CN106148537A

CN106148537A - 一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用

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Publication number: CN106148537A
Application number: CN201610644122.3A
Authority: CN
Inventors: 季晨博; 崔县伟; 郭锡熔; 王兴; 尤梁惠; 文娟
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2016-08-08
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2036-08-08
Also published as: CN106148537B

Abstract

本发明公开了一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用。本发明还公开了一种2型糖尿病诊断试剂盒。本发明的标志物从微观角度诊断肥胖儿童预警远期胰岛素抵抗及2型糖尿病发生的风险，并且操作简单，结果精确客观可靠，能够很好地将2型糖尿病组和代谢正常组区分开，可以准确、敏感的评估及预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗及2型糖尿病发生的风险，仅需提供血样即可进行，无需其他组织样本，大大提高了临床应用的可能性与可行性，为临床医生制定早期预防、干预方案及判断预后提供指导依据。

Description

一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及的是基因工程和医学领域，具体涉及一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用。

背景技术

糖尿病是以持续高血糖为其基本生化特征的一种慢性全身性代谢性疾病，主要是由于体内胰岛素分泌绝对或相对不足，从而导致以糖代谢紊乱为主的糖、蛋白质、脂肪代谢紊乱的一种综合病症。糖尿病主要分为1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他特殊类型的糖尿病。其中1型糖尿病主要由遗传因素决定，占5％-10％；2型糖尿病是由于人体无法有效合成及分泌胰岛素造成的，主要因体重过重和缺乏身体活动所致，占90％左右；我国糖尿病所占比例与国际相仿。据世界卫生组织统计，全球糖尿病患者在1998年为1.2亿，2025年预计将达3亿；而根据国际糖尿病联盟(IDF)统计，2000年全球糖尿病患者为1.51亿，而目前约2.85亿，按现有增长速度，预计到2030年全球糖尿病患者将超过5亿。值得注意的是，糖尿病已不仅仅是发达国家的“富贵病”，包括中国在内的发展中国家也已成为糖尿病的重灾区。

中国糖尿病患病率逐年增加，1986年糖尿病患病率约为0.9％，1994年上升到2.5％，1996年糖尿病发生率为3.21％，2002年调查发现我国糖尿病患者已超过2000多万，而且还有同等数量的空腹血糖受损病人。2010年报告显示中国成人糖尿病患病率为9.7％，其中男性10.5％，女性8.8％，男性略高于女性。20岁以上人群，随年龄增长，患病率呈线性增长趋势。年龄段调整后糖尿病前期患病率达15.5％，男性与女性的差异小于前者，城市与农村地区的糖尿病患病率男性均高于女性。按照2006年城市和农村20岁以上年龄人口占全部人口的比例，计算出城市的糖尿病人口，农村的糖尿病人口，总体上糖尿病患病总数已经达到9240万。糖尿病前期的患病总数已经达到了1.48亿。2007到2008年城市人口糖尿病患病率，无论经济状况如何，均在10.4％到12％区间浮动，而农村地区则彼此存在明显差异。而对于糖尿病前期，该差别已经消失，无论经济水平如何，2007到2008年农村地区糖尿病前期患病率均超过10％。随着农村地区居民生活水平提高和温饱的解决，体力活动大幅度下降，其高血糖状态已经明显在赶超城市居民的糖尿病前期水平。因此，我国糖尿病防治工作还存在巨大挑战。

