BR112013013656B1 - processo para determinação da sensibilidade de um indivíduo a um agente anticâncer, kit para realização do dito processo bem como processo de triagem para um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade a um agente anticâncer - Google Patents

processo para determinação da sensibilidade de um indivíduo a um agente anticâncer, kit para realização do dito processo bem como processo de triagem para um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade a um agente anticâncer Download PDF

Info

Publication number
BR112013013656B1
BR112013013656B1 BR112013013656-1A BR112013013656A BR112013013656B1 BR 112013013656 B1 BR112013013656 B1 BR 112013013656B1 BR 112013013656 A BR112013013656 A BR 112013013656A BR 112013013656 B1 BR112013013656 B1 BR 112013013656B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
gene
cancer
sensitivity
expression
agent
Prior art date
Application number
BR112013013656-1A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112013013656A2 (pt
Inventor
Masahiko Nishiyama
Hidetaka Eguchi
Satoru Wada
Original Assignee
Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabushiki Kaisha Yakult Honsha filed Critical Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
Publication of BR112013013656A2 publication Critical patent/BR112013013656A2/pt
Publication of BR112013013656B1 publication Critical patent/BR112013013656B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • G16H20/10—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to drugs or medications, e.g. for ensuring correct administration to patients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H10/00—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data
    • G16H10/40—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data for data related to laboratory analysis, e.g. patient specimen analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

MARCADOR ARA DETERMINAÇÃO DE SENSITIVIDADE PARA A GENTE ANTICÂNCER EM COMBINAÇÃO TRIPLETO Para prover um marcador para determinação de sensitividade de um paciente a um agente anticâncer, cujo marcador pode determinar se ou não o paciente tem uma resposta terapêutica para o agente anticâncer, e novos meios terapêuticos empregando o marcador. O marcador para determinação de sensitividade de um sujeito para um agente anti-câncer incluindo oxaliplatina ou seu sal, flúor ura cila ou seu sal, e levofolinato ou seu sal, o marcador contendo um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10.

