JP7497061B2 - Rna分子、キメラ型na分子、二本鎖rna分子、および二本鎖キメラ型na分子 - Google Patents
Rna分子、キメラ型na分子、二本鎖rna分子、および二本鎖キメラ型na分子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7497061B2 JP7497061B2 JP2021533105A JP2021533105A JP7497061B2 JP 7497061 B2 JP7497061 B2 JP 7497061B2 JP 2021533105 A JP2021533105 A JP 2021533105A JP 2021533105 A JP2021533105 A JP 2021533105A JP 7497061 B2 JP7497061 B2 JP 7497061B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- allele
- gene
- double
- rna molecule
- mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 title claims description 202
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 title claims description 56
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 453
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 126
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 117
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 67
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 49
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 claims description 47
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 42
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 36
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 36
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 36
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 32
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 claims description 31
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 30
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 30
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 30
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 125000001805 pentosyl group Chemical group 0.000 claims description 26
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 15
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 15
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 11
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 claims description 3
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 claims description 3
- 102200006531 rs121913529 Human genes 0.000 claims 1
- 102200006537 rs121913529 Human genes 0.000 claims 1
- 102200006539 rs121913529 Human genes 0.000 claims 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 117
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 24
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 24
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 20
- 102200124919 rs121913237 Human genes 0.000 description 18
- 101150053046 MYD88 gene Proteins 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 101150008921 Brca2 gene Proteins 0.000 description 14
- 108700001666 APC Genes Proteins 0.000 description 10
- 101150005295 GATA2 gene Proteins 0.000 description 10
- 101150041031 Gnaq gene Proteins 0.000 description 10
- 101150073900 PTEN gene Proteins 0.000 description 10
- 101150040067 STK11 gene Proteins 0.000 description 10
- 101150046722 idh1 gene Proteins 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 102220011004 rs121913237 Human genes 0.000 description 9
- 102220085771 rs121913237 Human genes 0.000 description 9
- 108700010154 BRCA2 Genes Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 102200124924 rs11554290 Human genes 0.000 description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 7
- 102100032543 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase PTEN Human genes 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 6
