the invention for PCR priming, after polyadenylation of the isolated miRNAs by methods known to the skilled person, such as using poly polymerase (A) and ATP.
  • A poly polymerase
  • ATP adenylation of the isolated miRNAs
  • a Northern Transfer involves the use of electrophoresis to separate RNA samples by size and subsequent detection with an oligonucleotide (s) (hybridization probe) complementary to (part of) the target sequence of the RNA of interest.
  • s oligonucleotide
  • the kit comprises a microarray.
  • An RNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a cell of a thin silicon film) that evaluates large amounts of different RNAs (here miRNA) that are detectable by specific probes immobilized on spots on a substrate solid.
  • Each spot contains a specific nucleic acid sequence, usually a DNA sequence, such as probes (or indicators).
  • said custom matrix comprises fifty spots or less, such as thirty spots or less, including twenty spots or less.
  • said custom microarray comprises the oligonucleotides as defined in the SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11 and 12 or the oligonucleotides comprising these sequences.
  • the TaqMan Set v2.0 human microRNA assay can be excluded from the invention.
  • kit is not particularly limited, although its use is preferred in the process of the invention or in any of its embodiments.
  • mFOLFOX 6 (43.6% of patients): 85 mg / m2 of Oxaliplatin IV, day 1. 400 mg / m2 of Leucovorin IV, day 1. 400 mg / m2 of 5-FU bolus IV on day 1, then 1200 mg / m2 / day x 2 days (total 2400 mg / m2 for 46-48 hours) in Infusion continues. Repeat every 2 weeks.
  • CapeQx (38.5% of patients): 130 mg / m2 of Oxaliplatin, day 1 1000 mg / m2 of Capecitabine twice daily on days 1-14 every 3 weeks x 24 weeks.
  • TOMOX (2.5% of patients): 3 mg / m2 of Raltitrexed bolus IV, day 1. 130 mg / m2 of Oxaliplatin bolus IV, day 1. Repeat every 3 weeks. Group 2. Chemotherapy based on irinotecan and fluoropyrimidine.
  • FOLFIRI (12.8% of patients): 180 mg / m2 of Irinotecan IV, day 1.
  • the inventors did not observe significant differences in the behavior of both groups according to the response and profile.
  • Both groups can therefore be considered as a treated group, which is a group of CRC patients to whom fluoropyrimidine and the additional agent were administered.
  • RNA Total RNA, which contained small RNA, was extracted from a sample of tumor tissue using the miVana miRNA isolation kit (Ambion, Austin, TX, USA) according to the manufacturer's instructions. Total RNA yield was determined using a Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop Tech, DE, USA). Expression of mature human miRNA was detected and quantified using TaqMan ® low density matrices (TLDA) based on Applied Biosystems Micro Fluidic Cards 7900 HT (Applied Biosystems, CA, USA) according to the instructions of the maker.
  • TLDA TaqMan ® low density matrices
  • the Human MicroRNA Card Set v2.0 matrix is a set of two cards that They contain a total of 384 TaqMan MicroRNA assays per card that allow reliable quantification of 667 human microRNAs, all cataloged in the miRBase database.
  • TLDAs were carried out in a two-stage procedure: briefly, during the first stage, 450 ng of total RNA were reverse transcribed using Megaplex RT Primers and the TaqMan miRNA reverse transcription kit in a total volume 7.5 ⁇ . The 7.5 ⁇ of the reactions were incubated in a G-Storm thermal cycler (Gene Technologies, Essex, UK) for 2 min at 16 ° C, 1 min at 42 ° C, and 1 min at 50 ° C for 40 minutes.
  • the miRNA validations were evaluated using the TaqMan ® MicroRNA assays (Applied Biosystems, CA, USA). After polyadenylation, a polyT primer was used to synthesize the cDNA from the pooled population of miRNA, and the first resulting cDNA chain was purified and concentrated. Subsequently, the first cDNA chain was analyzed by qPCR using SYBR ® Green, the polyT primer and a direct primer designed from the targets of the specific miRNA sequence of interest (miR-107, miR-337-5p, miR -564, miR-605, m ⁇ R-889 and miR-99a *). These direct primers are the oligonucleotides defined in SEQ ID NOs: 7 to 12.
  • the lack of response (NR) was defined as ⁇ 30% decrease or> 20% increase in the tumor area of one or more measurable lesions, or the appearance of at least one new lesion.
  • the relative quantification of miRNA expression was calculated by the 2 - ⁇ procedure.
  • the 2 ⁇ procedure is a convenient way to analyze the relative changes in gene expression from the quantitative PCR experiments in real time. (Applied Biosystems user bulletin no 2 (P / N 4303859)).
  • MicroRNA expression was calculated using Real-Time Statminer ® v.4.2 software (Intergromics, Inc). This software carries out a test of the moderate t between the groups (R and NR) corrects them using the Benjamini-Hochberg algorithm (Benjamini Y, et al 1995) with the False Discoveries Ratio (FDR) adjusted to a value of 5%. For the purposes of this study, miRNA expression was considered significant when the miRNA had been detected in at least 50% of patients. in each group compared. In addition, in situations where the miRNA is not detected and the Ct values are beyond the maximum in Ct 36, the StatMiner software imputes a value, which is set to the maximum Ct.
  • PFS progression-free survival
  • OS total survival
  • the Kruskal-Wallis test was used for the comparison of the averages and, for cases in which a significant difference resulted (p ⁇ 0.05), the Mann-Whitney test was applied for comparison between groups. These analyzes were carried out using the SPSS software (Statistical Package for Social Sciences version 17.0; SPSS, Inc, Chicago, IL).
  • the miRNAs with p ⁇ 0.05 in the univariate analysis were enabled for the multivariate Cox regression analysis.
  • the multivariate analysis of more than one statistical variable over time was carried out in general).
  • Cox regression analysis was carried out to test the association of miRNAs with survival time (PFS and OS). Be They included microRNAs with significant association with PFS and / or OS in both univariate analyzes in the Cox regression model. These analyzes were carried out using the SPSS software (Statistical Package for Social Sciences version 17.0; SPSS, Inc, Chicago, IL).
  • Example 1 Identification of miRNA expression models in patients according to the responses to chemotherapy. Prognostic survival value according to the expression profiles of the microRNA.
  • the expression profile of the microRNA was evaluated in patients with advanced colorectal cancer using the qRT-PCR analysis.
  • the comparative expression related to miRNA was represented as a volcano graph in Figure 1.
  • a volcano graph is a type of point diagram that is used to quickly identify changes in large data sets composed of replicated data.
  • the first dimension (horizontal) is the change of times between the two groups (on a logarithmic scale, of such that the regulation in excess and in defect seems symmetric), and the second axis (vertical) represents the p-value of a test of the t of differences between the samples (most convenient on a negative logarithmic scale - in this way, the smaller p-values seem much higher—)
  • the first axis indicates the biological impact of the change and the second indicates the statistical evidence, or the reliability of the change).
  • N 46
  • Example 2 Among the miRNAs detected with significant expression differences (Example 1), only eight miRNAs (let-7g *, m ⁇ R-107, m ⁇ R-299-5p, miR-337-5p, miR-370, miR were detected -505 *, miR-889, miR-99a *) in at least 50% of patients in both groups compared (R and NR) (Table 2). This value was considered representative of the general behavior of the population of the study. Specifically, in the case of miR-107, miR-337-5p, miR-564, miR-605, miR-889 and miR-99a *, expression was detected in 92.8% of the patients studied.
  • Example 2 MicroRNA expression models according to chemotherapy, that is, complete response, partial response, and stable disease versus progressive disease.
  • PD progressive disease
  • CR complete response
  • PR partial response
  • SD stable disease
  • CR complete response
  • PR partial response
  • SD stable disease
  • PD progressive disease
  • microRNA-107 and miR-337-5p were lower in patients with CR and PR compared to SD and PD.
  • the average ACt values were lower in patients with CR and PR compared to SD and PPD.
  • the expression levels of miR-107 and miR-337 -5p were higher in patients with CR and PR than in patients with DS and PD.
  • miRNAs were significantly lower in patients with PR versus PD. No homogeneous distribution was found in the levels of miR-564 expression in four groups of patients classified according to the response to chemotherapy. On the other hand, miR-605 expression levels were significantly lower in patients with PD compared to those patients with CR ( Figure 4).
  • MammU6 is an example of an RNA expression which can be used to normalize the relative expression of the miRNAs of interest.
  • Example 4A ACt value determined for unanswered subjects
  • Example 4B average miRNA values of all subjects:
  • Example 4 C Average ACt value determined for progressive disease and partial response of subjects
  • the expression profile of the microRNA was evaluated using the qRT-PCR analysis as described in the procedure chapter "Testing of the qRT-PCR for RNA and anterior miRNA isolation. The expression of each miRNA was calculated with respect to to the endogenous control MammU6.
  • ACt (Ct of U6B - Ct of the target miRNA). The subjects were grouped according to the RECIST guidelines, and the average ACt values of the progressive disease and the partial response were calculated, respectively. ACt values of the progressive disease / partial response as shown in the following Table 7.
  • Table 7 Average ACt value of progressive disease and partial response

Abstract

El cáncer colorrectal está entre las causas más comunes de muerte relacionada con cáncer en el mundo occidental y entre los tumores malignos más comunes en el mundo. El tratamiento del cáncer colorrectal metastásico comprende normalmente quimioterapia, aunque el éxito de la terapia varía significativamente entre los pacientes. Existe de esta manera una necesidad de predecir la respuesta y las índices de supervivencia de los pacientes individuales. La presente invención proporciona procedimientos y herramientas que representan un avance mayor. En particular, la invención informa acerca de un conjunto de microARN que son útiles en los procedimientos de predecir la supervivencia de pacientes tratadoscon quimioterapia. Las herramientas aplicables en dichos procedimientos de predicción son también parte de la invención.

Description

MODELO DE EXPRESIÓN DE MICROARN COMO INDICADOR DE SUPERVIVENCIA EN PACIENTES DE CÁNCER COLORRECTAL
METASTÁSICO
Antecedentes de la invención
El cáncer colorrectal (CRC), comúnmente conocido como cáncer de intestino, es un cáncer que procede del crecimiento celular descontrolado en el colon, recto o apéndice, y se origina a partir de las células epiteliales que tapizan el colon o el recto del tracto gastrointestinal. Los síntomas y signos del cáncer colorrectal dependen de la localización del tumor en el intestino. El CRC es la segunda causa más común de muerte relacionada con cáncer en el mundo occidental (Knijin y col., Discov. Med. 2010 (47):328-36). Es también el tumor maligno más común en el mundo (Jemal y col., 2011 , CA Cáncer J. Clin. 61(2): 69-90). Se estima que se podrían evitar por lo menos un 60% de muertes por cáncer colorrectal si toda la población de varones y mujeres de 50 años o más se controlara de manera rutinaria, aunque los procedimientos de cribado son a menudo insatisfactorios. Cuando se detecta en etapas iniciales, las posibilidades de cura gracias a una resección del tumor aumentan mucho. Sin embargo, la incidencia y mortalidad del CRC están creciendo debido a la elevada tasa de incidencia del tumor. A pesar de los avances en la detección temprana del CRC, aproximadamente un 40% de pacientes muere debido a la progresión del tumor después de 5 años de seguimiento (Parkin, 2004, Mol. Cáncer Ther. 9(12): 3396-3409).
Una de las razones relacionadas con la baja tasa de supervivencia de los pacientes de CRC es que casi el 50% de pacientes de cáncer colorrectal desarrollan metástasis, lo que conduce al cáncer colorrectal metastásico (MCRC). La tendencia al desarrollo de metástasis es también lo que hace al CRC particularmente peligroso (Knijin y col., Discov. Med. 2010 (47):328-36). El cáncer colorrectal metastásico es por tanto un cáncer que experimenta una diseminación desde el lugar en el que se inició por primera vez a otro lugar/órgano del cuerpo. El cáncer colorrectal avanzado (CRC avanzado o ACC) se puede definir como el cáncer colorrectal que en la presentación (o recaída) es tanto (i) metastásico como (ii) tan avanzado localmente que no se puede llevar a cabo la resección quirúrgica con intenciones curativas. El cáncer colorrectal metastásico (MCRC) se incluye de esta manera en el CRC avanzado.