Description

PROCESSO PARA DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE UM INDIVÍDUO A UM AGENTE ANTICÂNCER, KIT PARA REALIZAÇÃO DO DITO PROCESSO BEM COMO PROCESSO DE TRIAGEM PARA UM AGENTE DE APERFEIÇOAMENTO DE SENSIBILIDADE A UM AGENTE ANTICÂNCER Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se a um marcador para uso na determinação da sensibilidade de um paciente de câncer para um agente anticâncer a ser administrado ao mesmo, cujo marcador pode determinar se ou não o câncer do paciente tem uma resposta terapêutica para o agente anticâncer, e a aplicação do marcador.
Antecedentes da Técnica
[002] Agentes anticâncer têm vários tipos tal como um agente alquilante, um agente platina, um antimetabólito, um antibiótico antitumor, e um alcalóide de planta antitumor. Estes agentes anticâncer são eficazes para alguns cânceres, mas ineficazes para outros cânceres. Mesmo quando um agente anticâncer foi confirmado ser efetivo para um certo câncer, o agente anticâncer é ineficaz para alguns pacientes e não efetivo para outros pacientes, conduzindo a diferenças inter-indivíduos. Se ou não um câncer de um específico paciente tem resposta para um agente anticâncer é designado como sensibilidade para o agente anticâncer.
[003] Oxiplatina (L-OHP) é um agente anticâncer complexo baseado em platina. Similar a cisplatina (CDDP) e carboplatina (CBDCA), que são agentes anticâncer de complexo baseado em platina, seu mecanismo de ação é pensado ser baseado na inibição de síntese de DNA ou síntese de proteína via reticulação com bases DNA. L-OHP exibe efeito antitumor sobre câncer colorretal, para o qual CDDP ou CBDCA é efetivo, e mostra diferente espectro de atividade antitumor daquela de um agente antitumor de complexo baseado em platina anterior. Nos Estados Unidos da América, L-OHP para uso em combinação com fluorouracil (5-FU) / levofolinato (LV) foi aprovado como uma terapia de primeira linha para câncer colorretal metastático em janeiro de 2004. No Japão, L-OHP foi listado na lista de preços de National Health Insurance no caso de seu uso em combinação com contínua infusão de LV e 5-FU (regime FOLFOX4) para câncer colorretal avançado / recorrente não suscetível a ressecção cirúrgica curativa” em abril de 2005. Até o início dos anos 1990, regime de 5-FU/LV para câncer colorretal avançado / recorrente proveu uma sobrevivência de 10 a 12 meses. Em contraste, um regime FOLFOX combinado com L-OHP resulta em uma sobrevivência prolongada de 19,5 meses (cerca de duas vezes o tempo de sobrevivência). Em agosto de 2009, uma indicação de L-OHP combinado com contínua infusão de 5-FU/LV para “quimioterapia adjuvante pós-operativa para câncer de cólon” foi adicionada para eficácia e efetividade. Assim, L-OHP é uma droga promissora tendo uma eficácia em um aumentado número de pacientes de câncer colorretal.
[004] Enquanto isso, 5-FU é um agente anticâncer flúor pirimidina desenvolvido em 1957 e mesmo agora serve como uma droga básica para uso na quimioterapia de câncer gastrointestinal. Quando incorporado em células de câncer, 5-FU exerce efeito citotóxico através de um mecanismo de ação principal de inibição de síntese de DNA induzida por inibição de timidilato sintase (TS) através de um metabólito ativo, flúor desoxi uridino-5’-monofosfato (FdUMP), e um outro mecanismo de inibição de função de RNA através de um outro metabólito ativo, 5-flúor uridino trifosfato (FUTP).
[005] Enquanto isso, desempenho clínico incluindo taxa de sobrevivência obtida por quimioterapia de câncer colorretal metastático ou avançado foi drasticamente aperfeiçoada através de uma terapia de combinação empregando uma droga chave tal como irinotecano (CPT-11) ou L-OHP, que foi desenvolvida nos anos 90, e uma droga flúor pirimidina tal como 5-FU, que tem sido uma droga principal para a terapia de câncer colorretal. Entretanto, a taxa de resposta de tal quimioterapia é tão baixa quanto cerca de 50%. Ou seja, a quimioterapia não é efetiva para metade dos pacientes para os quais um agente anticâncer foi administrado com altos riscos tais como sérios eventos adversos. Assim, de modo a prover um ótimo regime em quimioterapia de câncer, existe urgente demanda pelo estabelecimento de um marcador para previsão de sensibilidade de um paciente a um agente anticâncer, cujo marcador permita determinação da resposta terapêutica de pacientes individuais (isto é, indicação de um respondedor ou não-respondendor).
[006] Genericamente, o esquema de terapia de quimioterapia de câncer requer um longo período de tempo. Após repetição de vários cursos de quimioterapia enquanto surgimento de eventos adversos é monitorado, obtenção de um efeito terapêutico e continuação da terapia são avaliadas. A avaliação requer um longo período de tempo e alto custo médico, e os eventos adversos foram realmente observados em um certo grau. Assim, se houvessem meios para prever se ou não pacientes individuais podem receber o efeito de quimioterapia antes ou no estágio inicial da terapia, a carga dos pacientes e surgimento de eventos adversos poderiam ser reduzidos ou mitigados, conduzindo a redução em custo médico.
[007] Experimento clínico prospectivo em larga escala (experimento FOCUS) para investigação de biomarcadores que preveem resposta terapêutica de pacientes de câncer colorretal avançado para quimioterapia revelou que somente topoisomerase-1 (Topo1) exibe fraca relação com a terapia de combinação 5-FU/L-OHP como um efeito de fator de previsão (Documento Não-Patente 1). Isto indica que não foi estabelecida nenhuma técnica que possa confiavelmente selecionar um paciente que seja esperado ser eficazmente tratado através de terapia de combinação de 5- FU/L-OHP. Por isso, há grande demanda pelo estabelecimento de um biomarcador que possa prever o efeito do regime FOLFOX empregando uma combinação tripla de L-OHP/5-FU/FV ou que possa diagnosticar a resposta terapêutica para o regime FOLFOX em um estágio inicial.
Documentos da Técnica Anterior
Documentos Não-Patentes
Documento não-patente 1: J. Clin. Oncol. 26, 2690-2698 (2008)
Resumo da Invenção
Problemas a serem resolvidos pela invenção
[008] Um objetivo da presente invenção é prover um marcador para determinação de sensibilidade de um paciente a um agente anticâncer (daqui por diante o marcador pode ser referido como um “marcador de determinação de sensibilidade de agente anticâncer”), cujo marcador pode determinar se ou não o paciente tem uma resposta terapêutica para o agente anticâncer. Um outro objetivo é prover novos meios terapêuticos para câncer empregando o marcador.
Meios para solução dos problemas
[009] Em vista do anterior, os presentes inventores conduziram compreensiva análise de expressão de gene e sensibilidade terapêutica através do uso de amostras de tecido de pacientes de câncer que receberam uma terapia de combinação de fluorouracil / levofolinato / oxaliplatina, pelo que nove genes concebivelmente envolvidos na sensibilidade foram especificados. Os inventores também verificaram que cinco genes dos nove especificados são particularmente úteis. Baseados nestas verificações, os inventores ainda investigaram, e verificaram que, através de determinação de níveis de expressão de gene de uma amostra biológica derivada de um paciente de câncer, se ou não o câncer do paciente de câncer tem sensibilidade para um específico agente anticâncer pode ser determinada; que a sensibilidade de um paciente para um agente anticâncer, especificamente, a melhor resposta para tumor (razão), pode ser calculada através de entrada de níveis de expressão dos genes para uma específica fórmula de cálculo; que, através de emprego de uma variação em expressão de gene como um índice, um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade de agente anticâncer pode ser selecionado através de triagem; e que, através do emprego de agente de aperfeiçoamento de sensibilidade em combinação com um agente anticâncer que é um alvo de aperfeiçoamento de sensibilidade, os efeitos terapêuticos do agente anticâncer podem ser acentuadamente aperfeiçoados. A presente invenção foi realizada nas bases destas verificações.
[0010] Da mesma maneira, a presente invenção provê um marcador para determinação de sensibilidade de um sujeito a um agente anticâncer incluindo oxaliplatina ou um sal deste, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal, o marcador compreendendo um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7AP27, gene TMEM18, e gene UGT2B10.
[0011] A presente invenção também provê uma específica realização do marcador de determinação, onde o dito um ou mais genes são gene ALAD, gene C20orf43, gene GDA, gene TMEM18, e gene UGT2B10.
[0012] A presente invenção também provê uma realização específica do marcador de determinação, que prevê melhor resposta de tumor (razão).
[0013] A presente invenção também provê um processo para determinação de sensibilidade de um sujeito para um agente anticâncer incluindo oxiplatina ou seu sal, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal, o processo compreendendo medição de níveis de expressão de um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7AP27, gene TMEM18, e gene UGT2B10 em um espécime. A presente invenção também provê uma realização específica do processo de determinação, o processo compreendendo medição de níveis de expressão de gene ALAD, gene C20orf43, gene GDA, gene TMEM18, e gene UGT2B10.
[0014] A presente invenção também provê uma realização específica do processo de determinação, o processo ainda compreendendo cálculo de melhor resposta de tumor (razão) através da seguinte fórmula (1):
Melhor resposta de tumor (razão) = 0,37664 + 96,360 x A – 8,5128 x B + 42,420 x C + 26,810 x D + 747,00 x E ..... (1)
(onde A representa um nível de expressão de gene ALAD; B representa um nível de expressão de gene C20orf43; C representa um nível de expressão de gene GDA; D representa um nível de expressão de gene TMEM18; e E representa um nível de expressão de gene UGT2B10).
[0015] A presente invenção também provê um kit para realização do processo de determinação, o kit compreendendo um protocolo para medição de níveis de expressão de um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10 em um espécime.
[0016] A presente invenção também provê um processo de triagem para um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para um agente anticâncer incluindo oxaliplatina ou seu sal, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal, o processo compreendendo emprego, como um índice, de uma variação em expressão de um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10 em um espécime.
[0017] A presente invenção também provê um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para um agente anticâncer incluindo oxaliplatina ou seu sal, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal, o agente o agente tendo sido obtido pelo processo de triagem.
[0018] A presente invenção também provê uma composição para terapia de câncer compreendendo o agente de aperfeiçoamento de sensibilidade mencionado anteriormente, e um agente anticâncer incluindo oxaliplatina ou seu sal, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal.
Efeitos da Invenção
[0019] Através do uso do marcador de determinação de sensibilidade de agente anticâncer da presente invenção, a resposta terapêutica para o agente anticâncer de um paciente pode ser corretivamente determinada antes de administração de, ou em um estágio inicial após administração do agente anticâncer. Como um resultado, um agente anticâncer tendo maior efeito terapêutico pode ser selecionado, e progressão de câncer e agravamento de efeitos adversos, que resultam de administração contínua de um agente anticâncer não exercendo esperado efeito terapêutico, podem ser prevenidos. Assim, reduções podem ser esperadas em carga do paciente e custo médico. Através do uso do marcador de determinação, uma droga que aperfeiçoa a sensibilidade para um agente anticâncer pode ser selecionada através de triagem. Através de emprego de agente de aperfeiçoamento de sensibilidade em combinação com o agente anticâncer alvejado pelo agente de aperfeiçoamento de sensibilidade, o efeito terapêutico de câncer pode ser acentuadamente aperfeiçoado.
Breve Descrição dos Desenhos
[0020] [Fig. 1] Um gráfico mostrando uma fórmula para previsão de melhor resposta de tumor (razão) sob a administração de L-OHP / 5-FU / LV em combinação tripla, estabelecida a partir dos níveis de expressão de cinco genes da invenção, e mostrando a utilidade da previsão.
Modos para Realização da Invenção
[0021] O marcador de determinação de sensibilidade de agente anticâncer da presente invenção compreende um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10. Os genes da presente invenção são pensados terem correlação com sensibilidade anti-câncer, a qual foi estimada através de análise de correlação dos resultados obtidos por análises compreensivas de níveis de expressão de genes em amostras de tecidos de câncer de pacientes de câncer que receberam uma terapia de combinação de fluorouracil / levofolinato / oxaliplatina. Entre estes genes, cinco genes: gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10, são particularmente úteis. Através do uso dos cinco genes, a melhor resposta para tumor (razão) de um paciente de câncer alvo pode ser prevista.
[0022] Na presente invenção, gene ALAD refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência de nucleotídeos definida pelo N°.de acesso GenBank NM_000031, ou um homólogo do gene;
[0023] Gene C20orf43 refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência de nucleotídeos definida no N°.de Acesso de GenBank NM_016407, ou um homólogo do gene;
[0024] Gene CABLES1 refere-se a um gene expressando nRNA tendo uma sequência de nucleotídeos definida pelo N°.de Acesso de GenBank NM_138375, ou um homólogo do gene;
[0025] Gene CDC14B refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência de nucleotídeos definida por N°.de Acesso GenBank NM_033331, ou um homólogo do gene;
[0026] Gene GDA refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência de nucleotídeos definida por N°.de Acesso de GenBank NM_004293, ou um homólogo do gene;
[0027] Gene HOXB6 refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência de nucleotídeos definida por N°.de Acesso de GenBank NM_018952, ou um homólogo do gene.