- 102000052609 BRCA2 Human genes 0.000 description 6
- 108700020462 BRCA2 Proteins 0.000 description 6
- 101001042041 Bos taurus Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial Proteins 0.000 description 6
- 102100031785 Endothelial transcription factor GATA-2 Human genes 0.000 description 6
- 102100025334 Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha Human genes 0.000 description 6
- 101001066265 Homo sapiens Endothelial transcription factor GATA-2 Proteins 0.000 description 6
- 101000857888 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha Proteins 0.000 description 6
- 101000960234 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 6
- 101000628562 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase STK11 Proteins 0.000 description 6
- 102100039905 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Human genes 0.000 description 6
- 102100024134 Myeloid differentiation primary response protein MyD88 Human genes 0.000 description 6
- 102100026715 Serine/threonine-protein kinase STK11 Human genes 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 208000008770 Multiple Hamartoma Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000002847 Cowden syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000006107 Familial adenomatous polyposis Diseases 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000029664 classic familial adenomatous polyposis Diseases 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 201000007815 Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000012609 Cowden disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003718 Dual-Luciferase Reporter Assay System Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000259 GATA2 Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 101150050733 Gnas gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002927 Hamartoma Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000022010 Lhermitte-Duclos disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000035490 Megakaryoblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010071972 N-ras gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000007531 Proteus syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010042265 Sturge-Weber Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005969 Uveal melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 208000013593 acute megakaryoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000020700 acute megakaryocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 201000006823 malignant adenoma Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
Description
[1-1] 本発明の一実施態様は、遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするRNA干渉法において用いるためのRNA分子であって、以下の要件を満たすRNA分子である:
(1)下記(2-1)で規定した塩基を除いて前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有すること;
(2)前記変異型アレルと相補的な塩基配列の最も5’側の塩基から数えて
(2-1)5番目または6番目の塩基が前記変異型アレルの塩基に対してミスマッチであること;
(2-2)10番目または11番目は前記点突然変異の位置に対応し、10番目または11番目の塩基は前記変異型アレルが有する塩基に対応すること;及び
(2-3)6-8番目または7-8番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位がOCH3、ハロゲン、またはLNAで修飾されていること。前記ハロゲンがFであってもよい。上記(1)で規定された塩基配列の5’末端の塩基がアデニンまたはウラシルでない場合、アデニンまたはウラシルに置換してもよい。上記(1)で規定された塩基配列の3’ 末端の塩基がシトシンまたはグアニンでない場合、シトシンまたはグアニンに置換してもよい。上記いずれのRNA分子も、13~28個のヌクレオチドからなっていてもよい。上記いずれのRNA分子も、1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型NA分子であってもよい。
