CN107860751A - 血清miRNA‑4463作为肝细胞癌的诊断标志物的应用 - Google Patents

血清miRNA‑4463作为肝细胞癌的诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公布了microRNA‑4463作为肝癌的诊断标志物的应用。本发明通过研究发现，肝癌患者血清中microRNA‑4463的表达水平明显高于正常人，同时对于甲胎蛋白低(AFP<400ug/l)肝癌患者血清中microRNA‑4463仍存在高表达，这对于低甲胎蛋白的肝癌诊断具有重要的作用。同时可以通过检测microRNA‑4463的表达水平来判断患者的预后。在此基础上，本公开发明了检测microRNA‑4463的方法，具有较好的开发前景和临床应用价值。

Description

血清miRNA-4463作为肝细胞癌的诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及血清microRNA(miRNA-4463)作为肝细胞癌的诊断标志物的应用，属于生物技术和医学领域。
背景技术
原发性肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其高居癌症相关死亡肿瘤的世界第三位。具有恶性程度高、转移率高、复发率高及生存率低的流行病学特点。严重危害人们生命健康，成为威胁人类公共卫生的巨大挑战。由于肝癌的早期临床表现隐匿和缺乏有效的早期诊断，大部分患者诊断时都为晚期肝癌，常伴有远处转移或肝内转移，其预后差，生存期短。因此早期发现和诊断对于及时采取有效的治疗手段，改善患者预后，延长生存期具有重要的意义。
甲胎蛋白(AFP)是目前使用最为广泛的诊断肝癌的肿瘤标志物，但是AFP仍存在诊断误区，例如部分肝癌患者的AFP呈阴性或轻度升高。并且在其他肝脏疾病例如肝炎、肝硬化中，AFP同样也会升高。
血清循环microRNA是一类单链，内源性非编码小分子RNA。研究表明miRNAs参与了疾病的发生发展、复发及转移。miRNA的表达紊乱是导致包括肝癌在内的一系列肿瘤形成的重要因素。miRNAs更早、更稳定的在体液或组织中表达，即使经过高温、极酸或极碱性条件下，血浆中miRNAs的含量变化不大，甚至是经过多次冻融循环，其同样能保持相对稳定。同时血清microRNA的检测方法具有无创性、非侵入性，不会增加患者的身体以及经济负担。
大量研究证实miRNAs对于包括肝癌在内的许多疾病的发生、发展、增殖及转移等多个生物学过程都起到了一定的作用。目前关于肝癌血清中循环microRNA的大量研究，也证明了其对于肝癌的诊断、转移以及预后的关系。
综上，血清microRNA是一种理想的肝癌诊断标志物。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种应用血清microRNA作为肝癌诊断标志物及预后判断的新方法。
本发明利用microRNA表达谱芯片技术，分别比较肝癌患者和正常人血清microRNA表达谱，筛选得到了表达水平具有明显差异的关键microRNA。在此基础上，利用Real-timePCR技术分别检测肝癌患者及正常人血清中关键microRNA的表达水平，随后采用SPSS 18.0软件(IBM,Chicago,IL)分析发现：肝癌患者血清中miRNA-4463的表达水平明显高于正常人。而且对于低甲胎蛋白型肝癌(AFP<400ug/l)，其miRNA-4463表达水平较正常人也明显升高。因此，miRNA-4463可以作为肝细胞癌的诊断标志物。同时对于低AFP的患者，检测miRNA-4463的表达水平，对于诊断肝癌具有更大的指导价值。
具体而言，本发明是通过以下技术方案实现的：
1.miRNA-4463作为肝细胞癌的诊断标志物或在制备肝癌诊断试剂中的用途，所述miRNA-4463的碱基序列为GAGACUGGGGUGGGGCC。
2.一种检测血清样本中miRNA-4463的表达水平的方法，该方法包括：
A、取血清样本，提取RNA；
B、以提取的RNA为模板，进行cDNA的合成；
C、使用特异性引物QIAGEN 218300-MS00044996、miR-39引物QIAGEN218300-MS00019789和上述cDNA，进行RT-PCR反应，获得待测血清标本中microRNA-4463的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；
D、根据公式(ΔCT＝CT miR-miRNA-4463–CT reference)，根据得到的CT值减去内参的CT值，得到该被检测者miRNA-4463的表达水平，
