CN102206642A - 具有哺乳动物体液稳定性的双链rna分子及其制备和应用 - Google Patents

具有哺乳动物体液稳定性的双链rna分子及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102206642A
CN102206642A CN201010253909XA CN201010253909A CN102206642A CN 102206642 A CN102206642 A CN 102206642A CN 201010253909X A CN201010253909X A CN 201010253909XA CN 201010253909 A CN201010253909 A CN 201010253909A CN 102206642 A CN102206642 A CN 102206642A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
stranded rna
rna molecule
double stranded
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201010253909XA
Other languages
English (en)
Inventor
杜权
梁子才
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University
Original Assignee
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University filed Critical Peking University
Priority to CN201010253909XA priority Critical patent/CN102206642A/zh
Publication of CN102206642A publication Critical patent/CN102206642A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子及其制备和应用方法，本发明公开的具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子全部由未修饰的核苷酸组成，本发明首次公开的具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子在免疫治疗和小核酸制药中具有重要的应用价值。

Description

具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子及其制备和应用
技术领域
本发明涉及核酸技术领域，具体涉及一种具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子及其制备方法和应用方法。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指双链RNA(dsRNA)分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象(Fire A，1998；Elbashir SM，2001)。最早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNA干扰现象(Napoli C，1990；Fire A，1991；Guo S，1995)。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，被称为小干扰核酸(siRNA)(Hamilton AJ，1999)。双链siRNA与细胞内源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。在RNA干扰过程中，双链siRNA中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达(Zamore PD，2000；Hammond SM，2001)。
除了基因功能研究外，siRNA被迅速应用于人类疾病的治疗，抑制病毒或肿瘤等重大疾病中致病基因的表达(Tiemann K，2009；Jackson AL 2010)。但由于siRNA的稳定性较差，在体内容易被血液中大量存在的核酸酶降解(Czauderna F，2003；Haupenthal J，2006；Turner JJ，2007)，因此人们需要对合成的siRNA进行化学修饰，以增加其血液稳定性(Braasch DA，2003；Layzer JM，2004；Choung S2006)。虽然这种化学修饰策略能够很好地提高siRNA分子的血液稳定性，但引入的核苷酸类似物增加了修饰siRNA的潜在细胞毒性，并在很多情况下降低了它的生物学活性，制约了其在体内的应用。
因此，迫切需要建立在不增加siRNA体内毒性条件下，提高其血液稳定性的方法，解决siRNA制药中的这个技术瓶颈。
Braasch DA，Jensen S，Liu Y，Kaur K，Arar K，White MA and Corey DR(2003)RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA.Biochemistry 42：7967
Choung S，Kim YJ，Kim S，Park HO and Choi YC(2006)Chemical modification of siRNAs to improve serum stability without loss of efficacy.Biochem Biophys Res Commun.342：919
Czauderna F，Fechtner M，Dames S，Aygün H，Klippel A，Pronk GJ，Giese K and Kaufmann J(2003)Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells.Nucleic Acids Res.31：2705
Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A，Weber K and Tuschl T(2001)Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature 411：494
Fire A，Albertson D，Harrison SW and Moerman DG(1991)Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression in C.elegans muscle.Development 113：503
Fire A，Xu S，Montgomery MK，Kostas SA，Driver SE and Mello CC(1998)Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature 391：806