目前，我国糖尿病的诊断主要是通过糖耐量实验。糖尿病诊断标准为，空腹血糖大于、等于7.0毫摩尔/升(mmol/l)，和/或饭后2小时大于等于11.1毫摩尔/升。有糖尿病症状者随机血糖到达这个数据就可以确诊。糖尿病最典型的临床表现“三多一少”，“三多”指的是多饮、多食、多尿，“一少”指的是体重减，但是如果出现三多一少，糖尿病的程度已经不轻了。大多数患者在早期没有症状，但是血糖数值已经达到糖尿病的诊断标准了。WHO也指出2型糖尿病症状可能与1型糖尿病相似，但往往症状不明显。因此，可能在发病多年之后才诊断出患有糖尿病，而此时则已出现并发症，对身体的各种组织特别是眼睛、肾脏、神经系统、心脑血管系统引起长期损害。因此，发现一种明确而有效的生物标志，对预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生具有重要意义，有助于2型糖尿病的早期诊断，早期干预，预防和控制糖尿病及其并发症的发生。

microRNA(miRNAs)是一类重要的基因表达调控因子，长度大小在18-22个碱基的非编码单链小分子RNA，它由一段具有发夹结构的单链RNA前体经Drosha酶和Dicer酶剪切产生。通过与靶mRNA3’端非编码区互补配对，使靶mRNA分子的翻译受到抑制或引起特异性切割，从而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，且成熟的miRNA在不同物种间进化上高度保守。miRNA不仅存在于各种组织和细胞中，还可以稳定存在于循环血液中。作为21世纪生命科学研究重大发现之一，近年来已经鉴定出了大量的miRNA，研究表明miRNA在许多生物学过程中发挥着至关重要的作用，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等，并与多种人类疾病存在重要的关联。

2型糖尿病是一种发病隐匿的慢性代谢疾病，主要以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损为主要特点。研究发现miRNAs对胰岛细胞的生长发育、分泌功能等均具有调控作用，而且miRNA的表达水平会随着糖尿病病程的进展而发生变化。有研究发现，在血糖水平紊乱但未确诊为糖尿病的时候，患者胰岛β细胞中miR-148a-3p、miR-26a-5p、miR-7-5p、miR-127-3p和miR-375已出现高表达。进一步研究发现，miR-375在胰腺组织中丰度极高，能够调控HuD/Elavl4基因的表达，而HuD/Elavl4与胰岛β细胞的生长和增殖有关，此外HuD/Elavl4同时可以调前胰岛素原(Ins2)的翻译和胰岛素的产生。敲除小鼠胰腺胰岛β细胞中miRNA-375的表达，HuD表达水平升高，从而导致β细胞中胰岛素分泌减少。此外，miR-124a、miR-9、miR-96a和miR-33也能调节胰岛素的释放。

一直认为高糖毒性是导致糖尿病患者胰岛β细胞受损的主要原因，用高糖处理MIN6胰岛β细胞系可以上调miR-30d、miR-124a和miR-107的表达，同时miR-690、miR-296和miR-484表达下调。miR-30d过表达可以上调胰岛素相关基因的表达，RNAi干扰抑制miR-30d表达后，由葡萄糖刺激诱导的胰岛素基因停止转录[41]。另一个miRNA分子miR-124a跟胰岛β细胞分化过程及胰岛的发生密切相关，并有研究表明miR-124a过表达可以通过调控其靶基因FoxA2的表达减少葡萄糖刺激诱导的胰岛素分泌，检测发现Pdx-1、Kir62和Sur-1等多个与胰岛素合成及分泌相关的特异性转录因子表达水平下调。miRNA的表达水平同时受软脂酸盐等因素的调控，研究发现miR-34a和miR-146a在MIN6胰岛β细胞系中的表达受软脂酸盐处理时间和浓度的影响，可以促进胰岛细胞的凋亡[43]。miR-34a不仅能够激活P53蛋白促进细胞凋亡，稳转过表达miR-34a还可抑制囊泡蛋白2的表达，抑制胰岛素的释放；miR-34a和miR-146a表达抑制可减少高脂毒性诱导的β细胞凋亡。以上研究均表明，miRNA表达水平不仅受高糖、高脂等环境因素影响，而且可以从胰岛素的从胰岛素的转录、翻译、分泌等多个方面影响胰岛β细胞功能。

