WO2012074085A1 - ３剤併用抗がん剤の感受性判定マーカー - Google Patents

３剤併用抗がん剤の感受性判定マーカー Download PDF

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正彦 西山
英孝 江口
智 和田
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学校法人埼玉医科大学
株式会社ヤクルト本社
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Definitions

  • the present invention relates to an anticancer drug sensitivity determination marker used for determining whether or not a cancer of a target patient has therapeutic reactivity to an anticancer drug to be used, and its application.
  • anticancer agents such as alkylating agents, platinum preparations, antimetabolites, anticancer antibiotics, and anticancer plant alkaloids. These anticancer drugs may or may not be effective depending on the type of cancer. Furthermore, it is known that even the types of cancer that are recognized as effective may or may not be effective depending on the individual patient. Whether or not an anticancer drug shows an effect on such individual patient's cancer is called anticancer drug sensitivity.
  • Oxaliplatin is a platinum complex antineoplastic agent. Like other cisplatin (CDDP) and carboplatin (CBDCA), which are other platinum complex antineoplastic agents, the mechanism of action is thought to be DNA synthesis inhibition and protein synthesis inhibition by crosslinking with DNA bases. L-OHP exhibits an antitumor effect even for colorectal cancer in which CBDCA is ineffective, and exhibits an antitumor spectrum different from that of conventional platinum complex antineoplastic agents. In the US, it was approved as a first-line treatment for metastatic colorectal cancer in combination with fluorouracil (5-FU) / levofolinate (LV) in January 2004.
  • fluorouracil 5-FU
  • LV levofolinate
  • the drug price was listed in combination with the continuous intravenous administration of LV and 5-FU (FOLFOX4 method) for "advanced and recurrent colorectal cancer".
  • the survival rate with 5-FU / LV therapy which was performed until the early 1990s, was 10 to 12 months, whereas the survival period with FOLFOX therapy with L-OHP Has almost doubled in 19.5 months.
  • “post-operative adjuvant chemotherapy in colon cancer” which was also used in combination with the continuous intravenous administration of 5-FU / LV, was added as an indication of efficacy and effects. It is a drug that can be expected to be beneficial.
  • 5-FU is a fluorinated pyrimidine anticancer drug developed in 1957 and is still a basic drug for digestive cancer chemotherapy.
  • 5-FU incorporated into cancer cells is mainly composed of inhibition of thymidylate synthase (TS) caused by active metabolite fluorodeoxyuridine-5′-monophosphate (FdUMP), and also has the main mechanism of action. It exhibits a cell-killing effect due to RNA dysfunction caused by 5-fluorouridine triphosphate (FUTP).
  • TS thymidylate synthase
  • FdUMP active metabolite fluorodeoxyuridine-5′-monophosphate
  • Chemotherapy for advanced and metastatic colorectal cancer is centered on key drugs such as irinotecan (CPT-11) and L-OHP, which appeared in the 1990s, and 5-FU, which has been a central drug for colorectal cancer treatment.
  • CPT-11 irinotecan
  • L-OHP L-OHP
  • 5-FU 5-FU
  • the clinical outcomes including survival rate have been dramatically improved, but the number of patients who are treated successfully is about half, taking the risk of serious side effects. The effect is not obtained in half of patients who received anticancer drugs.
  • the cancer chemotherapy treatment schedule is long-term, and after determining how many cool treatments have been performed while observing the occurrence of side effects, it is determined whether the effect has been obtained or whether the administration should be continued as is. Until then, it took a long time, expensive medical expenses, and side effects have occurred. Therefore, if there is a means for predicting whether an effect can be obtained for each patient before treatment or early in treatment, the burden on the patient and the occurrence of side effects can be reduced, and medical costs can be reduced.
  • An object of the present invention is to provide an anticancer drug sensitivity determination marker capable of discriminating treatment responsiveness of individual patients and a new cancer treatment means using the same.
  • the present inventors have been involved in sensitivity by comprehensively analyzing the gene expression and sensitivity to treatment using cancer tissues of cancer patients who have been treated with fluorouracil, levofolinate and oxaliplatin in combination.
  • Nine genes considered to be identified were identified, and among them, 5 genes were found to be particularly useful. Based on this finding, as a result of further investigation, if the expression level of the gene in a biological sample derived from a cancer patient is measured, it can be determined whether the cancer of the cancer patient is sensitive to an anticancer drug. Further, it was found that the sensitivity of an anticancer agent, specifically, the best tumor reduction effect (ratio) can be calculated by substituting the expression level of the gene into a specific calculation formula.
  • the gene expression change is used as an index, screening of an anticancer drug sensitivity-enhancing agent becomes possible, and if the sensitivity-enhancing agent is used in combination with the anticancer agent targeted for sensitivity enhancement, The present inventors have found that the therapeutic effect of a cancer drug is dramatically improved and completed the present invention.
  • the present invention relates to oxaliplatin or a salt thereof and fluorouracil or a fluorouracil comprising one or more genes selected from ALAD gene, C20orf43 gene, CABLES1 gene, CDC14B gene, GDA gene, HOXB6 gene, RPL7AP27 gene, TMEM18 gene and UGT2B10 gene.
  • the present invention provides a sensitivity determination marker for an anticancer drug containing the salt and levofolinate or the salt thereof.
  • the present invention also provides the determination marker described above, wherein the genes are ALAD gene, C20orf43 gene, GDA gene, TMEM18 gene, and UGT2B10 gene.
  • the present invention also provides the above-described determination marker for predicting the best tumor reduction effect (ratio).
  • the expression level of one or more genes selected from the ALAD gene, C20orf43 gene, CABLES1 gene, CDC14B gene, GDA gene, HOXB6 gene, RPL7AP27 gene, TMEM18 gene, and UGT2B10 gene in a sample is measured. It is intended to provide a method for determining the sensitivity of an anticancer drug comprising oxaliplatin or a salt thereof, fluorouracil or a salt thereof, and levofolinate or a salt thereof.
  • the present invention also provides the above determination method, wherein the gene whose expression level is measured is the ALAD gene, C20orf43 gene, GDA gene, TMEM18 gene, and UGT2B10 gene.
  • the present invention also provides the determination method described above, wherein the best tumor reduction effect (ratio) is calculated by the following equation (1).
  • Best tumor reduction effect (ratio) 0.37664 + 96.360 ⁇ A ⁇ 8.5128 ⁇ B + 42.420 ⁇ C + 26.810 ⁇ D + 747.00 ⁇ E (1)
  • A indicates the expression level of the ALAD gene
  • B indicates the expression level of the C20orf43 gene
  • C indicates the expression level of the GDA gene
  • D indicates the expression level of the TMEM18 gene
  • E indicates the expression level of the UGT2B10 gene.
  • the present invention is for measuring the expression level of one or more genes selected from the ALAD gene, C20orf43 gene, CABLES1 gene, CDC14B gene, GDA gene, HOXB6 gene, RPL7AP27 gene, TMEM18 gene and UGT2B10 gene in a sample.
  • the present invention provides a kit for carrying out the above-described determination method including a protocol.
  • the present invention relates to an oxali having an expression variation of one or more genes selected from ALAD gene, C20orf43 gene, CABLES1 gene, CDC14B gene, GDA gene, HOXB6 gene, RPL7AP27 gene, TMEM18 gene and UGT2B10 gene in a sample as an index.
  • the present invention provides a screening method for an agent for enhancing sensitivity to an anticancer agent containing platin or a salt thereof, fluorouracil or a salt thereof and levofolinate or a salt thereof.
  • the present invention provides an agent for enhancing sensitivity to an anticancer agent comprising oxaliplatin or a salt thereof, fluorouracil or a salt thereof, and levofolinate or a salt thereof obtained by the above screening method.
  • the present invention provides a composition for cancer treatment comprising the above-described sensitivity enhancer, oxaliplatin or a salt thereof, fluorouracil or a salt thereof, and levofolinate or a salt thereof.
  • the sensitivity determination marker of the anticancer agent of the present invention When the sensitivity determination marker of the anticancer agent of the present invention is used, the result that the anticancer agent treatment reactivity of each individual patient can be accurately determined before anticancer agent administration or early after the start of anticancer agent administration As a result, it is possible to select anticancer drugs with higher therapeutic effects, and as a result, it is possible to prevent the progression of cancer and the increase in side effects associated with the continuous administration of anticancer drugs that cannot be expected to have therapeutic effects. We can expect reduction, medical cost reduction. In addition, by using this judgment marker, it is possible to screen for drugs that enhance the sensitivity of anticancer drugs, and the combined use of the targeted anticancer drugs and sensitivity-enhancing drugs dramatically improves cancer treatment effects. To do.
  • 2 is a graph showing the prediction formula of the best tumor reduction effect (ratio) by the combined administration of L-OHP / 5-FU / LV using the expression amount of 5 genes of the present invention and the usefulness of the predictability.
  • the anti-cancer drug sensitivity determination marker is one or more genes selected from the ALAD gene, C20orf43 gene, CABLES1 gene, CDC14B gene, GDA gene, HOXB6 gene, RPL7AP27 gene, TMEM18 gene, and UGT2B10 gene.
  • the gene of the present invention is related to the sensitivity of anticancer agents by correlation analysis of comprehensive gene expression level analysis results using cancer tissues of cancer patients who have been treated with fluorouracil, levofolinate and oxaliplatin.
  • the ALAD gene refers to a gene that expresses mRNA of the base sequence represented by GenBank accession number NM_00000031 and its homologue
  • the C20orf43 gene refers to a gene that expresses mRNA having the base sequence represented by GenBank accession number NM_016407 and its homologue.
  • the CABLES gene refers to a gene that expresses mRNA having the nucleotide sequence represented by GenBank accession number NM_138375 and a homologue thereof.
  • the CDC14B gene refers to a gene that expresses mRNA having the nucleotide sequence represented by GenBank accession number NM_033331 and a homologue thereof.
  • the GDA gene refers to a gene that expresses mRNA having the nucleotide sequence represented by GenBank accession number NM_004293 and its homologue.
  • HOXB6 gene refers to a gene that expresses mRNA having the nucleotide sequence represented by GenBank accession number NM_0188952, and a homolog thereof.
  • RPL7AP27 gene refers to the gene shown in Enterz Gene ID152663 and its homologue
  • the TMEM18 gene refers to a gene that expresses mRNA having the nucleotide sequence represented by GenBank accession number NM_152834 and a homologue thereof.
  • the UGT2B10 gene refers to a gene that expresses mRNA having a base sequence represented by GenBank accession number NM_001075 and a homologue thereof.
  • the term “gene” is intended to include not only double-stranded DNA but also each single-stranded DNA such as a sense strand and an antisense strand constituting the DNA, and is not limited to the length.
  • the nucleic acid include RNA and DNA.
  • Examples of the DNA include cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, and examples of the RNA include mRNA, rRNA, and siRNA.