De manera breve, el cáncer colorrectal se puede dividir en varias etapas, dependiendo de las medidas de la diseminación del tumor primario a través de las capas de la pared del colon o recto hacia los órganos adyacentes, nodulos linfáticos y sitios distantes, evaluando por consiguiente la progresión del tumor. Originalmente existía el sistema de clasificación de Dukes, que clasificaba los pacientes en una de tres categorías (Etapas A, B, C). Astler-Coller modificó posteriormente este sistema para incluir una cuarta etapa (etapa D) (Astier y col., Ann. Surg. 1954; 139:846-852); Gunderson y Sosin transformaron con posterioridad éste de nuevo en 1978. Más recientemente, el American Joint Committee on Cáncer (AJCC) ha introducido el sistema de estadificación TNM, que sitúa a los pacientes en una de cuatro etapas (Etapa I— IV), tal como desarrolló el American Joint Committee on Cáncer (AJCC Cáncer Staging Manual, 7a ed., Springer, Nueva York, NY, 2002). La estadificación de los tumores rectales se lleva a cabo con unos criterios similares a los utilizados para los tumores de colon. Los cánceres de colon se clasifican en localizados (etapa I y etapa II), diseminados regionalmente (etapa III) o diseminados a distancia (etapa IV).
La elección del tratamiento para un paciente concreto se basará en consideraciones que implican la etapa del cáncer. Las opciones clásicas implican cirugía y/o terapia mediante la administración de fármaco(s) anticanceroso(s). Para eliminar tumores en el colon debidos a cáncer de colon, la resección es el tratamiento más común. Tras la cirugía, se van a necesitar chequeos regulares para asegurar que el cáncer no se ha reproducido.
Se sabe que, en el caso del CRC, la (quimio)terapia auxiliar es eficaz en la prevención de la extensión de la enfermedad metastásica que procede de un cáncer colorrectal que se ha eliminado quirúrgicamente. De esta manera, la (quimio)terapia auxiliar es normalmente un tratamiento de seguimiento para individuos que se han sometido a cirugía. Los fármacos citotóxicos actualmente usados en el tratamiento del cáncer colorrectal avanzado (ACC) son principalmente las fluoropirimidinas (tales como 5-fluorouracilo), irinotecán y oxaliplatino (Knijin y col., Discov. Med. 2010 (47):328-36). Durante mucho tiempo, 5-fluorouracilo más leucovorina (5-FU/LV) fue la única pauta terapéutica eficaz con un tiempo promedio de supervivencia total (OS) de aproximadamente 12 meses. Otros dos agentes citotóxicos, irinotecán y oxaliplatino, han mejorado adicionalmente el OS promedio (Koopman y Punt, 2009, Eur. J. Cáncer, 45 Suppl 1 :50-6). Recientemente, el tratamiento con anticuerpos monoclonales, la así denominada "terapia dirigida", ha añadido algún beneficio adicional a las terapias CRC existentes (Knijin y col., Discov. Med. 2010 (47):328-36). Sin embargo, se sabe generalmente que la "terapia dirigida" mediada por anticuerpos es cara y que, en muchos casos, su éxito puede depender de algunos modelos de expresión génica en la célula diana tipo. Por tanto, sería también deseable pronosticar qué pacientes responden bien a un tratamiento quimioterapéutico clásico.
En general, se ha informado que algunos factores biológicos están implicados en diversos tipos particulares de cánceres, incluyendo las mutaciones somáticas de genes concretos, la expresión alterada de proteínas, y la activación alterada de proteínas, y modelos alterados de expresión génica. Sin embargo, lo que llega a ser evidente de dichos estudios es que se encuentran implicados diferentes factores en diferentes tipos de cánceres, y que las relaciones cruzadas son difíciles y poco fiables.
El valor clínico de los marcadores moleculares en términos de su significancia como marcadores pronósticos o predictivos en el cáncer colorrectal metastásico (MCRC) sigue siendo poco claro. Hasta la fecha, se han descrito cambios somáticos con una respuesta a la terapia en el CRC, tales como KRAS, BRAF, poliposis adenomatosa del colon (APC) y mutaciones de TP53. Muchas de estas proteínas implicadas en las rutas claves de señalización del CRC están alteradas y parecen verse afectadas por la regulación del miARN. Tal y como se detalla a continuación, los microARN 8
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(miARN) son moléculas cortas de ARN no codificante que funcionan como reguladores postraduccionales de la expresión génica. De esta manera, mediante dos tipos de enfoque en el CRC, es decir, el perfilado y el análisis funcional del miARN, ha sido posible mejorar nuestro conocimiento acerca de algunos marcadores moleculares asociados con el CRC. Algunos estudios han examinado los perfiles de expresión del miARN en tumores colorrectales y tejidos no tumorales para evaluar su asociación con el CRC (etapas). Por ejemplo, en el caso del documento US2009/0233297A1 , los inventores debían identificar los miARNs que son útiles para el diagnóstico y/o el pronóstico de la recurrencia colorrectal en pacientes con cáncer en la etapa II o la etapa III. Desde un punto de vista funcional, se ha relacionado la expresión de algunos miARNs con un papel en las rutas de la patogénesis del CRC, tales como las alteraciones en la familia m¡R-135 que regula los niveles de APC, que conducen a la activación de la ruta de la Wnt/ -catenina (Nagel y col., 2008., Cáncer Res 68(14): 5795-5802). Se ha sugerido también que la ruta de señalización de EGFR contribuye al desarrollo y a la progresión del CRC (Krasinskas, A. M. (2011 ), Patholog. Res. Int. 2011 : 932932), y se ha descrito KRAS como una diana directa de la familia del miARN de let-7, miR-143, miR- 146b-3p, miR-18a, y miR-486-5p (Johnson y col. 2005, Cell 120(5): 635-647). Algunos estudios, tales como el de Slaby y col., Mol. Cáncer, 2009, 8: 102 han intentado ampliar la imagen mediante cartografiado de factores individuales, tales como miARNs individuales en el CRC, en rutas conocidas de señalización celular. Dichos intentos llegan, sin embargo, con el inconveniente de que cualquier miARN dado tiene una gran variedad de dianas diferentes (en algunas estimaciones aproximadamente 200 dianas por miARN de promedio), y por lo tanto dicho miARN dado está implicado normalmente en una multiplicidad de rutas celulares diferentes. A pesar del esfuerzo de Slaby y col, no es posible actualmente asignar de manera general un tipo de cáncer concreto a un conjunto de miARNs específicos, y a su vez, no es posible generalmente cartografiar un miARN concreto en una ruta conocida. Aún es menos posible predecir qué miARN podría estar asociado con alguna respuesta determinada a algún tratamiento concreto. Las actuales estimaciones del riesgo de recurrencia, decisiones de tratamiento y respuesta al tratamiento se siguen basando principalmente en la etapa del tumor. En el caso del cáncer de colon por ejemplo, la existencia de metástasis nodal ha sido el factor global de pronóstico más utilizado en la determinación de la supervivencia a largo plazo de los pacientes que padecen cáncer de colon. El resultado clínico, sin embargo, depende en gran medida de la comprensión de la biología del tumor. Sería, por tanto, de ayuda identificar biomarcadores fiables en pacientes que padecen CRC, lo que permitiría la predicción de la respuesta de pacientes a la quimioterapia y también ayudaría a la elección de una terapia apropiada para estos individuos y de esta manera, en último extremo, a la prolongación de la vida o a la mejora de la calidad de vida. No existen hasta el momento estudios comprehensivos que relacionen un perfil de expresión de miARNs con la respuesta a la quimioterapia en pacientes que padecen CRC metastásico.
Problema a resolver
Debido a que el CRC avanzado es una forma particularmente peligrosa de CRC, resulta muy deseable predecir qué pacientes con CRC avanzado responden bien al tratamiento quimioterapéutico. Una meta de la presente invención es, por tanto, la provisión de un procedimiento fácil y fiable in vitro capaz de predecir la respuesta a la quimioterapia de aquellos pacientes que padezcan de cáncer colorrectal avanzado.
De esta manera, un primer objectivo de la presente invención es el de superar algunos inconvenientes asociados con los procedimientos predictivos del CRC presentes en el estado de la técnica. En este sentido, la presente invención proporciona una serie de procedimientos y herramientas útiles para predecir la supervivencia de aquellos pacientes que padezcan de cáncer colorrectal, en particular la presente invención predice la supervivencia global o la supervivencia exenta de progresión. Un objetivo adicional de la presente invención, radica en proporcionar la medicación apropiada para un paciente individual que padezca de CRC basándose en la predicción del éxito del tratamiento. Un problema adicional a resolver es la provisión de un sistema de detección, tal como un kit, que puede ser útil en los procedimientos de la invención.
Términos y abreviaturas
ACC cáncer colorrectal avanzado
CR respuesta completa
CRC cáncer colorrectal
Ct valor umbral de ciclo
ADN ácido desoxirribonucleico
MCRC cáncer colorrectal metastásico
ARNm ARN mensajero
miARN microARN
RECIST Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos
ARN ácido ribonucleico
OS supervivencia global
PD enfermedad progresiva
PFS supervivencia exenta de progresión
PR respuesta parcial
SEQ secuencia
SD enfermedad estable
TNM Sistema de estad ificación tumor-nódulo-metástasis
Breve descripción de la invención
La presente invención, proporciona un procedimiento de predicción de la respuesta de un sujeto humano, en el que el sujeto padece cáncer colorrectal preferiblemente cáncer colorrectal metastásico, a quimioterapia. El procedimiento comprende la detección, en una muestra de dicho sujeto, de los niveles de expresión de uno o más miARN seleccionados del siguiente grupo: SEQ ID NO: 1 (miR107); SEQ ID NO: 2 (miR337-5p); SEQ ID NO: 3 (miR564); SEQ ID NO: 4 (miR605); SEQ ID NO: 5 (miR889); SEQ ID NO: 6 (miR99a*). Los inventores han demostrado que los niveles de uno o más de estos miARN pueden ser indicativos de una falta de respuesta, o de la respuesta de un sujeto. En una realización, la respuesta es una respuesta a la reducción de la carga tumoral. En una realización alternativa, la respuesta es una mejora o ausencia de deterioro del estado del tumor. En otra realización, la respuesta es un resultado clínico, tal como la supervivencia exenta de progresión o la supervivencia global.
El procedimiento para determinar el resultado, es decir, el nivel de expresión del miARN no está particularmente limitado y puede seleccionarse a partir de un procedimiento de perfilado génico, tal como una micromatriz, y/o un procedimiento que comprende la PCR, tal como la PCR en tiempo real y/o la transferencia Northern. Se prefiere la PCR en tiempo real, y los valores con respecto a un valor de referencia indicativo de la falta de respuesta se pueden expresar como -AACt.
Se prefiere que el sujeto cuya respuesta se va a predecir se haya sometido a cirugía del tumor, es decir, la resección quirúrgica del cáncer antes de la aplicación del procedimiento de la invención. Es posible que en el momento de tomar la muestra del sujeto humano, el sujeto humano esté (i) siendo tratado mediante quimioterapia, o (ii) no esté siendo tratado mediante quimioterapia, pero, se prefiere (ii). De esta manera, se puede predecir la respuesta a la quimioterapia tras la cirugía. La respuesta a la quimioterapia que se puede predecir comprende preferiblemente la administración de fluoropirimidina, sola o en combinación con un agente adicional. En realizaciones particulares de la presente invención, la quimioterapia puede comprender la administración de oxaliplatino y fluoropirimidina, o de irinotecán y fluoropirimidina.
En el procedimiento de la presente invención, la expresión del miARN puede estar normalizada, preferiblemente en relación con la expresión de otra molécula de ARN, tal como MammU6.
La invención proporciona también un procedimiento para clasificar un sujeto humano que padece cáncer colorrectal metastásico en uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende sujetos identificables mediante el procedimiento de la invención; y en el que el grupo 2 representa el resto de sujetos. Es posible proporcionar una terapia personalizada a un individuo, dependiendo de si el individuo se ha clasificado en el grupo 1 o en el grupo 2.
De esta manera, la presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende fluoropirimidina y un agente adicional, seleccionado entre oxaliplatino e irinotecán, para tratar un sujeto humano del grupo 1.
Además, la invención proporciona un anticuerpo para tratar a un sujeto humano del grupo 2. El anticuerpo se selecciona preferiblemente a partir de un anticuerpo dirigido contra VEGF y un anticuerpo dirigido contra EGFR. El anticuerpo dirigido contra VEGF puede ser bevacizumab, y el anticuerpo dirigido contra EGFR se puede seleccionar entre cetuximab and panitumumab.
La presente invención proporciona también un kit que comprende al menos un(os) oligonucleótido(s) capaces de hibridarse con uno cualquiera o más, preferiblemente dos o más, y aún más preferible con todos los miARNs que se definen como SEQ ID NOs: 1 a 6. Se prefiere que dicho(s) oligonucleótido(s) sea(n) capaz(ces) de hacerlo en condiciones rigurosas (stringent conditions). En una realización preferida, uno o más de dicho uno o más oligonucleótido(s) (ADN preferiblemente) se definen adicionalmente mediante las siguientes SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12. Es también posible que dicho kit comprenda adicionalmente un cebador de poli T oligonucleótido (ADN). Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) se inmovilicen en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En aún otra realización de la invención, el kit comprende una micromatriz.