Guo S and Kemphues KJ(1995)par-1，a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed.Cell 81：611
Hamilton AJ and Baulcombe DC(1999)A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.Science 286：950
Hammond SM，Boettcher S，Caudy AA，Kobayashi R and Hannon GJ(2001)Argonaute2，a link between genetic and biochemical analyses of RNAi.Science 293：1146
Haupenthal J，Baehr C，Kiermayer S，Zeuzem S and Piiper A(2006) Inhibition of RNAse A family enzymes prevents degradation and loss of silencing activity of siRNAs i
Jackson AL and Linsley PS(2010)Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application.Nat Rev Drug Discov.9：57
Layzer JM，McCaffrey AP，Tanner AK，Huang Z，Kay MA and Sullenger BA(2004)In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs.RNA 10：766
Napoli C，Lemieux C and Jorgensen R(1990)Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans.Plant Cell 2：279
Tiemann K and Rossi JJ(2009)RNAi-based therapeutics-current status，challenges and prospects.EMBO Mol Med.1：142
Turner JJ，Jones SW，Moschos SA，Lindsay MA and Gait MJ(2007)MALDI-TOF mass spectral analysis of siRNA degradation in serum confirms an RNAse A-like activity.Mol Biosyst 3：43
Zamore PD，Tuschl T，Sharp PA and Bartel DP(2000)RNAi：double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell 101(1)：25
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子。
为解决上述问题，本发明一方面，提供了一种分离的双链RNA分子，其序列特征符合以下条件中的至少一种：1)其中UA/UA序列的含量不大于10％；2)其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％；3)其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％，且其中UA/UA序列的含量不大于10％。
优选条件下，所述双链RNA分子全部由未修饰的核苷酸组成。未修饰的核苷酸优选为天然存在于哺乳动物体内的核苷酸。
在本发明中，术语“分离的”在用于RNA时，表示RNA基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。
在本文中，所述RNA分子中UA/UA和/或CA/UG和/或UG/CA序列的含量为UA/UA和/或CA/UG和/或UG/CA序列在该RNA分子所有可能的双核苷酸组合中所占的数量百分比。
所述UA/UA序列是指双链RNA分子的第一条链上的一个连续的UA序列与第二条链上的一个与第一条链的UA序列互补的连续的UA序列形成UA/UA序列；所述CA/UG序列是指双链RNA分子的第一条链上的一个连续的CA序列与第二条链上的一个与第一条链的CA序列互补的连续的UG序列形成CA/UG序列；所述UG/CA序列是指双链RNA分子的第一条链上的一个连续的UG序列与第二条链上的一个与第一条链的UG序列互补的连续的CA序列形成UG/CA序列。
在上述方案中，当双链RNA分子中含有UA/UA序列时，所述UA/UA序列在该RNA分子所有可能的双核苷酸组合中所占的数量百分比不大于10％；当双链RNA分子中含有CA/UG序列时，所述CA/UG序列在该RNA分子所有可能的双核苷酸组合中所占的数量百分比不大于20％，当双链RNA分子中含有UG/CA序列时，所述UG/CA序列在该RNA分子所有可能的双核苷酸组合中所占的数量百分比不大于20％；当双链RNA分子中同时含有UA/UA和CA/UG、或者同时含有UA/UA和UG/CA、或者同时含有UA/UA和CA/UG和UG/CA时，上述序列的总的含量不大于20％，并且其中UA/UA序列的含量不大于10％。
在上述方案中，优选的，所述双链RNA分子中不含有UA/UA序列；当双链RNA分子中含有CA/UG序列时，所述CA/UG序列在该RNA分子所有可能的双核苷酸组合中所占的数量百分比不大于10％，当双链RNA分子中含有UG/CA序列时，所述UG/CA序列在该RNA分子所有可能的双核苷酸组合中所占的数量百分比不大于10％。
最优选的，所述双链RNA分子中不含有任何UA/UA序列和CA/UG或UG/CA序列。
具有上述序列特征的双链RNA分子，在37℃条件下在哺乳动物体液中保持稳定。所述哺乳动物选自大鼠、小鼠、兔、狗、羊、猪、牛、猴或者人。所述哺乳动物体液选自血液、血浆、血清、组织液、脑脊液、唾液或者分泌物。哺乳动物体液浓度至少为10％、20％、50％、90％或者100％。所述双链RNA分子与上述哺乳动物体液接触后，至少70％、80％、90％甚至95％以上的RNA保持完整的双链结构。在哺乳动物体液中，具有上述序列特征的双链RNA稳定存在的时间大于10分钟，优选地大于1小时，再优选地大于6小时，更优选地大于12小时。
利用聚丙烯酰氨凝胶对siRNA的血清稳定性进行检测，然后用灰度定量软件如ImageJ对RNA条带进行定量，双链RNA分子的完整性用处理后样本的灰度值除以未处理样本的灰度值来表示。在实施例中siRNA的稳定性的表述方式如下：“+”表示经血清孵育后，siRNA主带完全消失，可见明显的降解条带，双链RNA分子的完整性小于70％；“++”表示经血清孵育后，双链RNA分子的完整性在70％以上，同时可见明显的降解条带；“+++”表示经血清孵育后，双链RNA分子的完整性在90％以上，未见明显的降解条带。