胰岛素抵抗是2型糖尿病的另一基本特征，胰岛素抵抗就是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素的主要效应器官是肝、骨骼肌和脂肪组织，当这些器官对胰岛素的敏感性和反应性降低时，即出现胰岛素抵抗。目前已有多种miRNA被证实与胰岛素抵抗相关。研究表明miRNA在胰岛素的靶组织骨骼肌、肝脏和脂肪细胞中存在异常表达的情况，提示miRNA的表达与2型糖尿病的发生密切相关。miRNA-802在2型糖尿病患者以及糖尿病小鼠肝细胞中表达上调，过表达miRNA-802可使血糖耐受不良、破坏胰岛素受体通路和肝细胞糖原合成。

有研究发现，肥胖可以使2型糖尿病患者以及糖尿病小鼠肝细胞miRNA-802水平上调，致其靶基因肝细胞核因子1b基因沉默，因而导致了血糖耐受不良，破坏胰岛素受体通路以及肝细胞合成糖原减少。正常情况下，miR-146a抑制PTPN1维持胰岛素信号传导通路的顺畅，但减低miR-46a表达水平降低的情况下，PTPN1活性增强抑制胰岛素信号通路，在2型糖尿病中发现了miR-146a的显著下调。胰岛素靶细胞细胞通路的最后一步就是将GLUT4运送到细胞膜上，而miR-320可通过阻断PI3-K/Akt信号通路与miR-150共同使靶细胞GLUT4下调，试验发现糖尿病患者miR-320发生了上调。IRS1可促进肿瘤细胞的生长。研究发现由于IRS1是主要的胰岛素受体底物酶，miR-144、miR-145可以靶向结合到IRS1的3'-UTR端，从而导致胰岛素信号通路受阻，因而miR-145可以有效减少人肝癌细胞HepG2细胞血糖。在HepG2细胞内胰岛素的抵抗能够促进p65的功能，而p65对于miRNA-145的促进因子具有抑制转录的作用。

生物标记物是随着分子生物学技术和免疫学技术的发展而提出的一类细胞生物特异性标记。例如：来自凯斯西储大学的研究人员鉴别出了miRNA-181a生物标记物，证实其有望用于预测一种常见的卵巢癌形式的治疗反应，改善患者的预后；另有研究人员鉴别出了与基底细胞样乳腺癌密切相关的生物标记物START3，为开发出新的疗法治疗这种致命的癌症提供了靶点，这些生物标记物的鉴定展现了潜在的临床应用价值。虽然肿瘤组织中的miRNA可以作为一种新的肿瘤标记物，但是肿瘤组织的miRNA就必需要进行手术或穿刺等才能获得，所以组织miRNA不能满足早期诊断需要，不能适用于广泛的筛查和预防。基于此，研究人员将目光投向了常规体检就可以收集到的血液。2008年研究人员从血浆/血清中发现了大量稳定的来源于组织/器官的miRNA，之后多项研究从血浆/血清中鉴别出了包括恶性肿瘤、心血管疾病、风湿、阿兹海默症等疾病的miRNA生物标记物，对疾病的预测、预后以及诊断都具有一定的临床应用价值。而且血清/血浆的检测是无创的，非侵入的，因此其中的miRNA适用于普查和预防，为早期诊断服务。因此从血清/血浆中筛选到可以用于胰岛素抵抗和2型糖尿病的早期标记物可以准确、敏感的评价早期、低水平的损害，提供早期预警，在很大程度上为临床医生制定早期预防、干预方案及判断预后提供依据。

发明内容

技术问题：针对现有技术的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物。

本发明还要解决的技术问题是提供上述miRNA标志物的引物及探针。

本发明还要解决的技术问题是提供了上述miRNA标志物及其引物或探针在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种2型糖尿病诊断试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供的一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物，所述标志物为miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b、miRNA-148a中的一种或多种的组合。