  • the polynucleotide includes an oligonucleotide having a plurality of base sequences.
  • the method for determining the sensitivity of an anticancer agent in the present invention can be performed by measuring the expression level of one or more genes selected from the 9 genes in a specimen.
  • 9 genes 5 genes of ALAD gene, C20orf43 gene, GDA gene, TMEM18 gene, and UGT2B10 gene are particularly useful.
  • the expression level of 5 genes in the sample is measured, and the expression level is used to calculate the expression (1).
  • the best tumor reduction effect (ratio) can be calculated, and the sensitivity of the target cancer patient to the anticancer agent can be determined.
  • the expression levels of the nine genes in the sample may be measured.
  • the specimen include biological samples derived from subjects having cancer (cancer patients) such as blood, serum, plasma, urine, tumor tissue / cells, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid, stool, sputum, and the like.
  • tumor tissue is particularly preferred.
  • the specimen can be appropriately treated by a known method and used as a tissue extract, a tissue specimen, or the like.
  • lip, oral and pharyngeal cancer typified by pharyngeal cancer
  • digestive organ cancer typified by esophageal cancer
  • stomach cancer colon / rectal cancer
  • lung cancer Respiratory and intrathoracic organ cancer, bone and joint cartilage cancer, cutaneous malignant melanoma, squamous cell carcinoma and other skin cancers, mesothelioma and mesothelioma Tissue cancer, breast cancer, uterine cancer, female genital cancer represented by ovarian cancer, male genital cancer represented by prostate cancer, urinary tract cancer represented by bladder cancer, brain tumor Representative eye, brain and central nervous system cancer, thyroid and other endocrine adenocarcinoma, non-Hodgkin lymphoma, lymphoid leukemia, lymphoid tissue, hematopoietic tissue and related tissue cancer, and these as the primary focus
  • cancer of metastatic tissue and for colon and rectal cancer (colorect
  • the gene expression level is measured by using the probe or primer capable of detecting the gene of the present invention or gene-derived mRNA, and the target gene copy number or expression level is determined by Northern hybridization method, DNA microarray, real-time PCR method It can be carried out by measuring by RT-PCR method or the like.
  • a polypeptide encoded by the gene is also exemplified as a measurement target, and is not particularly limited as long as it reflects the expression level of the gene, but it is preferable to use mRNA derived from the gene as a measurement target.
  • measurement of the expression level of a gene also includes confirming the presence or absence of gene expression.
  • RNA can be extracted from a specimen using a general-purpose method such as a method (AGPC method), a magnetic bead method, or a silica column method.
  • a general-purpose method such as a method (AGPC method), a magnetic bead method, or a silica column method.
  • RNA can be extracted using a commercially available kit (QIAGEN RNeasy KIt, TRIZOL, etc.).
  • Measurement of mRNA includes, for example, (1) determining the amount of amplification product by PCR using a nucleic acid fragment and specimen-derived RNA that can specifically hybridize to the target mRNA, and (2) specifically hybridizing to the target mRNA. Can be obtained by determining the hybridization efficiency between the possible nucleic acid fragment and the sample-derived RNA, or (3) by determining by a quantitative method using other known methods.
  • the design of “a nucleic acid fragment capable of specifically hybridizing to the target mRNA” is performed by comparing the base sequence of the target gene with the base sequence of another gene. This can be done by selecting a sequence that is specific for the mRNA.
  • the base sequence of the target gene mRNA can be obtained, for example, by referring to a database (GenBank, etc.).
  • the base sequence is aligned using software (Clustal X or the like), and a specific sequence can be found by means such as visual observation.
  • the length of the nucleic acid fragment is not particularly limited, but a nucleic acid fragment consisting of 5 to 50 bases is preferable, and a nucleic acid fragment consisting of 18 to 25 consecutive bases is more preferable.
  • the nucleic acid fragment capable of hybridizing to the mRNA of the target gene can be assumed as appropriate according to known technical common sense as well as the sequence thus designed.
  • the base sequence complementary to the base sequence and the target gene Homologous base sequences that can be used in the same manner for mRNA measurement, for example, a) base sequences in which 1 to 10, preferably 1 or several bases are substituted, added or deleted, b A) a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the base sequence; c) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence under stringent conditions.
  • Nucleic acid fragments comprising a base sequence that hybridizes can also be used. Further, such a nucleic acid fragment is a nucleic acid fragment to which any number, preferably 100, more preferably 20, even more preferably 10 or less bases are added at both ends or one end, preferably 5 ′ end. May be.
  • the nucleic acid fragment thus designed can be artificially synthesized by a DNA synthesizer, for example, according to the base sequence.
  • a fragment whose specificity has been confirmed after synthesis is preferable. Specificity can be confirmed here by using, for example, a specific PCR compared to an appropriate control when the target mRNA is used as a template. This can be done by confirming that an amplification product is obtained.
  • nucleic acid fragment for example, in the case of an ALAD gene, a nucleic acid fragment consisting of a part of the base sequence of GenBank accession number NM_00000031 or a base sequence complementary thereto, or a base sequence homologous thereto and functional
  • nucleic acid fragments having a base sequence homologous to them and functionally equivalent thereto are, for example, the nucleic acid fragments shown in the following (a) to (c), which are used for the measurement of mRNA of the target gene. The thing which can be used is mentioned. The same applies to cases other than the ALAD gene.
  • B A nucleic acid fragment comprising a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with a part of the nucleotide sequence represented by NM — 000031 or a complementary nucleotide sequence thereof.
  • C A nucleic acid fragment comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a part of the base sequence represented by NM — 000031 or a base sequence complementary thereto.
  • the identity of the base sequence is calculated by using a GENETYX TM homology analysis program.
  • “Stringent conditions” means that two DNA fragments hybridize to each other under standard hybridization conditions as described by Sambrook J et al. (Expression of cloned genes in E E. coli (Molecular Cloning: A laboratory manual (1989)) Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, 9.47-9.62 and 11.45-11.61).
  • the mRNA of the specimen can be measured by performing a PCR method, preferably a real-time RT-PCR method including a step of producing cDNA from mRNA, using the nucleic acid fragment thus prepared and the specimen-derived RNA.
  • the RT-PCR method can be performed using a known method such as Two-Step RT-PCR or One-Step RT-PCR, but it is particularly simple and prevents cross-contamination. Is preferably One-Step RT-PCR.
  • Such One-Step RT-PCR method can be performed, for example, using a commercially available kit (QIAGEN One-Step RT-PCR kit, etc.).
  • RNA polymerase used in the PCR reaction for amplifying DNA is preferably heat resistant at a temperature of 90 ° C. or higher.
  • Such a PCR reaction is, for example, a heat denaturation reaction in which double-stranded DNA is made into a single strand at 90 to 98 ° C., an annealing reaction to hybridize a primer to template cDNA at 37 to 72 ° C., and an extension that makes DNA polymerase act.
  • the reaction can be carried out by carrying out the reaction under a temperature condition of 50 to 75 ° C. for 1 to several tens of cycles.
  • an example of preferable reaction conditions is thermal denaturation 95 ° C./30 seconds, annealing 60 ° C./30 seconds, and extension reaction 72 ° C./40 seconds.
  • nucleic acid fragment of the present invention can be used as a probe, and can also be used in combination with other known universal primers, oligonucleotides and the like.
  • sample sample containing mRNA as a template for this RT-PCR reaction preferably contains 1 pg to 1 ⁇ g of RNA as the total amount of RNA, more preferably 2 ng to 50 ng.
  • the amount of mRNA of the target gene that is, the expression level of the target gene can be determined by appropriately calculating the amount of amplification product amplified by the PCR reaction thus performed and the number of PCR cycles.
  • the determination of the amount of PCR amplification product and the number of PCR cycles is not particularly limited and can be performed by any method.
  • the number of PCR cycles when a certain amount of DNA is set arbitrarily is specified.
  • Such specification is, for example, specifying the number of PCR cycles when the set fluorescence intensity is reached using the “PCR method for measuring the label over time in combination with the PCR method for labeling PCR products”.
  • examples of the label include a label with a fluorescent dye, and measurement of the label includes measurement of fluorescence intensity.
  • examples of the label with the fluorescent dye include a label with an intercalator fluorescent dye, and examples of the intercalator fluorescent dye include SYBR (R) Green I.
  • intercalating fluorescent dye has a property that the fluorescence intensity is enhanced by intercalating the double-stranded nucleic acid, fluorescence having an intensity reflecting the amplified PCR product is emitted.
  • labeling with a fluorescent dye can be performed by using a TaqMan probe labeled with a fluorescent dye, Molecular Beacon, or the like.
  • TaqMan probe and Molecular Beacon are probes in which a fluorescent dye and a quencher are bound to an oligonucleotide having homology with the internal sequence of the region amplified by PCR, and are used in the PCR reaction.
  • the PCR product amplified over time can be observed by measuring the fluorescence intensity at each PCR stage. it can.
  • the amount of mRNA of the target gene in the sample can also be obtained, for example, by knowing the hybridization efficiency between the nucleic acid fragment that can specifically hybridize to the target mRNA and the sample-derived RNA.
  • nucleic acid fragment that can specifically hybridize to the mRNA of the target gene for example, those designed and produced as described above can be used.
  • a nucleic acid fragment is preferably a labeled nucleic acid fragment.
  • the label include enzymes, paramagnetic ions, biotin, fluorescent dyes, chromophores, heavy metals, and radioisotopes, and more preferable markers include enzymes.
  • the enzymes include horseradish peroxidase or Alkaline phosphatase is mentioned. Such labeling can be performed by a known method.
  • the amount of mRNA of the target gene in the specimen can be obtained by a known conversion method.
  • the measurement of the degree of hybridization is not particularly limited, and can be performed according to a known method. For example, it can be performed by measuring a label added to a nucleic acid fragment. That is, for example, when a nucleic acid fragment labeled with a fluorescent dye is used, it can be performed by measuring the fluorescence intensity.
  • the expression level of the target gene can be measured using a nucleic acid fragment that can specifically hybridize to the target gene or its mRNA base sequence as a probe.
  • a nucleic acid fragment that can specifically hybridize to the target gene or its mRNA base sequence as a probe.
  • a nucleic acid fragment that can specifically hybridize to the target gene or its mRNA base sequence for example, in the case of the ALAD gene, a part of the base sequence described in the above GenBank accession number NM — 000031 (for example, GAGGAGTCCCCCAGCTATTGAGGCAA) (SEQ ID NO: 1) or a nucleic acid fragment consisting of a complementary base sequence or a base sequence homologous thereto Nucleic acid fragments that are functionally equivalent can also be used as probes. These probes can be immobilized on an arbitrary solid phase and used as a DNA chip, gene chip, cDNA microarray, oligo DNA array, or the like.
