JP7050277B2 - Rna分子 - Google Patents
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Description
[ガイド鎖]
本発明の一実施態様は、RNA干渉法においてガイド鎖として用いるためのRNA分子であって、ターゲット遺伝子と相補的な配列の5’末端側から数えて少なくとも2番目から6番目のヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位が、-OCH3で置換されている。
パッセンジャー鎖も、周知技術に従って容易に設計し、容易に製造することができる。以下に、設計の一例を示す。
本発明の一実施態様は、ターゲット遺伝子に対するRNA干渉法であって、上述したRNA分子を製造する工程と、生理的条件でそのRNA分子と2重鎖を形成するパッセンジャー鎖と、そのRNA分子とで2重鎖を形成する工程と、2重鎖を用いてRNA干渉法を行う工程と、を含む。2重鎖を用いたRNA干渉法は、周知技術に従って容易に行うことができる。例えば、ターゲット遺伝子を発現している培養細胞、またはヒトまたはヒト以外の生物個体に対して、RNA分子とパッセンジャー鎖で構成された2重鎖を導入することで、ターゲット遺伝子の発現を低下させることができる。
本発明の一実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのRNA干渉法においてガイド鎖として用いるためのRNA分子の選択方法であって、複数の上述したRNA分子を用いて、in vitroでRNA干渉法を行うことによって、複数のRNA分子のターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるRNA分子を選択する工程と、を含む方法である。このようにしてRNA分子を選択することによって、RNA干渉法において特に効率よくターゲット遺伝子を抑制するガイド鎖を得ることができる。
一方、遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、上記ガイド鎖と同じ塩基配列を有するDNA
5′-CGCCATCAACACCGAGTTCAAGA-3′(配列番号1)
及びオフターゲット効果を調べるためのレポーターとして、ターゲット遺伝子に相補的な配列の5’末端側から数えて2番目から8番目のリボヌクレオチド以外は、上記ガイド鎖とは異なる塩基配列を有するDNA
5′-AATGATGCACCAGGAGAGTTCAA-3′(配列番号2)
を、それぞれ1コピー(図2左)または3コピー(図2右)を発現ベクター(psiCHECK)のルシフェラーゼ遺伝子の3’-UTRに挿入した。なお、上記ガイド鎖の配列番号1に対するIC50は、上記ガイド鎖が修飾のないRNAで構成されている場合、156pMである。
Claims (16)
- RNA干渉法においてガイド鎖として用いるためのRNA分子であって、
ターゲット遺伝子と相補的な配列の5’末端側から数えて少なくとも2番目から6番目の5個のヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位が-OCH3で置換されており、
ターゲット遺伝子と相補的な配列の5’末端側から数えて1番目のヌクレオチドの五炭糖の2’位が-OCH3で置換されていない、RNA分子。 - ターゲット遺伝子と相補的な配列の5’末端側から数えて2番目から10番目のヌクレオチドの五炭糖の2’位が-OCH3で置換されている、請求項1に記載のRNA分子。
- 前記RNA分子が、5’末端にパッセンジャー鎖と相補しない2ヌクレオチドを有する、請求項1または2に記載のRNA分子。
- 前記RNA分子が、8個から28個のヌクレオチドからなる、請求項1~3のいずれか1項に記載のRNA分子。
- 前記相補的な配列がターゲット遺伝子と90%以上の相補性を有する、請求項1~4のいずれか1項に記載のRNA分子。
- 全てのヌクレオチドが修飾のないRNAである場合の、ターゲット遺伝子に対するIC50が1nM以下である、請求項1~5のいずれか1項に記載のRNA分子。
- RNA干渉法においてガイド鎖として用いるためのRNA分子の製造方法であって、
請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子を化学合成により製造する工程を含む方法。 - ターゲット遺伝子に対するRNA干渉法であって、
請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子を化学合成により製造する工程と、
生理的条件で前記RNA分子と2重鎖を形成するパッセンジャー鎖と前記RNA分子とで2重鎖を形成する工程と、
前記2重鎖を用いてRNA干渉法を行う工程と、
を含む、RNA干渉法(ヒト生体内で行う場合を除く)。 - RNA干渉によってターゲット遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法であって、
細胞(ヒト生体内の細胞を除く)に、請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子を投与する工程を含む、方法。 - オフターゲットに対する遺伝子発現抑制能を調べる方法であって、
ターゲット遺伝子と相補的な配列の5’末端側から数えて少なくとも2番目から6番目の5個のヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位が-OCH3で置換されているRNA分子をガイド鎖として化学合成により製造する工程と、
生理的条件で前記RNA分子と2重鎖を形成するパッセンジャー鎖と前記RNA分子とで2重鎖を形成する工程と、
前記2重鎖を用いてin vitroでRNA干渉法を行うことによって、前記2重鎖の前記ターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、
前記2重鎖を用いて、オフターゲットに対する遺伝子発現抑制能を調べる工程と、
を含む、方法。 - 前記RNA分子は、ターゲット遺伝子と相補的な配列の5’末端側から数えて2番目から10番目のヌクレオチドの五炭糖の2’位が-OCH3で置換されている、請求項10に記載の方法。
- 前記RNA分子は、ターゲット遺伝子と相補的な配列の5’末端側から数えて1番目のヌクレオチドの五炭糖の2’位が-OCH3で置換されていない、請求項10または11に記載の方法。
- 前記RNA分子が、5’末端にパッセンジャー鎖と相補しない2ヌクレオチドを有する、請求項10~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNA分子が、8個から28個のヌクレオチドからなる、請求項10~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNA分子は、前記相補的な配列がターゲット遺伝子と90%以上の相補性を有する、請求項10~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNA分子が全てのヌクレオチドが修飾のないRNAである場合の、ターゲット遺伝子に対するIC50が1nM以下である、請求項10~15のいずれか1項に記載の方法。
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Frank Czauderna et al.,Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells,Nucleic Acids Research,2003年,Vol.31、No.11,2705-2716 |
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