在本文中，对所述双链RNA分子的长度没有特别的限制，例如可以是长双链RNA，长度在几十至几百个核苷酸，甚至几千个核苷酸；也可是短的双链RNA，如小干扰RNA(siRNA)。在一个较佳的实施方式中，所述具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子中每条链的长度为8-50个核苷酸，更佳的为10-40个核苷酸，还要佳的为12-30个核苷酸。在本发明的另一优选实施方式中，所述具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子中每条链的长度为14-29个核苷酸，该RNA分子能够靶特异性RNA干涉，其中至少一条链具有1-5个核苷酸的3’-突出端。
在本发明的第二个方面，提供了获得所述具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子的方法，该方法包含以下步骤：
(1)从目标基因转录本序列中选择一个或多个18-30个核苷酸长度的核酸片段作为双链RNA分子的一条链，使双链RNA分子的另一条链与其互补，所述双链RNA分子的序列符合以下条件中的至少一种；
1)其中UA/UA序列的含量不大于10％；
2)其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％；
3)其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％，且其中UA/UA序列的含量不大于10％；
(2)制备上述双链RNA分子；
(3)将制备的双链RNA分子与含有10％以上哺乳动物体液的溶液接触10分钟以上，其中RNA的双链结构的完整性在70％以上的双链RNA为哺乳动物体液稳定的双链RNA。
本发明第三方面提供了上述双链RNA分子的应用方法。
首先，本发明所述的双链RNA分子可以用于在细胞中抑制基因表达，因此本发明提供了一种在细胞中抑制目标基因表达的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将上述双链RNA分子中的至少一种导入细胞；
(2)培养细胞直至目标基因的表达被抑制。
优选情况下，所述细胞为哺乳动物细胞。
其次，本发明所述的双链RNA分子还可以用于制备RNA干涉药物或者作为免疫佐剂。
本发明还提供了一种在哺乳动物中抑制基因表达的药物组合物，该药物组合物包含上述双链RNA分子中的至少一种以及至少一种药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的双链RNA分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在抑制基因表达方面的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等，其中较佳的载体选自生理盐水、甘油和磷酸盐缓冲盐水。本发明的药物组合物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。本发明所述制剂是指口服液、注射剂、舌下含服剂等多种液体剂型，或通过加以适当的赋形剂制备成片剂、胶囊剂等多种其他剂型。较佳的是，所述药物组合物的剂型选自注射剂、胶囊、舌下含服剂、口服液、气雾剂或贴剂。
在本发明的另一优选例中，提供了一种制备上述药物组合物的方法，该方法包括将上述双链RNA分子中的至少一种与至少一种药学上可接受的载体相混合，从而获得所述药物组合物。双链RNA分子以及药学上可接受的载体之间的混合次序没有特别的限制。
本发明通过对核酸序列的选择，降低其中UA/UA和/或CA/UG和/或UG/CA位点的含量，提高其对哺乳动物体液中核酸酶的抗性，从而达到增加未修饰的双链RNA分子在哺乳动物体液中稳定性的目的。与修饰的核酸分子相比，降低了因化学修饰带来的潜在的细胞毒性以及修饰对核酸分子的生物学活性的影响。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1.稳定性siRNA的体内稳定性实验
1，未处理的siRNA；2，siRNA处理的小鼠的尿液；3，生理盐水处理的小鼠的尿液。
具体实施方式
自1998年RNA干涉现象被发现以来，经过几年的探索，2001年左右小核酸制药这一新兴的生物制药领域逐渐开始形成。作为该领域一项革命性的突破，第一个siRNAi药物Bevasiranib于2004年获得批准进入临床试验(Acuity Pharmaceuticals公司，用于治疗湿性老年性黄斑变性)，2008年进入临床III期试验。临床试验结果表明，小核酸药物不仅安全、毒性低，而且临床治疗效果十分显著，极有可能成为一个可用于大规模药物开发的技术平台。
尽管如此，在siRNA制药技术方面还有许多问题没有得到解决，例如如何提高siRNA药物的血液稳定性和容留时间，如何提高siRNA药物的靶向性等。尤其是对于系统用药来说，siRNA制剂的血液稳定化技术是优化容留时间和靶向性的前提条件。以往siRNA稳定化技术基本是源于反义核酸和核酶时代的多种核酸修饰，包括2-O-(2，4-dinitriophenyl)修饰，2’-fluoro修饰，2’-O-methyl修饰，2’-O-methoxyethyl修饰，以及LNA修饰等。这些化学修饰虽然有效地提高了siRNA的化学稳定性，同时也增加了siRNA制剂的细胞毒性，为siRNA药物的研发造成了新的障碍。
本发明人针对如何增加siRNA制剂的血液稳定性开展了长期而深入的研究，发现siRNA在血液降解过程中存在敏感位点。在此基础上，发明人研究合成了一种具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子，其在未修饰的状态下能够长时间地在哺乳动物体液尤其是血液中保持稳定。
本发明的主要优点在于：
1)以往制备具有哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子是通过对RNA分子中的部分核苷酸进行化学修饰或利用非天然核苷酸替代来实现的，本发明首次提供一种未修饰的具备哺乳动物体液稳定性的双链RNA分子，在不增加RNA分子细胞毒性的条件下，提高了其对核酸酶降解的抵抗能力。
2)本发明提供了一种普遍适用的技术方法，制备针对任何基因序列的具备哺乳动物体液稳定性的双链RNA。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。下列实施例中未著名具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：A laboratory manual，3rd ed.，Sambrool等，Cold Spring Biology-A Laboratory Manual，Clrak等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
实施例1.双链RNA分子的稳定性实验