  • a plurality of appropriate locations are selected from the target gene or its mRNA base sequence so that the target gene or its mRNA base sequence can be specifically detected. Those designed to use a plurality of nucleic acid fragments that can specifically hybridize with each other may be used.
  • the solid phase used for immobilizing the probe is not particularly limited as long as it can immobilize the polynucleotide, and examples thereof include a glass plate, nylon membrane, microbead, silicon chip, and capillary. Further, the solid phase may be labeled. There is no restriction
  • marker For example, fluorescent dye, a radioisotope etc. can be mentioned.
  • the immobilization of the polynucleotide to the solid phase may be a method of placing a pre-synthesized polynucleotide on the solid phase, or a method of synthesizing the target polynucleotide on the solid phase.
  • a publicly known method printing of polynucleotide by ink jet method, in situ synthesis, photolithography method
  • a publicly known method printing of polynucleotide by ink jet method, in situ synthesis, photolithography method
  • Labeled DNA or RNA prepared on the basis of RNA prepared from a DNA chip or the like prepared by the above method and cultured cells, tissues, tissue sections or blood lysates or the like, or directly prepared from these samples
  • the amount of expression of the target gene is measured by hybridizing the labeled DNA or RNA and measuring the amount of the formed probe and the double strand of the labeled DNA or RNA as a signal derived from the labeled product of the probe.
  • the signal can be detected by a conventional method, for example, by measuring with a radiation detector or a fluorescence detector.
  • the expression level of the target gene can also be measured by the microbead method.
  • a probe for mRNA derived from each target gene is immobilized on microbeads with different fluorescent labels, and hybridized with mRNA of the target gene prepared from a specimen such as cultured cells, tissues, tissue sections or blood lysates.
  • a specimen such as cultured cells, tissues, tissue sections or blood lysates.
  • the labeled probe is hybridized to the mRNA derived from the target gene hybridized with the probe fixed to the microbead, and the label of the probe is detected.
  • the expression level of a plurality of target genes can also be measured simultaneously.
  • the copy number / expression level of the target gene can be measured by using a known method such as Southern hybridization method, Northern hybridization method, FISH method, CGH method, etc. using the above probe.
  • a known immunostaining method ELISA method, Western blot method, EIA method, RIA method, IHC method, etc.
  • the expression level of a target gene in a biological sample derived from a cancer patient before or during the administration of the anticancer drug is measured, and for example, the CABLES1 gene, the GDA gene, the HOXB6 gene
  • the expression level is a value greater than or equal to a predetermined reference value, the cancer is not sensitive to an anticancer agent, and if the expression level is less than a predetermined reference value, the cancer is It can be determined that the cancer drug is sensitive.
  • the best tumor reduction effect is calculated by the previous formula (1), and a numerical value equal to or greater than a predetermined reference value If it is, the cancer is sensitive to an anticancer agent, and if the value is less than a predetermined reference value, it can be determined that the cancer is not sensitive to an anticancer agent.
  • the predetermined reference value is the condition of the target cancer patient, the type of cancer, oxaliplatin or a salt thereof, fluorouracil or a salt thereof, and an anticancer agent containing levofolinate or a salt thereof.
  • the best tumor reduction effect is 0. It is preferably 5 or more, particularly 0.7 or more.
  • the sensitivity determination method of the present invention greatly contributes not only to determination of anticancer drug treatment responsiveness, but also to prevention of side effects associated with continuous administration of anticancer drugs that cannot be expected to be effective.
  • it can be suitably used for cancer patients before administration of anticancer agents. It can also be used as a determination method for actively selecting patients who can expect a therapeutic effect.
  • the expression level of the target gene in biological samples derived from cancer patients undergoing anticancer drug administration is measured, and the expression level of each gene and the numerical value obtained from the previous formula (1) are measured for each treatment cycle.
  • the sensitivity of the cancer can be evaluated over time, which is a method for determining whether or not to continue treatment.
  • the sensitivity determination method in the present invention is unnecessary. It can also be used as a determination method for avoiding the progression of cancer and the increase of side effects due to the occurrence of side effects or ineffective continuation of treatment.
  • the parameters that determine susceptibility include efficacy parameters such as overall survival (days), progression-free survival (days), overall response (days), and stability ( Day), treatment success period (day), blood concentration and elimination half-life of anti-cancer drugs and their metabolites that are side effects parameters, bioavailability, area under the concentration time curve, clearance, distribution volume, etc. It can also be used.
  • a cyclophosphamide cyclophosphamide
  • ifosfamide ifosfamide, thiotepa, melphalan
  • busulfan busulfan
  • nimustine ranimustine
  • dacarbazine procarbazine (procarbazine) (Carboplatin)
  • nedaplatin nedaplatin atine
  • methotrexate pemetrexed, tegafur / uracil, doxyfluridine, tegafur / gimeracil / teteracine
  • Enocitabine gemcitabine, 6-mercaptopurine, fludarabine, pentostatin, cladribine, hydroxyurey a)
  • 1 selected from ALAD gene, C20orf43 gene, CABLES1 gene, CDC14B gene, GDA gene, HOXB6 gene, RPL7AP27 gene, TMEM18 gene and UGT2B10 gene in a sample It is preferable to use a kit including a protocol for measuring the expression level of the above genes.
  • the gene expression level measurement protocol include a protocol that describes a method for measuring the expression level of the target gene, a reagent used in the method for measuring the expression level of the target gene, and a hybrid that specifically hybridizes to the mRNA of the target gene. Examples include DNA chips on which nucleic acid fragments capable of soybeans are immobilized.
  • the kit may include a reference value for determining the sensitivity of the anticancer agent, and the reference includes a standard expression level of each gene, an expression level determined to be high, Expression levels that are judged to be low, factors that affect the expression levels, and the degree of their effects, etc. are included. These reference values are based on the status of the target cancer patient, the type of specimen / cancer, oxaliplatin or It is possible to set appropriately for each parameter for judging the type and sensitivity of drugs containing other anticancer agents used in combination with the salt and fluorouracil or the salt and levophorinate or an anticancer agent containing the salt. . Using the reference value, it can be determined as described above.
  • the expression measurement protocol for the five genes includes, for example, (A1) a protocol describing a method for measuring the expression level of the target gene, and (A2) a method for measuring the expression level of the target gene.
  • the reagent used include (A3) a DNA chip on which a nucleic acid fragment capable of specifically hybridizing to the mRNA of the target gene is immobilized.
  • the standard includes the standard value of the best tumor reduction effect (ratio), the factors that affect the standard value, and the degree of the effect. These standard values are based on the condition of the cancer patient, It can be set as appropriate depending on the type of cancer, the type of drug containing other anticancer agents used in combination with the anticancer agent containing oxaliplatin or its salt and fluorouracil or its salt and levofolinate or its salt. It is. Using the reference value, it can be determined as described above.
  • the kit of the present invention is not limited to these, and refers to a collection of all or part of what is necessary to perform all or part of the method.
  • “thing necessary for performing the process” includes, for example, a buffer solution.
  • anti-cancer Agents that increase sensitivity to agents can be screened.
  • an agent that enhances sensitivity to anticancer agents can be screened using suppression of expression of these genes as an index. That is, a substance that suppresses the expression of these genes in vitro or in vivo enhances anticancer drug sensitivity.
  • a substance that enhances the decrease in gene expression before and after administration of an anticancer drug in a cancer-bearing animal is a substance that enhances the sensitivity of the anticancer drug (anticancer drug sensitivity enhancer).
  • a substance that enhances the decrease in gene expression in the presence of an anticancer drug is a substance that enhances the sensitivity of the anticancer drug (anticancer drug sensitivity enhancer). It is.
  • an agent for enhancing sensitivity to anticancer agents can be screened. That is, a substance that increases this value in vitro or in vivo enhances anticancer drug sensitivity.
  • a substance that enhances the increase in the value before and after administration of an anticancer agent in a cancer-bearing animal is a substance that enhances the sensitivity of the anticancer agent (anticancer agent sensitivity-enhancing agent).
  • the substance that enhances this increase in the presence of an anticancer drug is a substance that enhances the sensitivity of the anticancer drug (anticancer drug sensitivity enhancer). It is.
  • the composition of the present invention can be used either orally or parenterally.
  • a solid or liquid nontoxic pharmaceutical composition suitable for administration methods such as oral administration, rectal administration, injection, etc., containing an anticancer agent sensitivity-enhancing agent and an anticancer agent subject to increased sensitivity. It can be mixed with a sex carrier and administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation.
  • the composition containing the anticancer agent sensitivity-enhancing agent and the anticancer agent that is the subject of sensitivity enhancement may be a single composition containing both of these components, each of which is a separate formulation. It may be a combination of In addition, these components may be different administration routes.
  • preparations include solid agents such as tablets, granules, scattered powders, and capsules, solutions such as solutions, suspensions, and emulsions, and freeze-dried agents.
  • these preparations can be prepared by conventional means on the preparation.
  • the non-toxic pharmaceutical carrier include starch, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, amino acid, gelatin, albumin, water, and physiological saline. It is done.
  • conventional additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, binders, isotonic agents, excipients and the like can be appropriately added as necessary.
  • the numerical value of the first term and the coefficient of each gene in formula (1) are determined based on the expression level of each gene by the real-time RT-PCR method. If the quantity and the measured value of gene expression by another method other than the real-time RT-PCR method have a certain correlation, the real-time RT -A coefficient for adjusting the measurement value by the PCR method and another method other than that can be added and used, and the gene expression level by another method other than the real-time RT-PCR method may be substituted into the equation. Even when the real-time RT-PCR method is used, the condition and number of cancer patients, the type of cancer, oxaliplatin or its salt and fluorouracil or its salt and levofolinate or its salt are included. The expression level of each gene is slightly different depending on the type of drug containing other anticancer drugs used in combination with the cancer drug. A coefficient for adjusting the coefficient of the gene is added, and the previous formula (1) may be used.
  • the specific selection criteria were (1) cases in which a definitive diagnosis of colorectal cancer was obtained histologically, (2) post-surgical stage IV colorectal cancer postoperative cases, (3) measurable lesions (Response Evaluation) Criteria in Solid Tumors, RECIST), (4) Physiological functions (bone marrow, liver, kidney, heart, etc.) are sufficiently preserved. Meet the standards.
  • 54 cases excluding 4 cases (reference cases) in which the above-mentioned test values deviated from the standard, 44 cases were obtained for RNA required for evaluating the gene expression level.
  • 37 genes that could be analyzed using DNA microarrays from these cases were searched for genes associated with sensitivity to anticancer drug treatment.
  • the DNA microarray uses Whole Human Genome 4 ⁇ 44K (manufactured by Agilent), (1) synthesis of cDNA from total RNA, (2) synthesis of labeled cRNA from cDNA, (3) fragmentation of cRNA, (4) fragment The procedure was as follows: hybridization of activated cRNA and microarray, (5) washing of microarray, (6) scanning of microarray, and (7) gene expression analysis.