El uso del kit no está particularmente limitado, aunque se prefiere su uso en el procedimiento de la invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Gráfico volcán de los miARN expresados diferencialmente entre con respuesta y sin respuesta a la quimioterapia. El log2 del cambio de veces se representa en el eje x y el logaritmo negativo de los valores p del test de la t se representa en el eje y. La línea negra rayada muestra el punto en que p = 0,05, teniendo los puntos por encima de la línea p < 0,05 y teniendo los puntos por debajo de la línea p > 0,05.
Figura 2. Resultado clínico en pacientes con respuesta o sin respuesta a la quimioterapia de acuerdo con el estado de expresión de los miARN. (A) Supervivencia exenta de progresión (PFS) y (B) supervivencia global mediante los niveles de expresión de los miARN. La línea negra sólida muestra los pacientes con niveles de miARN por encima o iguales al valor promedio de ACt.
La línea negra punteada muestra los pacientes con niveles de miARN por debajo del valor promedio de ACt.
Figura 3. Resultado clínico en pacientes con respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable y enfermedad progresiva sobre la base de los niveles de expresión de los miARN. (A) supervivencia exenta de progresión (PFS) y (B) supervivencia global mediante los niveles de expresión de los miARN. La línea negra sólida muestra los pacientes con niveles de miARN por encima o iguales al valor promedio de ACt. La línea negra punteada muestra los pacientes con niveles de miARN por debajo del valor promedio de
ACt.
Figura 4. Comparación del valor promedio de ACt en pacientes con respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD) frente a enfermedad progresiva. *valor de p < 0,05. La parte superior y la parte inferior del recuadro son siempre los percentiles 25 y 75 y la banda próxima a la mitad del recuadro es siempre el percentil 50.
Figura 5. Comparación de los resultados obtenidos de pacientes con cáncer colorrectal avanzado estratificados como R y NR y los obtenidos en CR, PR, SD y PD.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para la predicción de la respuesta de un sujeto humano a la quimioterapia, en el que el sujeto padece cáncer colorrectal avanzado, tal como cáncer colorrectal metastásico (MCRC). Tal como se ha dicho anteriormente, el cáncer colorrectal avanzado (CRC o ACC avanzado) se puede definir como cáncer colorrectal que en la presentación (o recurrencia) es tanto (i) metastásico como que (ii) está tan avanzado localmente que es improbable que se lleve a cabo la resección quirúrgica con intención curativa. El cáncer colorrectal metastásico (MCRC) está incluido en la definición de CRC avanzado.
El diagnóstico del cáncer colorrectal se puede llevar a cabo mediante la biopsia del tumor, y la extensión de la enfermedad se determina a continuación usualmente mediante un barrido CT u otras pruebas de formación de imágenes. A continuación, se determina la etapa del cáncer de colon, basándose preferiblemente en el sistema TNM que está determinado por la cantidad en que se ha diseminado el tumor inicial, y si los nodulos linfáticos están afectados y, si existe metástasis, cuánto se ha desarrollado. De esta manera, para el procedimiento de la presente invención, el sistema de estadificación TNM, que sitúa a pacientes en una de cuatro etapas (Etapa I- IV), tal como desarrolló el American Joint Committee on Cáncer (AJCC Cáncer Staging Manual, 7a edición) se usa preferiblemente para definir la etapa o la gravedad del CRC en un sujeto concreto o para clasificar un sujeto particular en un grupo concreto (l-IV). El sistema TNM evalúa el tumor primario (T), los nodulos linfáticos regionales (N) y la metástasis distante (M). El American Joint Committee on Cáncer y la International Union for Cáncer Control actualizan periódicamente el sistema de estadificación tumor-nódulo-metástasis (TNM) del cáncer, basándose en los avances en la comprensión de los avances del pronóstico del cáncer actuales y relevantes para la práctica clínica. En una realización particular, se puede usar la estadificación tal como se describe en las NCCN Guidelines Versión 2.2012 Staging Colon Cáncer, disponible por ejemplo en línea en NCCN (www.nccn.org). Las categorías TNM reflejan resultados muy similares para el cáncer rectal y de colon. Por tanto, estas dos enfermedades comparten el mismo sistema de estadificación (Gunderson y col., J Clin Oncol. 10 de enero de 2010; 28(2):256-63).
En la presente invención, el procedimiento se puede llevar a cabo en sujetos con cualquier etapa de cáncer colorrectal, aunque se prefiere que se lleve a cabo en pacientes con una etapa avanzada, tales como con pacientes del grupo que comprende cualquiera de las etapas II, III o IV, y preferiblemente con pacientes del grupo que comprende cualquiera de las etapas III o IV, y lo más preferible, con pacientes que padezcan de cáncer colorrectal en la etapa IV. En una realización particular, el perfil determinado por la presente invención es más bien predictivo en lugar de pronóstico y diagnóstico. El cáncer colorrectal metastásico se define como un tipo de cáncer colorrectal avanzado, y el procedimiento de la invención se lleva a cabo preferiblemente con sujetos que padecen cáncer colorrectal avanzado.
Los sujetos cuya respuesta se predice son sujetos humanos que padecen CRC. Los términos "sujeto humano", "sujeto" y "paciente" se usan por tanto de manera indistinta en esta memoria descriptiva.
"Uno o más" tal como se usa también en la presente memoria descriptiva incluye uno y la especificación individualizada de cualquier número que sea más de uno, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc. "Más de uno" o "algunos" tal como se usa en la presente memoria descriptiva incluye la especificación individualizada de cualquier número que sea más de uno, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc.
El procedimiento de la invención comprende la detección, en una muestra procedente de un sujeto humano, de los niveles de expresión de uno o más miARNs particulares. Ejemplos ilustrativos no limitantes de dichas muestras incluyen diferentes tipos de muestras de tejidos, así como de fluidos biológicos, tales como sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, fluido peritoneal, heces. Preferiblemente, dichas muestras son muestras de tejidos y lo más preferible, dichas muestras de tejidos se originan de tejido del tumor CRC del individuo cuya respuesta se va a predecir y se pueden originar a partir de biopsias, preferiblemente provenientes de resección quirúrgica.
A no ser que se especifique expresamente de otra forma, el término "que comprende" se usa en el contexto de este documento para indicar que pueden estar opcionalmente presentes miembros adicionales además de los miembros de la lista introducida por el término "que comprende". Se contempla, sin embargo, como una realización específica de la presente invención que el término "que comprende" abarque la posibilidad de que no se encuentren presentes miembros adicionales, es decir, a los fines de esta realización "que comprende" debe entenderse que tiene el significado de "que consiste en". Los presentes inventores han investigado la asociación entre el perfil de expresión del miARN y el cáncer colorrectal en pacientes que reciben quimioterapia tras cirugía, lo que permite su uso como factor predictivo en la supervivencia exenta de progresión y la supervivencia global de pacientes que padecen cáncer colorrectal, así como como factores predictivos para el éxito de la quimioterapia (respuesta a la quimioterapia). En una realización particular, los pacientes padecen cáncer colorrectal en la etapa IV.
Los microARN son ARN monocatenarios de ~22-nucleótidos (aprox. 18- 25 nucleótidos) y regulan negativamente (inhiben) la expresión génica mediante la inhibición de la traducción o la escisión del ARNm. De esta manera, los miARN son reguladores postranscripcionales que se unen a secuencias complementarias en las transcripciones de ARN mensajeros diana (ARNm), dando como resultado la represión de la traducción o la degradación de la diana y el silenciamiento del gen. En un aspecto particular de la invención, la comprensión de los detalles moleculares de la acción de los miARN de la invención no es crítica, debido a que los niveles detectados de los miARN indicadores solo permiten llevar a cabo el procedimiento de la invención.
En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento que implica el uso del conjunto de miARNs consistente en: SEQ ID NO: 1 (miR107); SEQ ID NO: 2 (m¡R337-5p); SEQ ID NO: 3 (miR564); SEQ ID NO: 4 (miR605); SEQ ID NO: 5 (miR889); SEQ ID NO: 6 (miR99a*). En un segundo aspecto, la invención se refiere al uso de cualquier subconjunto de estos miARNs.
Tabla 1A: Secuencias de miARN Ubicaci
SE
ón de la
Q Sanger ID Secuencia
MicroARN MIID Seq.
ID Madura Madura
Tallo
NO
bucle
hsa-miR- MI000011 MIMAT00001 agcagcauuguac
1 50..72
107 4 04 agggcuauc hsa-miR- MI000080 MIMAT00046 gaacggcuucaua
2 23..43
337-5D 6 95 caggagu hsa-miR- MI000357 MIMAT00032 aggcacgguguca
3 16..34
564 0 28 gcagg
hsa-miR- MI000361 MIMAT00032 uaaaucccauggu
4 16..38
605 8 73 gccuucucc hsa-miR- MI000554 MIMAT00049 uuaauaucggaca
5 49..69
889 0 21 accauug hsa-miR- MI000010 MIMAT00045 caagcucgcuucua
6 50..71
99a* 1 11 ugggucu
Tabla 1B: Ubicación de los miARN.
Figure imgf000014_0001
A lo largo de la presente descripción, los inventores proporcionan evidencias mediante análisis univariante y multivariante de que existe un conjunto solapante de miARNs cuya determinación es predictiva tanto del resultado clínico de un sujeto sometido a quimioterapia como de la respuesta de la carga tumoral de un sujeto a la quimioterapia, véase el Ejemplo 3. De esta manera, mediante dos enfoques diferentes (Ejemplo 1 frente al Ejemplo 2), los inventores proporcionan evidencias del poder predictivo de los miARNs de la invención.
En un sistema de nomenclatura normalizado, los nombres se asignan a miARN experimentalmente como sigue: el prefijo "mir" está seguido (por un guión y) un número, en donde el último puede indicar el orden de nomenclatura. El "mir-" en minúscula se refiere al pre-miARN, mientras que un "miR-" en mayúscula se refiere a la forma madura. Los miARN con secuencias casi idénticas, excepto uno o dos nucleótidos, se indican letras minúsculas adicionales, por ejemplo miR99a*. Los pre-miARN que conducen a miARN maduros 100% idénticos pero que se localizan en diferentes lugares en el genoma se indican con un sufijo numérico adicional separado por guión. Se puede designar la especie original con un prefijo de tres letras, por ejemplo, hsa-miR-123 es un miARN humano (Homo sapiens). Debido a que en el contexto de este documento, todos los miARN individualizados son miARN humanos, el prefijo "hsa-" se omite algunas veces. Cuando dos microARN se originan de brazos opuestos del mismo pre-miARN, se denotan con un sufijo - 3p o -5p, tal como por ejemplo miR337-5p. Cuando se conocen niveles de expresión relativos, un asterisco tras el nombre indica un miARN expresado a bajos niveles con respecto al miARN en el brazo opuesto de una horquilla, por ejemplo miR99a*. La mayoría de genes de miARN conocidos se encuentran en regiones intergénicas o están orientados en sentido contrario a los genes adyacentes y se piensa, por tanto, que se transcriben como unidades independientes. Sus genes se transcriben usualmente mediante la ARN polímerasa II y los transcritos procesados, exportados desde el núcleo y procesados adicionalmente mediante maquinarias específicas, como se conoce bien en la técnica (véase por ejemplo. He y col., Nat. Rev. Genet. Jul 2004; 5(7):522-31 ). Se puede acceder a las secuencias de miARN en http://www.mirbase.org.
Es un inconveniente del valor predictivo de muchos análisis convencionales basados en los modelos de expresión del miARN que los miARNs subyacentes solo se expresen a menudo a niveles bajos o incluso no detectables. Dichos miARNs tienen un valor limitado para el pronóstico, en el mejor de los casos. Los miARNs a los que se refiere la presente invención son sin embargo normalmente detectables en un 50 % o más, tal como 60 % o más, 70 % o más u 80 % o más de pacientes de ambos grupos comparados (R (pacientes que muestran respuesta a la quimioterapia "respondedores") y NR (pacientes que no muestran respuesta a la quimioterapia "no respondedores"). En los ejemplos de la presente invención, sin embargo, se consideró la diferencia de la expresión de los miARNs para la evaluación cuando se detectaron el menos en un 50% de pacientes de ambos grupos comparados (R y NR). Se escogió este umbral debido a que representa al menos la mitad de los pacientes. Tal como se muestra en los ejemplos, la expresión de miR-107, miR-337-5p, miR-564, miR-605, miR-889 y miR-99a*, se detectó en un 92,8% de los sujetos estudiados, lo que evidencia la adecuación de estos miARN para el procedimiento predictivo de la presente invención. El procedimiento de la presente invención es de esta manera particularmente fiable en términos de las moléculas indicadoras (los miARN concretos).