上述的miRNA为：miRNA-486：UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG(SEQ ID NO.1)；miRNA-146b：UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU(SEQ ID NO.2)；miRNA-15b：UAGCAGCACA UCAUGGUUUACA(SEQ ID NO.3)；miRNA-148a：UCAGUGCACUACAGAACUUUGU(SEQ ID NO.4)。

所述标志物为miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a。

上述的与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物的引物或探针。这些单独的引物或探针可以通过商业渠道购买获得，也可以在了解这些miRNA序列之后由技术人员自行设计合成，根据已知miRNA序列设计合成引物或探针的方法为本领域技术人员熟知的方法。

上述miRNA-486的探针为：Assay ID：001278；miRNA-146b的探针为：Assay ID：001097；miRNA-15b的探针为Assay ID：000390；miRNA-148a的探针为Assay ID：000470。(上述探针Assay均购自美国ABI公司)。

上述的血清或血浆miRNA标志物在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用。

上述的血清或血浆miRNA标志物的引物或探针在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用。

上述的血清或血浆miRNA标志物的探针在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用。

一种2型糖尿病诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清或血浆中的miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a。

该试剂盒含有所述的血清或血浆miRNA标志物的探针。该试剂盒含有血清或血浆中miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a的引物或探针。该miRNA-486的探针为Assay ID：001278；miRNA-146b的探针为Assay ID：001097；miRNA-15b的探针为Assay ID：000390；miRNA-148a的探针为Assay ID：000470。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：miRNA区别于传统生物标志物，可以在血清/血浆中稳定存在，易于分离提取，不容易受反复冻融或pH变化的影响；并且血清/血浆的获得是微创的，将在很大程度上减轻患者的痛苦；最重要的是定量准确，将大大提高疾病诊断的灵敏度与特异度，因此该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗和2型糖尿病的辅助诊断。在本发明通过深度测序及RT-qPCR的方法发现肥胖儿童血清/血浆中异常高表达的miRNAs在成人肥胖合并2型糖尿病患者血清/血浆中均显著高表达，且与2型糖尿病患者空腹血糖具有显著相关性，揭示其在肥胖儿童预警远期胰岛素抵抗及2型糖尿病发生的诊断中具有宝贵价值。2型糖尿病症状可能与1型糖尿病相似，但往往症状不明显，目前的检测方法可能在发病多年之后才诊断出患有糖尿病，而此时则已出现并发症，对身体的各种组织特别是眼睛、肾脏、神经系统、心脑血管系统引起长期损害，因此需要此类血清/血浆miRNAs预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生，以实现早发现早防疗。本发明获得了肥胖儿童及成人肥胖合并2型糖尿病中特异高表达的血清/血浆中miRNA标志物，为临床诊断肥胖儿童预警远期胰岛素抵抗及2型糖尿病发生等提供了巨大的便利。本发明的标志物从微观角度诊断肥胖儿童预警远期胰岛素抵抗及2型糖尿病发生的风险，并且操作简单，结果精确客观可靠，能够很好地将2型糖尿病组和代谢正常组区分开，可以准确、敏感的评估及预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗及2型糖尿病发生的风险，仅需提供血样即可进行，无需其他组织样本，大大提高了临床应用的可能性与可行性，为临床医生制定早期预防、干预方案及判断预后提供指导依据。