  • TOTAL RNA was extracted from 54 human colon cancer tissue samples using RNeasy TM Minikit (manufactured by Qiagen) according to the attached protocol and stored at ⁇ 80 ° C.
  • the entire volume (700 ⁇ l) was added to the RNeasy mini spin column included in the kit and centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds.
  • the RNeasy mini spin column was set in a new 2 ml tube, 500 ⁇ l of Buffer RPE included in the kit was added to the column, and centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds to remove the eluate.
  • the mini-spin column was set again in the original 2 ml tube, 500 ⁇ l of Buffer RPE was added to the column, and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute to remove the eluate.
  • the mini spin column was transferred to a new 1.5 ml tube, 30 ⁇ l of Nuclease-free water was added directly onto the membrane, allowed to stand at room temperature for 1 minute, and then centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds to elute the cRNA sample. Quantification of cRNA was carried out with NanoDrop (manufactured by Thermo Scientific), the absorbance of the sample solution was measured at 260 nm and 280 nm, the cRNA concentration was quantified, and it was confirmed that the Cy3-CTP dye incorporation rate was 9 pmol / ⁇ g or more. . The cRNA quality check was performed using an Agilent 2100 Bioanalyzer according to the attached protocol, and it was confirmed that the length of the smear peak was 500 bases or more.
  • Hybridization of fragmented cRNA and microarray Hybridization was performed according to the protocol using a hybridization oven (manufactured by Agilent) and a hybridization rotor (manufactured by Agilent). That is, the hybridization solution prepared in (3) was applied to a Whole Human Genome 4 ⁇ 44K array surface, covered with a gasket slide (manufactured by Agilent), and fixed in a hybridization chamber for oligo DNA microarray (manufactured by Agilent). did. The fixed array was set in a hybridization rotor and heated in a hybridization oven for 17 hours while rotating at 65 ° C. and 10 rpm.
  • Microarray washing After hybridization, the microarray fixed by the hybridization chamber for oligo DNA microarray was taken out and washed. That is, the microarray was transferred to a reservoir filled with Gene Expression Wash Buffer 1 (manufactured by Agilent) supplemented with 0.005% Triton X-102 and washed for 1 minute at room temperature while stirring with a stirrer bar. Subsequently, the microarray was transferred to a constant temperature bath with a stirrer filled with Gene Expression Wash Buffer 2 (manufactured by Agilent) supplemented with 0.005% Triton X-102, and washed at 37 ° C. for 1 minute while stirring with a stirrer bar.
  • Gene Expression Wash Buffer 1 manufactured by Agilent
  • Triton X-102 Triton X-102
  • the expression level of each gene was quantified using a real-time RT-PCR method using TaqMan TM Gene Expression Assays, and regression analysis was performed. The results were as shown in Table 4.
  • the RPL7AP27 gene was excluded from analysis because an appropriate primer / probe for RT-PCR could not be prepared.
  • t-test was performed by stratifying into a group with a high expression level and a group with a low expression level of each gene. The result was as shown in Table 5.
  • the RPL7AP27 gene was excluded from analysis because an appropriate primer / probe for RT-PCR could not be prepared.
  • the best tumor reduction effect was stratified into CR and PR groups and SD and PD groups according to the RECIST criteria, and t-test was conducted, and one-way analysis of variance was conducted stratified into three groups: CR and PR groups, SD group and PD group. .
  • the result was as shown in Table 6.
  • the expression levels of the CABLES1, GDA, HOXB6, and TMEM18 genes are higher in the SD and PD groups in which no response was observed compared to the CR and PR groups in which the response was observed. Indicated.
  • the RPL7AP27 gene was excluded from analysis because an appropriate primer / probe for RT-PCR could not be prepared.

Abstract

　個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供する。　ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子からなる、オキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤の感受性判定マーカー。

Description

３剤併用抗がん剤の感受性判定マーカー
　本発明は、対象となる患者のがんが、使用しようとする抗がん剤に治療反応性を有するか否かを判定するために用いる抗がん剤感受性判定マーカー及びその応用に関する。
　抗がん剤には、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド等の種類がある。そしてこれらの抗がん剤にはがんの種類によって効果を示す場合と効果を示さない場合がある。さらに、有効であると認められている種類のがんであっても、個々の患者によって効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者のがんに対して抗がん剤が効果を示すか否かを抗がん剤感受性という。
　オキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）は白金錯体系抗悪性腫瘍薬である。作用機序は他の白金錯体系抗悪性腫瘍薬であるシスプラチン（ＣＤＤＰ）やカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）と同様、ＤＮＡ塩基との架橋形成によるＤＮＡ合成阻害、蛋白合成阻害と考えられているが、ＣＤＤＰやＣＢＤＣＡが無効な大腸癌に対してもＬ－ＯＨＰは抗腫瘍効果を示し、従来の白金錯体系抗悪性腫瘍薬とは異なる抗腫瘍スペクトルを示す。アメリカでは２００４年１月にフルオロウラシル（５－ＦＵ）／レボホリナート（ＬＶ）との併用で転移性結腸・直腸癌のファーストライン治療として承認されており、日本においても２００５年４月、「治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸癌」に対するＬＶ及び５－ＦＵの静脈内持続投与法との併用（ＦＯＬＦＯＸ４法）にて薬価収載された。進行再発大腸癌の治療は、１９９０年代前半まで行なわれていた５－ＦＵ／ＬＶ療法での生存率は１０～１２ヶ月であったのに対し、Ｌ－ＯＨＰを加えたＦＯＬＦＯＸ療法での生存期間は１９．５ヶ月とほぼ２倍にまで到達している。さらに２００９年８月には、同じく５－ＦＵ／ＬＶの静脈内持続投与法との併用による「結腸癌における術後補助化学療法」が効能・効果として追加され、大腸癌患者での使用拡大と有益性が期待できる薬剤である。
　５－ＦＵは、１９５７年に開発されたフッ化ピリミジン系抗癌剤であり、今なお消化器癌化学療法の基本となる薬剤である。がん細胞に取り込まれた５－ＦＵは、活性代謝物ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ－５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦｄＵＭＰ）によるｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＳ）の阻害が惹起するＤＮＡ合成阻害を主たる作用機序とする他、同じく活性代謝物である５－ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＵＴＰ）によるＲＮＡ機能障害などにより殺細胞効果を発揮する。
　進行性・転移大腸癌に対する化学療法は、１９９０年代に登場したイリノテカン（ＣＰＴ－１１）、Ｌ－ＯＨＰなどのｋｅｙ　ｄｒｕｇと、それまで大腸癌治療の中心的薬剤であった５－ＦＵを中心とするフッ化ピリミジン製剤とを併用することにより、生存率をはじめとする臨床成績が劇的に改善されたものの、治療が奏効する患者はおよそ半分程度であり、重篤な副作用というリスクを冒して抗がん剤が投与された患者の半分では効果が得られていないのが現状である。がん化学療法において最適な治療を提供するにあたり、個々の治療反応性（レスポンダー・ノンレスポンダー）を判別する抗がん剤感受性の予測マーカーの確立は急務である。
　一般的に、がん化学療法の治療スケジュールは長期に渡り、副作用の発現を見ながら何クールか繰り返し治療を行った後で、効果が得られているか、そのまま投与を続けるべきか判断するが、それまでには長い時間と高額な医療費がかかり、副作用の発現も起こっているのが事実である。よって、個々の患者に対し、効果が得られるかどうかを治療前或いは治療早期に予測できる手段があれば、患者の負担や副作用の発現を軽減し、医療費を削減することができる。
　進行性大腸癌患者を対象とした化学療法に対する治療反応性バイオマーカーに関する大規模前向き臨床試験（ＦＯＣＵＳ　Ｔｒｉａｌ）の報告では、５－ＦＵ／Ｌ－ＯＨＰ併用療法の効果予測因子として、Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ－１（Ｔｏｐｏ１）のみが弱い関連を示したのみであった（非特許文献１）。従って、５－ＦＵ／Ｌ－ＯＨＰ併用療法に感受性を持つ患者を確実に予測する手法は未だ確立されておらず、Ｌ－ＯＨＰ／５－ＦＵ／ＬＶの３剤併用によるＦＯＬＦＯＸ療法の効果予測もしくは治療応答性の早期診断を可能とするバイオマーカーの確立は急務である。
Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ　２００８；２６：２６９０－２６９８．
　本発明の課題は、個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供することにある。
　そこで本発明者らは、フルオロウラシル、レボホリナート及びオキサリプラチン併用治療を受けたがん患者のがん組織を用いて、その遺伝子発現と治療に対する感受性を網羅的に解析することにより、感受性に関わっていると考えられる９つの遺伝子を特定し、その中でも５遺伝子が特に有用であることを見出した。かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中の当該遺伝子の発現量を測定すれば、当該がん患者のがんが抗がん剤に感受性を有するか否か判定できること、また、当該遺伝子の発現量を特定の算出式に代入することにより、抗がん剤の感受性、具体的には最良腫瘍縮小効果（比）を算出できることを見出した。また、当該遺伝子の発現変動を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子からなる、オキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤の感受性判定マーカーを提供するものである。
　また、本発明は、遺伝子が、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子である上記の判定マーカーを提供するものである。
　また、本発明は、最良腫瘍縮小効果（比）を予測するものである上記の判定マーカーを提供するものである。
　また、本発明は、検体中のＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することを特徴とするオキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤の感受性判定方法を提供するものである。