[2-1] 本発明のさらなる実施態様は、[1-1]に記載のいずれかのRNA分子において、前記遺伝子がK-ras遺伝子であって、前記野生型アレルがK-ras(wt)アレルであって、前記変異アレルがK-ras(c.35G>A)アレル、K-ras(c.35G>T)アレル、またはK-ras(c.35G>C)アレルである。前記(2-1)で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
5’-UCCUACGCCAUCAGCUCCA-3’ (配列番号1)
5’-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3’ (配列番号2)
5’-UCCUACGCCAGCAGCUCCA-3’ (配列番号3)
のいずれかを有してもよい。また、前記RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
5’-UCCUACGCCAUCAGCUCCA-3’ (配列番号1)
5’-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3’ (配列番号2)
5’-UCCUACGCCAGCAGCUCCA-3’ (配列番号3)
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
5’-UCCUACGCCAUCAGCUCCA-3’ (配列番号1)
5’-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3’ (配列番号2)
5’-UCCUACGCCAGCAGCUCCA-3’ (配列番号3)
のいずれかを有してもよい。また、前記RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
5’-UCCUACGCCAUCAGCUCCA-3’ (配列番号1)
5’-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3’ (配列番号2)
5’-UCCUACGCCAGCAGCUCCA-3’ (配列番号3)
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
5’-UCCUACGCCAUCAGCUCCA-3’ (配列番号1)
5’-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3’ (配列番号2)
5’-UCCUACGCCAGCAGCUCCA-3’ (配列番号3)
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
[3-1] 本発明のさらなる実施態様は、[1-1]に記載のいずれかのRNA分子において、前記遺伝子がN-ras遺伝子であって、前記野生型アレルがN-ras(wt)アレルであって、前記変異アレルがN-ras(c.35G>A)またはN-ras(c.182A>G)アレルである。前記(2-1)で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
5’-CCCAACACCACCUGCUCCA-3’(配列番号146)
5’-GUACUCUUCUUGUCCAGCU-3’(配列番号147)
のいずれかを有してもよい。また、前記RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
5’-CCCAACACCACCUGCUCCA-3’(配列番号146)
5’-GUACUCUUCUUGUCCAGCU-3’(配列番号147)
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
5’-CCCAACACCACCUGCUCCA-3’(配列番号146)
5’-GUACUCUUCUUGUCCAGCU-3’(配列番号147)
のいずれかを有してもよい。また、前記RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
5’-CCCAACACCACCUGCUCCA-3’(配列番号146)
5’-GUACUCUUCUUGUCCAGCU-3’(配列番号147)
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
5’-CCCAACACCACCUGCUCCA-3’(配列番号146)
5’-GUACUCUUCUUGUCCAGCU-3’(配列番号147)
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
[4-1] 本発明のさらなる実施態様は、[1-1]に記載のいずれかのRNA分子において、前記遺伝子がBRCA2遺伝子であって、前記野生型アレルがBRCA2(wt)であって、前記変異アレルがA1114C変異型アレルであるか;上記いずれかのRNA分子において、前記遺伝子がSTK11遺伝子であって、前記野生型アレルがSTK11(wt)であって、前記変異アレルがC1062G変異型アレルであるか;上記いずれかのRNA分子において、前記遺伝子がPTEN遺伝子であって、前記野生型アレルがPTEN(wt)であって、前記変異アレルがC388G変異型アレルであるか;上記いずれかのRNA分子において、前記遺伝子がAPC遺伝子であって、前記野生型アレルがAPC(wt)であって、前記変異アレルがC4348T変異型アレルであるか;上記いずれかのRNA分子において、前記遺伝子がGATA2遺伝子であって、前記野生型アレルがGATA2(wt)であって、前記変異アレルがC953T変異型アレルであるか;上記いずれかのRNA分子において、前記遺伝子がMYD88遺伝子であって、前記野生型アレルがMYD88(wt)であって、前記変異アレルがT818C変異型アレルであるか;上記いずれかのRNA分子において、前記遺伝子がGNAQ遺伝子であって、前記野生型アレルがGNAQ(wt)であって、前記変異アレルがA626T変異型アレルであるか;または、上記いずれかのRNA分子において、前記遺伝子がIDH1遺伝子であって、前記野生型アレルがIDH1(wt)であって、前記変異アレルがG395A変異型アレルである。
前記ガイド鎖において、前記(2-1)で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
5’-GGCUUCUGAUUUGCUACAU-3’(配列番号148)
5’-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3’(配列番号149)
5’-ACACCAGUUCGUCCCUUUC-3’(配列番号150)
5’-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3’(配列番号151)
5’-GAGGCCACAGGCAUUGCAC-3’(配列番号152)
5’-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3’(配列番号153)
5’-CUCUGACCUUUGGCCCCCU-3’(配列番号154)および
5’-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3’(配列番号155)
を有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
前記ガイド鎖において、前記(2-1)で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
5’-GGCUUCUGAUUUGCUACAU-3’(配列番号148)