其中CT miR-miRNA-4463是指肝癌患者血清标本中microRNA-4463的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CT reference是指内参miR-39的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
3.根据第2项所述的方法，其中，使用QIAzol Lysis Reagent提取RNA，使用5xmiScript HISpec Buffer,10x miScript Nucleics Mix,RNase-free water和miScriptReverse Transcriptase Mix进行cDNA的合成，以及使用QuantiTect SYBR Green PCRmaster Mix,10x miScript Universal Primer,10x Has_miR-39miScript Primer Assay或Has_miR-miRNA-4463,miScript Primer Assay,RNase-free water和步骤B)合成的cDNA，进行RT-PCR反应。
4.根据第2或3项所述的方法，其包括进一步求出肝癌患者与正常人血清中miRNA-4463表达水平的差异2-ΔΔCT，其中，ΔΔCT＝ΔCT HCC-ΔCT normal，ΔΔCT是指肝癌患者的CT值与正常人CT值的比较值，ΔCT HCC代表肝癌患者的根据步骤(D)的公式求出的miRNA-4463的表达水平，ΔCT normal代表正常人的根据步骤(D)的公式求出的miRNA-4463的表达水平。
5.一种用于检测血清样本miRNA-4463的表达水平的试剂盒，其包括特异性引物QIAGEN 218300-MS00044996，内参为miR-39引物QIAGEN 218300-MS00019789)，QIAzolLysis Reagent、miScript II RT Kit、miRNeasy Serum/Placma Kit。
在具体应用时，检测待诊断患者的血清中miRNA-4463的表达水平，应用以下公式对miRNA-4463的相对表达量进行计算，来进行肝癌的诊断：
ΔCT＝CT miR-miRNA-4463–CT reference
CT值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。而阈值是由PCR仪自行设置。ΔCT的含义是指与特定内参miR-39比较，miRNA-4463到达设定阈值的循环数。
同时利用以下公式，可以得出肝癌患者较正常人miRNA-4463的表达水平的倍数情况。
2-ΔΔCT(ΔΔCT＝ΔCT HCC-ΔCT normal)
ΔΔCT是指肝癌患者的CT值与正常人CT值的比较。2-ΔΔCT即代表肝癌患者与正常人血清中miRNA-4463表达水平的差异。
本发明还提供了用于检测的特异性引物，其特异性引物为(QIAGEN，货号：218300-MS00044996)；该miRNA-4463的序列为5’GAGACUGGGGUGGGGCC；内参为miR-39引物(QIAGEN，货号：218300-MS00019789)，该miR-39序列为5’UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG。
本发明还提供了一种用于检测miRNA-4463的试剂盒，试剂盒由上述特异性扩增引物以及PCR扩增所需的试剂组成。包括了以下：QIAzol Lysis Reagent、miScript II RTKit、miRNeasy Serum/Placma Kit。
采用上述试剂盒检测miRNA-4463的具体方法为：
①RNA的提取：
⑴取上层血清标本200ul，加入5倍量的QIAzol裂解液，混匀，室温下(23-25℃)静置5分钟；
⑵加入7ul miRneasy serum/plasma spike-in control；
⑶加入与样本等量的氯仿，剧烈摇晃15秒，室温下(23-25℃)静置2-3分钟；
⑷12000X g,4℃，离心15分钟；
⑸移取上层液600ul,加入1.5倍上层液量的无水乙醇，立即混匀；
⑹吸取700ul混匀液加到RNeasy Minelute spin columns(吸附柱)，在12000X g,室温，离心30秒，废弃收集液；
⑺重复步骤⑹；
⑻加入700ul的Buffer RWT到吸附柱中，12000X g,室温，离心30秒，废弃收集液；
⑼加入500ul的Buffer RPE到吸附柱中，12000X g,室温，离心30秒，废弃收集液；