在含一定量胎牛血清的36μL 1×PBS溶液中加入4μL浓度为20μM的双链RNA溶液，血清终浓度分别为10％，20％，50％或90％；在37℃条件下将反应体系孵育10分钟、30分钟、1小时、3小时或6小时后取样；每次取样10μL并立即进行液氮速冻，样本保存于-80℃条件下备用。
配制20％的聚丙烯酰氨凝胶，将3μL 3×的上样缓冲液(30mM EDTA，36％甘油，0.06％溴氛蓝)与10μL siRNA的降解样本进行混合，然后上样，在80mA的恒流条件下电泳。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)进行10分钟的染色后照相。然后用灰度定量软件如ImageJ对RNA条带进行定量，双链RNA分子的完整性用处理后样本的灰度值除以未处理样本的灰度值来表示。
siRNA血清稳定性的表述方式如下：“+”表示经血清孵育后，siRNA主带完全消失，可见明显的降解条带，双链RNA分子的完整性小于70％；“++”表示经血清孵育后，双链RNA分子的完整性在70％以上，同时可见明显的降解条带；“+++”表示经血清孵育后，双链RNA分子的完整性在90％以上，未见明显的降解条带。
实施例2.siRNA基因沉默效率抑制活性检测
将在DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中(1×105细胞/0.5ml培养基/孔)。待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50％左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基(Gibco公司)。然后将带有siRNA分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告质粒和pRL-TK(编码海肾萤光素酶)的对照质粒(Promega公司，Madison WI，USA)与化学合成的siRNA通过Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)进行细胞转染，每孔含0.17g重组质粒和0.017g pRL-TK对照质粒，siRNA的终浓度为13nM。每种siRNA平行转染三个复孔，以只转染同样量的两种报告基因质粒，不转染siRNA的三个复孔作为对照。4小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)。24小时后收获细胞，以10μl细胞裂解液细胞，利用双荧光素酶报告基因分析系统(Dual-Luciferase Assay System，Promega公司)和酶标仪(Novostar，BMG Labtechnologies GmbH，Germany)测定两种荧光酶的活性，以未转染siRNA的孔中的报告基因的表达量作为标准对照，通过以下公式计算得到siRNA对靶位点的抑制活性，每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复2次。
抑制活性＝1-(实验组Firefly荧光素酶的表达量/实验组Renilla荧光素酶表达量)/(对照组Firefly荧光素酶的表达量/对照组Renilla荧光素酶表达量)
本发明利用含有siRNA分离靶位点的报告基因来检测siRNA的干涉活性，已有研究文献和实验数据表明，siRNA对分离靶位点的抑制活性与其对内源靶基因的抑制活性之间存在显著的相关性(Huang H，Qiao R，Zhao D，Zhang T，Li Y，Yi F，Lai F，Hong J，Ding X，Yang Z，Zhang L，Du Q and Liang Z(2009)Profiling of mismatch discrimination in RNAi enabled rational design of allele-specific siRNAs.Nucleic Acids Res.37(22)：7560-9；Du Q，Thonberg H，Wang J，Wahlestedt C and Liang Z(2005)A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites.Nucleic Acids Res.33(5)：1671-7；Du Q，Thonberg H，Zhang HY，Wahlestedt C and Liang Z(2004)Validating siRNA using a reporter made from synthetic DNA oligonucleotides.Biochem Biophys Res Commun.325(1)：243-9)。
实施例3.不同UA/UA和CA/UG和/或UG/CA含量siRNA的稳定性及抑制活性比较
在前期工作的基础上，本发明人制备了具有不同UA/UA和CA/UG和/或UG/CA含量的siRNA，按照实施例1所述的研究方案对其血清稳定性进行了研究，具体为将siRNA在37℃和10％血清浓度的条件下进行孵育，6小时后取样分析其血清稳定性。按照实施例2的方案检测siRNA对分离靶位点的抑制活性，其中分离靶位点为与所设计的siRNA互补的DNA序列。实验结果如表1。实验结果可以看出，siRNA的血清稳定性与siRNA中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量显著相关，而siRNA的血清稳定性与siRNA对融合靶基因的抑制活性无相关性。
表1 siRNA的血清稳定性
编号            序列                             UA      CA     稳定性 抑制活性
SEQ ID NO：6    5’-GGAAAAGAAGGAAGAAGAATT-3’    0％     0％    +++    94％
SEQ ID NO：7    5’-GGAAAGCCAGAGGAACCAATT-3’    0％     11％   +++    90％
SEQ ID NO：8    5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’    0％     11％   +++    87％
SEQ ID NO：9    5’-GGCCAGAACCUUCCUCCUCUUTT-3’  0％     6％    +++    83％
SEQ ID NO：10   5’-AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA-3’   0％     11％   +++    93％
SEQ ID NO：11   5’-GCCUGAGAGUGGAGGUAACTT-3’    6％     11％   +++    98％
SEQ ID NO：12   5’-GCAGCAAGCGACAGAGAAATT-3’    0％     17％   +++    95％
SEQ ID NO：13   5’-CAAUGACUGAAGAAUUCAATT-3’    0％     22％   +      97％