5’-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3’(配列番号149)
5’-ACACCAGUUCGUCCCUUUC-3’(配列番号150)
5’-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3’(配列番号151)
5’-GAGGCCACAGGCAUUGCAC-3’(配列番号152)
5’-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3’(配列番号153)
5’-CUCUGACCUUUGGCCCCCU-3’(配列番号154)および
5’-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3’(配列番号155)
を有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
前記ガイド鎖において、前記(2-1)で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
5’-GGCUUCUGAUUUGCUACAU-3’(配列番号148)
5’-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3’(配列番号149)
5’-ACACCAGUUCGUCCCUUUC-3’(配列番号150)
5’-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3’(配列番号151)
5’-GAGGCCACAGGCAUUGCAC-3’(配列番号152)
5’-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3’(配列番号153)
5’-CUCUGACCUUUGGCCCCCU-3’(配列番号154)および
5’-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3’(配列番号155)
を有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
前記ガイド鎖において、前記(2-1)で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
5’-GGCUUCUGAUUUGCUACAU-3’(配列番号148)
5’-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3’(配列番号149)
5’-ACACCAGUUCGUCCCUUUC-3’(配列番号150)
5’-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3’(配列番号151)
5’-GAGGCCACAGGCAUUGCAC-3’(配列番号152)
5’-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3’(配列番号153)
5’-CUCUGACCUUUGGCCCCCU-3’(配列番号154)および
5’-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3’(配列番号155)
を有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
前記ガイド鎖において、前記(2-1)で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
5’-GGCUUCUGAUUUGCUACAU-3’(配列番号148)
5’-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3’(配列番号149)
5’-ACACCAGUUCGUCCCUUUC-3’(配列番号150)
5’-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3’(配列番号151)
5’-GAGGCCACAGGCAUUGCAC-3’(配列番号152)
5’-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3’(配列番号153)
5’-CUCUGACCUUUGGCCCCCU-3’(配列番号154)および
5’-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3’(配列番号155)
を有してもよい。また、前記二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
==関連文献とのクロスリファレンス==
本出願は、2019年7月16日付で出願した日本国特許出願2019-130966に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施態様は、遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするRNA干渉法において用いるためのRNA分子である。対象となる遺伝子は、本開示のRNA分子を設計できるものであれば、特に限定されないが、点突然変異によって正常細胞ががん化するがん遺伝子であることが好ましい。RNA分子を構成するヌクレオチドの個数は特に限定されないが、13個以上100個以下でもよく、13個以上50個以下でもよく、13個以上28個以下でもよく、15個以上25個以下でもよく、17個以上21個以下でもよいが、19個以上21個以下であることがさらに好ましい。また、1個または複数個(2個以上18個以下であってもよく、2個以上15個以下であってもよく、2個以上12個以下であってもよく、2個以上9個以下であってもよく、2個以上6個以下であってもよく、2個以上3個以下であってもよい。)のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、またはイノシンやモルフォリノなどの核酸類縁体に置換されていてもよい。本明細書では、このようなRNA分子を、キメラ型NA分子と呼ぶが、本開示では、RNA分子はキメラ型NA分子を含めて説明されるものとする。
本発明の一実施態様は、前述のRNA分子(以下、第1のRNA分子と称する)がガイド鎖であって、第1のRNA分子に相補的な配列を有する第2のRNA分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖RNA分子である。第2のRNA分子は、第1のRNA分子に相補的な配列を有し、生理的条件で第1のRNA分子と2重鎖を形成するが、90%以上の相補性を有することが好ましく、95%以上の相補性を有することがより好ましく、98%以上の相補性を有することがさらに好ましく、100%の相補性を有することが最も好ましい。
本発明の一実施態様は、目的の遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、変異型アレルをターゲット遺伝子とするRNA干渉法である。このRNA干渉法は、キメラ型NA分子を含む第1のRNA分子、または二本鎖キメラ型NA分子を含む上述の二本鎖RNA分子を、野生型アレルと変異型アレルを有する細胞に導入する工程を含む。
本開示のsiRNAが治療薬として用いられるとき、その対象となる疾患は特に限定されないが、本発明の一実施態様は、腫瘍遺伝子(がん原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん抑制遺伝子などとも呼ばれることがある)の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、上述のキメラ型NA分子を含むRNA分子、または二本鎖キメラ型NA分子を含む二本鎖RNA分子を有効成分とする。