附图说明

图1、肥胖组儿童血清/血浆与对照组儿童血清/血浆中miRNA-486表达qPCR验证图；

图2、肥胖组儿童血清/血浆与对照组儿童血清/血浆中miRNA-146b表达qPCR验证图；

图3、肥胖组儿童血清/血浆与对照组儿童血清/血浆中miRNA-15b表达qPCR验证图；

图4、肥胖组儿童血清/血浆与对照组儿童血清/血浆中miRNA-148a表达qPCR验证图；

图5、miRNA-486在成人2型糖尿病患者血清中的表达水平与代谢正常组血清中表达水平的比较图；

图6、miRNA-146b在成人2型糖尿病患者血清中的表达水平与代谢正常组血清中表达水平的比较图；

图7、miRNA-15b在成人2型糖尿病患者血清中的表达水平与代谢正常组血清中表达水平的比较图；

图8、miRNA-148a在成人2型糖尿病患者血清中的表达水平与代谢正常组血清中表达水平的比较图；

图9、成人血清/血浆miRNA-486血清/血浆的表达水平与成人患者空腹血糖相关性比较图；

图10、成人血清/血浆miRNA-146b血清/血浆的表达水平与成人患者空腹血糖相关性比较图；

图11、成人血清/血浆miRNA-15b血清/血浆的表达水平与成人患者空腹血糖相关性比较图；

图12、成人血清/血浆miRNA-148a血清/血浆的表达水平与成人患者空腹血糖相关性比较图；

图13、用于预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生诊断效率的miRNA-486的ROC曲线图；

图14、用于预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生诊断效率的miRNA-146b的ROC曲线图；

图15、用于预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生诊断效率的miRNA-15b的ROC曲线图；

图16、用于预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生诊断效率的miRNA-148a的ROC曲线图；

图17、用于预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生诊断效率的miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a组合的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1：

1、试验材料：Trizol reagent，TaqMan逆转率试剂盒，UniversalMaster Mix II均购自Life technologies公司；氯仿，无水乙醇均购自国药集团药业股份有限公司；DEPC水购自上海碧云天生物技术有限公司。

2、样本收集和样本资料的整理：

本发明共计使用儿童血液样本352例，其中肥胖组样本136例，正常组样本216例；两组样本之间年龄无显著差异(P>0.05)，BMI差异显著(P<0.001)，此外两组间血脂、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白均差异显著(P<0.05)。

本发明共计使用成人2型糖尿病样本101例，对照组样本82例；两组样本间年龄无显著差异，BMI、空腹血糖、血脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白均存在显著差异。

本发明分别选取肥胖儿童和正常儿童血清样本各15例，抽提总RNA后，每5个样本混合为一个样本进行深度测序分析(Deep sequencing)。

3、血清总RNA的抽提

1)取300μl血清样本，于去酶EP管中，冰上放置；加入3倍体积的Trizol，充分震荡后加入终浓度为10^-4pmol/μl的人工合成的线虫cel-mir-39作为外参，用于标准化提取、反转录及控制后续的定量检测全过程操作的样本间差异(1.2ml体积中加入10μl 0.2μM的cel-39)，分成2个EP管继续后续实验。

2)静置15分钟后加入等体积的氯仿，充分震荡，静置15分钟后，12000g，4℃，离心15分钟(上清可再次加入等体积氯仿萃取)；

3)将上清转移至新的去酶EP管中，加入1.5倍体积无水乙醇，轻轻混匀转移700μl至QIAGEN miRNA抽提试剂盒吸附柱上，≥8000g，4℃，离心30s，弃液(重复此步骤)；

4)取700μl Buffer RWT于吸附柱上，≥8000g，4℃，离心30s，弃液；取500μlBuffer RPE于吸附柱上，≥8000g，4℃，离心30s，弃液；取500μl Buffer RPE于吸附柱上，≥8000g，4℃，离心30s，弃液；将吸附柱置于新的EP管中，≥8000g，4℃，离心2min。

5)取适量Depc水(30μl)于吸附柱上，静置2分钟，≥8000g，4℃，离心1min，测量RNA浓度，冰上放置待用或-80℃保存。

4、深度测序：本实验样本测序在华大基因进行。小分子RNA是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。基于HiSeq高通量测序技术的小RNA数字化分析，采用边合成边测序(SBS-sequencingby synthesis)，可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，一次性获得数百万条小分子RNA序列，能够快速全面地鉴定该物种在该状态下的小分子RNA并发现新的小分子RNA，构建样品之间的小分子RNA差异表达谱，为小分子RNA功能研究提供有力工具。