[0028] Gene RPL7AP27 refere-se a um gene definido por Entrez Gene ID52663, ou um homólogo do gene.
[0029] Gene TMEM18 refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência de nucleotídeos definida por N° de Acesso de GenBank NM_152834, ou um homólogo do gene; e
[0030] Gene UGT2B10 refere-se a um gene expressando mRNA tendo uma sequência de nucleotídeos definida por N° de Acesso GenBank NM_001075, ou um homólogo do gene.
[0031] Como aqui usado, o termo “gene” refere-se não somente a DNA de fita dupla, mas também a DNA de fita simples formando o DNA de fita dupla tal como uma fita sentido ou uma fita antissentido. Nenhuma limitação é imposta sobre o comprimento do DNA. Exemplos do ácido nucléico (polinucleotídeo) incluem RNA e DNA. Exemplos específicos de DNA incluem cDNA, DNA genômico, e DNA sintético, e exemplos específicos de RNA incluem mRNA, rRNA, e siRNA. O termo “polinucleotídeo” também abrange um oligonucleotídeo consistindo em uma pluralidade de nucleotídeos.
[0032] O processo da presente invenção para determinação de sensibilidade de um sujeito para um agente anticâncer pode ser realizado através de medição de níveis de expressão de um ou mais genes selecionados dos nove genes mencionados anteriormente em um espécime. Entre os nove genes, cinco genes; gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10 são particularmente úteis. Assim, através de medição de níveis de expressão dos cinco genes no espécime e cálculo de melhor resposta de tumor (razão) a partir dos níveis de expressão através de fórmula (1), a sensibilidade do paciente de câncer alvo para um agente anticâncer pode ser determinada.
[0033] Especificamente, uma análise de regressão múltipla foi realizada entre o nível de expressão de cada gene nos espécimes de tecido de câncer obtidos de pacientes de câncer e a melhor resposta de tumor (razão) dos pacientes relevantes (ver Shimokuni T et al., “Chemosensitivity prediction in esophageal squamous cell carcinoma: novel marker genes and efficacy-prediction formulae using their expression data”. Int. J. Oncol. 2006.5.). As análises revelaram que os valores obtidos através de entrada de níveis de expressão dos cinco genes mencionados anteriormente (isto é, gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10) na fórmula (1) têm correlação consideravelmente alta à melhor resposta de tumor (razão). Por isso, através de medição de níveis de expressão dos cinco genes mencionados anteriormente no espécime e alimentando as medições na seguinte fórmula (1), a sensibilidade de um sujeito para um agente anticâncer de interesse pode ser determinada, e especificamente a melhor resposta de tumor (razão) pode ser prevista.
[0034] Melhor resposta de tumor (razão) = 0,37664 + 96,360xA – 8,5128xB + 42,420xC + 26,810xD + 747,00xE ..... (1)
(onde A representa um nível de expressão de gene ALAD; B representa um nível de expressão de gene C20orf43; C representa um nível de expressão de gene GDA; D representa um nível de expressão de gene TMEM18; e E representa um nível de expressão de gene UGT2B10).
[0035] Para realização do processo da presente invenção para determinação de sensibilidade de um sujeito para um agente anticâncer, os níveis de expressão dos nove genes mencionados anteriormente em um espécime podem ser medidos. Exemplos do espécime incluem amostras biológicas derivadas de um sujeito tendo câncer (paciente de câncer) tais como sangue, soro, plasma, urina, tecido de tumor e células, áscites, fluido de pleura, fluido cérebro-espinhal, fezes, e saliva. Entre eles, tecido de tumor é particularmente preferido. O espécime pode ser tratado com um apropriado processo conhecido e empregado como um extrato de tecido, uma preparação de tecido, etc.
[0036] Exemplos do câncer para o qual a presente invenção é aplicada incluem câncer dos lábios, oral, e faringe, tipicamente câncer de faringe; cânceres digestivos como câncer de esôfago, câncer gástrico, e câncer do colorretal; cânceres de órgão respiratório e intra-toráxico tais como câncer de pulmão; cânceres de cartilagem articular e osso, melanoma maligno de pele, carcinoma de célula escamosa, e outros cânceres de pele; cânceres de tecido macio e mesotelial como mesotelioma; cânceres genitais de fêmeas como câncer de mama, câncer uterino, e câncer ovariano; cânceres genitais masculinos como câncer de próstata; cânceres de trato urinário como câncer de bexiga; cânceres do olho, cérebro, e sistema nervoso central tal como tumor de cérebro; cânceres de tiroide e outros endócrinos; cânceres de tecido linfoide, tecido hematopoiético, e outros tecidos relacionados tais como linfoma nãoHodgkin e leucemia linfoide; e cânceres metastáticos a partir dos cânceres mencionados anteriormente como focos primários. Entre eles, a presente invenção é preferivelmente aplicada a câncer colorretal (câncer de cólon). Particularmente preferivelmente, a presente invenção é aplicada a câncer antes de quimioterapia.
[0037] O nível de expressão de gene pode ser medido através do uso de uma sonda ou iniciador que pode detectar os genes da presente invenção ou seu mRNA, pelo que o número de cópias ou nível de expressão de um gene alvo é determinado através de processo de hibridização northern, o processo de micro arranjo de DNA, o processo PCR de tempo – real, o processo PCR-RT, ou semelhante. Também, o polipeptídeo codificado pelo gene pode ser empregado como um alvo de medição. Embora nenhuma limitação particular seja imposta sobre o alvo de medição, tanto quanto o alvo reflete o nível de expressão de gene, mRNA do gene alvo é preferivelmente empregado como um alvo de medição. Como aqui usado, a “medição de nível de expressão de gene” também abrange confirmação da presença de expressão do gene.
[0038] Daqui por diante, o processo PCR será descrito em detalhes. No caso onde mRNA é empregado como um alvo de medição, se requerido, o espécime é submetido a conhecidos tratamentos preliminares tais como filtração, centrifugação, e tratamento cromatográfico. Então, RNA pode ser extraído do espécime através de um processo genericamente empregado tal como o processo de ultracentrifugação com cloreto de césio – guanidina, o processo de clorofórmio fenol – guanidina (processo AGPC), o processo de pérolas magnéticas, ou o processo de coluna de sílica. Extração de RNA também pode ser realizada por meio de um kit comercial (QIAGEN RNeasy Kit, TRIZOL, etc.).
[0039] O nível de mRNA pode ser determinado através, por exemplo, (1) da determinação de quantidade do produto de amplificação obtido através de PCR empregando um fragmento de ácido nucléico que pode especificamente hibridizar com o mRNA alvo e um RNA derivado do espécime; (2) determinação de eficiência de hibridização entre um fragmento de ácido nucléico que pode hibridizar especificamente com o mRNA alvo e um RNA derivado do espécime; ou (3) outros processos de quantificação conhecidos.
[0040] No caso de PCR, o “fragmento de ácido nucléico que pode hibridizar especificamente com o mRNA alvo” pode ser desenhado através de comparação da sequência de nucleotídeos do gene alvo com a sequência de nucleotídeos de um outro gene e seleção de uma sequência específica para mRNA do gene alvo. A sequência de nucleotídeos de mRNA do gene alvo pode ser obtida com referência a, por exemplo, uma base de dados (por exemplo, GenBank). Alternativamente, a sequência de nucleotídeos é alinhada por meio de um software (por exemplo, Clustal X), e uma específica sequência é selecionada em uma maneira visual ou semelhante. Nenhuma limitação particular é imposta sobre o comprimento do fragmento de ácido nucléico. Entretanto, um fragmento de ácido nucléico consistindo em 5 a 50 bases é preferido, com um fragmento de ácido nucléico consistindo em 18 a 25 bases contínuas sendo mais preferido.
[0041] O fragmento de ácido nucléico que pode hibridizar com mRNA do gene alvo não está limitado à sequência assim desenhada, e aqueles versados na técnica podem apropriadamente conceber outros equivalentes nas bases de senso técnico comum. Tais equivalentes incluem um fragmento de ácido nucléico tendo uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência assim desenhada, e um fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos homóloga a qualquer uma das sequências acima e que pode ser empregado para determinação de nível de mRNA do gene alvo. Exemplos de tais equivalentes incluem (a) um fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos equivalente à sequência de nucleotídeos, exceto que 1 a 10, preferivelmente 1 ou várias bases são substituídas, adicionadas, ou suprimidas; (b) um fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos tendo uma identidade de 90% ou maior, preferivelmente 95% ou maior, mais preferivelmente 99% ou maior, à sequência de nucleotídeos; e (c) um fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos que hibridiza, sob condições rigorosas, com o fragmento de DNA tendo uma sequência de nucleotídeos complementar para a sequência de nucleotídeos.
[0042] O fragmento de ácido nucléico pode ser um fragmento de ácido nucléico no qual qualquer número, preferivelmente 100 ou menos, mais preferivelmente 20 ou menos, ainda mais preferivelmente 10 ou menos de bases são adicionadas a uma ou duas extremidades suas, preferivelmente à extremidade 5’.
[0043] O fragmento de ácido nucléico assim desenhado pode ser, por exemplo, sintetizado artificialmente, de acordo com a sua sequência de nucleotídeos, por meio de um sintetizador de DNA. Preferivelmente, a especificidade do fragmento de ácido nucléico é confirmada após a síntese. Quando o mRNA alvo é empregado como um molde, a especificidade pode ser confirmada pela presença de um específico amplicon de PCR, que não é obtido no caso de uma certa referência.
[0044] No caso de gene ALAD, exemplos de tais fragmentos de ácidos nucléicos incluem um fragmento de ácido nucléico tendo uma parte da sequência de nucleotídeos definida por GenBank Accession No. NM_000031 ou tendo uma sequência de nucleotídeos complementar para a sequência de nucleotídeos, e um fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos homóloga a qualquer uma das sequências acima e que é funcionalmente equivalente ao fragmento de ácido nucléico acima. Exemplos do fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos homóloga a qualquer uma das sequências acima e que é funcionalmente equivalente ao fragmento de ácido nucléico acima incluem os seguintes fragmentos de ácidos nucléicos (a) a (c) que podem ser empregados para determinação de nível de mRNA do gene alvo. O mesmo é aplicado para os casos de genes outros que não o gene ALAD. Exemplos específicos incluem (a) o fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos equivalente a uma parte da sequência de nucleotídeos definida por N°.de Acesso GenBank NM_000031 ou uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos, exceto que 1 ou várias bases são suprimidas, substituídas, ou adicionadas; (b) um fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos tendo uma identidade de 90% ou maior, preferivelmente 95% ou maior, mais preferivelmente 99% ou maior, para uma parte da sequência de nucleotídeos definida por N°. de Acesso GenBank NM_000031 ou uma sequência de nucleotídeos complementar para a sequência de nucleotídeos; e (c) um fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos que hibridiza, sob condições rigorosas, com o fragmento de DNA tendo uma parte da sequência de nucleotídeos definida por N°. de Acesso de GenBank NM_000031 ou uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos.
[0045] A identidade de uma sequência de nucleotídeos é calculada por meio de um programa de análise de homologia, GENETIX.
[0046] O termo “condições rigorosas” refere-se a dois fragmentos de DNA sendo hibridizados um com outro sob condições padrões de hibridização como descrito por Sambrook J. et al. (Expression of cloned genes in E. coli (Molecular Cloning: A laboratory manual (1989)), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 9.47-9.62 and 11.45-11.61).
[0047] O nível de mRNA de um espécime pode ser determinado através de PCR empregando os fragmentos de ácido nucléico assim produzidos e RNA derivado do espécime, preferivelmente através de RT-PCR de tempo real incluindo uma etapa de produção de cDNA a partir de mRNA. RT-PCR pode ser realizada de acordo com uma técnica conhecida tal como RT-PCR de duas etapas ou RT-PCR de uma etapa. A partir dos pontos de vista de simplicidade e prevenção de contaminação – cruzada, RT-PCR de uma etapa é preferida. RT-PCR de uma etapa pode ser realizada por meio de, por exemplo, um kit comercial (por exemplo, QIAGEN OneStep RT-PCR kit). Como a enzima tendo atividade de transcrição reversa que pode ser empregada em reação RT, uma variedade de transcriptases reversas como transcriptase reversa MMLV podem ser empregadas. A DNA polimerase, que é empregada em PCR para amplificação de um fragmento de DNA, preferivelmente tem resistência térmica (≥ 90°C).
[0048] Em um modo de tal PCR, reação de desnaturação térmica (DNA de fita dupla para DNA de fita simples) é realizada em 90 a 98°C, reação de anelamento para hibridização de um iniciador para cDNA molde é realizada em 37 a 72°C, e reação de extensão na qual DNA polimerase atua é realizada em 50 a 75°C. O conjunto de reações (ciclo) é realizado uma vez até algumas dezenas de vezes. Condições de reação preferidas incluem desnaturação térmica a 95°C por 30 segundos, anelamento a 60°C por 30 segundos, e extensão a 72°C por 40 segundos. Em PCR, dois iniciadores são preferivelmente usados em combinação. Neste caso, os dois iniciadores têm de ser selecionados de modo a formarem uma combinação de uma fita sentido e uma fita anti-sentido. O fragmento de ácido nucléico da presente invenção pode servir como uma sonda, e pode ser usado em combinação com outros iniciadores universais conhecidos, oligonucleotídeos, etc.
[0049] A amostra de espécime contendo mRNA servindo como um molde para RT-PCR preferivelmente tem uma quantidade de RNA total de 1 pg a 1 μg, mais preferivelmente 2 ng a 50 ng.
[0050] Quando PCR procedeu apropriadamente, a “quantidade de amplicon PCR” e o “número de ciclos de PCR” são genericamente correlacionados com a “quantidade de molde de PCR”. Assim, o nível de mRNA de um gene alvo; isto é, o nível de expressão de gene alvo, pode ser calculado a partir da quantidade de amplicon produzida em PCR e o número de ciclos de PCR.