El hecho de que las presente invención use miARN (es decir, ARN muy cortos y bien definidos) como factores indicadores tiene la ventaja de una detección fácil y fiable, al contrario que algunos procedimientos conocidos, tales como los descritos por el documento US 201 10039269 A1 , por ejemplo, que se basa en los ARN mensajeros (ARNm) para evaluar la supervivencia del paciente con CRC. Las moléculas de ARNm tienen normalmente un tamaño de varios cientos o incluso varios miles de bases; dichas moléculas grandes y al mismo tiempo delicadas son propensas generalmente a la degradación, y su detección depende de la elección (a menudo ensayo y error) de la sonda apropiada, lo que convierte dichos ensayos a primera vista en menos fiables que los procedimientos de la presente invención. Los miARN indicadores del procedimiento de la presente invención son uno o más de los seleccionados entre el grupo que consiste en los que se han definido mediante las siguientes SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 1 (miR 07); SEQ ID NO: 2 (miR337-5p); SEQ ID NO: 3 (miR564); SEQ ID NO: 4 (m¡R605); SEQ ID NO: 5 (miR889); SEQ ID NO: 6 (miR99a*). Los inventores han evidenciado que estos miARNs son indicadores predictivos de la respuesta de un sujeto que padezca CRC a quimioterapia (véase por ejemplo el Ejemplo 3, Figura 5). El procedimiento implica la comparación de los niveles de expresión de dichos miARNs con los niveles de expresión de dichos miARNs en una muestra de referencia o con los niveles promedios de expresión de dichos miARNAs. En el contexto de la presente invención, se entiende "muestra de referencia" como la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión de los miARNs de la presente invención. En una realización de la invención, el valor de referencia se obtiene a partir de la señal proporcionada usando una muestra de tejido obtenida de un individuo que es un no respondedor. Preferiblemente, las muestras se toman del mismo tejido de varios individuos no respondedores y se combinan, de tal manera que el valor de referencia refleja el valor promedio de dichas moléculas en la población de no respondedores. "Valor de referencia" es el nivel de expresión de un miARN de la invención en la muestra de referencia. El valor de referencia indicativo de la no respuesta para cada miARN concreto debe conocerse antes de llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Se prefiere que la muestra de referencia sea del mismo tejido y/u obtenida mediante el mismo procedimiento (opciones descritas anteriormente) que la muestra a partir de la cual se va a predecir la respuesta del individuo. Se prefiere que la muestra se origine a partir de la misma etapa o gravedad del CRC que la muestra a partir de la cual se va a predecir la respuesta del individuo. De esta manera, si se va a predecir la respuesta de un paciente que padezca CRC con un cáncer tipo IV (que es una manera preferida de llevar a cabo la invención), entonces, la muestra de referencia seria también la de un paciente no respondedor que padezca de CRC tipo IV o en la etapa IV. La respuesta puede referirse a las características de los tumores del sujeto. De manera alternativa pero no mutuamente excluyente, la respuesta puede referirse al resultado clínico del sujeto.
De esta manera, mediante el procedimiento de la invención, se puede predecir si un paciente individual mostrará (i) una respuesta (R) a la quimioterapia o (ii) no mostrará respuesta (NR) a la quimioterapia.
Siempre que la respuesta se refiera a las características de los tumores del sujeto, la distinción entre R y NR se puede llevar a cabo sobre la base del cambio en el tamaño de la lesión. Por ejemplo, se puede definir "Respuesta" como una disminución en la carga total del tumor (definida como la suma de las áreas del tumor de lesiones medidas bidimensionalmente), tomando como referencia los valores correspondientes al valor inicial, sin la aparición de una nueva lesión. De manera particular, la respuesta puede ser > 5 % de disminución en la carga total del tumor, tal como > 10 % de disminución en la carga total del tumor, > 15 % de disminución en la carga total del tumor,≥ 20 % de disminución en la carga total del tumor,≥ 25 % de disminución en la carga total del tumor,≥ 30% de disminución en la carga total del tumor, > 35 % de disminución en la carga total del tumor, > 40 % de disminución en la carga total del tumor,≥ 45 % de disminución en la carga total del tumor o≥ 50 % de disminución en la carga total del tumor, definida cada una como la suma de las áreas del tumor de las lesiones medidas bidimensionalmente. En una realización preferida de la presente invención, la respuesta se define como > 30% de disminución en la carga total del tumor (definida como la suma de las áreas del tumor de las lesiones medidas bidimensionalmente), tomando como referencia los valores correspondientes a los valores iniciales, sin la aparición de una nueva lesión. La falta de respuesta (NR) se define de forma contraria a (R). Preferiblemente, sin respuesta (NR) se define como < 30% de disminución en el área del tumor de una o más lesiones medibles, o la aparición de al menos una nueva lesión. Esto incluye normalmente un aumento, tal como > 20% de aumento en el área de una o más lesiones medibles o la aparición de al menos una nueva lesión. Los inventores han demostrado que, cuando se define la respuesta como disminución en la carga total del tumor, los niveles de expresión de uno o más miARNs tal y como se definen en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 5, 6 son buenos indicadores predictivos de dicha respuesta.
En concreto, dichos niveles de expresión indican una disminución en la carga total del tumor si: (i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 han aumentado; y/o (¡i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2 han aumentado; y/o (v) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 5 han disminuido; y/o (vi) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 6 han aumentado con referencia a un valor control indicador de la falta de respuesta. Esto se aplica particularmente si la respuesta se define como≥ 30% de disminución en la carga total del tumor.
Siempre que "Respuesta" se refiera al resultado clínico del sujeto, se puede expresar la "Respuesta" como la supervivencia global o la supervivencia exenta de progresión. La supervivencia de pacientes de cáncer se expresa de manera adecuada generalmente mediante las curvas de Kaplan-Meier, que han recibido su denominación de Edward L. Kaplan y Paul Meier que fueron los que describieron éstas en primer lugar (Kaplan, Meier: Amer. Statist. Assn. 53:457- 481). El estimador Kaplan-Meier se conoce también como el estimador límite del producto. Sirve para estimar la función de supervivencia a partir de los datos del tiempo de vida. Una representación gráfica de la estimación de Kaplan-Meier de la función de supervivencia es una serie de etapas horizontales de magnitud decreciente que, cuando se toma una muestra suficientemente grande, se aproxima a la función de supervivencia verdadera de esta población. El valor de la función de supervivencia entre sucesivas observaciones muestreadas distintas se supone que es constante. En la estadística en la que se basa la presente invención, los pacientes de CRC se agrupan en categorías, por ejemplo, aquellos con un perfil de expresión concreto tal como el perfil de expresión de un miARN particular y aquellos sin dicho perfil. Con respecto a la presente invención, se puede usar el estimador de Kaplan-Meier para medir la fracción de pacientes vivos a lo largo de un espacio de tiempo tras comenzar la quimioterapia. El resultado clínico previsto puede ser la supervivencia (global/exenta de progresión) en meses/años desde el momento de tomar la muestra. Puede ser la supervivencia durante un cierto periodo de tiempo desde la toma de la muestra, tal como, de seis meses o más, un año o más, dos años o más, tres años o más, cuatro años o más, cinco años o más, seis años o más. En cada caso, la "supervivencia" puede referirse a la "supervivencia global" o a la "supervivencia exenta de progresión".
De esta manera, en una realización de la invención, la respuesta se basa en el resultado clínico, concretamente en la "supervivencia global" (OS). La "supervivencia global" denota las posibilidades de un paciente de CRC de seguir vivo en un grupo de individuos que padecen cáncer. La cuestión decisiva es si el individuo muere o vive en un momento dado. Los inventores han demostrado que todos los miARNs de la invención son indicadores de supervivencia global. En particular, cuando en el procedimiento de la invención el resultado clínico es la supervivencia global, el resultado del procedimiento de la invención es indicador de la supervivencia global si se observan uno o más de los siguientes hechos: (i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 han aumentado; y/o (¡i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2 han aumentado; y/o (iii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 3 han aumentado; y/o (iv) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 4 han disminuido; y/o (v) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 5 han disminuido; y/o (vi) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 6 han aumentado, cada uno con respecto al valor promedio, donde el valor promedio se calcula a partir de todos los valores de expresión del miARN tal y como se ilustra en el ejemplo 4B.
En el Ejemplo 4 B se proporciona el valor promedio determinado por los presentes inventores. De esta manera, los valores promedio proporcionados en el Ejemplo 4 B se pueden usar en esta realización de la invención.
Se entenderá fácilmente que, debido a que estas alteraciones (aumento/disminución) de los valores son predictivas con respecto al valor ACt promedio, (i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 si aumentan; y/o (ii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2, si aumentan; y/o (iii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 3, si aumentan; y/o (iv) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 4, si disminuyen; y/o (v) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 5, si disminuyen; y/o (vi) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 6, si aumentan con respecto al valor de referencia indicador de la falta de supervivencia, son también indicadores de supervivencia global.
En una realización alternativa, la respuesta se basa en el resultado clínico, concretamente en la "supervivencia exenta de progresión" (PFS). La supervivencia exenta de progresión (PFS) es el plazo de tiempo durante y después de la medicación o tratamiento durante el cual, el CRC que se está tratando mediante la quimioterapia no empeora. El tema decisivo en esta realización es si el individuo que padece CRC muestra una disminución en la carga del tumor (tal como se ha descrito anteriormente) en un momento dado. Los presentes inventores han demostrado que los valores del miARN de la invención son indicadores de la falta de respuesta si se observan uno o más de los siguientes: (i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 han aumentado; y/o (ii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2 han aumentado; y/o (iv) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 4 han disminuido; y/o (vi) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 6 han aumentado, cada uno con referencia al valor promedio (véase el Ejemplo 4 B), donde el valor promedio se calcula a partir de todos los valores de expresión de los miARNs respectivos. Se entenderá fácilmente que, debido a que estas alteraciones de los valores son predictivas con respecto al valor promedio, (i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 , si aumentan; y (ii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2, si aumentan; y (iv) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 4, si disminuyen; y (vi) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 6, si aumentan con respecto a un valor de referencia indicador de la falta de PFS, son también indicadores de PFS.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento de predicción de la respuesta completa y/o la respuesta parcial de un sujeto humano a la quimioterapia, en el que el sujeto padece cáncer colorrectal metastásico, y en el que el procedimiento comprende detectar, en una muestra de un sujeto, los niveles de expresión que comprenden uno o más miARNs de la invención. En particular, los inventores proporcionan evidencias de que se pueden usar los niveles de expresión de uno o más miARNs tal como se ha definido en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 4 como indicadores, y que el resultado es indicador de la respuesta completa o la respuesta parcial de un sujeto humano si se observan uno o más de los siguientes hechos: (i) los niveles del miARN tal como se ha indicado en la SEQ ID NO: 1 han aumentado; y/o (ii) los niveles del miARN tal como se ha indicado en la SEQ ID NO: 2 han aumentado; y/o (iv) los niveles del miARN tal como se ha indicado en la SEQ ID NO: 4 han disminuido, con respecto a un valor de referencia indicador de la enfermedad progresiva. La presente invención proporciona valores de referencia de la enfermedad progresiva, tal y como se ha determinado por los autores, en el Ejemplo 4 C.
La evaluación de la respuesta completa y/o la respuesta parcial es un factor importante para determinar el estado de un paciente individual. De esta manera, es necesario estimar la carga total del tumor en el valor inicial y usar ésta como elemento comparador para las posteriores medidas que se llevan a cabo normalmente de acuerdo con las directrices RECIST revisadas, Eisenhauer y col., Eur. J. Cáncer, 45 (2009) 228-247 (versión 1.1.), en particular las definiciones de los criterios utilizados para determinar la respuesta, las proporciona Eisenhauer y col. de acuerdo con las siguientes definiciones:
1. Respuesta Completa (CR): Desaparición de todas las lesiones diana. Cualquier nodulo linfático patológico (tanto diana como no diana) debe tener reducción en el eje hasta <10 mm. 2. Respuesta Parcial (PR): Al menos una disminución del 30% en la suma de diámetros de las lesiones diana, tomando como referencia el valor inicial de la suma de diámetros.
3. Enfermedad Progresiva (PD): Al menos un aumento del 20% en la suma de diámetros de las lesiones diana, tomando como referencia la suma más pequeña en el estudio (esto incluye el valor inicial de la suma si este es el más pequeño del estudio). Además del aumento relativo del 20%, la suma debe también demostrar un aumento absoluto de al menos 5 mm. (Nota: la aparición de una o más nuevas lesiones se considera también progresión).