SEQ ID NO：14   5’-GUUCCAUUGCUUGGCGAAUTT-3’    0％     17％   +++    75％
SEQ ID NO：15   5’-UGAGGUUGGUGUACUGUGUGUGA-3’  0％     39％   +      89％
SEQ ID NO：16   5’-CGGCUGACCCAUGAAAUAATT-3’    6％     17％   +      94％
SEQ ID NO：17   5’-CACUGUGGACAGCAAAUAATT-3’    6％     28％   +      95％
SEQ ID NO：18   5’-UAUUAAUUGAAGCACCACCTT-3’    11％    17％   +      99％
SEQ ID NO：19   5’-GCGUAAUCUCCAGGAUAACTT-3’    11％    6％    +      89％
SEQ ID NO：20   5’-UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG-3’  22％    6％    +      79％
SEQ ID NO：21   5’-CGUUAAUACUCACUGUAUATT-3’    22％    11％   +      84％
实施例4.基因特异的血清稳定siRNA的制备及研究
为了制备针对任意基因序列片段的具备血清稳定性的siRNA，本发明人按照实施例3结果的提示，建立了一个相应的技术方案，该方案由以下步骤组成：1)从目标基因转录本序列中选择一个或多个18-30个核苷酸长度的核酸片段作为双链RNA分子的一条链，使双链RNA分子的另一条链与其互补，所述双链RNA分子的序列符合以下条件中的至少一种：其中UA/UA序列的含量不大于10％；其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％；其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％，且其中UA/UA序列的含量不大于10％。2)化学合成上述双链RNA分子。3)将制备的双链RNA分子与一定浓度的哺乳动物体液进行接触，获得在所述哺乳动物体液中能够稳定存在的双链RNA分子。4)按照实施例2的实验方案将带有siRNA分离靶位点的报告质粒与siRNA共转染到培养细胞中。5)检测报告基因的表达水平，获得能够特异性抑制分离靶位点的双链RNA分子。
按照实施例1所述的研究方案对所述siRNA的血清稳定性进行了研究，具体为将siRNA在37℃和10％血清浓度的条件下进行孵育，6小时后取样分析其血清稳定性。按照实施例2的方案检测了其对靶位点的抑制活性(表2)。
表2血清稳定性siRNA的设计及验证
编号           基因           siRNA序列                        UA     CA      稳定性     抑制活性
SEQ ID NO：22  CVU47298       5′-AGAGUCCUUCGAUAGGGACtt-3′    6％    0％     +++        95％
SEQ ID NO：23  CVU47298       5′-UCCCCUCUCUAAGGAAGUCtt-3′    6％    0％     +++        92％
SEQ ID NO：24  CVU47298       5′-GGGACGAAGACGAACACUUtt-3’    0％    6％     +++        87％
SEQ ID NO：25  CVU47298       5’-GACGAAGUACCGAAAGGUCtt-3’    6％    0％     +++        93％
SEQ ID NO：26  CVU47298       5’-AAGAAGGGCGGAAAGAUCGtt-3’    0％    0％     +++        75％
SEQ ID NO：27  NM_000546      5’-GUAAACAAUCCGGAAGCGAtt-3’    6％    6％     +++        97％
SEQ ID NO：28  NM_000546      5’-GAGAUUCTCGCAUGCCAGAtt-3’    0％    17％    +++        88％
SEQ ID NO：29  NM_000546      5’-GUCGAUGUACACGUUCGUCtt-3’    6％    11％    +++        90％
SEQ ID NO：30  NM_007294.3    5’-CUGGAGAGCAACCGCATAAtt-3’    0％    17％    +++        94％
SEQ ID NO：31  NM_007294.3    5’-GAUUCUCGCAUGCCAGAGAtt-3’    0％    17％    +++        97％
SEQ ID NO：32  NM_007294.3    5’-CAUAAAGGCCAAGAAGGGCtt-3’    6％    11％    +++        72％
SEQ ID NO：33  NM_007294.3    5’-CAAGAAGGGCGGAAAGAUCtt-3’    0％    6％     +++        94％
SEQ ID NO：34  NM_007294.3    5’-AUAAAGGCCAAGAAGGGCGtt-3’    6％    6％     +++        99％
SEQ ID NO：35  NM_000125      5’-AUCAGGCAAGGATATGGGCtt-3’    0％    11％    +++        87％
SEQ ID NO：36  NM_000125      5’-GAAGAGAUACGCCCUGGUUtt-3’    6％    6％     +++        89％
SEQ ID NO：37  NM_000125      5’-UUCGAAAUGUCCGUUCGGUtt-3’    0％    6％     +++        98％
SEQ ID NO：38  BT007245.1     5’-UUUCUGAGGAGCCUUCAGGtt-3’    0％    11％    +++        94％
SEQ ID NO：39  BT007245.1     5’-UCUAAGGAAGUCGGGGAAGtt-3’    6％    0％     +++        97％
实施例5.长双链RNA血清稳定性的研究
双链RNA除了用作siRNA，对同源靶基因的表达进行调控外，还被广泛地应用于免疫佐剂，调节机体的免疫力。为了验证由未修饰的核苷酸组成的具有稳定性的双链RNA分子在免疫佐剂方面的用途，本发明人制备了长双链8-50碱基不同长度的双链RNA分子，按照实施例1所述的研究方案对其血清稳定性进行了研究，具体为将siRNA在37℃和10％血清浓度的条件下进行孵育，6小时后取样分析其血清稳定性。实验结果见表3.