　また、本発明は、発現量を測定する遺伝子が、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子である上記の判定方法を提供するものである。
　また、本発明は、次式（１）により最良腫瘍縮小効果（比）を算出することを特徴とする上記の判定方法を提供するものである。
（数１）
最良腫瘍縮小効果（比）＝０．３７６６４＋９６．３６０×Ａ－８．５１２８×Ｂ＋４２．４２０×Ｃ＋２６．８１０×Ｄ＋７４７．００×Ｅ・・・・・（１）
（式中、ＡはＡＬＡＤ遺伝子の発現量、ＢはＣ２０ｏｒｆ４３遺伝子の発現量、ＣはＧＤＡ遺伝子の発現量、ＤはＴＭＥＭ１８遺伝子の発現量、ＥはＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の発現量を示す。）
　また、本発明は、検体中のＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする上記の判定方法を実施するためのキットを提供するものである。
　また、本発明は、検体中のＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現変動を指標とするオキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤に対する感受性亢進剤のスクリーニング方法を提供するものである。
　さらに本発明は、上記のスクリーニング方法により得られたオキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤に対する感受性亢進剤を提供するものである。
　さらにまた本発明は、上記の感受性亢進剤とオキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤を含有するがん治療用組成物を提供するものである。
　本発明の抗がん剤の感受性判定マーカーを用いれば、個々の患者の抗がん剤治療反応性が抗がん剤投与前、或いは抗がん剤投与開始後早期に適確に判定できる結果、より治療効果の高い抗がん剤の選択が可能となり、その結果として治療効果の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行、副作用の増大を防止でき、さらには患者の負担軽減、医療費の削減も期待できる。また、この判定マーカーを用いれば、抗がん剤の感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となる抗がん剤と感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。
本発明の５遺伝子の発現量を用いたＬ－ＯＨＰ／５－ＦＵ／ＬＶの３剤併用投与による最良腫瘍縮小効果（比）の予測式とその予測性の有用性を示すグラフである。
　本発明における抗がん剤の感受性判定マーカーは、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子である。本発明の遺伝子は、フルオロウラシル、レボホリナート及びオキサリプラチン併用治療を受けたがん患者のがん組織を用いた網羅的な遺伝子発現量解析結果の相関解析により抗がん剤の感受性に関わっていると考えられる遺伝子で、この中でもＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子、ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の５遺伝子が特に有用であり、この５遺伝子を用いることで対象となるがん患者の最良腫瘍縮小効果（比）を予測することが可能となる。
　ここで、ＡＬＡＤ遺伝子とはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００３１に示される塩基配列のｍＲＮＡを発現する遺伝子及びそのホモログをいい、
　Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子とはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６４０７に示される塩基配列のｍＲＮＡを発現する遺伝子及びそのホモログをいい、
　ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子とはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３８３７５に示される塩基配列のｍＲＮＡを発現する遺伝子及びそのホモログをいい、
　ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子とはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３３３１に示される塩基配列のｍＲＮＡを発現する遺伝子及びそのホモログをいい、
　ＧＤＡ遺伝子とはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４２９３に示される塩基配列のｍＲＮＡを発現する遺伝子及びそのホモログをいい、
　ＨＯＸＢ６遺伝子とはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８９５２に示される塩基配列のｍＲＮＡを発現する遺伝子及びそのホモログをいい、
　ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子とはＥｎｔｅｒｚ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ１５２６６３に示される遺伝子及びそのホモログをいい、
　ＴＭＥＭ１８遺伝子とはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２８３４に示される塩基配列のｍＲＮＡを発現する遺伝子及びそのホモログをいい、
　ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子とはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０７５に示される塩基配列のｍＲＮＡを発現する遺伝子及びそのホモログをいう。
　また、遺伝子とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。また、核酸（ポリヌクレオチド）としては、ＲＮＡ、ＤＮＡを例示でき、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡが挙げられる。ここでポリヌクレオチドには、複数個の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも含まれる。
　また、本発明における抗がん剤の感受性判定方法は、検体中の前記９遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。前記９遺伝子の中でもＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子、ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の５遺伝子が特に有用であり、検体中の５遺伝子の発現量を測定し、その発現量を用いて式（１）により最良腫瘍縮小効果（比）を算出し、対象となるがん患者の抗がん剤に対する感受性を判定することができる。
　具体的に、がん患者のがん組織検体の各遺伝子の発現量と、各患者の最良腫瘍縮小効果（比）を重回帰分析（文献名　Ｓｈｉｍｏｋｕｎｉ　Ｔ他　“Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｎｏｖｅｌ　ｍａｒｋｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃａｃｙ－ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｆｏｒｍｕｌａｅ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅｉｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄａｔａ．”Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ　２００６．５．）により解析したところ、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子、ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の５遺伝子の発現量を代入した式（１）が、最良腫瘍縮小効果（比）と非常に高い相関性を有することが明らかになった。従って、検体中の上記５遺伝子の発現量を測定し、次式（１）に代入することで、抗がん剤の感受性を判定することができ、具体的に、最良腫瘍縮小効果（比）を予測することが可能となる。
（数２）
最良腫瘍縮小効果（比）＝０．３７６６４＋９６．３６０×Ａ－８．５１２８×Ｂ＋４２．４２０×Ｃ＋２６．８１０×Ｄ＋７４７．００×Ｅ・・・・・（１）
（式中、ＡはＡＬＡＤ遺伝子の発現量、ＢはＣ２０ｏｒｆ４３遺伝子の発現量、ＣはＧＤＡ遺伝子の発現量、ＤはＴＭＥＭ１８遺伝子の発現量、ＥはＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の発現量を示す。）
　本発明の抗がん剤に対する感受性判定方法を用いて感受性を判定するには、検体中の上記９つの遺伝子の発現量を測定すればよい。ここで、検体としては、がんを有する被験者（がん患者）由来の生体試料、例えば血液、血清、血漿、尿、腫瘍組織・細胞、腹水、胸水、脳脊髄液、便、喀痰等が挙げられるが、腫瘍組織が特に好ましい。検体は適宜公知の方法により処理し、組織抽出液、組織標本等として使用することもできる。
　また、本発明の対象となるがんとしては、咽頭がんを代表とする口唇、口腔及び咽頭がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がんなどを代表とする消化器がん、肺がんを代表とする呼吸器及び胸腔内臓器がん、骨及び関節軟骨がん、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞がん及びその他の皮膚のがん、中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がんを代表とする女性性器がん、前立腺がんを代表とする男性性器がん、膀胱がんを代表とする尿路がん、脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系がん、甲状腺及びその他の内分泌腺がん、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織がん、及びこれらを原発巣とする転移組織のがん等が挙げられ、結腸・直腸がん（大腸がん）に対して好適に利用できるが、化学療法未治療がんが特に好ましい。
　遺伝子の発現量の測定は、本発明の遺伝子や遺伝子由来のｍＲＮＡを検出し得るプローブやプライマーを用いて、標的とする遺伝子のコピー数や発現量をノーザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法等で測定すること、により行うことができる。また、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドも測定対象として挙げられ、遺伝子の発現量を反映するものであれば特に限定されないが、当該遺伝子由来のｍＲＮＡを測定対象とすることが好ましい。ここで、遺伝子の発現量の測定とは、遺伝子の発現の有無を確認することも含む。
　ここで、ＰＣＲ法について説明する。測定対象としてｍＲＮＡを用いる場合、必要に応じて、ろ過、遠心分離、クロマトグラフィー等の公知の方法による前処理を検体に行ったのち、例えば、グアニジン－塩化セシウム超遠心法、酸性グアニジン－フェノールクロロホルム法（ＡＧＰＣ法）、磁気ビーズ法、シリカカラム法等の汎用法を用いて、検体からＲＮＡを抽出することができる。また、市販のキット（ＱＩＡＧＥＮ　ＲＮｅａｓｙ　ＫＩｔ、ＴＲＩＺＯＬ等）を用いてＲＮＡを抽出することもできる。
　ｍＲＮＡの測定は、例えば、（１）目的ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片及び検体由来ＲＮＡを用いてＰＣＲ法による増幅産物量を求めること、（２）目的ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片と検体由来ＲＮＡとのハイブリダイズ効率を求めること、又は（３）その他公知の方法を用いた定量方法により求めること、により行うことができる。
　ここで、ＰＣＲ法を用いる場合において、「目的ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片」の設計は、目的遺伝子が有する塩基配列と他の遺伝子が有する塩基配列とを比較し、目的遺伝子のｍＲＮＡに特異的である配列を選ぶことにより行うことができる。ここで、目的遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）を参酌することにより得ることができる。また、塩基配列をソフトウェア（Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ等）を用いて整列させ、目視等の手段により特異的な配列を見出すことができる。当該核酸断片の長さは、特に制限はないが、５～５０塩基からなる核酸断片が好ましく、１８～２５個の連続した塩基からなる核酸断片がより好ましい。
　目的遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズしうる核酸断片としては、かくして設計される配列のみならず、公知の技術常識にのっとれば適宜想定することができ、当該塩基配列と相補的な塩基配列や目的遺伝子のｍＲＮＡの測定に同様に用いることができる相同な塩基配列、例えば、ａ）当該塩基配列のうちの１乃至１０個、好ましくは１又は数個の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列、ｂ）当該塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列、ｃ）当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、からなる核酸断片などを用いることもできる。
　また、斯かる核酸断片は、その両端又は片端、好ましくは５'端に任意の数、好ましくは１００個、より好ましくは２０個、さらに好ましくは１０個以下の塩基が付加された核酸断片であってもよい。
　かくして設計される核酸断片は、例えば、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成することができる。当該断片としては、合成後に、その特異性が確認された断片が好ましく、ここで特異性の確認としては、例えば、目的ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、適当な対照と比べて特異的なＰＣＲ増幅産物が得られることを確かめることにより行うことができる。
　このような核酸断片としては、例えばＡＬＡＤ遺伝子であれば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００３１の塩基配列の一部若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片が挙げられる。ここで、それらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片としては、例えば、以下に示す（ａ）～（ｃ）に示す核酸断片であって、目的遺伝子のｍＲＮＡの測定に用いることができるものが挙げられる。ＡＬＡＤ遺伝子以外の場合も同様である。
（ａ）ＮＭ＿００００３１で示される塩基配列の一部若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片において、１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された核酸断片。
（ｂ）ＮＭ＿００００３１で示される塩基配列の一部若しくはそれと相補的な塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸断片。