4. Enfermedad Estable (SD): Ni una disminución suficiente para calificarla como PR ni un aumento suficiente para calificarla como PD, tomando como referencia la suma de diámetros más pequeña durante el estudio.
A lo largo de la presente invención, los términos CR, PR, PD y SD se definen de acuerdos con las definiciones 1 a 4 anteriores tomadas de las Directrices RECIST revisadas de Eisenhauer y col., Eur. J. Cáncer, 45 (2009) 228-247.
En cualquiera de las realizaciones de la presente invención, el procedimiento para determinar el resultado, es decir, la determinación del nivel de expresión de los miARNs no necesita limitarse de manera particular y se puede seleccionar a partir de un procedimiento de perfilado génico, tal como una micromatriz y/o un procedimiento que comprenda la PCR, tal como la PCR en tiempo real; y/o la transferencia Northern. La PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR) es una técnica de cuantificación de la expresión génica sensible y reproducible que se puede usar de manera particular para la expresión del perfil del miARN en células y tejidos. Se puede usar cualquier procedimiento para la evaluación de los resultados de la RT-PCR y se puede preferir el procedimiento AACt. El procedimiento AACt se describe en detalle en Livak y col. (Methods 2001 , 25:402-408). (Ct = Valores umbral del ciclo). Cuando se lleva la presente invención a la práctica, se deberá usar preferiblemente el procedimiento AACt tal como describen Livak y col. (Methods 2001 , 25:402- 408). El procedimiento AACt implicará una "muestra del control" y una "muestra del sujeto". La "muestra del sujeto" es una muestra procedente del sujeto que se va a analizar. Por cada muestra, se incluyen un gen diana (aquí: el miARN de interés) y un gen endógeno del control (tal como se describe a continuación) para la amplificación de la PCR a partir de alícuotas (normalmente diluciones en serie). Normalmente se usan varias réplicas de cada concentración diluida para derivar la eficacia de la amplificación. La eficacia de la amplificación de la PCR se puede definir como el porcentaje de amplificación (de 0 a 1). Durante la reacción de la qPCR, un software mide normalmente el número de ciclos de cada muestra en el cual la fluorescencia cruza una línea arbitraria (indicadora de la amplificación de la PCR), el umbral. Este punto de cruce es el valor Ct. Muestras más diluidas cruzarán a valores Ct posteriores. Para cuantificar la expresión génica del miARN, se divide el Ct de un ácido nucleico procedente del miARN del gen de interés por el Ct del ácido nucleico procedente del control endógeno en la misma muestra para normalizar la variación en la cantidad y calidad del ARN entre diferentes muestras y obtener la expresión relativa (con respecto al control endógeno) de cada una de la "muestra del sujeto" y de la "muestra del control". Opcionalmente, esto se lleva a cabo por duplicado, triplicado, cuadriplicado y de manera similar, respectivamente. Se puede obtener de manera adecuada un valor ACt del control calculando el promedio de los valores ACt obtenidos a partir de muestras de un grupo del control de varios individuos con los cuales se van a comparar los valores de la "muestra del sujeto". El grupo del control (del cual se calcula el valor promedio) consiste en los individuos adecuados a los respectivos fines (de comparación). La persona experta aprenderá de esta divulgación que un grupo de control adecuado es para un fin concreto (por ejemplo, en el caso del Ejemplo 4 A, el grupo del control consiste en sujetos sin respuesta, en el caso del Ejemplo 4 B, el grupo del control consiste en todos los sujetos y en el Ejemplo 4 C, el grupo del control consiste en los sujetos con enfermedad progresiva o con respuesta parcial. En una realización particular, la presente invención se puede llevar a la práctica omitiendo la determinación del valor ACt del grupo del control, es decir, determinar (solo) el valor ACt de la "muestra del sujeto" y a continuación comparando posteriormente este con el respectivo valor ACt promedio del control indicado en el Ejemplo 4 (A, B, C, respectivamente).
En la presente invención los cálculos de ΔΔΟί expresan la expresión relativa en el contexto de la "muestra del sujeto" frente a la "muestra del control" (o el promedio de las muestras del control descrito anteriormente). La cantidad de miARN diana, normalizada a una referencia endógena y con respecto a una muestra del control (promedio), se proporciona por: 2-AACÍ. Por ejemplo: si el primer valor (por ejemplo, el sujeto) es mayor que el segundo valor ACt (por ejemplo (promedio) control), entonces, el valor de 2"(ΔΔ Γ) será <1. Esto implica que la expresión relativa en la segunda muestra se redujo con respecto a la primera muestra. Tomando la inversa negativa de 2"(AACT) se proporcionará el cambio de veces de reducción de la expresión. Se pueden encontrar también detalles del procedimiento de cálculo del ΔΔΟί en: Applied Biosystems user Bulletin N° 2 (P/N 4303859).
Una micromatriz es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda con una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de material biológico, en el presente caso, una gran cantidad de miARN diferentes o, preferiblemente, sus transcritos de ADN inverso, que son detectables mediante sondas inmovilizadas específicas sobre el sustrato sólido.
Una transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y la posterior detección con una sonda complementaria a (parte de) la secuencia diana del ARN de interés.
En algunos casos, para cada uno de los miARN del procedimiento de la invención, se considera significativa una relación de expresión de los miARN (sujeto a ser el valor previsto/de referencia), según sea detectable mediante el análisis de la RT-PCR en tiempo real, de 0,9 o inferior, tal como de 0,8 o inferior, o de 0,75 o inferior.
Se prefiere que el sujeto al cual se le va a predecir la respuesta haya experimentado la cirugía del tumor, es decir, la resección quirúrgica del cáncer antes de la aplicación del procedimiento de la invención. Las opciones para la cirugía incluyen, pero no se limitan a, (a) colectomía parcial (el cirujano elimina solo parte del colon) (b) ¡leocolectomía (se elimina el íleo) (c) resección abdominoperineal (operación quirúrgica en la que se eliminan el ano, el recto y el colon sigmoideo), (d) proctosigmoidectomía (se elimina la sección enferma del recto y el colon sigmoideo), (e) colectomía abdominal total (elimina el colon completo pero preserva el recto y el ano), (f) proctocolectomía total (operación del intestino grueso que implica la eliminación del recto y el colon). No se excluye que se usen otros tratamientos tales como la radiación junto con la cirugía.
Es posible que en el momento de tomar la muestra del sujeto humano, el sujeto humano esté (i) siendo tratado con quimioterapia o (ii) no esté siendo tratado con quimioterapia. Se prefiere la opción (¡i). En este sentido, se prefiere la siguiente secuencia de pasos: (a) pacientes que experimentan la cirugía del cáncer colorrectal, (b) a partir de la cirugía, se extrae una muestra reciente del tumor para el análisis del miARN, (c) (opcional) se tratan los pacientes mediante quimioterapia, tal como con quimioterapia basada en fluoropirimidina más oxaliplatino o irinotecán. El aislamiento de la muestra del sujeto vivo como tal no es también una parte de la invención. La cirugía de un cuerpo humano vivo como tal no es también una parte de la invención. Lo que es una parte de la invención es el procedimiento in vitro para determinar el nivel de expresión del miARN de la invención en una muestra que se ha obtenido mediante las etapas (a) y (b). De esta manera, el procedimiento para predecir una respuesta de acuerdo con la presente invención es preferiblemente un procedimiento in vitro.
En el contexto de esta memoria descriptiva, el término "tratamiento" o "tratar" significan la administración de un agente para evitar, aliviar o eliminar el CRC o de uno o más síntomas asociados con dicha enfermedad. "Tratamiento" incluye también evitar, aliviar o eliminar las secuelas fisiológicas de la enfermedad. En el contexto de esta invención, el término "aliviar" se entiende que significa cualquier mejora de la situación del paciente tratado, de manera subjetiva (los sentimiento de o acerca del paciente) y de manera objetiva (los parámetros medidos). En la práctica, la etapa (b) comprende normalmente: (b1 ) la extracción del ARN (total) o del miARN (total) procedentes de la muestra reciente del tumor, y los procedimientos adecuados para este fin no están particularmente limitados. Esta comprende también normalmente la etapa (b2), es decir, la detección de los niveles de los miARN de interés entre el ARN extraído en (b1). Estos procedimientos, a modo de ejemplo, se proporcionan en los materiales y métodos situados al final de la parte descriptiva (Ejemplos).
La quimioterapia, la respuesta a la cual se va a prever, puede ser cualquier tipo de quimioterapia adecuada para tratar a pacientes de cáncer colorrectal. Se entiende la quimioterapia como tratamiento del cáncer con un fármaco antineoplásico o con una combinación de dichos fármacos. Sin pretender estar vinculado a ninguna teoría particular, se entiende que la quimioterapia actúa normalmente eliminando células que se dividen rápidamente, lo que es una de las propiedades principales de la mayor parte de células cancerosas. Para el tratamiento de los pacientes de cáncer colorrectal, la quimioterapia comprende preferiblemente la administración de compuestos de fluoropirimidina, que se piensa que actúan como antimetabolitos. Los ejemplos de compuestos de fluoropirimidina son capecitabina, floxuridina, y fluorouracilo (5-FU), que es el más preferido en la presente invención. Dicha fluoropirimidina se puede administrar sola o en combinación con un agente adicional, por consiguiente, se prefiere la combinación con un agente adicional. El agente adicional puede ser una molécula capaz de interactuar con el ADN, tal como en la inhibición de la síntesis de ADN y/o en prevenir el desenrollado del ADN. En una realización preferida de la presente invención, la quimioterapia puede comprender la administración de oxaliplatino y fluoropirimidina, o de irinotecán y fluoropirimidina. Se piensa que la citotoxicidad del oxaliplatino (documento US 4.169.846) da como resultado la inhibición de la síntesis del ADN en células cancerosas. Los estudios in vivo han mostrado que oxaliplatino presenta actividad antitumoral frente al carcinoma de colon por su efecto citotóxico (no dirigidos). Irinotecán por otra parte es un análogo semisintético del alcaloide natural camptotecina, que se piensa que actúa evitando el desenrollado del ADN mediante la inhibición de la topoisomerasa 1. De esta manera, oxaliplatino e irinotecán se piensa que ejercen su función interviniendo con el ADN.
El procedimiento de la presente invención se puede aplicar con muestras de individuos de cualquier sexo, es decir, hombre o mujer, y de cualquier edad. En una realización particular, los individuos sometidos al procedimiento de la presente invención son individuos de grupos conocidos por su mayor predisposición al CRC, tales como sujetos varones y/o individuos de 50 años de edad o más, o preferiblemente de 60 años de edad o más. Puede también llevarse a cabo con individuos en cualquier etapa del CRC, aunque se prefiere el CRC avanzado preferiblemente el CRC metastásico. Aún más preferido es la utilización del procedimiento de la presente invención para predecir el tratamiento con quimioterapia de un sujeto que padezca de CRC en la etapa IV.
En el procedimiento de la presente invención, se puede normalizar la expresión del miARN en relación con un control endógeno. El control endógeno es preferiblemente la expresión endógena (es decir, en el mismo individuo) de otro ácido nucleico, preferiblemente un ARN, tal como uno cualquiera seleccionado entre ARNm, miARN, ARN nucleolar, ARNr y similares. Se prefiere en gran manera que dicho ARN se sepa que se expresa de manera estable. La expresión estable significa cualquier expresión que se sabe que se expresa de manera independiente de factores variables tales como la edad, el tipo de célula, la enfermedad, el sexo, el estado fisiológico, o la respuesta a condiciones externas, o similares. Los genes que se expresan de manera estable se conocen también como genes de mantenimiento. En una realización particular, se puede escoger este ácido nucleico entre ARN nucleolares pequeños, preferiblemente MammU6. (MammU6 se usa, por ejemplo, para la normalización en el ensayo de microARN humano TaqMan Set v2.0 comercialmente disponible, que se ha usado en los ejemplos de la presente invención). Se pueden usar también para la normalización otros ARN nucleolares tales como RNU44, RNU48, RNU24, RNU43, RNU6B, RNU19, y Z30, así como el miARN de genes (let-7a, miR-10b, miR-16, miR-21 and miR- 26b). RUN44 y RUN48 pueden ser particularmente útiles. Se puede acceder a todas las secuencias de los nucleotidos de los miARN en línea en la miRBase (miRBase 16), que es el principal depositario en línea de todas las secuencias y anotaciones de microARNs (Kozormara y col., Nucí. Acids Res. (2011 ) 39 (suppl 1 )). Las secuencias de nucleotidos de los otros ARN humanos, tales como los ARN nucleolares pequeños se pueden encontrar en línea en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (ensamblaje GRCh37 (GCA_000001405.6) procedente del Genome Reference Consortium). Se describen moléculas adicionales adecuadas para la normalización en Davoren y col., BMC Mol Biol. 2008; 9: 76, y se pueden usar en el procedimiento de la invención. Es también posible que se use más de un ARN diferente para la normalización, tal como dos o más, tres o más y/o hasta cinco ARN diferentes. En cualquier caso, se obtiene el valor de referencia por normalización con respecto al mismo ácido nucleico que el valor del cual se va a predecir la respuesta del paciente. Únicamente a fines de ilustración: si se obtiene el valor de referencia por normalización de la expresión de un(os) miARN concreto(s) de la invención con respecto a la expresión de MammU6, entonces, en el paciente del cual se va a predecir la respuesta, se obtiene también el valor de la expresión por normalización de la expresión de un(os) miARN concreto(s) de la invención con respecto a la expresión de MammU6.