[0051] Nenhuma limitação particular é imposta sobre o processo de determinação de quantidade de amplicons e PCR e o número de ciclos de PCR, e qualquer processo pode ser aplicado. Por exemplo, o número de ciclos de PCR pode ser contado quando o nível de DNA atingir um predeterminado nível. Este procedimento pode ser realizado através de, por exemplo, determinação de número de ciclos de PCR quando a intensidade de fluorescência tenha atingido um nível predeterminado em um processo combinatório incluindo o processo de PCR no qual um amplicon de PCR é marcado e o processo de PCR no qual o marcador é monitorado com tempo. Em um típico procedimento, a marcação é realizada através do uso de um corante fluorescente, e o marcador é monitorado através de medição de intensidade de fluorescência. Em um modo de marcação com um corante fluorescente, um corante fluorescente intercalador tal como SYBR ® Verde I pode ser empregado. Uma vez que o corante fluorescente intercalador aperfeiçoa a intensidade de fluorescência via intercalação com um ácido nucléico de fita dupla, uma intensidade de fluorescência que corretamente reflete o nível de amplicons de PCR é obtida. Marcação com um corante fluorescente também pode ser realizada através do uso de sonda TaqMan, Moleculer Beacon, etc., que são marcadas com um corante fluorescente. Uma sonda TaqMan ou Moleculer Beacon é uma sonda na qual um corante fluorescente e um de extinção são ligados a um oligonucleotídeo tendo uma homologia a uma sequência interna de uma região que é amplificada através de PCR. A sonda é adicionalmente empregada em PCR. Uma vez que fluorescência em resposta ao grau de PCR é emitida através de interação entre o corante fluorescente e o de extinção ligados à sonda, o produto de PCR formado através de amplificação pode ser monitorado através de medição de intensidade de fluorescência em cada estágio de PCR.
[0052] Como descrito acima, o nível de mRNA de gene alvo de um espécime também pode ser determinado a partir de, por exemplo, a eficiência de hibridização entre o fragmento de ácido nucléico que pode hibridizar especificamente com um mRNA alvo e RNA derivado do espécime.
[0053] O fragmento de ácido nucléico que pode hibridizar especificamente com um mRNA de gene alvo pode ser um fragmento de ácido nucléico desenhado e produzido na maneira mencionada anteriormente. O fragmento de ácido nucléico é preferivelmente um fragmento de ácido nucléico marcado. Exemplos do agente de marcação incluem uma enzima, um íon paramagnético, biotina, um corante fluorescente, um cromóforo, um metal pesado, e um radiosótopo. Um mais preferido é uma enzima. Exemplos da enzima incluem peroxidase de raiz forte e fosfatase alcalina. A marcação pode ser realizada através de um processo conhecido. Através de determinação de grau de hibridização entre uma amostra contendo RNA derivado de um espécime e o fragmento de ácido nucléico, o nível de mRNA de gene alvo do espécime pode ser determinado através de um conhecido processo de cálculo. Nenhuma limitação particular é imposta sobre o processo de determinação de grau de hibridização, e ele pode ser determinado de acordo com um processo conhecido, por exemplo, medição de um marcador ligado ao fragmento de ácido nucléico. Ou seja, quando um fragmento de ácido nucléico marcado com um corante fluorescente é usado, a intensidade de fluorescência é medida, para determinação de grau de hibridização.
[0054] O nível de expressão de um gene alvo também pode ser determinado através do uso, como uma sonda, de um fragmento de ácido nucléico que pode hibridizar especificamente com uma sequência de nucleotídeos do gene alvo ou seu mRNA. No caso de gene ALAD, pode ser usada, como uma sonda, um fragmento de ácido nucléico tendo uma parte da sequência de nucleotídeos definida pelo N°. de Acesso de GenBank NM_000031 (por exemplo, GAGGAGTCCCCAGCTATTGAGGCAA) (SEQ ID NO: 1) ou tendo uma sequência de nucleotídeos complementar para a sequência de nucleotídeos, ou um fragmento de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos homóloga a qualquer uma das sequência acima e que é funcionalmente equivalente ao fragmento de ácido nucléico acima. Estas sondas podem ser imobilizadas sobre qualquer fase sólida, para através do que prover um chip de DNA, um chip de gene, um microarranjo de cDNA, um arranjo de oligo DNA, etc.
[0055] Outras sondas que não as mencionadas acima, também podem ser empregadas, como uma sonda, uma combinação de uma pluralidade de fragmentos de ácidos nucléicos que são desenhados para especificamente detectarem uma sequência de nucleotídeos do gene alvo ou seu mRNA e que podem hibridizar especificamente com uma pluralidade de regiões apropriadamente selecionadas de uma sequência de nucleotídeos do gene alvo ou seu mRNA.
[0056] Nenhuma limitação particular é imposta sobre a fase sólida que é empregada para imobilização de uma sonda, tanto quanto a fase sólida possa imobilizar polinucleotídeo. Exemplos da fase sólida incluem placa de vidro, membrana de nylon, micropérolas, um chip de silício, e um capilar. A fase sólida pode ser marcada. Nenhuma limitação particular é imposta sobre o agente de marcação, e um corante fluorescente, um radioisótopo, etc., pode ser usado. Em imobilização de polinucleotídeo sobre uma fase sólida, um polinucleotídeo que foi sintetizado em avanço pode ser colocado sobre uma fase sólida, ou um polinucleotídeo alvo pode ser sintetizado sobre uma fase sólida. Quando um microarranjo de DNA é selecionado, imobilização pode ser realizada através do uso de um formador de pontos comercial ou semelhantes, através de um processo apropriado conhecido (impressão de polinucleotídeo através de processo de jato de tinta, síntese in situ, ou fotolitografia) dependendo do tipo da sonda a ser imobilizada.
[0057] O nível de expressão de um gene alvo pode ser determinado através de hibridização de chip de DNA preparado acima ou semelhante com um DNA ou RNA marcado preparado de um RNA obtido de um espécime (por exemplo, células cultivadas, tecido, seção de tecido, ou lisado de sangue) ou um DNA ou RNA marcado preparado diretamente do espécime; e medindo, como um sinal atribuído à sonda marcada, a quantidade da fita dupla formada da sonda e o DNA ou RNA marcado. O sinal pode ser detectado através de um processo de rotina, por exemplo, por meio de um contador de radiação, um detector de fluorescência, etc.
[0058] Alternativamente, o nível de expressão de um gene alvo pode ser determinado através de processo de micropérolas. Por exemplo, os níveis de expressão de uma pluralidade de genes alvos podem ser determinados simultaneamente através do seguinte procedimento. Especificamente, sondas para mRNA derivado de diferentes genes alvos são imobilizadas sobre micropérolas que foram marcadas com diferentes agentes fluorescentes. O mRNA dos genes alvos preparado de um espécime (por exemplo, células cultivadas, tecido, seção de tecido, ou lisado de sangue) é hibridizado com os mesmos, e cada gene alvo é especificamente detectado através de fluorescência a partir do mesmo. Também, uma sonda marcada é hibridizada com mRNA de genes alvos que foram hibridizados com as sondas imobilizadas sobre as micropérolas, e o marcador da sonda é detectado, para através do que determinar os níveis de mRNA.
[0059] Além disso, o número de cópias e o nível de expressão de um gene alvo podem ser determinados através do uso da sonda mencionada anteriormente através de um processo conhecido (por exemplo, o processo de hibridização southern, o processo de hibridização northern, o processo FISH, ou o processo CGH). No caso onde um polipeptídeo codificado pelo gene alvo é medido, o nível de expressão do gene alvo pode ser determinado através de um processo de mancha imune conhecido (o processo ELISA, o processo de western blotting, o processo EIA, o processo RIA, o processo IHC, ou semelhantes) empregando um anticorpo específico para o polipeptídeo.
[0060] Em determinação da sensibilidade de um sujeito para um agente anticâncer, os níveis de expressão dos genes alvos em uma amostra biológica coletada de um paciente de câncer antes ou durante administração do agente anticâncer são medidos. No caso onde os genes alvos são gene CABLES1, gene GDA, gene HOXB6, e gene TMEM18, quando o valor obtido de níveis de expressão é igual a, ou maior que um valor de referência predeterminado, o câncer não tem sensibilidade ao agente anticâncer, enquanto quando o valor obtido é menor que o valor de referência, o câncer tem sensibilidade para o agente anticâncer.
[0061] Além disso, a melhor resposta de tumor (razão) do paciente de câncer é calculada a partir dos níveis de expressão de cinco genes; gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10, através de fórmula (1). Quando o valor obtido é igual ou maior que um valor referência predeterminado, o câncer tem sensibilidade para o agente anticâncer, enquanto quando o valor obtido é menor que o valor referência, o câncer não tem sensibilidade para o agente anticâncer. O valor de referência predeterminado pode ser apropriadamente modificado de acordo com as condições e tipo de câncer do paciente de câncer alvo, o tipo de uma droga incluindo um agente anticâncer adicional empregado em combinação com um agente anticâncer contendo oxaliplatina ou seu sal, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal, etc. (ver os Exemplos abaixo). No caso onde fluorouracil, levofolinato, e oxaliplatina são administrados em combinação, por exemplo, o valor de referência da melhor resposta de tumor (razão) é preferivelmente 0,5 ou maior, particularmente preferivelmente 0,7 ou maior.
[0062] Antes da administração de um agente anticâncer, quando o nível de expressão de cada gene recusa sensibilidade, ou quando o valor obtido pela fórmula (1) é menor que o valor de referência, o câncer pode ser verificado não ter sensibilidade para o agente anticâncer. Neste caso, o efeito do agente não é esperado. Se determinado agente anticâncer ineficaz é continuamente administrado para um paciente de câncer, progressão de câncer e agravamento de efeitos adversos podem ser antecipados. Assim, o processo de determinação de sensibilidade da presente invenção contribui grandemente não somente para determinação de possível resposta terapêutica provida por um agente anticâncer, mas também para prevenção de agravamento de efeitos adversos que de outro modo podem ser causados por administração contínua de um agente anticâncer ineficaz. Particularmente, o processo de determinação de sensibilidade da presente invenção pode ser adequadamente apropriado para um paciente de câncer antes de administração de um agente anticâncer. Em adição, o processo também pode ser empregado como um processo para selecionar ativamente um paciente que é esperado ser tratado por um agente anticâncer.
[0063] Através de medição de níveis de expressão dos genes alvos em uma amostra biológica derivada de um paciente de câncer que está atualmente recebendo um agente anti câncer e monitoração de nível de expressão de cada um dos genes ou dos valores obtidos da fórmula (1) em cada ciclo de terapia, a sensibilidade do câncer para o agente anticâncer pode ser avaliada com o tempo, pelo que o processo também pode servir como um processo para determinação de se ou não a terapia é para ser continuada. Quando o câncer não tem sensibilidade para o agente anticâncer, um efeito farmacêutico do agente não é mais esperado, e somente efeitos adversos do agente anticâncer são concebivelmente providos. Assim, o processo de determinação de sensibilidade da presente invenção também pode ser empregado para prevenção de início de indesejados efeitos adversos e progressão de câncer e agravamento de efeitos adversos que de outro modo podem ser causados por continuação de terapia ineficaz.
[0064] Em adição a melhor resposta de tumor (razão), ali também pode ser empregado como parâmetro para a determinação de sensibilidade, parâmetros relacionados a eficácia tais como sobrevivência total (dias), sobrevivência livre de progressão (dias), duração de resposta total (dias), duração de doença estável (dias), e tempo para falha de tratamento (dias) e parâmetros relacionados com efeito adverso como a concentração em sangue, meia-vida de depuração, biodisponibilidade, área sob a curva de tempo – concentração no sangue, depuração, distribuição de volume, etc. do agente anticâncer e um seu metabólito.
[0065] Nenhuma limitação particular é imposta sobre o agente anticâncer adicional usado em combinação com oxaliplatina ou seu sal, fluorouracil ou seu sal, e levofolinoato ou seu sal. Exemplos do agente anticâncer adicionalmente usado incluem ciclo fosfamida, ifosfamida, tiotepa, melfalam, busulfam, nimustina, ranimustina, dacarbazina, procarbazina, temozolomida, cisplatina, carboplatina, nedaplatina, metotrexato, pemetrexede, tegaful/uracila, doxifluridina, tegaful/gimeracil/oteracil, capecitabina, citarabina, enocitabina, gencitabina, 6-mercapto purina, fuludarabina, pentostatina, cladribina, hidroxi uréia, doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, idarubicina, pirarubicina, mitoxantrona, amurubicina, actinomicina D, bleomicina, pepleomicina, mitomicina C, aclarubicina, zinostatina, vincristina, vindesina, vinblastina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, irinotecano, metabólito ativo de irinotecano (SN-38), nogitecano (topotecano), etoposide, prednisolona, dexametasona, tamoxifeno, toremifeno, medroxiprogesterona, anastrozol, exemestano, letrozol, rituximabe, imatinibe, gefitinibe, gentuzumabe ozogamicina, bortezomibe, erlotinibe, cetuximabe, bevacizumabe, sunitinibe, sorafenibe, dasatinibe, panitumumabe, asparaginase, tretinoína, trióxido arsênico, um sal de qualquer um destes, e um seu metabólito ativo. Destes, irinotecano, SN-38, um sal de qualquer um destes, e bevacizumabe são preferidos, com bevacizumabe sendo particularmente preferido.