（ｃ）ＮＭ＿００００３１で示される塩基配列の一部若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸断片。
　尚、ここで、塩基配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸTMのホモロジー解析プログラムを用いることにより算出される。
　また、「ストリンジェントな条件」とは、２つのＤＮＡ断片がＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊらによって記載されたような標準的なハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７－９．６２及び１１．４５－１１．６１）。
　かくして作製される核酸断片及び検体由来ＲＮＡを用いてＰＣＲ法、好ましくはｍＲＮＡからのｃＤＮＡを作製する工程を含むリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を行なうことで、検体のｍＲＮＡを測定することができる。ここで、ＲＴ－ＰＣＲ法は、Ｔｗｏ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲやＯｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができるが、特に簡便であり、かつクロスコンタミネーションを防ぐという点からは、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲが好ましい。斯かるＯｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ法は、例えば、市販のキットを用いて行うことができる（ＱＩＡＧＥＮ　Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｋｉｔ等）。ＲＴ反応に使用する逆転写活性を有する酵素としてはＭＭＬＶ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ等の種々の逆転写酵素を用いることができる。また、ＤＮＡを増幅させるＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラーゼは９０℃以上の温度に耐熱性があるものが好ましい。
　このようなＰＣＲ反応は、例えば、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする熱変性反応を９０～９８℃、プライマーを鋳型ｃＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を３７～７２℃、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を５０～７５℃という温度条件で、これを１サイクルとしたものを１～数十サイクル行うことにより、行うことができる。なお、好ましい反応条件の一例は、熱変性９５℃・３０秒、アニーリング６０℃・３０秒、伸長反応７２℃・４０秒である。また、ＰＣＲ反応の際は、２種類のプライマーを１組として用いることが好ましく、この場合は両者がセンス鎖とアンチセンス鎖との組合せになるようにする必要がある。本発明の核酸断片はプローブとしての使用もでき、他の公知のユニバーサルプライマー、オリゴヌクレオチド等と組合わせて用いることもできる。
　また、このＲＴ－ＰＣＲ反応の鋳型となるｍＲＮＡを含む検体試料としては、ＲＮＡ全体量として１ｐｇ～１μｇのＲＮＡを含むものが好ましく、２ｎｇ～５０ｎｇ含むものがより好ましい。
　適切なＰＣＲ反応が行われた場合には通常、「ＰＣＲ増幅産物量」、「ＰＣＲサイクル数」と「ＰＣＲの鋳型量」との間には相関関係がある。従って、かくして行われたＰＣＲ反応により増幅された増幅産物量とＰＣＲサイクル数を参酌して適宜計算すれば、目的遺伝子のｍＲＮＡ量、すなわち目的遺伝子の発現量を求めることができる。
　ＰＣＲ増幅産物量とＰＣＲサイクル数の決定は、特に限定されず、あらゆる方法により行うことができるが、例えば、任意に設定された一定量のＤＮＡ量に達したときのＰＣＲサイクル数を特定することにより行うことができる。斯かる特定は、例えば、「ＰＣＲ産物を標識するＰＣＲ法に併せて、標識の経時的な計測を行うＰＣＲ法」を用いて、設定した一定の蛍光強度に達する際のＰＣＲサイクル数を特定することにより行うことができる。ここで、標識としては、例えば、蛍光色素による標識が挙げられ、標識の計測としては蛍光強度の計測が挙げられる。またここで、蛍光色素による標識としては、例えば、インターカレーター性蛍光色素による標識が挙げられ、インターカレーター性蛍光色素としてはＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ　Ｉが挙げられる。インターカレーター性蛍光色素は、二本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光強度が増強する性質を有することから、増幅したＰＣＲ産物を反映した強度の蛍光が発せられることとなる。また、蛍光色素による標識は、蛍光色素により標識したＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｂｅａｃｏｎ等の使用により行うこともできる。ＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｂｅａｃｏｎは、ＰＣＲにより増幅される領域の内部配列と相同性を有するオリゴヌクレオチドに蛍光色素とクエンチャーを結合させたプローブであり、ＰＣＲ反応に共存させて用いる。プローブに結合した蛍光色素とクエンチャーの相互作用でＰＣＲ増幅反応に応じた蛍光を発するため、各ＰＣＲ段階での蛍光強度を測定することにより増幅されるＰＣＲ産物の経時的な観察を行うことができる。
　また、前述のとおり、検体中における目的遺伝子のｍＲＮＡ量は、例えば、目的ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片と検体由来ＲＮＡとのハイブリダイズ効率の知得によっても、求めることができる。
　ここで、目的遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片は、例えば、前述のように設計及び作製されたものを用いることができる。また、斯かる核酸断片としては、標識がなされている核酸断片が好ましい。ここで、標識としては、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光色素、発色団、重金属、あるいはラジオアイソトープが挙げられ、より好ましいマーカーとしては酵素が挙げられ、ここで酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼが挙げられる。斯かる標識は、公知の方法により行うことができる。検体由来のＲＮＡを含有する試料とこのような核酸断片とのハイブリダイズの程度を測定すれば、公知の換算方法により、検体中における目的遺伝子のｍＲＮＡ量を知得することができる。斯かるハイブリダイズの程度の計測は、特に限定されず、公知の方法に準じて行うことができるが、たとえば核酸断片に付加された標識の計測により行うことができる。すなわち、たとえば、蛍光色素によって標識された核酸断片を用いた場合には、蛍光強度を計測することにより行うことができる。
　また、目的遺伝子の発現量の測定は、目的遺伝子やそのｍＲＮＡの塩基配列に特異的にハイブリダイズしうる核酸断片をプローブとして用いて行なうこともできる。例えばＡＬＡＤ遺伝子であれば、上記のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００３１記載の塩基配列の一部（例えばＧＡＧＧＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣＡＡ）（配列番号１）若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片もプローブとして使用できる。これらのプローブは任意の固相に固定化して、ＤＮＡチップ、遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ等として利用することができる。
　また、プローブとしては、上記に挙げるもの以外に、目的遺伝子やそのｍＲＮＡの塩基配列を特異的に検出できるよう、目的遺伝子やそのｍＲＮＡの塩基配列から適宜の箇所を複数箇所選択して、当該領域に特異的にハイブリダイズしうる核酸断片を複数個併用するように設計されたものを使用してもよい。
　プローブの固定化に使用される固相は、ポリヌクレオチドを固定化できるものであれば、特に制限はなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリー等を挙げることができる。また、固相を標識してもよい。標識には特に制限はなく、例えば蛍光色素、ラジオアイソトープ等を挙げることができる。固相へのポリヌクレオチドの固定は、予め合成したポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい、固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッターを利用するなど、固定化プローブの種類に応じて、適宜公知の方法（インクジェット法によるポリヌクレオチドのプリント、ｉｎ　ｓｉｔｕ合成、フォトリソグラフィー法）を使用すればよい。
　上記の方法により作成されたＤＮＡチップ等と培養細胞、組織、組織切片もしくは血液のライセート等の検体から調製されたＲＮＡをもとに調製された標識ＤＮＡあるいはＲＮＡ、あるいはこれらの検体から直接調製された標識ＤＮＡあるいはＲＮＡをハイブリダイズさせ、形成されたプローブと標識ＤＮＡあるいはＲＮＡの二本鎖の量を当該プローブの標識物に由来するシグナルとして測定することで、目的遺伝子の発現量を測定することができる。ここで、シグナルの検出は常法により、例えば、放射線検出器や蛍光検出器等で測定して行なうことができる。
　上記方法に加え、マイクロビーズ法によっても目的遺伝子の発現量を測定することができる。例えばそれぞれ異なる蛍光標識を施したマイクロビーズにそれぞれの目的遺伝子由来のｍＲＮＡに対するプローブを固定し、培養細胞、組織、組織切片もしくは血液のライセート等の検体から調製された目的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、その蛍光を検出することでそれぞれの目的遺伝子を識別し、同時に、マイクロビーズに固定したプローブとハイブリダイズした目的遺伝子由来のｍＲＮＡに対して標識プローブをハイブリダイズさせ、そのプローブの標識を検出することでｍＲＮＡ量を測定することにより、複数の目的遺伝子の発現量を同時に測定することもできる。
　さらに、上記のプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法等の公知の方法を用いて、目的遺伝子のコピー数・発現量を測定することができる。また、目的遺伝子によりコードされるポリペプチドを測定対象とする場合は、当該ポリペプチドに対する特異的抗体を用いた公知の免疫染色法（ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ＩＨＣ法等）により、目的遺伝子の発現量を測定すればよい。
　抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前或いは投与中のがん患者由来の生体試料中の目的遺伝子の発現量を測定し、例えば、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子及びＴＭＥＭ１８遺伝子の場合、発現量が所定の基準値以上の数値であった場合はそのがんは抗がん剤感受性ではなく、所定の基準値未満の数値であった場合はそのがんは抗がん剤感受性であると判定できる。
　さらに、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子、ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の５遺伝子の発現量を用いて、前式（１）により最良腫瘍縮小効果（比）を算出し、所定の基準値以上の数値であった場合はそのがんは抗がん剤感受性であり、所定の基準値未満の数値であった場合はそのがんは抗がん剤感受性ではないと判定できる。ここで、所定の基準値は、対象となるがん患者の状態やがんの種類、オキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤と組み合わせて使用する他の抗がん剤を含む薬剤の種類等により、後述の実施例に従って適宜設定することができるが、例えば、フルオロウラシル、レボホリナート及びオキサリプラチン併用投与の場合は、最良腫瘍縮小効果（比）について０．５以上、特に０．７以上とするのが好ましい。
　抗がん剤投与前に、個々の遺伝子の発現量により感受性ではないと判定できる場合や、前式（１）により得られる数値が所定の基準値未満である場合は、そのがんは抗がん剤に対して感受性ではないと判定でき、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における感受性判定方法は、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴う副作用の増大を防ぐことにも大きく貢献するので、特に抗がん剤投与前のがん患者に好適に利用することができる。また、治療効果を期待できる患者を積極的に選出するための判定方法としても使用できる。
　また、抗がん剤投与中のがん患者由来の生体試料中の目的遺伝子の発現量を測定し、個々の遺伝子の発現量や前式（１）により得られる数値を治療サイクルごとに測定しモニタリングしていくことにより、そのがんにおける感受性を経時的に評価できるため、治療を継続すべきか否かの判定方法ともなる。抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、抗がん剤による副作用のみが発現すると考えられるため、本発明における感受性判定方法は、不必要な副作用の発現もしくは無効な治療継続に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するための判定方法としても使用できる。
　感受性を判定するパラメターとしては、最良腫瘍縮小効果（比）のほか、有効性を表わすパラメターである全生存期間（日）、無増悪生存期間（日）、全奏効期間（日）、安定期間（日）、治療成功期間（日）、副作用を表わすパラメターである抗がん剤及びその代謝物の血中濃度及び消失半減期、生体内利用率、濃度時間曲線下面積、クリアランス、分布容積等を使用することもできる。
　オキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤と組み合わせて使用する他の抗がん剤としては特に限定されないが、例えばシクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ－３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ　ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち、イリノテカン、ＳＮ－３８若しくはそれらの塩又はベバシズマブが好ましく、特にベバシズマブが好ましい。
　本発明の抗がん剤感受性の判定方法を実施するには、検体中のＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。遺伝子の発現量測定プロトコールには、例えば、目的遺伝子の発現量測定のための方法を記載したプロトコール、目的遺伝子の発現量測定のための方法に使用する試薬、目的遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片を固定化したＤＮＡチップ等が含まれる。また、当該キットには、抗がん剤の感受性の有無を判定するための基準値を含んでいてもよく、当該基準には、個々の遺伝子の標準発現量、高いと判断される発現量、低いと判断される発現量、発現量に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの基準値は、対象となるがん患者の状態や検体・がんの種類、オキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤と組み合わせて使用する他の抗がん剤を含む薬剤の種類、感受性を判定するパラメターごとに適宜設定することが可能である。当該基準値を用いて、前記のように判定することができる。