En el procedimiento de la invención, se pueden usar uno o más miARN como control negativo. Para los miARNs del control negativo, se prefiere principalmente un origen no humano.
Es también posible aislar los miARNs de la invención mediante cualquier procedimiento conocido adecuado a dichos fines.
En un tercer aspecto, la invención proporciona también un procedimiento para clasificar un sujeto humano que padece cáncer colorrectal metastásico en uno de dos grupos. A no ser que se especifique de manera implícita o explícita de otra forma, los detalles de la invención tal como se ha detallado anteriormente (incluyendo la normalización, el procedimiento de detección de las etapas del cáncer, etc.) se aplican también al tercer aspecto de la invención. El grupo 1 comprende los sujetos identificables mediante el procedimiento de la invención tal como se ha detallado anteriormente que muestran una cualquiera o más de: respuesta, respuesta parcial, respuesta completa, supervivencia; y en el que el grupo 2 representa el resto de sujetos. Es posible proporcionar una terapia personalizada a un individuo, dependiendo de si el individuo está clasificado en el grupo 1 o el grupo 2. Esto se lleva a cabo normalmente como sigue: (a) pacientes que experimentan cirugía para cáncer colorrectal, (b) a partir de cirugía, se extrae una muestra reciente de tumor para el análisis del miARN para la clasificación en el grupo 1 o el grupo 2. Basándose en la clasificación en el grupo 1 o el grupo 2, se puede seleccionar una terapia personalizada que puede ser particularmente beneficiosa para el paciente, cuyo tratamiento se proporciona además del tratamiento primario, principal o inicial, es decir, la cirugía. Dicho tratamiento adicional se puede denominar terapia auxiliar.
Los presentes inventores han identificado de esta manera un subgrupo novedoso de pacientes que se beneficiarían de la quimioterapia. De esta manera, la presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una fluoropirimidina y un agente adicional, seleccionado entre oxaliplatino e irinotecán, para tratar un sujeto humano del grupo 1. Dada la predicción positiva, la invención proporciona de esta manera un procedimiento de selección de pacientes (grupo 1) que puede ser particularmente beneficioso para la administración de dicha terapia. Además, puede no justificarse en sujetos pacientes del grupo 1 la potencial toxicidad de un tratamiento alternativo, tal como un tratamiento basado en anticuerpos.
Además, la invención proporciona un anticuerpo terapéutico para tratar un sujeto humano del grupo 2. El anticuerpo se selecciona de manera preferible a partir de un anticuerpo dirigido contra VEGF y un anticuerpo dirigido contra EGFR. El anticuerpo es, preferiblemente, un anticuerpo monoclonal, humano o humanizado. Las terapias dirigidas basadas en anticuerpos no son técnicamente quimioterapia. En particular, un anticuerpo útil dirigido contra VEGF puede ser bevacizumab, y el anticuerpo dirigido contra EGFR se puede seleccionar entre cetuximab y panitumumab. Estos anticuerpos se sabe que son adecuados en casos de CRC, pero los criterios de acuerdo con el estado de la técnica por los cuales se seleccionan os pacientes para recibir tanto (1 ) quimioterapia como (2) terapia dirigida basada en anticuerpos son todavía pobres y a menudo insatisfactorios. A la vista de la contribución de la presente invención, y dada la predicción negativa para pacientes del grupo 2, puede no justificarse en sujetos pacientes del grupo 2 la potencial toxicidad y los efectos secundarios de un tratamiento de quimioterapia. Estos pacientes pueden a su vez someterse a un tratamiento con un anticuerpo terapéutico. Aunque no se requiera necesariamente, para definir un subgrupo de pacientes del grupo 2 que se va a someter a una terapia dirigida basada en anticuerpos, puede ser posiblemente recomendable de manera adicional determinar la expresión/estado de los genes para definir un subgrupo del grupo 2 que se va a tratar. Este subgrupo puede expresar niveles indicadores de un gen adicional y algunos anticuerpos terapéuticos vienen con recomendaciones específicas para ensayar los niveles de expresión de dicho gen adicional, ya sea por el fabricante y/o como se recomienda, por ejemplo, por la National Comprehensive Cáncer Network (NCCN, www.nccn.org). Por ejemplo, se sabe que una determinación del estado del gen KRAS a partir tanto del tumor primario status como de un sitio de la metástasis debería ser parte de la elaboración de un pretratamiento con un anticuerpo dirigido contra EGFR para todos los pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal metastásico, basándose en los estudios de los resultados que indican que el estado del tumor producido por el gen KRAS es muy predictivo con respecto a los resultados con terapias dirigidas contra EGFR, es decir, los beneficios de la terapia inhibidora de EGFR se restringieron a pacientes con tumores caracterizados por el gen KRAS natural.
La presente invención proporciona también un kit que comprende al menos un(os) oligonucleótido(s) capaz(ces) de hibridarse con uno cualquiera de dos o más, y preferiblemente todos los miARNs que se definen como las SEQ ID NOs: 1 a 6. En la Tabla A3 se proporcionan las realizaciones particulares de dichos oligonucleótidos.
El kit se basa en el poder predictivo del procedimiento de la presente invención. Tal como se ha mencionado anteriormente, el valor indicador de referencia para la falta de respuesta de cada miARN concreto se puede determinar antes de llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. En el caso particular del kit, se pueden proporcionar con el kit el valor indicador de referencia para la falta de respuesta (y/o un valor de referencia indicador para la respuesta). Con la ayuda del kit, se puede calcular la expresión de cada miARN diana, es decir, con respecto a, dichas moléculas endógenas del control ejemplificadas anteriormente. El control endógeno puede de esta manera estar comprendido también en el kit.
Se prefiere que dicho(s) oligonucleótido(s) tengan un contenido de GC entre 30 % y 70 %, preferiblemente entre 38 y 65 %. Esto se lleva a cabo también de tal manera que el(los) oligonucleótido(s) se hibride(n) con dos correspondientes o menos, y preferiblemente sin correspondientes, con respecto al miARN que se va a determinar.
Siempre que se refiera a la hibridación del(de los) oligonucleótido(s), se prefiere que dicho(s) oligonucleótido(s) sea(n) capaz(ces) de hacerlo en condiciones rigurosas. El rigor es un término usado en los experimentos de hibridación. El rigor refleja el grado de complementariedad entre el oligonucleótido y el ácido nucleico (que es en este caso el del miARN que se va a detectar), el de mayor rigor, el mayor porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico que se une al filtro. La persona experta sabe bien que la temperatura y las concentraciones salinas tienen un efecto directo en los resultados que se obtienen. Se reconoce que los resultados de la hibridación están relacionados con el número de grados por debajo de la Tf (temperatura de fusión) del ADN a la cual el experimento se lleva a cabo. A menudo, se definen las condiciones de rigor como un lavado con 0,1X SSC (tampón de solución salina-citrato de sodio (SSC) a 65°C. (SSC se proporciona normalmente como una disolución madre 20X, que consta de cloruro de sodio 3 M y citrato trisódico 300 mM (ajustado a pH 7,0 con HCI)). En una realización preferida uno o más de dicho uno o más oligonucleótido(s) se definen además por las siguientes SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12. Se proporcionan sus detalles en la Tabla A3.
Tabla A3: Secuencias de oligonucleótidos
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En realizaciones particulares, el kit se selecciona entre (a) un kit adecuado para la PCR, (b) un kit adecuado para la Transferencia Northern Blot y (c) un kit adecuado para los análisis de micromatriz. Se pueden combinar cualquiera de dos o más de estas realizaciones, de tal manera que el kit puede comprender, por ejemplo, ambos de (a) y (c).
En el caso de (a) un kit adecuado para la PCR, esta PCR es normalmente la PCR cuantitativa en tiempo real PCR (RQ-PCR), una técnica de cuantificación de la expresión génica sensible y reproducible. En este caso se desea que el kit comprenda adicionalmente un cebador del oligonucleótido poliT además del(de los) oligonucleótido(s) del kit. El cebador del oligonucleótido poliT se puede usar junto con el(los) oligonucleótido(s) de la invención para el cebado de la PCR, tras la poliadenilación de los miARN aislados mediante los procedimientos conocidos por la persona experta, tales como usando la polimerasa poli(A) y ATP. Estos reactivos pueden estar comprendidos opcionalmente en el kit.
Una Transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar las muestras de ARN por tamaño y la posterior detección con un(os) oligonucleótido(s) (sonda de hibridación) complementaria con (parte de) la secuencia diana del ARN de interés.
Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN (aquí miARN) que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. En una realización particular, dicha micromatriz personalizada comprende los oligonucleótidos tal como se han definido en las SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11 y 12 o los oligonucleótidos que comprenden estas secuencias. En una realización particular, el Ensayo de microARN humano TaqMan Set v2.0 se puede excluir de la invención.
El uso del kit no está particularmente limitado, aunque se prefiere su uso en el procedimiento de la invención o en cualquiera de sus realizaciones.
Materiales v Métodos
Pacientes y especímenes clínicos
El presente estudio se ha llevado a cabo en 61 pacientes que se habían sometido a cirugía para el cáncer colorrectal. Se utilizaron treinta y nueve pacientes en el estudio del perfil de expresión del miARN y 22 para los resultados de la prueba. Se alistaron los pacientes en el Hospital Universitario Virgen del Rocío, el Hospital Universitario Virgen de la Victoria, El Hospital de La Merced, y el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Sevilla, España. El promedio de seguimiento fue de 28 meses [16.0-43.2] y a los 30 meses [19.0-44.5] los pacientes murieron. Los rasgos clínicos de los pacientes se resumen en la Tabla 1. Se trató a todos los pacientes con quimioterapia basada en fluoropirimidina más oxaliplatino o irinotecán (véanse los detalles a continuación) hasta la progresión de la enfermedad. Se obtuvo un formulario con el consentimiento por escrito de todos los pacientes y los Comités Éticos de los Hospitales aprobaron el estudio. Durante el procedimiento quirúrgico se extrajeron muestras de tejido tumoral de todos los pacientes y a continuación se congelaron instantáneamente de manera inmediata a -80°C hasta su uso. Quimioterapia
Los pacientes de quimioterapia se sometieron a ésta en todos los casos con terapia basada en fluoropirimidina. Hubo sin embargo dos diferentes grupos de pacientes, llevándose a cabo el agrupamiento en un segundo agente comprendido en la terapia (tratamiento combinado). En cualquier caso, el segundo agente fue un agente que se entendía que intervenía en el ADN. Por tanto, existen dos grupos de pacientes:
Grupo 1. Quimioterapia basada en oxaliplatino y fluoropirimidina.
mFOLFOX 6 (43.6% de pacientes): 85 mg/m2 de Oxaliplatino IV, día 1. 400 mg/m2 de Leucovorina IV, día 1. 400 mg/m2 de 5-FU bolo IV en el día 1 , a continuación 1200 mg/m2/día x 2 días (total 2400 mg/m2 durante 46-48 horas) en infusión continúa. Repetir cada 2 semanas.
CapeQx (38,5% de pacientes): 130 mg/m2 de Oxaliplatino, día 1. 1000 mg/m2 de Capecitabina dos veces al día los días 1-14 cada 3 semanas x 24 semanas.
TOMOX (2.5% de pacientes): 3 mg/m2 de Raltitrexed bolo IV, día 1. 130 mg/m2 de Oxaliplatino bolo IV, día 1. Repetir cada 3 semanas. Grupo 2. Quimioterapia basada en irinotecán v fluoropirimidina.
FOLFIRI (12.8% de pacientes): 180 mg/m2 de Irinotecán IV, día 1.
400 mg/m2 de Leucovorina infusión IV, día 1. 400 mg/m2 de 5-FU bolo IV día
1 , a continuación 1200 mg/m2/día x 2 días (total 2400 mg/m2 durante 46-48 horas) en infusión continúa. Repetir casa 2 semanas.