⑽加入500ul的80％乙醇到吸附柱中，12000X g,室温，离心2分钟，废弃收集液和收集管；
⑾重置一个新的2ml的收集管，12000X g,室温，离心5分钟，废弃收集液和收集管；
⑿重置一个新的1.5ml的收集管，加入14ul无酶水，12000X g,室温，离心1分钟；
最后收集管中为总的RNA。
②cDNA合成：
取3ul上述步骤中提取的RNA做模板，参照miScript II RT Kit试剂盒上要求，分别加入以下试剂：4ul of 5x miScript HISpec Buffer,2ul of 10x miScript NucleicsMix,9ul of RNase-free water and 2ul of miScript Reverse Transcriptase Mix。反应体系共20ul，放至PCR逆转录仪中，设置反应条件为37℃60分钟，95℃5分钟，4℃30分钟。最后所得cDNA中加入200ul无酶水后可放至-20℃中长期保存。
③RT-PCR反应
在48孔板中分别加入5ul of 2x QuantiTect SYBR Green PCR master Mix,1ulof 10x miScript Universal Primer,1ul of 10x Has_miR-39miScript Primer Assayor 1ul of Has_miR-miRNA-4463,miScript Primer Assay,2ul of RNase-free waterand 1ul上述cDNA。使用实时荧光定量PCR仪，反应分为两步，第一步是95℃15分钟预变性1个循环；然后进行第二步扩增40个循环(95℃15秒，55℃30秒，70℃30秒)。
根据得到的CT值，减去内参的CT值，根据公式(ΔCT＝CT miR-miRNA-4463–CT reference)可以得到该被检测者miRNA-4463的表达水平。
本发明采用血清miRNA-4463来进行肝癌诊断，同时对于低AFP的检测者，通过检测miRNA-4463可以协助诊断肝癌，具有较好的灵敏度和特异性，可以推广应用。
附图说明
图1为正常人与肝癌患者血清中miRNA-4463的表达水平；
图2为miRNA-4463表达高组与低组的生存曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明
实施例血清标本收集：实验组为南华大学附属南华医院及附一医院在2015年9月至2016年1月的肝癌患者45例。患者年龄为31-80岁,平均年龄为57.64岁。每例肝癌患者至少经过超声、CT和组织病理学中的两种方法，并结合相关病史及血清AFP水平而确诊。所有样本均在患者进行治疗前收集。对照组的45例正常人血清样本来自南华大学附属南华医院体检中心。志愿者年龄28-72岁，平均年龄45.22岁。所有参与到此次试验中的参与者在实验前均签署了知情同意书，同时经过了南华大学伦理委员会的批准。实验组和对照组均取外周血2ml,离心后取上层血清，放至-80℃环境中保存。
具体实验方法如下：
1.总RNA的提取取上层血清标本200ul，加入5倍量的QIAzol试剂并严格按照QIAzol Lysis Reagent试剂盒说明书上进行操作。
2.cDNA合成取3ul上述步骤中提取的RNA做模板，参照miScript II RT Kit试剂盒上要求，分别加入以下试剂：4ul of 5x miScript HISpec Buffer,2ul of 10x miScriptNucleics Mix,9ul of RNase-free water and 2ul of miScript ReverseTranscriptase Mix。反应体系共20ul，放至PCR逆转录仪中，设置反应条件为37℃60分钟，95℃5分钟，4℃30分钟。最后所得cDNA中加入200ul无酶水后可放至-20℃中长期保存。
3.RT-PCR反应在48孔板中分别加入5ul of 2x QuantiTect SYBR Green PCRmaster Mix,1ul of 10x miScript Universal Primer,1ul of 10x Has_miR-39miScriptPrimer Assay or 1ul of Has_miR-miRNA-4463,miScript Primer Assay,2ul of RNase-free water and 1ul上述cDNA。使用实时荧光定量PCR仪，反应分为两步，第一步是95℃15分钟预变性1个循环；然后进行第二步扩增40个循环(95℃15秒，55℃30秒，70℃30秒)。
