JP2011147374A - 外科切除された進行胃癌における術後補助化学療法の有効性予測方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】外科切除された進行胃癌患者における、S-1を用いた術後補助化学療法の有効性を予測するために、患者から採取された癌細胞を含む試料に含まれるチミジル酸合成酵素(TS)遺伝子の発現量を測定し、この発現量により前記有効性を予測する方法。また、TS遺伝子増幅用プライマー及び/又はTS遺伝子用プローブを含有する、S-1を用いた術後補助化学療法の有効性を判定するための、TS遺伝子発現量測定用試薬やキット。
【選択図】なし
Description
4.外科切除された進行胃癌患者においてテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を投与する術後補助化学療法を採択すべきかを判定するための、上記1〜3のいずれかに記載の方法。
本発明においてTS遺伝子発現量の測定に用いる試料は、癌細胞を含む試料であれば特に限定されず、組織、その抽出物、採取した組織の培養物などが例示できる。試料からのDNA 、RNA 、タンパク質の調製は公知の方法により行えばよい。
対象・方法
1.対象
本研究は、原発巣に対し外科的切除されたstage II / IIIの進行胃癌の79例を対象とした。いずれの症例も術前に化学療法は施行されていない。全79例は、S-1 群39例とSurgery 群40例に2群分けされた。いずれの症例でも(1) 組織学的にstage II(T1 を除く) 、IIIA、IIIBの進行胃癌であることが証明されており、(2) D2リンパ節郭清の標本を含め残存腫瘍が無く(R0)、(3) 肝転移、腹膜播種、腹腔洗浄細胞診が陰性であること、(4) 正常な骨髄機能、肝機能、腎機能を有し、重篤な合併症がないことを満たす症例であった。
S-1 群の症例では、S-1 投与後は2 週間毎に血液検査や症状の有無について経過を診た。
2.方法
2-1.マイクロダイセクション
外科切除された病理標本からHematoxylin and Eosin 染色(H.E.染色)で腫瘍部を観察し、それを基に、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロック(FFPE)から、10μm厚の薄切切片を作成した。薄切切片にNuclear Fast Red染色を行い、H.E.染色標本と対比しながら、Laser Capture Microdissection (Arcturus XTTM microdissection instrument, CA, 米国) で腫瘍部のみ採取した。
2-2. RNA抽出とcDNA合成
RNAはFFPE kit (Qiagen Inc.,CA, 米国) のマニュアルに従って抽出された。cDNA合成については、High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, CA, 米国) のマニュアルに従い、ランダムプライマーと逆転写酵素を用いて合成した。
2-3.リアルタイムPCR
リアルタイムPCR は、LightCycler Software 2.0 (Roche Diagnostics,インディアナポリス、米国) を使用し解析した。
PCR はLightCycler TaqMan Master Mix (Roche Diagnostics, インディアナポリス、米国) と各遺伝子に応じた1.0 μl cDNA 、10μM のリバースプライマーとフォワードプライマー、10μM のプローブを用いて、全量20μlで解析を行った。PCR のサイクル条件は、95℃10分間の後、95℃10秒、60℃20秒、72℃1秒を1サイクルとして計45サイクル行った。
mRNA の遺伝子発現については相対定量が用いられ、各遺伝子に対して標準曲線を作成した。ターゲット遺伝子のmRNAとβactin のmRNAに関する標準曲線は、正常な下行結腸のcDNAを10倍ごとに希釈し、計5段階で各遺伝子について定量解析を行い、作成した。
2-5.統計解析
すべての解析はSPSS version17 (SPSS Japan Inc.)で行われた。TS発現量と臨床病理学的因子との相関性についてはカイ2乗検定が使用された。すべてのターゲット遺伝子の発現量については、各遺伝子のS-1 群の中央値をカットオフ値とし、それよりも高い値は高発現量、低い値は低発現量と表現し、Surgery 群とS-1 群ともに同じカットオフ値を使用することとした。無再発生存期間(RFS) は手術が施行された日から再発もしくは最終観察日もしくは死亡した期日までの期間とし、全生存期間(OS)は、手術が施行された日から最終観察日または死亡した期日までの期間とした。全生存期間と無再発生存期間はKaplanMeier 生存曲線を使用し、log rank検定で評価した。
結 果
1.臨床病理学的特徴
2群分けされたS-1 群39例とSurgery 群40例について各々の臨床病理学的因子について比較したところ、リンパ節転移(N) とリンパ節転移の数について有意差を認めた (リンパ節転移:p=0.027 、リンパ節転移の数:p=0.028)が、他の項目については有意差を認めなかった。