CPT-11 +TOMUDEX (2.5 % de pacientes): 3 mg/m2 de Raltitrexed bolo
IV, día 1. 300 mg/m2 de Irinotecán IV, día 1. Repetir cada 3 semanas.
Los inventores no observaron diferencias significativas en el comportamiento de ambos grupos de acuerdo con la respuesta y el perfil.
Ambos grupos pueden considerarse por tanto como un grupo tratado, que es un grupo de pacientes de CRC a los cuales se administraron fluoropirimidina y el agente adicional.
Ensayo qRT-PCR de aislamiento de ARN y miARN
Se extrajo el ARN total, que contenía ARN pequeño, de una muestra de tejido tumoral mediante el kit mirVana de aislamiento de miARN (Ambion, Austin, TX, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se determinó el rendimiento del ARN total usando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Tech, DE, USA). Se detectó la expresión del miARN humano maduro y se cuantificó usando las matrices de baja densidad TaqMan® (TLDA) basadas en las Micro Fluidic Cards 7900 HT de Applied Biosystems (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La matriz Human MicroRNA Card Set v2.0 es un conjunto de dos tarjetas que contienen un total de 384 ensayos TaqMan de MicroRNA por tarjeta que permiten una cuantificación fiable de 667 microARN humanos, todos ellos catalogados en la base de datos miRBase. Se llevaron a cabo las TLDA en un procedimiento en dos etapas: de manera breve, durante la primera etapa, se transcribieron de manera inversa 450 ng de ARN total usando Cebadores Megaplex RT y el kit de transcripción inversa del miARN de TaqMan en un volumen total de 7,5 μΙ. Los 7,5 μΙ de las reacciones se incubaron en un ciclador térmico G-Storm (Gene Technologies, Essex, Reino Unido) durante 2 min a 16 °C, 1 min a 42 °C, y 1 min a 50 °C durante 40 ciclos, se mantuvieron durante 5 min a 85°C, y a continuación se mantuvieron a 4 °C. En la segunda etapa, 6 μΙ de una muestra de ADNc y una mezcla maestra TaqMan Universal PCR se introdujeron en los puertos de relleno de la tarjeta de TLDA microfluídico. La tarjeta se centrifugó de manera breve durante 1 min a 280 g para distribuir las muestras en los múltiples pocilios conectados a los puertos de relleno y a continuación se sellaron para evitar la contaminación entre pocilios. Se incubaron las reacciones en una placa de 384 pocilios a 50 °C durante 2 s y 94,5 °C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 30 s a 97 °C y 1 min a 59 °C. Se evaluaron las validaciones de los miARN usando los ensayos de MicroARN TaqMan® (Applied Biosystems, CA, EE. UU.). Tras la poliadenilación, se usó un cebador poliT para sintetizar el ADNc la población agrupada de miARN, y se purificó y concentró la primera cadena de ADNc resultante. Posteriormente, se analizó la primera cadena de ADNc mediante la qPCR usando SYBR® Green, el cebador poliT y un cebador directo diseñado a partir de las dianas de la secuencia del miARN específico de interés (miR-107, miR-337-5p, miR-564, miR-605, m¡R-889 y miR-99a*). Estos cebadores directos son los oligonucleótidos que se definen en las SEQ ID NOs: 7 a 12. Diez ng del ARN total se transcribieron de manera inversa usando el kit TaqMan de transcripción inversa del miARN en un volumen total de 10 μΙ. Se incubaron las reacciones durante 30 min a 16 °C, 30 min a 42 °C, y 5 min a 85 °C, y a continuación se mantuvieron a 4 °C. Después, se usaron 1 ,33 μΙ de ADNc para los ensayos de MicroARN TaqMan. Las reacciones se incubaron a 95 °C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C. Se calculó la expresión de cada miARN diana con respecto al control endógeno Mammll6. Se presentan los datos como expresión del miARN diana = 2Δα, con ACt = (Ct de U6B - Ct del miARN diana).
Análisis de la expresión del miARN
La expresión del miARN se normalizó en relación con la expresión de MammU6. Se usó en cada experimento un miARN no humano como control negativo. Finalmente, se procesaron y analizaron las tarjetas en un sistema de detección de secuencias ABIPrism 7900 HT. Se calcularon los valores umbrales de ciclo (Ct) usando el software SDS v.2.3 usando las configuraciones automáticas de los valores iniciales y un umbral de 0,2.
Los inventores clasificaron a los pacientes en dos grupos de acuerdo a la quimioterapia, es decir, se definió la respuesta (R) como ≥ 30% de disminución en la carga total del tumor (definida como la suma de las áreas del tumor de las lesiones medidas bidimensionalmente, se llevó a cabo la tomografía computerizada de acuerdo con las directrices de RECIST), tomando como referencia los valores correspondientes a los valores iniciales, sin la aparición de una nueva lesión. Se definió la falta de respuesta (NR) como < 30% de disminución o > 20% de aumento en el área del tumor de una o más lesiones medibles o, la aparición de al menos una nueva lesión.
Se calculó la cuantificación relativa de la expresión del miARN mediante el procedimiento 2-ΔΔα. El procedimiento 2_ΔΔ es una forma conveniente de analizar los cambios relativos en la expresión génica a partir de los experimentos de la PCR cuantitativa en tiempo real. (Boletín de usuario de Applied Biosystems no 2 (P/N 4303859)). Se calculó la expresión de los microARN usando el software Real-Time Statminer® v.4.2 (Intergromics, Inc). Este software lleva a cabo un test de la t moderado entre los grupos (R y NR) los corrige usando el algoritmo de Benjamini-Hochberg (Benjamini Y, y col 1995) con la Proporción de Descubrimientos Falsos (FDR) ajustada a un valor del 5%. A los efectos de este estudio, se consideró significativa la expresión del miARN cuando el miARN se había detectado al menos en un 50% de pacientes en cada grupo comparado. Además, en las situaciones en la que no se detecta el miARN y los valores de Ct se encuentran más allá del máximo en Ct 36, el software StatMiner imputa un valor, que se ajusta al Ct máximo.
Se llevó a cabo el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier sobre la supervivencia exenta de progresión (PFS) y la supervivencia total (OS) de los pacientes como una función de la expresión del miARN, usando el valor promedio como el de interrupción. Se calculó la PFS como el tiempo entre la fecha del diagnóstico y la fecha de la progresión clínica. Se calculó la OS a partir de la fecha del diagnóstico hasta la fecha de la muerte (debida a cualquier causa) y se silenciaron los datos de los pacientes que sobrevivieron, de los que lo último que se sabía es que permanecían con vida. Se usó la prueba del rango logarítmico para ensayar las diferencias de supervivencia entre grupos. Se usaron los modelos multivariantes de regresión de Cox de la PFS y la OS para proporcionar comparaciones ajustadas del tratamiento e identificar factores simultáneos de pronóstico significativo. Se usó el test de Kruskal-Wallis para la comparación de los promedios y, para casos en los que dio como resultado una significativa diferencia (p< 0,05), se aplicó el test de Mann-Whitney para la comparación entre grupos. Estos análisis se llevaron a cabo usando el software SPSS (Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales versión 17.0; SPSS, Inc, Chicago, IL).
Análisis univariante y multivariante
Se llevó a cabo el análisis univariante para explorar cada variable en un conjunto de datos, por separado. Esto describe el modelo de respuesta de la variable. Se llevaron a cabo comparaciones univariantes entre grupos usando test de la t de muestras independientes. Los valores p resultantes se ajustaron para un ensayo múltiple mediante el ajuste de Benjamini-Hochberg.
Los miARN con p < 0,05 en el análisis univariante fueron habilitados para el análisis multivariante de regresión de Cox. (Se llevó a cabo de manera general el análisis multivariante de más de una variable estadística en el tiempo). Se llevó a cabo el análisis de regresión de Cox para probar la asociación de los miARN con el tiempo de supervivencia (PFS y OS). Se incluyeron los microARN con asociación significativa con PFS y/u OS en ambos análisis univariantes en el modelo de regresión de Cox. Se llevaron a cabo estos análisis usando el software SPSS (Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales versión 17.0; SPSS, Inc, Chicago, IL).
Ejemplos
Ejemplo 1 : Identificación de los modelos de expresión del miARN en pacientes de acuerdo con las respuestas a la quimioterapia. Valor pronóstico de supervivencia de acuerdo con los perfiles de expresión del microARN.
Se evaluó el perfil de expresión del microARN en pacientes con cáncer colorrectal avanzado usando los análisis de la qRT-PCR. La expresión comparativa relativa al miARN (niveles de respuesta frente a falta de respuesta a la quimioterapia (para los detalles de la quimioterapia véase la sección de "Materiales y Métodos")) se representó como gráfico volcán en la Figura 1. (En estadística, un gráfico volcán es un tipo de diagrama de puntos que se usa para identificar con rapidez cambios en grandes conjuntos de datos compuestos de datos replicados. La primera dimensión (horizontal) es el cambio de veces entre los dos grupos (en una escala logarítmica, de tal manera que la regulación en exceso y en defecto parece simétrica), y el segundo eje (vertical) representa el valor p de un test de la t de diferencias entre las muestras (lo más conveniente en una escala logarítmica negativa— de esta manera, los valores p más pequeños parecen mucho mayores— ). El primer eje indica el impacto biológico del cambio y el segundo indica la evidencia estadística, o la fiabilidad del cambio). Aquí, cerca del 7% (N=46) de los 667 miARN estudiados mostraron diferencias de expresión (p<0,05).
Ejemplo 1A: Diferencias de expresión significativas
Entre los miARN detectados con diferencias de expresión significativas (Ejemplo 1 ), solo se detectaron ocho miARN (let-7g*, m¡R-107, m¡R-299-5p, miR-337-5p, miR-370, miR-505*, miR-889, miR-99a*) al menos en un 50% de pacientes de ambos grupos comparados (R y NR) (Tabla 2). Se consideró que este valor era representativo del comportamiento general de la población del estudio. Concretamente, en el caso de miR-107, miR-337-5p, miR-564, miR- 605, miR-889 and miR-99a*, se detectó la expresión en un 92,8% de los pacientes estudiados.
Tabla 2. Los miARN expresaron de manera diferente la respuesta a la quimioterapia en pacientes con CRC metastásico, de acuerdo con el análisis de la RT-PCR en tiempo real.
Figure imgf000041_0001
Los pacientes en tratamientos clínicos se clasificaron en dos grupos, es decir, respuesta (R) o sin respuesta (NR) a la quimioterapia sobre la base de cambio en el tamaño de la lesión.
*Los valores p resultantes se ajustaron al ensayo múltiple en el ajuste de Benjamini-Hochberg.
Ejemplo 1B: Correlación
Basándose en los datos de expresión significativa de miARNs, se determinó la correlación de los resultados significativos de expresión del miARN con PFS y OS para identificar el valor pronóstico de la expresión específica del miARN en pacientes con cáncer colorrectal avanzado. El PFS promedio fue de 13,6 meses [8,8-21 ,2] y el OS promedio fue de 25,6 meses [17,1-39,3]. En la figura 2A y la figura 2B se muestran las estimaciones de Kaplan-Meier del PFS y el OS de ocho miARN con diferencias de expresión significativas en pacientes con R y NR. Entre los 8 miARN, la expresión de miR-107, miR-337-5p and miR-99a* se asoció con PFS y OS (p < 0,05). Además, miR-889 se asoció con OS (p=0,017). Todos los otros miARN no se asociaron con PFS u OS.
Ejemplo 2: Modelos de expresión de los MicroARN de acuerdo con la quimioterapia, es decir, respuesta completa, respuesta parcial, y enfermedad estable frente a enfermedad progresiva.
Para evaluar las diferencias en la expresión del miARN sobra la base del cambio biológico del tumor con la quimioterapia, los inventores compararon pacientes con enfermedad progresiva (PD) frente a pacientes con respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), y enfermedad estable (SD). Se han recogido muestras de tejido tumoral durante el procedimiento quirúrgico (antes del inicio de la quimioterapia).
Estas respuestas se definieron usando las directrices de RECIST (versión 1.1) (Eisenhauer y col. 2009). En este análisis, los inventores detectaron varios miARN con expresión significativa en las diferentes respuestas a la quimioterapia. Los inventores de la presente invención detectaron 7 miARN expresados de forma diferente en la SD (miR-301 b, miR- 338-3p, miR-564, miR-625*, miR-760, miR-885-5p, y miR-941 ), 5 miARN en la PR (miR-107, miR-337-5p, miR-450b-5p, miR-539, y miR-589*) y 3 miARN (miR-509-3p, miR-571 , y miR-605) en la CR. Además, miR-597 se expresó de manera significativamente diferencial en las tres respuestas al tratamiento frente a la enfermedad progresiva (Tabla 3).