　また、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子、ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の５遺伝子の発現量を用いて、前式（１）により最良腫瘍縮小効果（比）を算出する場合、感受性判定用キットとしては、（Ａ）前記５遺伝子の発現量測定プロトコールと、（Ｂ）前記最良腫瘍縮小効果（比）を算出するためのプロトコールとを含有する。ここで（Ａ）前記５遺伝子の発現量測定プロトコールには、例えば、（Ａ１）目的遺伝子の発現量測定のための方法を記載したプロトコール、（Ａ２）目的遺伝子の発現量測定のための方法に使用する試薬、（Ａ３）目的遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片を固定化したＤＮＡチップ等が含まれる。一方、（Ｂ）のプロトコールには、（Ｂ１）式（１）により最良腫瘍縮小効果（比）を算出するためのプロトコールに加え、（Ｂ２）抗がん剤の感受性の有無を判定するための基準値等が挙げられる。当該基準には、最良腫瘍縮小効果（比）の基準値、基準値に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの基準値は、対象となるがん患者の状態や検体・がんの種類、オキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤と組み合わせて使用する他の抗がん剤を含む薬剤の種類等により適宜設定することが可能である。当該基準値を用いて、前記のように判定することができる。
　本発明のキットはこれらに限定されず、斯かる方法の全部又は一部の工程を行うのに必要なものの全部又は一部を集めたものをいう。ここで、「工程を行うのに必要なもの」には、例えば緩衝液等が挙げられる。
　また、検体中のＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現変動を指標とすれば、抗がん剤に対する感受性亢進剤がスクリーニングできる。
　具体的に、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子及びＴＭＥＭ１８遺伝子の場合、これらの遺伝子の発現抑制を指標とすれば、抗がん剤に対する感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、これらの遺伝子の発現を抑制する物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、担癌動物における抗がん剤投与前後において、遺伝子発現の低下を亢進させる物質は、抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において、抗がん剤の存在下で遺伝子発現の低下を亢進させる物質は、抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
　さらに、前式（１）により得られる最良腫瘍縮小効果（比）の増加を指標とすれば、抗がん剤に対する感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、この数値を増加させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、担癌動物における抗がん剤投与前後において、この数値の増加を亢進させる物質は、抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において、抗がん剤の存在下でこの数値の増加を亢進させる物質は、抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
　抗がん剤感受性亢進剤であれば、個々の遺伝子の発現変動や前式（１）により得られる数値の増加は腫瘍の縮小あるいは殺細胞効果よりも早く現れるため、より短時間の検討で当該物質が抗がん剤感受性亢進剤として有用であるかどうかを判定することができ、スクリーニングに伴う労力や費用の削減という面からも大きな効果が期待できる。
　かくして得られた抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上する。本発明の組成物は、経口投与又は非経口投与のいずれも使用できる。投与に際しては、抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を含有する組成物を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。ここで、抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを含有する組成物は、それらの成分の両方を含む一の組成物であってもよく、それぞれ別個の製剤の組み合せであってもよい。また、それらの成分はそれぞれ別の投与経路であってもよい。
　このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
　なお、前式（１）における第１項の数値や各遺伝子の係数は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法による各遺伝子の発現量をもとにして決定されているが、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法による遺伝子発現量と、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法以外の別の方法による遺伝子発現量の測定値が一定の相関を有するものであれば、前式（１）の第１項の数値や各遺伝子の係数にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法とそれ以外の別の方法による測定値を調整する係数を追加して使用することもでき、当該式にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法以外の別の方法による遺伝子発現量を代入すればよい。なお、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を用いた場合であっても対象となるがん患者の状態や症例数、がんの種類、オキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤と組み合わせて使用する他の抗がん剤を含む薬剤の種類等によって各遺伝子の発現量が若干異なってくるので、その場合は、前式（１）の第１項の数値や各遺伝子の係数を調整する係数を追加して、前式（１）を使用すればよい。
　以下、実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
ｍＦＯＬＦＯＸ６療法によるヒト臨床試験による検討
１．ｍＦＯＬＦＯＸ６療法によるヒト臨床試験
　フルオロウラシル４００ｍｇ／平方メートル（急速静注）、レボホリナート２００ｍｇ／平方メートル、フルオロウラシル２，４００～３，０００ｍｇ／平方メートル（持続点滴静注）にオキサリプラチン８５ｍｇ／平方メートルを併用投与するがん化学療法（ｍＦＯＬＦＯＸ６療法）を実施したがん患者において、がん化学療法の効果と関連する遺伝子を明らかにし、これを検証するため前向きゲノム薬理学的臨床研究を行った。対象は根治切除不能ステージＩＶ大腸癌薬物療法未治療例で、姑息的手術時に腫瘍検体の採取可能な症例とした。具体的な選択基準は、（１）組織学的に大腸がんの確定診断が得られている症例、（２）根治切除不能ステージＩＶ大腸癌術後症例、（３）測定可能病変（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｃｒｉｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｓｏｌｉｄ　Ｔｕｍｏｒｓ，ＲＥＣＩＳＴ）を有する症例、（４）生理機能（骨髄、肝、腎、心など）が十分保持されている症例で、仮登録及び本登録前１週間以内の検査値が以下の基準を満たすこと。白血球数４，０００／μＬ以上１２，０００／μＬ以下、好中球数２，０００／μＬ以上、血小板数１００，０００／μＬ以上、ヘモグロビン量９．０ｇ／ｄｌ以上、血清ＡＳＴ・ＡＬＴ　施設正常値上限の２倍以下（但し、肝転移症例は３倍以下）、血清総ビリルビン１．５ｍｇ／ｄｌ以下、血清クレアチニン１．５ｍｇ／ｄｌ以下、クレアチニン・クリアランス５０ｍＬ／ｍｉｎ以上、ＢＵＮ　２５ｍｇ／ｄｌ以下、ＣＲＰ　１ｍｇ／ｄｌ以下、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｓｔａｔｕｓ（Ｅａｓｔｅｒｎ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｇｒｏｕｐ：ＥＣＯＧ）の分類が０～２の症例、手術以外に前治療のない症例、手術から本登録までに２１日以上経過している症例、予想生存期間が３ヶ月以上期待される症例、重篤な併存疾患、活動性の重複がんのない症例、年齢２０歳以上７５歳未満の症例、遺伝子解析のための組織が手術時に得られている症例、試料提供を含む研究への参加について、患者本人から文書による同意が術前に得られている症例、とし、除外基準を、（１）重篤な合併症を有する症例、（２）感染症を合併している症例、（３）下痢（水様便）のある症例、（４）腸管麻痺、腸閉塞、亜腸閉塞のある症例（本登録前のみ）、（５）間質性肺炎又は肺線維症のある症例、（６）多量の腹水、胸水のある症例、（７）黄疸のある症例、（８）治療を要する程度の虚血性心疾患、不整脈などの心疾患を有する症例（高血圧に伴う左室肥大や軽度の左室負荷、軽度の右脚ブロックなどは登録可）、（９）６ヶ月以内に発症した心筋梗塞の既往を有する症例、（１０）肝硬変を合併している症例、（１１）繰り返し輸血を要する消化管新鮮出血を認める症例、（１２）向精神薬で治療中又は治療を要すると思われる精神障害を有する症例、（１３）コントロール困難な糖尿病を合併している症例、（１４）その他、重篤な術後合併症を有している症例、（１５）他の薬剤に対して重篤な過敏症の既往歴のある症例、（１６）妊娠中あるいは授乳中の女性、及び授子を希望する男女、（１７）肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、梅毒の陽性例、とした。ｍＦＯＬＦＯＸ６療法は、術後２８日以内に、投与を開始し、投与開始日をｄａｙ　１として、２週間ごと１回投与１週休薬を１コースとして投与を行なった。
　計５６例が研究に参加し、このうち５４例で標的病変における腫瘍縮小効果の評価が可能であった。５４例中、前述の検査値が基準を逸脱した４例（参考症例）を除外し、遺伝子発現量を評価するために要するＲＮＡが得られた症例は４４例であった。更に、これら症例からＤＮＡマイクロアレイを用いた解析が可能であった３７例により、抗がん剤治療に対する感受性と関連のある遺伝子を探索した。
　ＤＮＡマイクロアレイはＷｈｏｌｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　４×４４Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)を用い、（１）ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの合成、（２）ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの合成、（３）ｃＲＮＡの断片化、（４）断片化ｃＲＮＡとマイクロアレイとのハイブリダイズ、（５）マイクロアレイの洗浄、（６）マイクロアレイのスキャン、（７）遺伝子発現解析の手順で行った。
　ＴＯＴＡＬ　ＲＮＡは５４例のヒト大腸癌組織サンプルからＲＮｅａｓｙＴＭ　Ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、添付プロトコールに従って抽出し、－８０℃で保存した。
　（１）ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの合成
　Ｑｕｉｃｋ　Ａｍｐ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)を用いて、そのプロトコールに従いｄｏｕｂｌｅ-ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ合成を行った。すなわち、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　５００ｎｇを５．３μｌにＮｕｃｌｅａｓｅ-ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒで調整し、該キットに含まれる１．２μｌ　Ｔ７　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒとポジティブコントロールとして希釈した５μｌ　Ｓｐｉｋｅ－Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を混合し、計１１．５μｌを６５℃で１０分間加温した後、氷上で５分間急冷した。氷上で該キットに含まれる４μｌの５×Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ、２μｌの０．１Ｍ　ＤＴＴ、０．５μｌのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１μｌのＭＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを加え、計２０μｌを４０℃で２時間加温した。ｃＤＮＡ合成反応を停止させるため６５℃で１５分間加温した後、氷上で５分間急冷した。
　（２）ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの合成
　引き続きＱｕｉｃｋ　Ａｍｐ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)のプロトコールに従いｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）反応を行い、ｃＲＮＡを合成した。すなわち、該キットに含まれる２０μｌの４×Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、６μｌの０．１Ｍ　ＤＴＴ、８μｌのＮＴＰ　ｍｉｘ、６．４μｌの５０％　ＰＥＧ、０．５μｌのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、０．６μｌのＩｎｏｒｇａｎｉｃ　Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、０．８μｌのＴ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２．４μｌのＣｙａｎｉｎｅ　３－ＣＴＰ、１５．３μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒをよく混合し、計６０μｌを（１）で調整した２０μｌ　ｃＤＮＡ溶液に添加した後、４０℃で２時間加温した。反応終了後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて添付プロトコールに従い、合成したｃＲＮＡを精製した。すなわち、反応液（８０μｌ）に２０μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒを添加し、合計１００μｌの溶液に該キットに含まれる３５０μｌのＢｕｆｆｅｒＲＬＴを添加してよく混合し、さらに２５０μｌの１００％エタノールを添加してよく混合し、全量（７００μｌ）を該キットに含まれるＲＮｅａｓｙ　ミニスピンカラムに添加して、１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。ＲＮｅａｓｙ　ミニスピンカラムを新しい２ｍｌチューブにセットし、該キットに含まれる５００μｌのＢｕｆｆｅｒ　ＲＰＥをカラムに添加して１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、溶出液を除去した。再度ミニスピンカラムを元の２ｍｌチューブにセットし、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ　ＲＰＥをカラムに添加して１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、溶出液を除去した。ミニスピンカラムを新しい１．５ｍｌチューブに移し、３０μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒをメンブレン上に直接添加し、室温で１分間静置した後、１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、ｃＲＮＡサンプルを溶出した。