[0066] Na realização do processo da presente invenção para determinação de sensibilidade de um sujeito para um agente anti-câncer, é preferivelmente empregado um kit contendo um protocolo para determinação de níveis de expressão de um ou mais genes em um espécime selecionado do grupo consistindo em gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10. O protocolo para determinação de níveis de expressão de gene inclui, por exemplo, um protocolo que indica o processo para determinação de nível de expressão de um gene alvo, um reagente usado no processo para determinação de nível de expressão do gene alvo, e um chip de DNA no qual um fragmento de ácido nucléico que pode hibridizar especificamente com o mRNA do gene alvo foi imobilizado. Em adição, o kit ainda pode conter valores de referências para determinação de se ou não o sujeito tem sensibilidade para o agente anticâncer. Os valores de referência incluem nível de expressão padrão dos respectivos genes, níveis de expressão que são avaliados como níveis altos, níveis de expressão que são avaliados como níveis baixos, e fatores (e o grau de fatores) que afetam os níveis de expressão. Estes valores de referência podem ser apropriadamente pré-determinados separadamente de acordo com as condições de paciente de câncer alvo, o tipo de espécime, o tipo de câncer, o tipo de droga incluindo um agente adicional anticâncer usado em combinação com um agente anticâncer contendo oxaliplatina ou sal do mesmo, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal, e os parâmetros para determinação de sensibilidade. Com referência aos valores de referência, determinação de sensibilidade pode ser realizada em uma maneira como descrito acima.
[0067] No caso onde a melhor resposta de tumor (razão) é calculada a partir de níveis de expressão de cinco genes; gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10, através da fórmula (1) mencionada anteriormente, o kit de determinação de sensibilidade contém (A) um protocolo para determinação de níveis de expressão dos cinco genes mencionados anteriormente e (B) um protocolo para cálculo de melhor resposta de tumor (razão). O protocolo (A) para determinação de níveis de expressão dos cinco genes mencionados anteriormente contém, por exemplo, (A1) um protocolo que indica o processo para determinação de nível de expressão de um gene alvo, (A2) um reagente usado no processo para determinação de nível de expressão do gene alvo, e (A3) um chip de DNA no qual um fragmento de ácido nucléico que pode hibridizar especificamente com o mRNA do gene alvo foi imobilizado. O protocolo (B) contém (B1) um protocolo para cálculo de melhor resposta de tumor (razão) através de fórmula (1) e (B2) valores de referência para determinação de se ou não o sujeito tem sensibilidade para o agente anticâncer ou semelhante. Os valores de referência incluem valores padrões de melhor resposta de tumor (razão), e os fatores (e o grau de fatores) que afetam os valores padrões. Estes valores de referência podem ser apropriadamente predeterminados de acordo com as condições de paciente de câncer alvo, o tipo de espécime, o tipo de câncer, e o tipo da droga incluindo um adicional agente anticâncer usado em combinação com um agente anticâncer contendo oxaliplatina ou seu sal, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal. Com referência aos valores de referência, determinação de sensibilidade pode ser realizada em uma maneira como descrito acima.
[0068] O kit da presente invenção não é limitado às realizações acima e abrange um kit incluindo todos ou uma parte dos membros requeridos para realização de todas ou uma parte das etapas do processo. Exemplos de “membros requeridos para realização das etapas” incluem um tampão.
[0069] Quando uma variação em expressão de um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em gene ALAD, gene C20orf43, gene CABLES1, gene CDC14B, gene GDA, gene HOXB6, gene RPL7A27, gene TMEM18 e gene UGT2B10 em um espécime é empregada como um índice, um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para um agente anticâncer pode ser selecionado por triagem.
[0070] Especificamente, no caso onde os genes alvos são gene CABLES1, gene GDA, gene HOXB6, e gene TMEM18, um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para um agente anticâncer pode ser selecionado através de triagem empregando, como um índice, supressão da expressão dos genes. Em outras palavras, a substância que suprime a expressão dos genes in vitro ou in vivo aperfeiçoa sensibilidade de um sujeito para um agente anti-câncer. Por exemplo, em um câncer de animal, a substância que promove supressão de expressão de gene antes e após administração de um agente anticâncer é definida como uma substância que aperfeiçoa a sensibilidade para o agente anticâncer (agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para agente anti-câncer). Em várias linhas de células de câncer, a substância que promove supressão de expressão de gene in vitro na presença de um agente anticâncer é definida como uma substância que aperfeiçoa a sensibilidade para o agente anticâncer (agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para agente anti-câncer).
[0071] Através do emprego, como um índice, de um aumento na melhor resposta de tumor (razão) obtida a partir de fórmula (1), um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para um agente anticâncer pode ser selecionado por triagem. Em outras palavras, a substância que aumenta o valor in vitro ou in vivo aperfeiçoa sensibilidade de um sujeito para um agente anticâncer. Por exemplo, em um câncer de animal, a substância que promove elevação no valor antes e após administração de um agente anticâncer é definida como uma substância que aperfeiçoa a sensibilidade para o agente anticâncer (agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para agente anticâncer). Em várias linhas de células de câncer, a substância que promove elevação no valor in vitro na presença de um agente anticâncer é definida como uma substância que aperfeiçoa a sensibilidade para o agente anticâncer (agente de aperfeiçoamento de sensibilidade de agente anticâncer).
[0072] Quando um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade de agente anticâncer é usado, uma variação em expressão de cada gene ou um aumento no valor obtido a partir da fórmula (1) mencionada anteriormente é observado antes da observação de regressão do tumor ou efeito citocida. Por isso, se ou não a substância teste pode servir como um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para agente anticâncer útil pode ser determinado em um período de tempo mais curto, pelo que carga e custo envolvidos em triagem podem ser reduzidos, o que é uma grande vantagem da presente invenção.
[0073] Através do emprego do assim obtido agente de aperfeiçoamento de sensibilidade de agente anticâncer e um agente anticâncer de interesse (alvo de aperfeiçoamento de sensibilidade) em combinação, o efeito terapêutico do agente anticâncer pode ser acentuadamente aperfeiçoado. A composição da presente invenção pode ser administrada oralmente ou parenteralmente. Com administração, uma composição contendo um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade de agente anticâncer e um agente anticâncer (alvo de aperfeiçoamento de sensibilidade) podem ser misturados com um carreador farmacêutico não-tóxico sólido ou líquido para provimento de uma formulação apropriada para a rota de administração (oral, intra-retal, injeção, etc.), para pelo que formar uma preparação farmacêutica genérica. A composição contendo um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade para agente anticâncer e um agente anticâncer (alvo de aperfeiçoamento de sensibilidade) pode ser uma composição única contendo ambos os ingredientes ou uma composição tipo combinação de uma pluralidade de preparações. Estes ingredientes podem ser administrados através de diferentes rotas. Exemplos da forma de preparações incluem formulações sólidas como comprimidos, grânulos, pulverizado e cápsulas; preparações líquidas como uma solução, suspensão, e emulsão; e formulações liofilizadas. Estas preparações podem ser produzidas através de um processo genericamente empregado na técnica. Exemplos do carreador farmacêutico nãotoxico incluem amido, dextrina, glicerídeo de ácido graxo, polietileno glicol, hidroxi etil amido, etileno glicol, éster de ácido polioxietileno sorbitano graxo, aminoácido, gelatina, albumina, água, e solução salina fisiológica. Se requerido, aditivos genericamente empregados na técnica tais como um estabilizador, um umectante, um agente emulsificante um agente de tonicidade, e um veículo (diluente) podem ser apropriadamente adicionados à composição.
[0074] Notar que o valor do primeiro termo e o fator de cada nível de expressão de gene na fórmula (1) foram determinados a partir dos dados de níveis de expressão de gene obtidos através de RT-PCR de tempo real. Entretanto se níveis de expressão de gene obtidos através de RT-PCR de tempo real têm uma certa correlação com aqueles obtidos através de um outro processo que não RT-PCR de tempo real, o valor do primeiro termo e o fator de cada nível de expressão de gene na fórmula (1) podem ser modificados com certos fatores que ajustam variações entre RT-PCR de tempo real e um outro processo que não RT-PCR de tempo real, a a fórmula assim ajustada pode ser usada. Neste caso, níveis de expressão de gene determinados através de um outro processo que não RT-PCR de tempo real são entrados na fórmula relevante. Mesmo quando RT-PCR de tempo real é empregado, respectivos níveis de expressão de gene variam levemente dependendo da condição e número dos pacientes de câncer alvos, o tipo de câncer, o tipo de uma droga incluindo um adicional agente anticâncer usado em combinação com um agente anticâncer contendo oxaliplatina ou seu sal, fluorouracil ou seu sal, e levofolinato ou seu sal, e outros fatores. Em tal caso, um fator adicional para modificação do primeiro termo e o fator de cada nível de expressão de gene é adicionado à fórmula (1), e a fórmula (1) assim modificada pode ser empregada.
Exemplos
[0075] A presente invenção será descrita a seguir em mais detalhes por meio de exemplos, os quais não devem ser construídos como limitantes da invenção.
Estudos através de teste clínico de sujeitos humanos que receberam regime mFOLFOX6 1. Teste clínico de sujeito humano que recebeu regime mFOLFOX6
[0076] Os sujeitos humanos testados foram pacientes de câncer que receberam uma quimioterapia de câncer (mFOLFOX6) envolvendo administração, em combinação, fluorouracil (400 mg/m2) (via injeção intravenosa rápida), levofolinato (200 mg/m2), fluorouracil (2400 a 3000 mg/m2) (via infusão intravenosa contínua), e oxaliplatina (85 mg/m2). De modo a identificar e confirmar os genes com relação ao efeito de quimioterapia de câncer, foram realizados estudos clínicos farmacológicos genômicos prospectivos. Os casos alvos foram pacientes de câncer colorretal estágio IV não-removível que não receberam quimioterapia e dos quais um espécime de tumor pode ser removido durante cirurgia paliativa. Os critérios de seleção para os sujeitos humanos testes foram como se segue: (1) um caso que foi histologicamente diagnosticado como câncer colorretal; (2) um caso que sofreu cirurgia de câncer colorretal estágio IV não-removível; (3) um caso envolvendo critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST); e (4) um caso onde funções fisiológicas (medula óssea, fígado, rim, coração, etc.) são suficientemente mantidas, onde os resultados de teste de sangue dentro de uma semana antes de registro preliminar ou sensação de registro dentro das seguintes faixas de referência: WBC: 4000/μL a 12 000/μL, NEUT: ≥ 2000/μL, PLT: ≥ 100 000/μL, Hb: ≥ 9,0 g/dL, soro AST.ALT: não mais que duas vezes o limite superior de normal na instituição (no caso de metástase de fígado, não mais que três vezes), T-Bil: ≤ 1,5 mg/dL, Cr: ≤ 1,5 mg/dL, CCr: ≥ 50 mL/minuto, BUN: ≤ 25 mg/dL, e CRP: ≤ 1 mg/dL. Os sujeitos humanos testes também incluíram um caso classificado em status de desempenho (Eastern Cooperative Oncology Group: ECOG) de 0 a 2; um caso que não sofreu tratamento preliminar outro que não cirurgia; um caso para o qual, no registro, 21 dias ou mais se passaram após cirurgia; um caso que é esperado ter um período de sobrevivência previsto de 3 meses ou mais; um caso que não tem severa co-morbidez ou câncer primário múltiplo ativo; um caso de uma idade de 20 ou mais velho e mais jovem que 75; um caso do qual uma amostra de tecido para análise de genes foi obtida na cirurgia; e um caso onde o próprio ou própria paciente proporcionou informação consentida de cirurgia incluindo doação de uma amostra biológica para estudos. Foram excluídos os seguintes casos: (1) um caso tendo uma severa complicação; (2) um caso tendo uma complicação infecciosa; (3) um caso tendo diarreia (fezes aquosas); (4) um caso tendo paralisia intestinal, ileus, ou subileus (somente antes de registro); (5) um caso tendo pneumonia intersticial ou fibrose pulmonar; (6) um caso tendo áscites ou fluido pleural em um grande volume; (7) um caso tendo icterícia; (8) um caso tendo uma doença de coração tal como doença de coração isquêmico ou arritmia em uma extensão requerendo tratamento (um caso tendo hipertrofia ventricular esquerda ou sobrecarga ventricular esquerda leve concomitante com hipertensão ou bloco de ramificação de feixe direito leve pode ser registrado); (9) um caso que experimentou infarto de coração dentro de 6 meses; (10) um caso tendo cirrose como uma complicação; (11) um caso exibindo hemorragia recente do trato digestivo para ser tratada através de repetida transfusão de sangue; (12) um caso tendo um distúrbio mental tratado com ou possivelmente para ser tratado com um psicotrópico; (13) um caso tendo diabetes de difícil controle como uma complicação; (14) um caso tendo outras complicações pós-operativas severas; (15) um caso que experimentou severa anafilaxia para outras drogas; (16) um sujeito fêmea em gravidez ou lactação ou um sujeito macho ou fêmea desejando ter um bebê; e (17) um caso que é positivo para vírus de hepatite, vírus de HIV, ou sífilis. No regime mFOLFOX6, administração foi iniciada ≤ 28 dias após operação cirúrgica. A partir de dia 1 (dia de início de administração), administração foi realizada uma vez por semana por uma semana, seguido por um período de descanso de uma semana, em duas semanas como 1 curso.