Tabla 3. Los miARNs expresaron de manera diferente la respuesta a la quimioterapia en pacientes con carcinoma colorrectal, de acuerdo con el análisis de la RT-PCR en tiempo real.
Figure imgf000043_0001
625*
miR-
-2,255 0,002 -1 ,261 0,181 - - 760
miR-
-1 ,262 0,009 -0,076 0,969 - - 885-5p
miR-
-0,962 0,031 -0,295 0,611 -1 ,200 0,247 941
Los pacientes en tratamientos clínicos se clasificaron en uno de cuatro grupos, es decir, respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD) y enfermedad progresiva (PD) en base al cambio en el tamaño de la lesión.
*Los valores p resultantes se ajustaron para el múltiple ensayo mediante el ajuste de Benjamini-Hochberg.
Se detectaron todos los miARN al menos en un 50% de pacientes de los grupos comparados. Se estimó la Kaplan-Meier de la PFS y la OS de dieciséis miARN diferenciados. Se asociaron el MicroARN-107, miR-337-5p y miR-605 con la PFS y la OS, y se asoció también miR-564 con la OS (Figura 3A y 3B). Los inventores de la presente invención compararon el valor promedio de la expresión de miR-107, miR-337-5p, miR-605 y miR-564 entre la CR, PR, o SD frente a la PD. El valor ACt promedio comparativo relativo de miR-107, miR- 337-5p, miR-605 y miR-564 en cada grupo (CR, PR, SD y PD) se representa en la Figura 4.
Las expresiones del microARN-107 y miR-337-5p fueron inferiores en los pacientes con CR y PR en comparación con la SD y PD. (En el caso de miR- 107 y miR-337-5p, los valores ACt promedio fueron inferiores en pacientes con CR y PR en comparación con SD y PPD. De esta manera, los niveles de expresión de miR-107 y miR-337-5p fueron mayores en pacientes con CR y PR que en pacientes con SD y PD.)
En ambos los, miARN fueron significativamente menores en pacientes con PR frente a PD. No se encontró distribución homogénea en los niveles de expresión de miR-564 en cuatro grupos de pacientes clasificados de acuerdo con la respuesta a la quimioterapia. Por otra parte, los niveles de expresión de miR-605 fueron significativamente menores en pacientes con PD frente a aquellos pacientes con una CR (Figura 4).
Ejemplo 3: Análisis multi variante de los resultados
Los resultados obtenidos de los pacientes con CRC avanzado clasificados como R y NR (Ejemplo 1 ) se compararon con los obtenidos en la CR, PR, SD y PD. De forma sorprendente, algunos resultados permanecieron muy similares en ambos análisis. Los inventores detectaron que el miRNA-107 y el m¡R-337-5p se expresaron de manera significativamente diferente tanto en el PFS como en OS en ambos análisis (Figura 5). Los inventores establecieron la supervivencia multivariante de PFS y OS incluyendo los miARN con análisis univariantes significativamente diferentes. Este modelo desveló que miR-107, miR-337-5p y miR-605 fueron significativos predictores del PFS y el miR-564 y miR-605 de OS. Este análisis desveló que la expresión de miR-107 y miR-337- 5p fueron ~ mayores asociadas como factor de pronóstico del PFS (p=0.026; riesgo relativo (RR) 2.29 (95% de Cl 1 ,10-4,79) y p=0.022; (RR) 2,53 (95% de Cl 1 ,14-5,60), respectivamente) y miR-564 fue cinco veces mayor asociada como factor de pronóstico del OS (p=0,009; RR 5,11 (95% de Cl 1 ,49-17,46). De esta manera, el análisis multivariante de regresión de Cox desveló que el miARN-107, miR-337-5p y miR-605 fueron factores predictores de la supervivencia, excepto la expresión de miR-99a* para PFS y la expresión de miR-564 y miR-605 para OS (Tabla 4).
Tabla 4. Análisis univariante y multivariante de factores de pronóstico en pacientes de cáncer colorrectal para PFS y OS.
miARN SEQ ID Análisis Análisis multivariante
NO Univariante Riesgo Valor p
Valor p Relativo (95%
de Cl)
1 0,043 2,29 [1,10-4,79] 0,026
Figure imgf000046_0001
Cl: Intervalo de confianza.
Ejemplo 4: Como se determinan los valores ACt promedio
Los valores ACt promedio de diversos grupos de sujetos se calcularon con respecto al control endógeno MammU6, tal como se indica a continuación. De esta manera, MammU6 es un ejemplo de un ARN la expresión del cual puede servir para la normalización de la expresión relativa de los miARN de interés.
Ejemplo 4A: Valor ACt determinado para los sujetos sin respuesta
Se evaluó el perfil de expresión del micro ARN usando los análisis de la qRT-PCR tal como se describe en el capítulo del procedimiento "Ensayo de la qRT-PCR para el aislamiento de ARN y miARN" anterior. Se calculó la expresión de cada miARN diana con respecto al control endógeno MammU6. ACt = (Ct de U6B - Ct de miARN diana). Se encontró que un valor indicador del control adecuado de la falta de respuesta es el valor ACt promedio de sujetos sin respuesta (definiéndose la falta de respuesta como < 30% disminución en el área del tumor de una o más lesiones medibles o la aparición de al menos una nueva lesión). El valor ACt promedio de la falta de respuesta se identificó como se muestra en la siguiente Tabla 5. Tabla 5: Valor ACt promedio de la falta de respuesta
Figure imgf000047_0001
Ejemplo 4B valores promedio del miARN de todos los sujetos:
Se evaluó el perfil de expresión del microARN de las muestras de todos los sujetos del estudio usando los análisis de la qRT-PCR tal como se describe en el capítulo del procedimiento "Ensayo de la qRT-PCR para el aislamiento de ARN y miARN" anterior. Se calculó la expresión de cada miARN con respecto al control endógeno MammU6. ACt = (Ct de U6B - Ct del miARN diana). Se encontró que los valores promedio eran tal como se muestra en la siguiente Tabla 6.
Tabla 6: valores promedio de los miARN
SEQ ID NO: MicroARN ACt
(promedio)
1 m¡R-107 13,1575
2 m¡R-337-5p 12,4475
3 m¡R-564 13,3325
4 m¡R-605 11 ,415
5 miR-889 13,3375
6 miR-99a* 12,3825
Ejemplo 4 C: Valor ACt promedio determinado para la enfermedad progresiva y la respuesta parcial de los sujetos
Se evaluó el perfil de expresión del microARN usando los análisis de la qRT-PCR tal como se describe en el capítulo del procedimiento "Ensayo de la qRT-PCR para el aislamiento de ARN y miARN anterior. Se calculó la expresión de cada miARN con respecto al control endógeno MammU6. ACt = (Ct de U6B - Ct del miARN diana). Se agruparon los sujetos de acuerdo con las directrices RECIST, y se calcularon los valores ACt promedio de la enfermedad progresiva y la respuesta parcial, respectivamente. Se identificaron los valores ACt promedio de la enfermedad progresiva/respuesta parcial tal como se muestra en la siguiente Tabla 7.
Tabla 7: Valor ACt promedio de la enfermedad progresiva y la respuesta parcial
SEQ ID NO: MicroARN Valor ACt promedio de Valor ACt promedio la enfermedad de la respuesta progresiva parcial
1 miR-107 13,92 12,62
2 miR-337- 13,74 11 ,82
5p
4 miR-605 10,78 11 ,23

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para predecir la respuesta de un sujeto humano a la quimioterapia, en el que el sujeto padece cáncer colorrectal avanzado, y en el que el procedimiento comprende:
usar, como indicador, la determinación de los niveles de expresión de uno o más de los siguientes miARNs:
i) SEQ ID NO: 1 (miR107);
ü) SEQ ID NO: 2 (miR337-5p);
iii) SEQ ID NO: 3 (miR564);
¡v) SEQ ID NO: 4 (m¡R605);
v) SEQ ID NO: 5 (miR889);
vi) SEQ ID NO: 6 (miR99a*);
donde se obtiene el resultado del procedimiento comparando los niveles de expresión de dichos uno o más miARNs con niveles control de expresión indicativos de falta de respuesta.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que el cáncer colorrectal avanzado es cáncer colorrectal metastásico (MCRC).
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la respuesta se refiere a las características del tumor del sujeto.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la respuesta es≥ 30% de disminución en la carga total del tumor, y en el que se usa como un indicador, los niveles de expresión de uno o más miARNs tal como se han definido en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 5, 6, y en el que el resultado es indicador de la respuesta si:
(i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 han aumentado; y/o
(ii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2 han aumentado; y/o
(v) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 5 han disminuido; y/o
(vi) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 6 han aumentado.
5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la respuesta es parcial o completa, y en el que, como un indicador, se usan los niveles de expresión de uno o más miARN tal como se han definido en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 4, y en el que el resultado es indicador de la respuesta si:
(i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 han aumentado; y/o
(ii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2 han aumentado; y/o
(iv) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 4 han disminuido.
6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la respuesta se refiere al resultado clínico del sujeto.
7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el resultado clínico es la supervivencia exenta de progresión y en el que el resultado es indicador de supervivencia exenta de progresión si
(i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 han aumentado; y/o
(ii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2 han aumentado; y/o
(iv) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 4 han disminuido; y/o
(vi) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 6 han aumentado.
8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el resultado clínico es la supervivencia total y en el que el resultado es indicador de la supervivencia total si
(i) Los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 1 han aumentado; y/o
(¡i) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 2 han aumentado; y/o
(iii) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 3 han aumentado; y/o
(iv) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 4 han disminuido; y/o
(v) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 5 han disminuido; y/o
(vi) los niveles del miARN tal como se ha definido en la SEQ ID NO: 6 han aumentado.
9. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho resultado se puede obtener mediante
(i) un procedimiento de perfilado génico, tal como una micromatriz; y/o
(ii) un procedimiento que comprende la PCR, tal como la PCR en tiempo real; y/o
(iii) transferencia Northern. 10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el resultado se puede obtener mediante la PCR cuantitativa en tiempo real y se expresa como -ΔΔΟί.
1 1. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento se lleva a cabo in vitro usando una muestra originaria del sujeto humano, y en el que en el momento de tomar la muestra del sujeto humano, el sujeto humano no está siendo tratado con quimioterapia.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la quimioterapia comprende la administración de fluoropirimidina. 3. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la quimioterapia es una terapia de combinación que comprende la administración de fluoropirimidina y de un agente adicional. 14. El procedimiento de una cualquiera o más de las reivindicaciones anteriores, en el que la expresión del miARN está normalizada, preferiblemente en relación con la expresión de MammU6.
15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que se selecciona la quimioterapia a partir de una terapia que comprende la administración de:
a. oxaliplatino y fluoropirimidina, o
b. irinotecán y fluoropirimidina. 16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el paciente ha experimentado la resección quirúrgica del cáncer antes de la aplicación del procedimiento.
17. Un procedimiento para clasificar un sujeto humano que padece de cáncer colorrectal metastásico en uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende los sujetos identificables mediante el procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5 o 7 u 8 o cualquiera de las reivindicaciones dependientes de la anteriores,
y en el que el grupo 2 representa el resto de sujetos.
18. Una composición farmacéutica que comprende una fluoropirimidina y un agente adicional seleccionado entre oxaliplatino e ¡rinotecán, para tratar un sujeto humano del grupo 1 identificable mediante el procedimiento de la reivindicación 17. 19. Un anticuerpo para tratar un sujeto humano del grupo 2 identificable mediante el procedimiento de la reivindicación 17, en el que el anticuerpo se selecciona a partir de un anticuerpo dirigido contra VEGF y un anticuerpo dirigido contra EGFR, en el que el anticuerpo dirigido contra VEGF es preferiblemente bevacizumab, y el anticuerpo dirigido contra EGFR se selecciona preferiblemente entre cetuximab y panitumumab.
20. Un kit que comprende al menos un(os) oligonucleótido(s) capaz(ces) de hibridarse con uno cualquiera de dos o más, y preferiblemente todos los miARN tal como se ha definido en las SEQ ID NOs: 1 a 6 en condiciones de rigor.
21. El kit de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el dicho uno o más oligonucleótido(s) se definen además mediante las siguientes SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12.
22. Un kit de acuerdo con la reivindicación 21 , que comprende adicionalmente un cebador del oligonucleótido poliT.
23. Un kit de acuerdo con las reivindicaciones 20 o 21 , en el que el(los) oligonucleótido(s) están inmovilizados en manchas sobre una superficie, que es preferiblemente la superficie de una micromatriz.
24. Uso del kit de acuerdo con la reivindicación 20 en un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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