2.胃癌のターゲット遺伝子発現について
ターゲット遺伝子の発現量は、内部標準のリファレンス遺伝子であるβactin mRNA発現量に対する相対定量で算出した (Target gene mRNA levels/βactin mRNA levels)。
S-1 群とSurgery 群の術後観察期間の中央値はそれぞれ34.5ヶ月(12.4 〜80.1ヶ月) 、42.8ヶ月(3.8〜73.3ヶ月) であった。またRFS の中央値はS-1 群、Surgery 群それぞれ30.4ヶ月(6.5〜80.1ヶ月) 、40.1ヶ月(3.6〜73.3ヶ月) であった。
3.ターゲット遺伝子と全生存期間(OS)の関係
S-1 群とSurgery 群のOSの中央値はそれぞれ34.5ヶ月(12.4 〜80.1ヶ月) 、42.8ヶ月(3.8〜73.3ヶ月) であった。
4. TS 発現量と臨床病理学的因子の関係
S-1 群とSurgery 群におけるTS発現量と臨床病理学的因子の相関性を評価した。TS発現量とリンパ節転移(N) の間に、S-1 群 (p =0.568)、Surgery 群 (p =0.325)共に有意な相関関係を認めなかった。また、他の項目に関しても同様にTS発現量との間に有意差を認めなかった。
5.まとめ
外科切除されたstage II / III進行胃癌79例について、術後S-1 による化学療法が施行された群 (S-1 群) と、外科切除単独群 (Surgery 群) において、その治療成績と各遺伝子発現量との相関性を検討した。その結果、Surgery 群ではTS発現量と予後について有意差を認めなかったが、S-1 群においてはRFS 及びOSについて、腫瘍内のTS低発現量はTS高発現量と比較して予後が良好であった(KaplanMeier survival analysis, logrank test, p=0.021 、p=0.016)。さらにS-1 群では、年齢や性別、腫瘍径、組織型、増殖形式(INF )、深達度(T )、所属リンパ節転移(N )、リンパ節転移の数、リンパ管侵襲(ly)、静脈侵襲(vein)、Stage を含めた臨床病理学的因子を加えて解析すると、単変量解析にてRFS についてTS発現量(p=0.021) とリンパ節転移(p=0.038) で有意差を認め、OSでは、TS発現量(p=0.032) とリンパ節転移(p=0.020) について有意差を認めた。多変量解析では、TS発現量がRFS とOSそれぞれについて独立した予後規定因子であることが確認された(RFS:p=0.027,ハザード比=5.682、95%CI=1.218-26.503、OS:p=0.050 、ハザード比=4.654、95% CI=1.000-21.662)。
Claims (7)
- 外科切除された進行胃癌患者における、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた術後補助化学療法の有効性を予測する方法であり、患者から採取された癌細胞を含む試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を測定し、該発現量により前記有効性を予測する方法。
- 前記発現量が、予め設定したカットオフポイントと比較して低い場合、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた術後補助化学療法の有効性が高いと判断する、請求項1記載の方法。
- 前記発現量が、チミジル酸合成酵素遺伝子がコードするmRNAの発現量である、請求項1または2記載の方法。
- 外科切除された進行胃癌患者において、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を投与する術後補助化学療法を採択すべきかを判定するための、請求項1〜3のいずれかの項記載の方法。
- 外科切除された進行胃癌患者における、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いる術後補助化学療法の有効性を判定するための、試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量測定用試薬であり、チミジル酸合成酵素遺伝子増幅用プライマーまたはチミジル酸合成酵素遺伝子用プローブを含有する、前記試薬。
- チミジル酸合成酵素遺伝子増幅用プライマーおよびチミジル酸合成酵素遺伝子用プローブを含有する、外科切除された進行胃癌患者における、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いる術後補助化学療法の有効性を判定するためのキット。
- チミジル酸合成酵素遺伝子増幅用プライマーが、配列番号1に示す配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号2に示す配列を有するリパースプライマーからなり、チミジル酸合成酵素遺伝子用プローブが配列番号3に示す配列を有する、請求項6記載のキット。
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