[0077] Cinqüenta e seis sujeitos no total participaram no estudo, e 54 sujeitos dos mesmos puderam ser avaliados em termos de resposta de tumor para uma lesão alvo. Entre os 54 sujeitos, quatro casos (casos de referência) que exibiram uma pontuação teste caindo fora das faixas acima foram excluídos, e RNA para avaliação de níveis de expressão de gene foi obtido de 44 casos. Entre 44 casos, genes relacionados à sensibilidade a uma terapia de agente anticâncer foram recuperados de 37 casos que foram adaptados para análises de micro arranjo de DNA.
[0078] Como um micro arranjo de DNA, foi usado Whole Human Genoe 4x44K (produto de Agilent). Análises de micro arranjo de DNA foram realizadas através das seguintes etapas: (1) síntese de cDNA a partir de RNA total, (2) síntese de cRNA marcado a partir de cDNA, (3) fragmentação de cRNA, (4) hibridização de cRNA fragmentado com micro arranjo, (5) lavagem do micro arranjo, (6) exploração do micro arranjo, e (7) análise de expressão de gene, nesta ordem.
[0079] RNA total foi extraído de amostras de tecido de câncer colorretal humano de 54 casos por meio de RNeasy Mini Kit (produto de Qiagen) de acordo com o protocolo ligado ao mesmo, e cada amostra de RNA foi estocada em -80°C.
(1) Síntese de cDNA a partir de RNA total
[0080] cDNA de fita dupla foi sintetizado por meio de Quick Amp Labeling Kit (produto de Agilent) de acordo com um protocolo ligado ao mesmo. Especificamente, RNA total (500 ng) foi diluído com água livre de nuclease para 5,3 microlitros, e o diluído foi misturado com iniciador promotor T7 (1,2 microlitros) contido no kit e Spike-Mix diluída (produto de Agilent) (5 microlitros) como um controle positivo. A mistura (volume total: 11,5 microlitros) foi aquecida a 65°C por 10 minutos e então resfriada sobre gelo por 5 minutos. Sob resfriamento em gelo, 5 x tampão de primeira fita (4 microlitros), mistura dNTP 10 mM (1 microlitro), DTT 0,1 M (2 microlitros), inibidor RNase (0,5 microlitro), e transcriptase reversa MMLV (1 microlitro), que foram componentes do kit, foram adicionados à mistura. A resultante mistura (volume total de 20 microlitros0 foi aquecida a 40°C por 2 horas e ainda a 65°C por 15 minutos de modo a terminar reação de síntese de cDNA. Após término da reação, a mistura de reação foi resfriada sobre gelo por 5 minutos.
(2) Síntese de cRNA marcado a partir de cDNA
[0081] Subsequentemente, transcrição in vitro (IVT) foi realizada por meio de Quick Amp Labeling Kit (produto de Agilent) de acordo com o protocolo ligado ao mesmo, para através do que sintetizar cRNA. Especificamente, tampão de transcrição 4x (20 microlitros), DTT 0,1M (6 microlitros0, mistura NTP (8 microlitros), PEG 50% (6,4 microlitros), inibidor RNase (0,5 microlitro), pirofosfatase inorgânica (0,6 microlitro), RNA polimerase T7 (0,8 microlitro), cianina 3-CTP (2,4 microlitros), e água livre de nuclease (15,3 microlitros), que foram componentes do kit, foram suficientemente misturados juntos. A mistura (volume total: 60 microlitros) foi adicionada à solução de cDNA (20 microlitros) preparada em (1), e a mistura resultante foi aquecida a 40°C por 2 horas. Após término de reação, a mistura de reação foi purificada por meio de RNeasy Mini Kit (produto de Qiagen) de acordo com um protocolo ligado ao mesmo, para pelo que render cRNA purificado. Mais especificamente, água livre de nuclease (20 microlitros) foi adicionada à mistura de reação (80 microlitros), e à solução resultante (volume total: 100 microlitros), tampão RLT (350 microlitros) contido no kit foi adicionado, seguido por suficiente mistura. À mistura, foi adicionado etanol 100% (250 microlitros), seguido por suficiente mistura. A resultante mistura (volume total: 700 microlitros) foi adicionada a coluna RNeasy mini-spin contida no kit e centrifugada em 13 000 rpm por 30 segundos. A coluna RNeasy minispin foi fixada em um tubo de 2 mL novo. Tampão RPE (500 microlitros) contido no kit foi adicionado à coluna, e o resultante foi centrifugado a 13 000 rpm por 30 segundos, para pelo qual remover líquido de eluição. A coluna mini-spin foi novamente fixada no tubo de 2 mL, e tampão RPE (500 microlitros) foi adicionado à coluna. O resultante foi centrifugado em 13000 rpm por 1 minuto, para pelo qual remover líquido de eluição. A coluna mini spin foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, e água isenta de nuclease (30 microlitros) foi diretamente adicionada à membrana. O tubo foi deixado em repouso em temperatura ambiente por 1 minuto e então submetido a centrifugação em 13000 rpm por 30 segundos, para pelo que eluir uma amostra de cRNA.
[0082] cRNA foi quantificado por meio de um NanoDrop (produto de Thermo scientific). A absorbância da solução amostra foi medida em 260 nm e 280 nm, para pelo qual determinar concentração de cRNA e confirmar que a porcentagem de incorporação de corante Cy3-CTP foi ≥ 9 p moles/μg. A qualidade de cRNA foi investigada por meio de Agilent 2100 Bioanalyzer de acordo com o protocolo ligado ao mesmo. Especificamente, o pico de mancha foi verificado ter um comprimento de ≥ 500 bases em eletroforese.
(3) Fragmentação de cRNA
[0083] cRNA foi fragmentado por meio de Kit de Hibridização de Expressão de Gene (produto de Agilent) de acordo com protocolo ligado ao mesmo. Especificamente, cRNA (1,65 microgramas) foi diluído com água livre de nuclease de modo a ajustar o volume para 41,8 microlitros. Tampão de fragmentação 25x (2,2 microlitros) e agente de bloqueio 10x (11 microlitros), que foram componentes do kit, foram adicionados ao cRNA diluído, e a mistura foi aquecida a 60°C por 30 minutos, seguido por resfriamento sobre gelo por 1 minuto. À solução contendo fragmentos de cRNA (55 microlitros), 2x tampão de hibridização HI-RPM (55 microlitros) contido no kit foi adicionado, para através do que preparar uma solução de hibridização (volume total: 110 microlitros).
(4) Hibridização de cRNA fragmentado com micro arranjo
[0084] A hibridização foi realizada por meio de um forno de hibridização (produto de Agilent) e um rotor de hibridização (produto de Agilent) de acordo com um protocolo ligado ao mesmo. Especificamente, a solução de hibridização preparada em (3) foi aplicada a uma superfície de arranjo Whole Human Genome 4x44K, e a superfície de arranjo foi coberta com uma lâmina de gaxeta (produto de Agilent). O arranjo foi fixado por meio de uma câmara de hibridização para micro arranjo oligoDNA (produto de Agilent). O arranjo assim fixado foi montado em um rotor de hibridização e aquecido em um forno de hibridização a 65°C por 17 horas sob rotação de 10 rpm.
(5) Lavagem de Micro Arranjo
[0085] Após o término da hibridização, o micro arranjo fixado pela câmara de hibridização para micro arranjo oligo-DNA foi removido da câmara e lavado. Especificamente, o micro arranjo foi transferido em um reservatório enchido com um Tampão de Lavagem de Expressão de Gene 1 (produto de Agilent) contendo Triton X102 0,005%, e lavado sob agitação com uma barra agitadora em temperatura ambiente por 1 minuto. Então, o micro arranjo lavado foi transferido em um banho de termostato equipado com um agitador, enchido com um Tampão de Lavagem de Expressão de Gene 2 (produto de Agilent) contendo Triton X-102 0,005%, e lavado sob agitação com uma barra agitadora a 37°C por 1 minuto.
(6) Exploração de Micro Arranjo
[0086] O micro arranjo assim lavado foi fixado em um prendedor de lâmina e submetido a exploração por meio de um explorador Agilent G2565BA (produto Agilent), pelo que foi lido um padrão de fluorescência. Os dados foram estocados como uma imagem TIFF. A imagem TIFF foi processada por software; Agilent Feature Extraction Ver. 9.5, pelo que intensidades de sinais dos pontos observados sobre o arranjo atribuídos a respectivos genes foram calculados.
(7) Análise de Expressão de Gene
[0087] Na análise de expressão de gene, os dados de intensidade de sinal assim obtidos foram normalizados por software de análise de expressão de gene; GeneSpring GX (produto de Agilent). Especificamente, um sinal de fundo foi subtraído de cada sinal de ponto. Quando a diferença foi menor que 0,01, a diferença foi empregada como 0,01. O valor foi dividido por um valor de altura de ¾ de sinais de todos os pontos no arranjo e convertido a um logaritmo (base: 2), para pelo que prover um nível de expressão de gene relativo normalizado.
2. Recuperação de genes relacionados com sensibilidade
[0088] A partir dos resultados de análises de 37 casos que foram capazes de ser analisados através de análise de micro arranjo de DNA, genes que podem prever melhor resposta de tumor (razão) foram recuperados. A correlação dos resultados de analise de micro arranjo de DNA dos 37 casos com melhor resposta de tumor foi investigada através de análise de correlação de produto – momento de Pearson e análise de correlação de classificação de Spearman. Como um resultado, 17 genes foram identificados como genes que tiveram um valor absoluto de fator de correlação R de mais que 0,5, um valor p menor que 0,2 como obtido pelo teste de fator de correlação ρ, e um nível de expressão média relativa de mais que 0,5 (Tabela 1). Também, as mesmas análises foram realizadas com relação a 41 casos, incluindo 4 adicionais casos de referência. Como um resultado10 genes foram identificados como genes que tiveram um valor absoluto de fator de correlação R maior que 0,5, um valor p menor que 0,05 como obtido pelo teste de fator de correlação ρ, e um nível de expressão média relativa maior que 0,5 (Tabela 2). Entre os 17 genes selecionados dos resultados de análises de 37 casos e os 10 genes selecionados dos resultados de análises de 41 casos, 9 genes comuns pertencendo a ambos os grupos foram identificados (Tabela 3). Uma vez que estes 9 genes foram comumente identificados em ambos os grupos analisados sob diferentes condições, estes genes foram considerados serem mais úteis clinicamente. Assim, a correlação entre cada um dos nove genes e a melhor resposta de tumor foi avaliada.
Figure img0001
Figure img0002
[0089] De modo a investigar a correlação entre cada um dos 9 genes assim identificados e a melhor resposta de tumor, os níveis de expressão de respectivos genes foram determinados através de RT-PCR em tempo real empregando ensaios de expressão de gene TaqMan, e os resultados foram avaliados através de análises de regressão. A Tabela 4 mostra os resultados. Gene RPL7AP27 foi excluído dos alvos de análises, uma vez que uma sonda iniciadora do gene apropriada para RT-PCR não pode ser produzida.
Figure img0003
[0090] Os dados do nível de expressão de cada gene foram classificados em dois grupos; um grupo de alto nível de expressão e um grupo de baixo nível de expressão, e cada grupo foi analisado através de teste-t. A Tabela 5 mostra os resultados. O gene RPL7AP27 foi excluído dos alvos de análises, uma vez que uma sonda iniciadora do gene apropriado para RT-PCR não pode ser produzida.
Figure img0004
[0091] Os dados de melhor resposta de tumor foram classificados em um grupo CR + PR e um grupo SD + PD, de acordo com os padrões RECIST, e cada grupo foi analisado através de teste-t. Também, os dados foram classificados em um grupo CR + PR, um grupo SD, e um grupo PD, e cada grupo foi analisado através de análise de variância de uma-via. A Tabela 6 mostra os resultados. Os níveis de expressão de gene CABLES1, gene GDA, gene HOXB6, e gene TMEM18 foram verificados serem estatisticamente maiores no grupo SD + PD (nenhuma resposta para terapia) que no grupo CR + PR (com resposta para a terapia). Gene RPL7AP27 foi excluído dos alvos de análises, uma vez que uma sonda iniciadora do gene apropriada para RT-PCR não pode ser produzida.
Figure img0005
3. Estabelecimento e verificação de uma fórmula de previsão de sensibilidade
[0092] Através dos estudos acima, entre os 9 genes relacionados a sensibilidade identificados através do uso de um micro arranjo de DNA, os 8 genes excetuando o gene RPL7AP27 foram verificados terem uma correlação estatisticamente significante com sensibilidade a um agente anticâncer. Também, os 8 genes foram analisados através de análise de regressão múltipla, e uma fórmula prevendo melhor resposta de tumor através de entrada de níveis de expressão dos genes identificados foi estabelecida. A capacidade de previsão da fórmula foi verificada. Os 44 casos mencionados anteriormente nos quais RNA requerido para avaliação de níveis de expressão foi obtido, foram divididos em um grupo de estudo (26 casos, empregado para estabelecimento de uma fórmula de previsão) e um grupo de verificação (18 casos, empregado para verificação de fórmula de previsão). Os níveis de expressão dos 8 genes foram determinados através de RT-PCR de tempo real. Através do uso dos níveis de expressão dos 8 genes do grupo de estudo (26 casos), uma fórmula prevendo melhor resposta de tumor foi estabelecida através de análise de regressão múltipla. Assim, como a fórmula que pode prever mais corretamente a melhor resposta de tumor, a seguinte fórmula incluindo níveis de expressão de 5 genes (gene ALAD, gene C20orf43, gene GDA, gene TMEM18, e gene UGT2B10), entre os 8 genes:
Melhor resposta de tumor (razão) = 0,37664 + 96,360 x A – 8,5128 x B + 42,420 x C + 26,810 x D + 747,00 x E ..... (1)
(onde A representa um nível de expressão de gene ALAD; B representa um nível de expressão de gene C20orf43; C representa um nível de expressão de gene GDA; D representa um nível de expressão de gene TMEM18; e E representa um nível de expressão de gene UGT2B10) foi estabelecida.
[0093] A fórmula (1) foi indicada ter alta capacidade de previsão (R = 0,8695, AICPS (critério de informação de Akaike por amostra) = -3,367294).
[0094] De modo a verificar a capacidade de previsão da fórmula (1), os níveis de expressão dos 5 genes formando a fórmula (1) do grupo de verificação (18 casos) foram analisados através de análise de correlação de produto – momento de Pearson. Como um resultado, a fórmula (1) foi verificada ter alta capacidade de precisão (R = 0,5840392 (p = 0,01093)) (Fig. 1).
[0095] Nos estudos da fórmula de previsão, todas as combinações de 2 a 8 genes foram investigadas. Entre as combinações, a combinação de 5 genes: gene ALAD, gene C20orf43, gene GDA, gene TMEM18, e gene UGT2B10, foi verificada prover uma fórmula de previsão com precisão acentuadamente alta. Surpreendentemente, gene ALAD e gene C20orf43, cada um dos quais foi verificado ter uma baixa correlação com a sensibilidade, foram selecionados entre os 5 genes, enquanto gene HOXB6, que foi verificado ter alta correlação com a sensibilidade, não foi selecionado entre os 5 genes.