实验结束后，根据溶解曲线(随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线)和CT值，按照公式得到目的基因在该血清中的相对表达量进行分析。
统计分析：实验中采用了SPSS 18.0统计软件进行分析。连续变量采用均数±标准差进行运算。在肝癌患者及正常人中表达量水平的比较使用了t-检验。miRNA-4463的表达量与肝癌患者临床特征各参数间的比较运用了单因素变量分析。取P<0.05为假设具有统计学意义。
实验结果：
1.正常人和肝癌患者血清中miRNA-4463的相对表达量如图1所示；
2.miRNA-4463的表达量与肝癌患者临床特征的相关性分析如表1所示；
表1.microRNA-4463的相对表达量与肝癌临床特征的相关性分析
3.miRNA-4463在不同AFP组中相对表达量的分析如表2所示；
表2.microRNA-4463在不同AFP组中相对表达量的分析。
4.低甲胎蛋白(AFP<400ug/l)组与正常人血清中miRNA-4463的相对表达量的相关性分析如表3所示；
表3.正常人与低AFP组microRNA-4463相对表达量的分析。
5.miRNA-4463表达水平高的组别相比于表达水平低组具有更短的生存时间，表达水平的高低以平均值作为分界点，如图2所示。
根据以上实验结果，可以判定血清中miRNA-4463可以作为肝癌诊断的新型标志物，并且对于AFP阴性或轻度升高患者，具有诊断意义。同时对于肝癌的预后判断具有临床意义。

Claims (5)

1.miRNA-4463作为肝细胞癌的诊断标志物或在制备肝癌诊断试剂中的用途，所述miRNA-4463的碱基序列为GAGACUGGGGUGGGGCC。
2.一种检测血清样本中miRNA-4463的表达水平的方法，该方法包括：
A、取血清样本，提取RNA；
B、以提取的RNA为模板，进行cDNA的合成；
C、使用特异性引物QIAGEN 218300-MS00044996、miR-39引物QIAGEN218300-MS00019789和上述合成的cDNA，进行RT-PCR反应，获得待测血清标本中microRNA-4463的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；
D、根据公式(ΔCT＝CTmiR-miRNA-4463–CTreference)，根据得到的CT值减去内参的CT值，得到该被检测者miRNA-4463的表达水平，
其中CTmiR-miRNA-4463是指肝癌患者血清标本中microRNA-4463的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CTreference是指内参miR-39的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，使用QIAzol Lysis Reagent提取RNA，使用miScript HISpec Buffer,miScript Nucleics Mix,RNase-free water和miScriptReverse Transcriptase Mix进行cDNA的合成，以及使用QuantiTect SYBR Green PCRmaster Mix,miScript Universal Primer,Has_miR-39miScript Primer Assay或Has_miR-miRNA-4463,miScript Primer Assay,RNase-free water和步骤B)合成的cDNA，进行RT-PCR反应。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其包括进一步求出肝癌患者与正常人血清中miRNA-4463表达水平的差异2-ΔΔCT，其中，ΔΔCT＝ΔCTHCC-ΔCTnormal，ΔΔCT是指肝癌患者的CT值与正常人CT值的比较值，ΔCTHCC代表肝癌患者的根据步骤(D)的公式求出的miRNA-4463的表达水平，ΔCTnormal代表正常人的根据步骤(D)的公式求出的miRNA-4463的表达水平。
5.一种用于检测血清样本miRNA-4463的表达水平的试剂盒，其包括特异性引物QIAGEN218300-MS00044996，内参为miR-39引物QIAGEN 218300-MS00019789)，QIAzol LysisReagent、miScript II RT Kit、miRNeasy Serum/Placma Kit。
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