5、根据Deep sequencing测序结果，依据miRNA差异性和表达丰度高低，我们选择miR-222、miR-375、miR-27a、miR-30a、miR-130b、miRNA-206、miRNA-26b、miRNA-320a、miRNA-197、miRNA-19a、miRNA-30d、miRNA-146a、miRNA-99b、miRNA-146b、let-7d、miRNA-15b、miRNA-21和miRNA-20a等18个miRNA设计逆转录和qRT-PCR的探针(探针ID分别为Taqman MicroRNA assay-has-mir-197(Assay ID:000497)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-146a(Assay ID:000468)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-130b(Assay ID:000456)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-222(Assay ID:002276),Taqman MicroRNAassay-has-mir-486(Assay ID:001278)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-148a(AssayID:000470),Taqman MicroRNA assay-has-mir-21(Assay ID:000397),Taqman MicroRNAassay-has-mir-375(Assay ID:000564)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-146b(AssayID:001097)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-99b(Assay ID:000436),Taqman MicroRNAassay-has-mir-30a(Assay ID:000416)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-27a(AssayID:000408)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-30d(Assay ID:000420),Taqman MicroRNAassay-has-mir-let-7d(Assay ID:002283)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-26b(AssayID:000395)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-15b(Assay ID:000390),Taqman MicroRNAassay-has-mir-19a(Assay ID:000395)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-20a(AssayID:000580)，均购自美国ABI公司)。对“肥胖儿童”组和“正常儿童”组血清单个个体进行miRNA的实时荧光定量PCR检测。用探针法进行qRT-PCR检测，每个样本连续检测3次，对整个实验过程严格质控，并采用盲法，以避免偏倚出现。

6、探针法：使用ABI公司的逆转录试剂盒(Taqman MicroRNAreversetranscription kit+Taqman gene expression master mix+Taqman assay-has-mir-26b/Taqman MicroRNA assay-has-mir-222/Taqman MicroRNA assay-has-mir-146a/TaqmanMicroRNA assay-has-mir-146b/+Taqman MicroRNA assay-cel-mir-39)。

1)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录体系为：100mM dNTPs 0.15μl，50U/μl Reverse Transcriptase 1.00μl，10*Reverse Transcription Buffer 1.50μl，20U/μl RNase Inhibitor 0.19μl，Nuclease-free water 4.16μl以及3μl逆转录引物和5μl上述提取的RNA样品。逆转录反应热循环为：16℃孵育30分钟，42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟，4℃维持至取出，-20℃保存备用。

2)q-PCR：探针法的q-PCR的反应体系为：cDNA 1μl，miRNAs的探针1μl，Taqmangene expression master mix 10μl及DEPC水8μl。反应步骤为95℃，5min预变性进行一个循环，95℃、15s变性，60℃、1min退火延伸进行45个循环，使用QuantStudio^TM 6Flex荧光定量PCR仪操作。

7、数据处理与分析

7.1)采用IBM SPSS 20.0统计软件进行录入及数据处理，计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，采用t检验分析两组样本间差异，采用Pearson相关分析分析数据相关性。

7.2)深度测序分析(Deep sequencing)：肥胖组儿童目的miRNA的相对表达量(H2)与正常儿童目的miRNA的相对表达量(H1)比值的对数值(以2为底数)大于1者(表示上调)；或者小于0者(表示下调)进行探针法qRT-PCR验证实验。共选出18个miRNAs。(见表1)

表1深度测序结果

7.3)探针法qRT-PCR验证实验数据分析：

1)用方程-△△Ct表示两组样本血清miRNA的相对表达量，其中△△Ct＝△(C_T肥胖-△C_Tcel-mir-39)-(△C_T正常-△C_Tcel-mir-39)，在每个样本提取RNA时加入人工合成的cell-mir-39的成熟RNA作为参照，计算血清/血浆中miRNA的相对表达量。以上数据，即Ct值均可用荧光定量检测仪配带的检测软件读出。最后数据用IBM SPSS 20.0进行统计分析。