Claims (10)

  1. Processo para determinação da sensibilidade de um indivíduo a um agente anticâncer incluindo oxaliplatina ou um sal da mesma, fluorouracil ou um sal do mesmo, e levofolinato ou um sal do mesmo, o processo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a medição dos níveis de expressão do gene ALAD, gene C20orf43, gene GDA, gene TMEM18 e gene UGT2B10 em um espécime.
  2. Processo para determinação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que prevê a melhor resposta ao tumor (razão).
  3. Processo para determinação, de acordo com a reivindicação 2, o processo CARACTERIZADO pelo fato de que ainda calcula a melhor resposta ao tumor (razão) através da seguinte fórmula (1):
    melhor resposta ao tumor (razão) = 0,37664 + 96,360 x A – 8,5128 x B + 42,420 x C + 26,810 x D + 747,00 x E ..... (1)
    (em que A representa um nível de expressão do gene ALAD; B representa um nível de expressão do gene C20orf43; C representa um nível de expressão do gene GDA; D representa um nível de expressão do gene TMEM18; e E representa um nível de expressão do gene UGT2B10).
  4. Processo para determinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o espécime é uma amostra biológica derivada de um indivíduo tendo câncer.
  5. Processo para determinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o espécime é uma amostra biológica derivada de um indivíduo tendo câncer colorretal.
  6. Processo para determinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão do gene é uma quantidade de mRNA derivado do gene.
  7. Kit para realização de um processo de determinação, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o kit CARACTERIZADO pelo fato de que consiste em um protocolo para medição dos níveis de expressão do gene ALAD, gene C20orf43, gene GDA, gene TMEM18 e gene UGT2B10 em um espécime, e um reagente para medir os níveis de expressão do gene ALAD, gene C20orf43, gene GDA, gene TMEM18 e gene UGT2B10 em um espécime.
  8. Kit, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o espécime é uma amostra biológica derivada de um indivíduo tendo câncer.
  9. Kit, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o espécime é uma amostra biológica derivada de um indivíduo tendo câncer colorretal.
  10. Processo de triagem para um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade a um agente anticâncer incluindo oxaliplatina ou um sal da mesma, fluorouracil ou um sal do mesmo, e levofolinato ou um sal do mesmo, o processo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o emprego, como um índice, de uma variação na expressão do gene ALAD, gene C20orf43, gene GDA, gene TMEM18 e gene UGT2B10 em um espécime.
BR112013013656-1A 2010-12-03 2011-12-02 processo para determinação da sensibilidade de um indivíduo a um agente anticâncer, kit para realização do dito processo bem como processo de triagem para um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade a um agente anticâncer BR112013013656B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-270634 2010-12-03
JP2010270634 2010-12-03
PCT/JP2011/077890 WO2012074085A1 (ja) 2010-12-03 2011-12-02 ３剤併用抗がん剤の感受性判定マーカー