表3不同长度双链RNA分子的血清稳定性
Figure BSA00000230030500091
Figure BSA00000230030500101
实施例6.稳定性siRNA在不同哺乳动物血液及组分中稳定性的研究
为了进一步验证实施例3和4中提供的在胎牛血清中具有稳定性的siRNA在其它哺乳动物血液或血液组分中的稳定性情况，本发明人获得了小鼠、大鼠、兔、牛、恒河猴及人类的血液，从中分离出血浆和血清成分。在这些血液组分中，对实施例3和4中的稳定性siRNA进行了检测。按照实施例1所述的研究方案对siRNA血清稳定性进行了研究，具体为将siRNA在37℃和10％血清浓度的条件下进行孵育，6小时后取样分析其血清稳定性。实验结果如表4。
血清和血浆的分离过程如下：
1.动物血清的分离。使采集的动物全血室温自然凝固，再置37℃温箱1小时，然后放4℃冰箱过夜，待血块收缩后分离血清。
2.动物血浆的分离。用常规离心分离法从全血中去除血细胞，制备血浆。
表4 siRNA在小鼠血液及组分中的稳定性
编号             物种    血液   血浆   血清
SEQ ID NO：22    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：23    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：24    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：25    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：26    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：27    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：28    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：29    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：30    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：31    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：32    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：33    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：34    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：35    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：36    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：37    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：38    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：39    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：40    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：41    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：42    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：43    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：44    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：45    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：46    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：47    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：48    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：49    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：50    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：51    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：52    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：53    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：54    小鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：22    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：23    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：24    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：25    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：26    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：27    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：28    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：29    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：30    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：31    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：32    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：33    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：34    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：35    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：36    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：37    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：38    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：39    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：40    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：41    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：42    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：43    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：44    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：45    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：46    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：47    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：48    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：49    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：50    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：51    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：52    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：53    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：54    大鼠    +++    +++    +++
SEQ ID NO：22    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：23    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：24    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：25    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：26    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：27    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：28    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：29    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：30    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：31    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：32    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：33    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：34    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：35    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：36    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：37    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：38    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：39    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：40    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：41    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：42    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：43    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：44    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：45    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：46    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：47    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：48    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：49    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：50    兔      +++    +++    +++