==治療薬の対象となる疾患==
==選択方法==
本発明の一実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのRNA干渉法において用いるためのRNA分子、キメラ型NA分子、二本鎖RNA分子または二本鎖キメラ型NA分子の選択方法であって、複数の上述のRNA分子、キメラ型NA分子、二本鎖RNA分子または二本鎖キメラ型NA分子を用いて、RNA干渉法をin vitroで行うことによって、特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるRNA分子、キメラ型NA分子、二本鎖RNA分子または二本鎖キメラ型NA分子を選択する工程と、を含む。
(方法)
10%FBS含有DMEMで培養したHeLa細胞を、1x105個/mLの密度で24ウエルプレートに播種し、100ngの各レポーター及び100ngの内部標準用プラスミド(pGL3)と二重鎖siRNAとを、2μLのlipofectamine2000とともにコトランスフェクトした。二重鎖siRNAの濃度は、各図に示した。なお、コントロールのsiRNAとしてはsiGY441を導入した。24時間後に細胞を回収し、dual-luciferase reporter assay system(Promega社)を用いて、firefly luciferase及びRenilla luciferaseの活性を測定し、firefly luciferaseの測定値を用いて、Renilla luciferaseの測定値を標準化した。また、二重鎖siRNAで得られた測定値は、siGY441で得られた測定値を100%として、グラフに表した。
[実施例1A]
本実施例では、siRNAの10番目または11番目をA変異型K-ras(c.35G>A)アレル(cDNA(GENE ID:3845)において、35番目の塩基がGからAに変異)(以下、A変異型アレルと称する)の点突然変異の位置に対応させることで、野生型K-rasアレル(以下、野生型アレルと称する)に比較してA変異型K-ras(c.35G>A)アレルに対するRNA分子の発現抑制能の特異性が向上することを示す。
K(35)9Aは、A変異型アレル、野生型アレルの両方に対して、強い発現抑制効果を有していた。K(35)10A及びK(35)11Aは、発現抑制効果が少し弱くなったものの、野生型アレルよりA変異型アレルの方の発現を強く抑制している。
本実施例では、siRNAの11番目をA変異型アレルの点突然変異の位置に対応させた上で、siRNAのガイド鎖の5’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の5’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換したsiRNAを用いることで、A変異型アレルに対するRNA分子の発現抑制能が強くなり、その特異性がさらに向上することを示す。
K(35)11Aは、野生型アレルよりA変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、K(35)11Arevは、両方に対して発現抑制効果が強くなり、野生型アレルよりA変異型アレルの方の発現をさらに強く抑制している。
本実施例では、siRNAの11番目をA変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、siRNAのガイド鎖の5’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の5’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、siRNAのガイド鎖の6番目から8番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位をOCH3に置換することで、A変異型アレルに対するRNA分子の発現抑制能が強くなり、その特異性がさらに向上することを示す。
K(35)11Arevは、野生型アレルよりA変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、K(35)11ArevOM(6-8)は、両方に対して発現抑制効果が強くなり、野生型アレルよりA変異型アレルの方の発現を強く抑制している。もう一つのコントロールであるK(35)11ArevOM(2-5)(ガイド鎖の2番目から5番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位がOCH3に置換されている)は、両方に対する発現抑制効果がかなり弱くなった。
本実施例では、siRNAの11番目をA変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、siRNAのガイド鎖の5’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の5’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、siRNAのガイド鎖の5番目または6番目の塩基をA変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型アレルに対するRNA分子の発現抑制能が弱くなり、その結果、A変異型アレルに対する特異性がさらに向上することを示す。
K(35)11Arevは、野生型アレルよりA変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、K(35)11ArevM5及びK(35)11ArevM6は、野生型アレルに対するRNA分子の発現抑制能が非常に弱くなり、その結果、A変異型アレルに対する特異性がさらに向上した。
本実施例では、siRNAの11番目をA変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、siRNAのガイド鎖の5’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の5’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、siRNAのガイド鎖の6番目から8番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位をOCH3に置換siRNAのガイド鎖の6番目から8番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位をOCH3に置換し、かつsiRNAのガイド鎖の5番目または6番目の塩基をA変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせると、A変異型アレルに対する特異性がさらに向上することを示す。
K(35)11ArevOM(6-8)M5及びK(35)11ArevOM(6-8)M6は、野生型アレルに対するRNA分子の発現抑制能が非常に弱くなり、その結果、A変異型アレルに対する特異性がさらに向上した。
本実施例では、A変異型アレル特異的なsiRNAは、野生型アレルだけでなく、T変異型K-ras(c.35G>T)アレル(cDNAにおいて、35番目の塩基がGからTに変異)及びC変異型K-ras(c.35G>C)アレル(cDNAにおいて、35番目の塩基がGからCに変異)に対する発現抑制能が低いことを示す。