2)将上面筛选出来的18条miRNAs，进行定量PCR验证，以化学合成的cel-miR-39做为外参。结果发现在136例肥胖儿童与216例正常儿童对照组中，有4条miRNAs在肥胖组儿童血清/血浆中表达高于对照组，且结果具有显著统计学意义。这4条miRNAs分别是miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b、miRNA-148a(见图1-4)。

3)肥胖是导致2型糖尿病发生的主要因素，肥胖患者标志miRNA是否可以在糖尿病预防中发挥预警作用并不为人所知。因此，我们进一步检测了上述差异miRNA在成人2型糖尿病患者中的表达，证实其作为肥胖预警2型糖尿病的分子标记物的可能性。结果在101例2型糖尿病样本和82例糖代谢正常对照样本中，发现这4条在肥胖儿童血清中差异表达的miRNAs在肥胖合并2型糖尿病患者血清中均显著高表达(见图5-8)。

4)我们进一步借助统计相关性分析中Pearson相关性分析，分析这4种差异miRNAs的表达水平与成人患者空腹血糖相关性，评估其作为肥胖诱发的2型糖尿病的可行性。结果发现，4种miRNA与空腹血糖水平相关性显著(miR-486，R＝0.674；miR-146b，R＝0.594；miR-15b，R＝0.688；miR-148a，R＝0.554)(见图9-12)，可以作为预警肥胖儿童远期2型糖尿病发生的标志物。

5)对这4个miRNAs用于预警肥胖儿童远期胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生诊断效率，绘制ROC曲线(Receiver Operating Curve)计算AUC(Area Under the ROC Curve)(见图13-17)。

miR-486以92.58％的AUC将2型糖尿病组和糖代谢正常组分开，最佳临界点的灵敏度为：93.33％，特异度为：81.13％。

miR-146b以88.18％将2型糖尿病组和糖代谢正常组分开，最佳临界点的灵敏度为：90.00％，特异度为：79.25％。

miR-15b以96.86％将2型糖尿病组和糖代谢正常组分开，最佳临界点的灵敏度为：100.00％，特异度为：83.02％。

miR-148a以87.23％将2型糖尿病组和糖代谢正常组分开，最佳临界点的灵敏度为：90.00％，特异度为：77.36％。

miR-486、miR-146b、miR-15b和miR-148a组合以98.18％的AUC将2型糖尿病组和糖代谢正常组分开，最佳临界点的灵敏度为：96.67％，特异度为：90.57％。

以上结合附图对本发明的实施方式做出详细说明，但本发明不局限于所描述的实施方式。对本领域的普通技术人员而言，在本发明的原理和技术思想的范围内，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变形仍落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物，其特征在于，所述标志物为miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b、miRNA-148a中的一种或多种的组合。

2.根据权利要求1所述的与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物，其特征在于，所述标志物为miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a。

3.权利要求1或2所述的与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物的引物或探针。

4.根据权利要求3所述的与2型糖尿病相关的血清或血浆miRNA标志物的探针，其特征在于，所述miRNA-486的探针为Assay ID：001278； miRNA-146b的探针为Assay ID：001097；miRNA-15b的探针为Assay ID：000390；miRNA-148a的探针为Assay ID：000470。

5.权利要求1或2所述的血清或血浆miRNA标志物在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用。

6.权利要求3所述的血清或血浆miRNA标志物的引物或探针在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用。

7.权利要求4所述的血清或血浆miRNA标志物的探针在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用。

8.一种2型糖尿病诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测血清或血浆中的miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a。

9.根据权利要求8所述的2型糖尿病诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有血清或血浆中miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a的引物或探针。

10.根据权利要求8所述的2型糖尿病诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求4所述的血清或血浆miRNA标志物的探针。