SEQ ID NO：51    兔        +++    +++    +++
SEQ ID NO：52    兔        +++    +++    +++
SEQ ID NO：53    兔        +++    +++    +++
SEQ ID NO：54    兔        +++    +++    +++
SEQ ID NO：22    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：23    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：24    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：25    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：26    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：27    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：28    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：29    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：30    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：31    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：32    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：33    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：34    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：35    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：36    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：37    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：38    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：39    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：40    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：41    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：42    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：43    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：44    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：45    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：46    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：47    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：48    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：49    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：50    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：51    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：52    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：53    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：54    牛        +++    +++    +++
SEQ ID NO：22    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：23    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：24    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：25    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：26    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：27    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：28    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：29    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：30    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：31    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：32    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：33    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：34    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：35    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：36    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：37    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：38    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：39    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：40    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：41    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：42    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：43    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：44    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：45    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：46    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：47    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：48    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：49    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：50    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：51    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：52    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：53    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：54    恒河猴    +++    +++    +++
SEQ ID NO：22    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：23    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：24    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：25    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：26    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：27    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：28    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：29    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：30    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：31    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：32    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：33    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：34    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：35    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：36    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：37    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：38    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：39    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：40    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：41    人        +++    +++    +++
SEQ ID NO：42    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：43    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：44    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：45    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：46    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：47    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：48    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：49    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：50    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：51    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：52    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：53    人    +++    +++    +++
SEQ ID NO：54    人    +++    +++    +++