いずれのsiRNAも、A変異型Kレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にK(35)11ArevOM(6-8)M5及びK(35)11ArevOM(6-8)M6は、T変異型Kレポーター及びC変異型Kレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
本実施例では、T変異型アレル特異的なsiRNAは、野生型アレルだけでなく、A変異型アレル及びC変異型アレルに対する発現抑制能が低いことを示す。
いずれのsiRNAも、T変異型Kレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にK(35)11TrevOM(6-8)M5及びK(35)11TrevOM(6-8)M6は、T変異型Kレポーター及びC変異型Kレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
本実施例では、C変異型アレル特異的なsiRNAが、野生型アレルだけでなく、A変異型アレル及びT変異型アレルの発現抑制能は低いことを示す。
いずれのsiRNAも、C変異型Kレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にK(35)11CrevOM(6-8)M5及びK(35)11CrevOM(6-8)M6は、A変異型Kレポーター及びT変異型Kレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
[実施例1B]
本実施例では、N-ras遺伝子のcDNA35番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、siRNAの11番目をA変異型N-ras(c.35G>A)アレル(以下、A変異型N35アレルと称する)の点突然変異の位置に対応させ、siRNAのガイド鎖の5’末端の塩基をシトシンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の5’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の6番目から8番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位をOCH3に置換し、かつsiRNAのガイド鎖の5番目の塩基をA変異型N35アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型N-ras(wt)アレル(以下、野生型Nアレルと称する)の発現より、A変異型N35アレルの発現をより特異的に抑制することを示す。
N(35)11Gは、A変異型N35アレルの発現より野生型Nアレルの発現を効果的に抑制し、N(35)11Aは、それとは逆に、野生型Nアレルの発現よりA変異型N35アレルの発現を効果的に抑制した。N(35)11ArevOM(6-8)M5は、野生型アレルの発現抑制能が非常に弱くなり、A変異型N35アレルの発現抑制能が強くなった結果、A変異型N35アレルに対する特異性が向上した。
本実施例では、N-ras遺伝子のcDNA182番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、siRNAの11番目をA変異型N-ras(c.182A>G)アレル(以下、G変異型N182アレルと称する)の点突然変異の位置に対応させ、siRNAのガイド鎖の5’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の5’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の6番目から8番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位をOCH3に置換し、かつsiRNAのガイド鎖の5番目の塩基をG変異型N182アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型N-ras(wt)アレル(以下、野生型Nアレルと称する)の発現より、G変異型N182アレルの発現をより特異的に抑制することを示す。
本実施例では、BRCA2遺伝子の野生型アレルとA1114C変異型アレル(cDNA(GENE ID:675)において、1114番目の塩基がAからCに変異)、STK11遺伝子の野生型アレルとC1062G変異型アレル(cDNA(GENE ID:6794)において、1062番目の塩基がCからGに変異)、PTEN遺伝子の野生型アレルとC388G変異型アレル(cDNA(GENE ID:5728)において、388番目の塩基がCからGに変異)、APC遺伝子の野生型アレルとC4348T変異型アレル(cDNA(GENE ID:324)において、4348番目の塩基がCからTに変異)、GATA2遺伝子の野生型アレルとC953T変異型アレル(cDNA(GENE ID:2624)において、953番目の塩基がCからTに変異)、MYD88遺伝子の野生型アレルとT818C変異型アレル(cDNA(GENE ID:4615)において、818番目の塩基がTからCに変異)、GNAQ遺伝子の野生型アレルとA626T変異型アレル(cDNA(GENE ID:2776)において、626番目の塩基がAからTに変異)、IDH1遺伝子の野生型アレルとG395A変異型アレル(cDNA(GENE ID:3417)において、395番目の塩基がGからAに変異)の各ペアに対し、本開示の配列を有するsiRNAが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す。
このように、各siRNAは、内在性の遺伝子発現に対し、レポーターのような外因性の遺伝子発現と同様の特異性で発現抑制することができる。
ヌードマウス(BALB/cAJcl-Foxn1null)3匹の皮下に、1.0x106個のAsPC-1細胞を5-6箇所ずつ移植し、毎週2回、腫瘍の体積をノギスで測定することにより、腫瘍の増殖能を評価した。移植後10日目の腫瘍サイズは、移植3日目と比較して2倍程度に増加していたため、増殖フェーズに入っていると判断し、移植後11日目から1週間おきに5μgのsiRNA(siCont、siKRAS-WT、またはsiKRAS-A)とトランスフェクション試薬であるin vivo JET PEI(Polyplus Transfection社)の混合液を27Gのニードルを用い、各腫瘍に対して直接投与した。なお、1個体につき1種類のsiRNAのみを投与した。図13に結果をグラフにして示した。
siKRAS-Aを投与した群では、siContやsiKRAS-WTの投与群と比較し、移植後24日目以降、有意に腫瘍サイズが小さくなった。
このように、変異K-ras依存的に増殖する細胞において、siKRAS-Aはその増殖を抑制できる。
Claims (17)
- 遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするRNA干渉法において用いるためのRNA分子であって、以下の要件を満たすRNA分子である:
(1)下記(2-1)で規定した塩基を除いて前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有すること;
(2)前記変異型アレルと相補的な塩基配列の最も5’側の塩基から数えて
(2-1)5番目または6番目の塩基が前記変異型アレルの塩基に対してミスマッチであること;
(2-2)10番目または11番目は前記点突然変異の位置に対応し、10番目または11番目の塩基は前記変異型アレルが有する塩基に対応すること;及び