　ｃＲＮＡの定量はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で行い、サンプル溶液の２６０ｎｍおよび２８０ｎｍ吸光度を測定し、ｃＲＮＡ濃度を定量するとともに、Ｃｙ３－ＣＴＰ色素の取り込み率が９ｐｍｏｌ／μｇ以上であることを確認した。ｃＲＮＡの品質チェックはＡｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて添付プロトコールに従って泳動し、スメアピークの長さが５００塩基以上であることを確認した。
　（３）ｃＲＮＡの断片化
　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）のプロトコールに従い、ｃＲＮＡを断片化した。すなわち、１．６５μｇのｃＲＮＡが４１．８μｌになるよう、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップし、該キットに含まれる２．２μｌの２５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒと１１μｌの１０×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ａｇｅｎｔを添加し、６０℃で３０分間加熱後、氷上で１分間急冷した。断片化されたｃＲＮＡを含む５５μｌの溶液に、該キットに含まれる５５μｌ　２×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＨＩ－ＲＰＭを加え、計１１０μｌのハイブリダイゼーション溶液を調整した。
　（４）断片化ｃＲＮＡとマイクロアレイとのハイブリダイズ
　ハイブリダイゼーションオーブン（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）とハイブリダイゼーションローター（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてプロトコールに従いハイブリダイズを行った。すなわち、（３）で調整したハイブリダイゼーション溶液をＷｈｏｌｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　４×４４Ｋアレイ面にアプライした後、ガスケットスライド（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）でカバーし、オリゴＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーションチャンバ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で固定した。固定したアレイをハイブリダイゼーションローターにセットし、ハイブリダイゼーションオーブンにて、６５℃、１０ｒｐｍで旋回させながら１７時間加温した。
　（５）マイクロアレイの洗浄
　ハイブリダイゼーション後、オリゴＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーションチャンバによって固定されていたマイクロアレイを取り出し、洗浄を行った。すなわち、０．００５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１０２を添加したＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　１（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を満たしたリザーバーにマイクロアレイを移し、スターラーバーで撹拌しながら室温で１分間洗浄した。引き続き、０．００５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１０２を添加したＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　２（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で満たしたスターラー付恒温槽にマイクロアレイを移し、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で１分間洗浄した。
　（６）マイクロアレイのスキャン
　洗浄が終了したマイクロアレイをスライドホルダにセットし、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｇ２５６５ＢＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）スキャナに供し、蛍光パターンを読み取りＴＩＦＦ　ｉｍａｇｅとして保存した。ＴＩＦＦ　ｉｍａｇｅをＡｇｉｌｅｎｔ　Ｆｅａｔｕｒｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｖｅｒ．９．５ソフトウエアで処理し、アレイ上の各遺伝子スポットのシグナル強度を数値化した。
　（７）遺伝子発現解析
　上記で得られたシグナル強度データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ　ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)マイクロアレイ遺伝子発現解析ソフトを用いてＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行い解析した。すなわち、スポットシグナルから背景シグナルを差し引き、その値が０．０１未満は０．０１とし、アレイの全スポットシグナルの３/４分位値で割り、底を２とした対数値に変換した値をそれぞれの遺伝子の標準化した相対的発現量とした。
２．感受性関連遺伝子の探索
　ＤＮＡマイクロアレイ解析が可能であった３７例の解析結果を用い、最良腫瘍縮小効果（比）を予測しうる遺伝子の探索を行った。３７例から得られたＤＮＡマイクロアレイの解析結果から、最良腫瘍縮小効果との関連について、ピアソンの積率相関解析およびスピアマンの順位相関解析を行い、相関係数Ｒの絶対値が０．５を超え、相関係数ρの検定によりｐ値が０．２未満、かつ、平均発現量の相対値が０．５を超える遺伝子として１７遺伝子を特定した（表１）。また、参考症例４例を加えた４１例で同様の解析を実施したところ、相関係数Ｒの絶対値が０．５を超え、相関係数ρの検定によりｐ値が０．０５未満、かつ、平均発現量の相対値が０．５を超える遺伝子として１０遺伝子を特定した（表２）。３７例の解析結果から特定された１７遺伝子と４１例の解析結果から特定された１０遺伝子のうち、両者に共通する９遺伝子を特定した（表３）。これら９遺伝子は、条件の異なる解析集団に共通して認められたものであり、より臨床における有用性があると判断し、それぞれの遺伝子と最良腫瘍縮小効果との相関性を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　特定した９遺伝子それぞれについて、最良腫瘍縮小効果との相関を確認するため、ＴａｑＭａｎTM　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓを用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を用いて各遺伝子の発現量を定量し、回帰分析を行った。その結果は表４のごとくであった。なお、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子については、ＲＴ－ＰＣＲ用の適切なプライマー・プローブが作成できなかったことから、解析対象から除外した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、各遺伝子の発現量の高い群と低い群に層別してｔ検定を行った。その結果は表５のごとくであった。なお、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子については、ＲＴ－ＰＣＲ用の適切なプライマー・プローブが作成できなかったことから、解析対象から除外した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　更に、最良腫瘍縮小効果をＲＥＣＩＳＴ基準に則りＣＲ及びＰＲ群とＳＤ及びＰＤ群に層別してｔ検定を、ＣＲ及びＰＲ群、ＳＤ群及びＰＤ群の３群に層別して一元配置分散分析を行った。その結果は表６のごとくであった。ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子及びＴＭＥＭ１８遺伝子については、治療に対する奏功が認められたＣＲ及びＰＲ群と比較して、奏功の認められなかったＳＤ及びＰＤ群でより発現量が高いことが統計上示された。なお、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子については、ＲＴ－ＰＣＲ用の適切なプライマー・プローブが作成できなかったことから、解析対象から除外した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
３．感受性予測式の作成及び検証
　以上の結果、ＤＮＡマイクロアレイを用いて特定した感受性に関連する９遺伝子のうち、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子を除く８遺伝子について、単独で抗がん剤感受性と統計上有意な相関を示すものが認められた。また、これら８遺伝子について重回帰分析の手法を用い、特定された遺伝子群の定量的発現量を代入することで最良腫瘍縮小効果を予測する式を求め、その予測性を確認した。前述の遺伝子発現量を評価するために要するＲＮＡが得られた症例４４例を、予測式の作成に用いる２６例（検討群）と、これを検証するための１８例（検証群）に分け、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を用いて８遺伝子の発現量を求めた。検討群２６例における８遺伝子の発現量を用い、重回帰分析の手法により最良腫瘍縮小効果を予測する式を求めた。その結果、最も良く最良腫瘍縮小効果を予測しうる式として、８遺伝子中５遺伝子（ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子）を用いた予測式
（数３）
最良腫瘍縮小効果（腫瘍径ベースライン比）＝０．３７６６４＋９６．３６０×Ａ－８．５１２８×Ｂ＋４２．４２０×Ｃ＋２６．８１０×Ｄ＋７４７．００×Ｅ・・（１）
（式中、ＡはＡＬＡＤ遺伝子の発現量、ＢはＣ２０ｏｒｆ４３遺伝子の発現量、ＣはＧＤＡ遺伝子の発現量、ＤはＴＭＥＭ１８遺伝子の発現量、ＥはＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の発現量を示す。）
が得られた。
　式（１）では、Ｒ＝０．８６９５，ＡＩＣＰＳ（Ａｋａｉｋｅ’ｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ　ｐｅｒ　ｓａｍｐｌｅ）＝－３．３６７２９４と高い予測性が示唆された。
　前述の式（１）の妥当性を検証するため、前述の検証群１８例における式（１）を構成する５遺伝子の発現量を用い、ピアソンの積率相関分析を行ったところ、Ｒ＝０．５８４０３９２（ｐ＝０．０１０９３）と良好な予測式であることが明らかとなった（図１）。
　なお、前述の予測式の検討において、２～８個の遺伝子の組合せを全て検討したが、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の５遺伝子を用いることで、驚異的な精度を有する予測式を得ることができた。個々の遺伝子の検討では感受性との相関が比較的低かったＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子が５遺伝子のうちの一つとして選択され、一方、感受性との相関が比較的高かったＨＯＸＢ６遺伝子が５遺伝子として選択されず、予想外の結果となった。

Claims (16)

  1. 　ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子からなる、オキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤の感受性判定マーカー。
  2. 　遺伝子が、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子である請求項１記載の判定マーカー。
  3. 　最良腫瘍縮小効果（比）を予測するものである請求項１又は２記載の判定マーカー。
  4. 　検体中のＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することを特徴とするオキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤の感受性判定方法。
  5. 　発現量を測定する遺伝子が、ＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子である請求項４記載の判定方法。
  6. 　最良腫瘍縮小効果（比）を予測するものである請求項４又は５記載の判定方法。
  7. 　次式（１）により最良腫瘍縮小効果（比）を算出することを特徴とする請求項６記載の判定方法。
    （数１）
    最良腫瘍縮小効果（比）＝０．３７６６４＋９６．３６０×Ａ－８．５１２８×Ｂ＋４２．４２０×Ｃ＋２６．８１０×Ｄ＋７４７．００×Ｅ・・・・・（１）
    （式中、ＡはＡＬＡＤ遺伝子の発現量、ＢはＣ２０ｏｒｆ４３遺伝子の発現量、ＣはＧＤＡ遺伝子の発現量、ＤはＴＭＥＭ１８遺伝子の発現量、ＥはＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の発現量を示す。）
  8. 　検体が、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項４～７のいずれか１項記載の判定方法。
  9. 　検体が、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項４～８のいずれか１項記載の判定方法。
  10. 　遺伝子の発現量が該遺伝子由来のｍＲＮＡ量である請求項４～９のいずれか１項記載の判定方法。
  11. 　検体中のＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項４～１０のいずれか１項記載の判定方法を実施するためのキット。
  12. 　検体が、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項１１記載のキット。
  13. 　検体が、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項１１又は１２記載のキット。
  14. 　検体中のＡＬＡＤ遺伝子、Ｃ２０ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＢＬＥＳ１遺伝子、ＣＤＣ１４Ｂ遺伝子、ＧＤＡ遺伝子、ＨＯＸＢ６遺伝子、ＲＰＬ７ＡＰ２７遺伝子、ＴＭＥＭ１８遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現変動を指標とするオキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤に対する感受性亢進剤のスクリーニング方法。
  15. 　請求項１４記載の方法により得られたオキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤に対する感受性亢進剤。
  16. 　請求項１５記載の感受性亢進剤とオキサリプラチン又はその塩とフルオロウラシル又はその塩とレボホリナート又はその塩を含む抗がん剤を含有するがん治療用組成物。
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