实施例7.稳定性siRNA的体内实验
siRNA稳定化的研究一个重要的目的用于siRNA制药，为了研究这些血清稳定性siRNA在体内的稳定性情况，发明人选用其中4条稳定性的siRNA(SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：27)进行了小鼠体内注射，通过检查小鼠尿液中排出的siRNA的完整性(图1)，分析这些siRNA在小鼠体内的稳定性。
1)小鼠的饲养和所有实验方案由北京大学动物伦理委员会批准。
2)取体重在18-22克左右的8-12周龄的C57雄性小鼠，按照2.5mg/kg的标准，尾静脉注射0.2毫升siRNA溶液。注射后1小时，处死小鼠，从膀胱中抽取尿液。取10微升尿液进行聚丙烯酰氨凝胶电泳。
3)配制20％的聚丙烯酰氨凝胶，将3μL 10×的上样缓冲液(30mM EDTA，36％甘油，0.06％溴氛蓝)与小鼠尿液进行混合，然后上样，在80mA的恒流条件下电泳。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)进行10分钟的染色后照相。
图1表明，小鼠尿液中的siRNA片段是完整的。这一结果表明，siRNA在小鼠体内的代谢过程中是稳定的。
Figure ISA00000230030700011
Figure ISA00000230030700021
Figure ISA00000230030700031
Figure ISA00000230030700041
Figure ISA00000230030700051
Figure ISA00000230030700061
Figure ISA00000230030700101
Figure ISA00000230030700111
Figure ISA00000230030700121
Figure ISA00000230030700131
Figure ISA00000230030700141
Figure ISA00000230030700151

Claims (14)

1.分离的双链RNA分子，其序列特征符合以下条件中的至少一种：
1)其中UA/UA序列的含量不大于10％；
2)其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％；
3)其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％，且其中UA/UA序列的含量不大于10％。
2.如权利要求1所述的双链RNA分子，其特征在于，所述的序列全部由未修饰的核苷酸组成。
3.如权利要求1-2任一项所述的双链RNA分子，其特征在于，其中双链RNA部分的长度为8-50个核苷酸。
4.如权利要求1-2任一项所述的双链RNA分子，其特征在于，其中双链RNA部分的长度为14-27个核苷酸，其中至少一条链具有1-5个核苷酸的3’-突出端，该RNA分子能够靶特异性RNA干涉。
5.如权利要求1-4任一项所述的双链RNA分子，其特征在于，所述双链RNA分子在哺乳动物体液中稳定存在的时间大于10分钟，优选的大于30分钟，更优选的大于1小时，最优选的大于6小时。
6.如权利要求1-4任一项所述的双链RNA分子，其特征在于，所述双链RNA分子与哺乳动物体液接触后，70％以上的RNA保持完整的双链结构，优选的90％以上的RNA保持完整的双链结构。
7.如权利要求5、6任一项所述的哺乳动物选自大鼠、小鼠、兔、狗、猴或者人。
8.如权利要求5、6任一项所述的哺乳动物体液选自血液、血浆、血清、组织液、脑脊液、唾液或者分泌物。
9.一种获得权利要求1-8任一项所述双链RNA分子的方法，其特征在于，该方法包含以下步骤；
(1)从目标基因转录本序列中选择一个或多个18-30个核苷酸长度的核酸片段作为双链RNA分子的一条链，使双链RNA分子的另一条链与其互补，所述双链RNA分子的序列符合以下条件中的至少一种；
1)其中UA/UA序列的含量不大于10％；
2)其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％；
3)其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20％，且其中UA/UA序列的含量不大于10％；
(2)制备上述双链RNA分子；
(3)将制备的双链RNA分子与含有10％以上哺乳动物体液的溶液接触10分钟以上，其中RNA的双链结构的完整性在70％以上的双链RNA为哺乳动物体液稳定的双链RNA。
10.一种在细胞中抑制目标基因表达的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤；
(1)将权利要求1-8任一项所述的双链RNA分子中的至少一种导入细胞；
(2)培养细胞直至目标基因的表达被抑制。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的细胞为哺乳动物细胞。
12.一种在哺乳动物中抑制基因表达的药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含权利要求1-8任一项所述的双链RNA分子中的至少一种，以及药学上可接受的载体。
13.一种制备权利要求12所述的药物组合物的方法，其特征在于，将权利要求1-8所述的双链RNA分子中的至少一种与药学上可接受的载体混合。
14.权利要求1-8任一项所述的双链RNA分子中的至少一种在制备RNA干涉药物以及免疫佐剂中的应用。
CN201010253909XA 2010-03-29 2010-08-16 具有哺乳动物体液稳定性的双链rna分子及其制备和应用 Pending CN102206642A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010253909XA CN102206642A (zh) 2010-03-29 2010-08-16 具有哺乳动物体液稳定性的双链rna分子及其制备和应用

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010134253.X 2010-03-29
CN201010134253 2010-03-29
CN201010253909XA CN102206642A (zh) 2010-03-29 2010-08-16 具有哺乳动物体液稳定性的双链rna分子及其制备和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102206642A true CN102206642A (zh) 2011-10-05

Family

ID=44695705

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201010253909XA Pending CN102206642A (zh) 2010-03-29 2010-08-16 具有哺乳动物体液稳定性的双链rna分子及其制备和应用
CN201110001593XA Pending CN102206702A (zh) 2010-03-29 2011-01-06 miR-122作为肝脏疾病血清标志物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110001593XA Pending CN102206702A (zh) 2010-03-29 2011-01-06 miR-122作为肝脏疾病血清标志物

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8846895B2 (zh)
CN (2) CN102206642A (zh)
WO (1) WO2011120332A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103160585A (zh) * 2013-04-01 2013-06-19 哈尔滨体育学院 一种优秀越野滑雪运动员体能相关基因的筛选方法
CN105755138A (zh) * 2016-04-15 2016-07-13 浙江省医学科学院 一种检测大鼠印记miRNA-675表达水平的引物
CN107860751A (zh) * 2016-11-24 2018-03-30 南华大学 血清miRNA‑4463作为肝细胞癌的诊断标志物的应用
CN106480229A (zh) * 2017-01-03 2017-03-08 成都仕康美生物科技有限公司 一种miRNA‑122检测试剂盒及应用
CN107015261A (zh) * 2017-04-13 2017-08-04 南方医科大学 一种6.5Gy电离辐射的检测方法
US11339440B2 (en) * 2018-09-20 2022-05-24 Tamirna Gmbh Micro-RNA signatures for the prediction of liver dysfunction
CN110018302A (zh) * 2019-03-27 2019-07-16 南京大学 一种新的由肝脏疾病引起肺部炎症的诊断和治疗试剂
CN112795636A (zh) * 2021-01-07 2021-05-14 成都医学院 检测肝脏组织中的miR-122的试剂在制备肝硬化筛查试剂盒中的用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1663957A (zh) * 2004-11-05 2005-09-07 浙江大学 针对中期因子基因的小干扰核糖核酸分子及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101370818A (zh) * 2005-11-01 2009-02-18 阿尔尼拉姆医药品有限公司 RNAi抑制流感病毒的复制

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1663957A (zh) * 2004-11-05 2005-09-07 浙江大学 针对中期因子基因的小干扰核糖核酸分子及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAEDDIN TAFECH ET AL: "Identification of c-myc coding region determinant RNA sequences and structures cleaved by an RNase1-like endoribonuclease", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *
ANTON A. VOLKOV ET AL: "Selective Protection of Nuclease-Sensitive Sites in siRNA Prolongs Silencing Effect", 《OLIGONUCLEOTIDES》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20130065940A1 (en) 2013-03-14
CN102206702A (zh) 2011-10-05
WO2011120332A1 (zh) 2011-10-06
US8846895B2 (en) 2014-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10927376B2 (en) Compositions of asymmetric interfering RNA and uses thereof
CN102206642A (zh) 具有哺乳动物体液稳定性的双链rna分子及其制备和应用
JP6295232B2 (ja) 修飾を有するｄｓＲＮＡによる遺伝子発現の特異的な阻害のための組成物および方法
CN102575254B (zh) 利用不对称双链rna特异性抑制kras的方法和组合物
JP2020188771A (ja) 二本鎖ＲＮＡによるα−１アンチトリプシンの特異的阻害のための方法及び組成物
JP2014097072A5 (zh)
CN105907756A (zh) 延长的dicer酶底物和特异性抑制基因表达的方法
KR20150006477A (ko) 단일-뉴클레오타이드 ｋｒａｓ 돌연변이에 특이적인 이-기능성 짧은-헤어핀 ｒｎａ (ｂｉ-ｓｈｒｎａ)
WO2010093788A2 (en) Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
Xie et al. Silencing of the human TERT gene by RNAi inhibits A549 lung adenocarcinoma cell growth in vitro and in vivo
Fiedler et al. MicroRNA‐based therapeutic approaches in the cardiovascular system
JP7050277B2 (ja) Ｒｎａ分子
Hagopian et al. Induction of RNAi responses by short left-handed hairpin RNAi triggers
JP6191980B2 (ja) ＲＮＡｉ分子活性抑制用核酸の阻害剤
KR20230159804A (ko) DICER에 의한 dsRNA 가공의 서열 결정 인자
Roos Design and characterization of new classes of antagonists targeting the Lin28/let-7 interaction

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20111005