(2-3)6-8番目または7-8番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の2’位がOCH3、ハロゲン、またはLNAで修飾されていること。 - 前記ハロゲンがFである、請求項1に記載のRNA分子。
- 請求項1の(1)で規定された塩基配列の5’末端の塩基がシトシンまたはグアニンである場合、アデニンまたはウラシルに置換されている、請求項1または2に記載のRNA分子。
- 請求項1の(1)で規定された塩基配列の3’ 末端の塩基がアデニンまたはウラシルである場合、シトシンまたはグアニンに置換されている、請求項1~3のいずれか1項に記載のRNA分子。
- 13~28個のヌクレオチドからなる、請求項1~4のいずれか1項に記載のRNA分子。
- 請求項1の(1)で規定された塩基配列の3’ 末端に、さらに、1~3個のヌクレオチドを有する、請求項1~5のいずれか1項に記載のRNA分子。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型NA分子。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のRNA分子がガイド鎖であって、前記RNA分子に相補的な配列を有するRNA分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖RNA分子。
- ガイド鎖の3’末端及び/又はパッセンジャー鎖の3’末端にオーバーハング部位を有する、請求項8に記載の二本鎖RNA分子。
- 前記オーバーハング部位が1~3個のヌクレオチドからなる、請求項9に記載の二本鎖RNA分子。
- 請求項8~10のいずれか1項に記載の二本鎖RNA分子において1個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、二本鎖キメラ型NA分子。
- RNA干渉法においてガイド鎖として用いるためのRNA分子の製造方法であって、
請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子を製造する工程を含む、製造方法。 - RNA干渉法においてガイド鎖として用いるためのキメラ型NA分子の製造方法であって、
請求項7に記載のキメラ型NA分子を製造する工程を含む、製造方法。 - 遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、前記変異型アレルをターゲット遺伝子とするRNA干渉法であって、
請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子、請求項7に記載のキメラ型NA分子、請求項8~10のいずれか1項に記載の二本鎖RNA分子または請求項11に記載の二本鎖キメラ型NA分子を、前記細胞に導入する工程を含む、RNA干渉法。 - 腫瘍遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、前記点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、
請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子、請求項7に記載のキメラ型NA分子、請求項8~10のいずれか1項に記載の二本鎖RNA分子または請求項11に記載の二本鎖キメラ型NA分子を有効成分とする、治療薬。 - ターゲット遺伝子を抑制するためのRNA干渉法において用いるためのRNA分子、キメラ型NA分子、二本鎖RNA分子または二本鎖キメラ型NA分子の選択方法であって、
請求項11のRNA干渉法を、複数の請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子、請求項7に記載のキメラ型NA分子、請求項8~10のいずれか1項に記載の二本鎖RNA分子または請求項11に記載の二本鎖キメラ型NA分子のそれぞれを用いてin vitroで行うことによって、前記複数のRNA分子、キメラ型NA分子、二本鎖RNA分子または二本鎖キメラ型NA分子の前記ターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、
前記特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるRNA分子、キメラ型NA分子、二本鎖RNA分子または二本鎖キメラ型NA分子を選択する工程と、
を含む、RNA分子、キメラ型NA分子、二本鎖RNA分子または二本鎖キメラ型NA分子の選択方法。 - 前記遺伝子がK-ras遺伝子であって、前記野生型アレルがK-ras(wt)アレルであって、前記変異アレルがK-ras(c.35G>A)アレル、K-ras(c.35G>T)アレル、またはK-ras(c.35G>C)アレルである、請求項1~6のいずれか1項に記載のRNA分子。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019130966 | 2019-07-16 | ||
JP2019130966 | 2019-07-16 | ||
PCT/JP2020/027738 WO2021010449A1 (ja) | 2019-07-16 | 2020-07-16 | Rna分子、キメラ型na分子、二本鎖rna分子、および二本鎖キメラ型na分子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2021010449A1 JPWO2021010449A1 (ja) | 2021-01-21 |
JP7497061B2 true JP7497061B2 (ja) | 2024-06-10 |
Family
ID=74209878
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021533105A Active JP7497061B2 (ja) | 2019-07-16 | 2020-07-16 | Rna分子、キメラ型na分子、二本鎖rna分子、および二本鎖キメラ型na分子 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220411800A1 (ja) |
EP (1) | EP4000638A4 (ja) |
JP (1) | JP7497061B2 (ja) |
CN (1) | CN114402074B (ja) |
WO (1) | WO2021010449A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022154123A1 (ja) * | 2021-01-15 | 2022-07-21 | 国立大学法人 東京大学 | Rna分子、キメラ型na分子、二本鎖rna分子、および二本鎖キメラ型na分子 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010538677A (ja) | 2007-09-19 | 2010-12-16 | アプライド バイオシステムズ, エルエルシー | RNAiにおけるオフターゲット表現型の影響を減少させるためのSiRNA配列非依存性修飾フォーマットおよびその安定化型 |
JP2017502665A (ja) | 2013-12-17 | 2017-01-26 | インコドゥヂュン シーオー.,エルティーディー | オフターゲットを防ぐために変形したrna干渉誘導拡散およびその用途 |
WO2018098328A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Modified rna agents with reduced off-target effect |