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112013013656A2 BR112013013656A2 (pt) 2016-09-06
BR112013013656B1 true BR112013013656B1 (pt) 2021-01-26

Family

ID=46172007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112013013656-1A BR112013013656B1 (pt) 2010-12-03 2011-12-02 processo para determinação da sensibilidade de um indivíduo a um agente anticâncer, kit para realização do dito processo bem como processo de triagem para um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade a um agente anticâncer

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8980557B2 (pt)
EP (1) EP2647708B1 (pt)
JP (1) JP5980685B2 (pt)
KR (1) KR101873079B1 (pt)
CN (1) CN103261413B (pt)
AU (1) AU2011337612B2 (pt)
BR (1) BR112013013656B1 (pt)
CA (1) CA2819399C (pt)
WO (1) WO2012074085A1 (pt)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074436B (zh) * 2013-01-25 2014-07-16 宁波海尔施基因科技有限公司 一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法
CN110231482B (zh) * 2014-08-26 2022-07-19 学校法人庆应义塾 抗癌剂的感受性的判定标记
JP6763611B2 (ja) * 2015-04-17 2020-09-30 学校法人 川崎学園 アスベスト曝露歴または中皮腫の検査方法
EP3605103A4 (en) * 2017-03-31 2021-04-14 Keio University COMBINED ANTI-CANCER AGENT SENSITIVITY MARKER
EP3888021B1 (en) * 2018-11-30 2024-02-21 Caris MPI, Inc. Next-generation molecular profiling
JP7370046B2 (ja) * 2019-10-16 2023-10-27 医療法人社団キャンサーフリートピア 抗癌剤の選択方法
CA3163319A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Caris Mpi, Inc. Pan-cancer platinum response predictor
CN112662782B (zh) * 2020-12-30 2023-03-14 华南农业大学 鸡屠宰性状相关的tmem18基因分子标记及应用
ES2976061A1 (es) * 2022-12-01 2024-07-22 Servicio Andaluz De Salud UGT2B10 como predictor de respuesta a la neoadyuvancia en pacientes con cáncer de mama HER2 positivo y receptores hormonales negativos

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009050189A (ja) * 2007-08-24 2009-03-12 Sumitomo Bakelite Co Ltd 抗癌剤の有効性予測方法
WO2010103851A1 (ja) * 2009-03-13 2010-09-16 学校法人 埼玉医科大学 イリノテカンの感受性判定方法及びその利用

Also Published As

Publication number Publication date
US20130302327A1 (en) 2013-11-14
AU2011337612A1 (en) 2013-06-20
US8980557B2 (en) 2015-03-17
EP2647708B1 (en) 2017-04-26
CN103261413A (zh) 2013-08-21
CA2819399A1 (en) 2012-06-07
WO2012074085A1 (ja) 2012-06-07
BR112013013656A2 (pt) 2016-09-06
CA2819399C (en) 2021-03-23
JP5980685B2 (ja) 2016-08-31
EP2647708A4 (en) 2014-04-23
KR101873079B1 (ko) 2018-06-29
EP2647708A1 (en) 2013-10-09
JPWO2012074085A1 (ja) 2014-05-19
CN103261413B (zh) 2015-09-16
KR20130140046A (ko) 2013-12-23
AU2011337612B2 (en) 2016-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112013013656B1 (pt) processo para determinação da sensibilidade de um indivíduo a um agente anticâncer, kit para realização do dito processo bem como processo de triagem para um agente de aperfeiçoamento de sensibilidade a um agente anticâncer
CN106715723B (zh) 测定样品中pik3ca突变状态的方法
AU2017202786A1 (en) Methods of Treating Breast Cancer with Anthracycline Therapy
AU2010222334B2 (en) Method for determining sensitivity to irinotecan and use thereof
CN114717312B (zh) 用于膀胱癌分子亚型分型的方法和试剂盒
US20210251998A1 (en) Systems and methods for treating cancer
US20120095030A1 (en) Methods and kits to predict therapeutic outcome of tyrosine kinase inhibitors
JP2006520197A (ja) チミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失に基づいて化学療法計画を決定する方法
CN116457473A (zh) 用于监测乳腺癌的内分泌疗法中的er调节基因组套
WO2009071720A1 (es) Huella genómica para el pronóstico de la evolución de adenocarcinoma colorectal
TW201400810A (zh) 對胃癌患者選擇化學療法之方法
Mohr Expression pattern and diagnostic value of cyclin-dependent kinase 5 (CDK5) in colorectal tumors
JP2011147374A (ja) 外科切除された進行胃癌における術後補助化学療法の有効性予測方法
WO2013150167A2 (es) Modelo de expresión de microarn como indicador de supervivencia en pacientes de cancer colorrectal metastásico

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 02/12/2011, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B21F Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time

Free format text: REFERENTE A 13A ANUIDADE.