JP2019088196A (ja) | 2017-11-10 | 2019-06-13 | 株式会社バイオシンクタンク | Rna分子 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2583692A4 (en) * | 2010-06-18 | 2014-11-26 | Lsip Llc | HEMMER OF THE EXPRESSION OF DOMINANT ALLELES |
-
2020
- 2020-07-16 CN CN202080064828.7A patent/CN114402074B/zh active Active
- 2020-07-16 US US17/626,867 patent/US20220411800A1/en active Pending
- 2020-07-16 EP EP20840283.4A patent/EP4000638A4/en active Pending
- 2020-07-16 JP JP2021533105A patent/JP7497061B2/ja active Active
- 2020-07-16 WO PCT/JP2020/027738 patent/WO2021010449A1/ja unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010538677A (ja) | 2007-09-19 | 2010-12-16 | アプライド バイオシステムズ, エルエルシー | RNAiにおけるオフターゲット表現型の影響を減少させるためのSiRNA配列非依存性修飾フォーマットおよびその安定化型 |
JP2017502665A (ja) | 2013-12-17 | 2017-01-26 | インコドゥヂュン シーオー.,エルティーディー | オフターゲットを防ぐために変形したrna干渉誘導拡散およびその用途 |
WO2018098328A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Modified rna agents with reduced off-target effect |
JP2019088196A (ja) | 2017-11-10 | 2019-06-13 | 株式会社バイオシンクタンク | Rna分子 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ACS Omega,2017年,Vol.2,pp.2055-2064 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021010449A1 (ja) | 2021-01-21 |
US20220411800A1 (en) | 2022-12-29 |
CN114402074A (zh) | 2022-04-26 |
EP4000638A1 (en) | 2022-05-25 |
EP4000638A4 (en) | 2023-12-27 |
CN114402074B (zh) | 2024-08-06 |
JPWO2021010449A1 (ja) | 2021-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1718747B1 (en) | Stabilized rnas as transfection controls and silencing reagents | |
US20200056177A1 (en) | Long non-coding rna used for anticancer therapy | |
JP4605799B2 (ja) | Rna干渉において使用するための修飾ポリヌクレオチド | |
US7763590B2 (en) | Compositions and methods for inhibiting expression of a mutant gene | |
US8980855B2 (en) | Minor groove binder (MGB)-oligonucleotide miRNA antagonists | |
AU2017320901A1 (en) | Chemically modified single-stranded RNA-editing oligonucleotides | |
JP2019518772A (ja) | 一本鎖rna編集オリゴヌクレオチド | |
PT1527176E (pt) | Novas formas de muléculas de arn de interferência | |
JP2007525169A5 (ja) | ||
KR20150006477A (ko) | 단일-뉴클레오타이드 kras 돌연변이에 특이적인 이-기능성 짧은-헤어핀 rna (bi-shrna) | |
JP7497061B2 (ja) | Rna分子、キメラ型na分子、二本鎖rna分子、および二本鎖キメラ型na分子 | |
US20090280567A1 (en) | Stabilized sirnas as transfection controls and silencing reagents | |
JP2022541212A (ja) | 治療的使用のための、ヒト遺伝子JAK1又はJAK3の発現を標的とするSiRNA配列 | |
WO2022154123A1 (ja) | Rna分子、キメラ型na分子、二本鎖rna分子、および二本鎖キメラ型na分子 | |
WO2022154122A1 (ja) | Rna分子、キメラ型na分子、二本鎖rna分子、および二本鎖キメラ型na分子 | |
US11306310B2 (en) | MicroRNA inhibitor | |
JP5468978B2 (ja) | Rna干渉において使用するための修飾ポリヌクレオチド | |
US20220251566A1 (en) | Cells engineered for oligonucleotide delivery, and methods for making and using thereof | |
JP2022062034A (ja) | Rna作用抑制剤及びその利用 | |
Gill | Selective targeting of MYC by antisense oligonucleotides | |
WO2015190606A1 (ja) | 二本鎖核酸分子、dna、ベクター、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞移動抑制剤、及び医薬 | |
CN107034216A (zh) | miRancer分子的设计与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221006 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230616 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240423 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240522 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7497061 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |