CN109884297B - 用于评估儿童易感arti风险的临床标志物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于评估儿童易感ARTI风险的临床标志物。具体地，本发明提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括选自下组的1种或2种生物标志物：TIMP‑1、PDGF‑BB、或其组合。本发明首次提供了TIMP‑1和PDGF‑BB作为血清标志物在在临床筛查评估儿童易感ARTI中的应用；同时血清做为常规体检样本来源，具有容易采集，标准化处理等优点；血清因子做为检测指标后续便于应用于试纸条以及契合诊断检测试剂盒。

Description

用于评估儿童易感ARTI风险的临床标志物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于评估受试者中易感ARTI的方法。

背景技术

急性呼吸道感染是临床最常见的感染性疾病，约70％-80％由病毒引起。常见的呼吸道病毒包括鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等。另有20％～30％的由细菌引起。在世界范围内，特别是发展中国家，每年有190万5岁以下儿童死于急性呼吸道感染(ARTIs)。目前临床上对于ARTI的诊断和治疗没有统一的标准。由于造成ARTI的致病因子复杂多变，因此临床上针对ARTI的治疗没有特定的特异疗法，而是大多采取抗生素法，这增加了致病因子的突变耐药机率，同时使感染人群更容易发生反复感染。

部分儿童在一段时间内会发生多次ARTIs，即ARTI易感人群；而另一些儿童发生ARTI的次数相对较低，为ARTI非易感人群。如何区分这些人群对于临床上更加合理的用药以及针对性的对易感人群进行预防是至关重要的。虽然目前已有证据表明鼻病毒、呼吸道合胞体病毒的早期感染是发生呼吸道慢性疾病(如哮喘，反复喘息)的危险因素，但是此类证据并不充足，而且病毒作为临床疾病发生的判断指标也存在难以诊断和量化的不足。利用血清免疫/生化指标来作为判断标志物具有较好的广泛性、稳定性、容易量化测定等优点，已被应用在临床多种疾病的诊断中。然而针对儿童急性呼吸道感染，如何预测易感和非易感人群仍然是空白。

因此本领域迫切需要开发一种简便快速、灵敏、准确地评估儿童发生ARTI风险的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种用于评估受试者中易感ARTI的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括选自下组的1种或2种生物标志物：TIMP-1、PDGF-BB、或其组合。

在另一优选例中，所述生物标志物集合用于评估急性呼吸道感染(ARTI)风险或诊断，或用于制备一试剂盒或试剂，所述的试剂盒或试剂用于评估待测对象的ARTI风险(易感性)或诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)待测对象ARTI疾病。

在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于评估ARTI风险或诊断的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：IL-6。

在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于评估ARTI风险或诊断的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：IL-17、IL-15、或其组合。

在另一优选例中，所述的集合包括选自表A的生物标志物：

表A

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1～b5。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1-b2和选自子集Y的生物标志物，其中子集Y由生物标志物b3-b5构成。

在另一优选例中，所述的生物标志物或生物标志物集合来源于血液、血浆、或血清样品。

在另一优选例中，通过检测细胞因子表达量方法对各个生物标志物进行检测。

在另一优选例中，所述检测细胞因子表达量方法包括：基于双抗夹心法的蛋白检测芯片(QAH CUST)。

在另一优选例中，所述的集合用于评估待测对象的ARTI疾病患病风险或待测对象ARTI疾病诊断。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的ARTI患病风险包括ARTI的早期筛查。

在本发明的第二方面，提供了一种用于ARTI患病风险评估或诊断的试剂组合，所述试剂组合包括用于检测如本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的试剂。

在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括如本发明第一方面所述的集合和/或如本发明第二方面所述的试剂组合。

在另一优选例中，如本发明第一方面所述的集合中各个生物标记物用作标准品。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，所述的说明书记载了来源于ARTI疾病患者和/或健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平的参考数据集。

在本发明的第四方面，提供了一种生物标志物集合的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于评估待测对象的ARTI患病风险或待测对象ARTI诊断，其中，所述生物标志物集合包括选自下组的1种或2种生物标志物：TIMP-1、PDGF-BB、或其组合。

在另一优选例中，当用于评估待测对象的ARTI患病风险或待测对象ARTI诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：IL-6。

在另一优选例中，当用于评估待测对象的ARTI患病风险或待测对象ARTI诊断时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：IL-17、IL-15、或其组合。

在另一优选例中，所述的评估包括步骤：

(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；

(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较；

较佳地，所述的参考数据集包括来源于ARTI疾病患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平；

较佳地，所述的参考数据集包括来源于ARTI患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平；

在另一优选例中，所述的将步骤(1)测得的水平与一参考数据集进行比较，当所述量与标志物的参考量相比是变化时，关联所述受试者处于发生ARTI的风险。

在另一优选例中，如果所述的患病可能性≥0.75，所述的对象被判定为具有AMD疾病患病风险或患有ARTI疾病。

在另一优选例中，所述的样品选自血液、血浆、或血清样品。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，所述的方法还包括对样品进行处理的步骤。

在本发明的第五方面，提供了一种评估待测对象的便秘风险及便秘程度的方法，包括步骤：

(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；

(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较。

较佳地，所述的参考数据集包括来源于ARTI疾病患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平；

较佳地，所述的参考数据集包括来源于ARTI患者和健康对照者的如所述集合中各个生物标记物的水平；

在另一优选例中，所述的将步骤(1)测得的水平与一参考数据集进行比较，当所述量与标志物的参考量相比是变化时，关联所述受试者处于发生ARTI的风险。

在另一优选例中，如果所述的患病可能性≥0.75，所述的对象被判定为具有AMD疾病患病风险或患有ARTI疾病。

在另一优选例中，所述的样品选自血液、血浆、或血清样品。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，所述的方法还包括对样品进行处理的步骤。

在本发明的第六方面，提供了一种筛选治疗ARTI患病的候选化合物的方法，包括步骤：

(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中集合中各个生物标记物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照(包括溶媒)，检测对照组中来源于所述对象的样品中所述集合中各个生物标记物的水平V2；

(2)比较上一步骤检测得到的水平V1和水平V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是治疗便秘的候选化合物，其中所述集合包括两种或多种选自下组的生物标志物：b1-b2。

在另一优选例中，所述还包括：b3-b5。

在另一优选例中，所述的待测对象为ARTI患者。

在另一优选例中，如果一个或多个选自子集H的生物标志物的水平V1显著低于水平V2，表明测试化合物为治疗ARTI的候选化合物，

在另一优选例中，所述“显著低于”指水平V1/水平V2的比值≤0.8，较佳地≤0.6，更佳地，≤0.4。

在本发明的第七方面，提供了一种生物标志物集合的用途，用于筛选治疗ARTI疾病的候选化合物和/或用于评估候选化合物对ARTI疾病的治疗效果，其中，所述生物标志物集合选自下组的1种或2种的生物标志物：TIMP-1、PDGF-BB、或其组合。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括：IL-6。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括：IL-17、IL-15、或其组合。

在本发明的第八方面，提供了一种ARTI疾病早期辅助筛查系统，所述系统包括：

(a)ARTI相关疾病特征输入模块，所述ARTI相关疾病特征输入模块用于输入某一对象的ARTI相关疾病特征；

其中所述的ARTI相关疾病特征包括选自下组A的1种或2种：TIMP-1、PDGF-BB、或其组合。

(b)ARTI相关疾病判别处理模块，所述处理模块对于输入的ARTI相关疾病特征，按预定的判断标准进行评分处理，从而获得风险度评分；并且将所述风险度评分与ARTI相关疾病的风险度阈值进行比较，从而得出辅助筛查结果，其中，当所述风险度评分高于所述风险度阈值时，则提示该对象患ARTI相关疾病的风险高于正常人群；当所述风险度评分低于所述风险度阈值时，则提示该对象患ARTI相关疾病的风险高于正常人群；和

(c)辅助筛查结果输出模块，所述输出模块用于输出所述的辅助筛查结果。

在另一优选例中，所述的ARTI相关疾病特征还包括选自下组B：IL-6。

在另一优选例中，所述的ARTI相关疾病特征还包括选自下组C：IL-17、IL-15、或其组合。

在另一优选例中，所述的对象是人。

在另一优选例中，所述的对象包括婴幼儿、青少年或成年人。

在另一优选例中，所述的对象的年龄为6岁以内(中位数50个月)。

在另一优选例中，在所述处理模块中，如下进行风险度评分处理：

在另一优选例中，所述的评分包括(a)单个特征的评分；和/或(b)多个特征的评分之和。

在另一优选例中，所述的特征输入模块选自下组：血清采集仪。

在另一优选例中，所述的ARTI相关疾病的判别处理模块包括一处理器，以及一储存器，其中所述的储存器中存储有基于ARTI相关疾病特征的ARTI相关疾病的风险度阈值数据。

在另一优选例中，所述的输出模块包括报告系统。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了血清TIMP-1在健康组、不易感儿童(单次ARTI组)、易感儿童(多次ARTI组，包括几次ARTI时间点)的表达差异。

图2显示了血清PDGF-BB在健康组、不易感儿童(单次ARTI组)、易感儿童(多次ARTI组，包括几次ARTI时间点)的表达差异。

图3显示了筛选过程中血清中其它细胞因子(共46种)在健康组、不易感儿童(单次ARTI组)、易感儿童(多次ARTI组，包括几次ARTI时间点)的表达差异。

图4显示了血清中TIMP-1和PDGF-BB对儿童易感ARTI的诊断价值评价。

a.显示受试者工作特征曲线评价血清中TIMP-1和PDGF-BB单独或者联合鉴别易感(多次ARTI组)和非易感儿童(单次ARTI组)的能力；b.显示受试者工作特征曲线评价血清中TIMP-1和PDGF-BB单独或者联合鉴别易感(多次ARTI组)和健康儿童的能力。

图5显示了7种常见的呼吸道病毒因素(鼻病毒HRV、肠道病毒HEV、流感病毒IFV、呼吸道合胞体病毒RSV、TTV、TTMV、TTMDV)并不和儿童ARTI的易感性相关。

图6显示了7种常见的呼吸病毒因素并不影响TIMP-1和PDGF-BB的血清表达水平。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种简便、灵敏、准确地评估儿童对ARTI易感性的方法。具体地，本发明人通过对ARTI儿童人群的筛选，找出一段时期内易感和不易感ARTI的人群，通过对多种血清细胞因子在两组中的差异表达，筛选出潜在的标志物。利用医学统计模型和独立性验证进一步确定TIMP-1和PDGF-BB可单独或者联合作为诊断区分儿童对ARTI易感性的标志物。本发明所涉及的标志物可进一步用于临床诊断检测的指标，并且可用于涉及开发适用于诊断检测的各种试剂盒等产品。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“灵敏度”是指用本发明中涉及的标志物判断为ARTI易感儿童的真实概率，灵敏度越高，漏诊机会越小。

术语“特异性”是指用本发明中涉及的标志物判断为ARTI不易感儿童的真实概率，特异性越高，发生误诊的机会就越小。

术语“比诊断值比”是指阳性似然比和阴性似然比之间的比值，数值越大表明诊断试验(所涉及的标志物)区分易感和非易感儿童的能力越大。

术语“独立性的验证”是指排除引起ARTI的主要病毒因素对筛选得到的血清标志物的干扰。

组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)

组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)是结合基质金属蛋白酶(MMP)的特异性抑制剂，后者主要功能是水解细胞外基质。有4种TIMP(1-4)，其主要参与了发育和组织重建等功能。

血小板衍生因子(PDGF-BB)

血小板衍生因子(PDGF-BB)属于生长因子的一类，主要调节多种细胞的分化、增殖、迁移等。它被发现可以促进呼吸道胶原的合成，平滑肌的增殖和纤维化，促进呼吸道的重塑。

本发明的主要优点包括：

1)本发明首次提供了TIMP-1和PDGF-BB作为血清标志物在在临床筛查评估儿童易感ARTI中的应用；

2)本发明用血清做为常规体检样本来源，具有容易采集，标准化处理等优点，用血清因子做为检测指标便于后续应用于试纸条以及契合诊断检测试剂盒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.

筛选易感ARTI儿童血清标志物

1.1易感、非易感ARTI儿童的筛选确定

选取范围为2009-2015年共计4407例门诊确定为ARTI的儿童，根据每个个体在这一时间范围内记录的发生ARTI的次数分为非易感儿童(单次ARTI组)和易感儿童(多次ARTI组)。这一筛选分组标准主要利用了患者的姓名、年龄、家庭住址、父母姓名和联系方式以及两次ARTI的时间间隔等因素。当两个或多个病例记录为相同的姓名和年龄时则认为是同一患者个体；当两个或多个病例记录的姓名和年龄有一条不完全相同时，如果其家庭住址、父母姓名和联系方式至少有两个信息是一致时，则认为是同一患者个体；否则认为是非同一患者个体。最后两次独立的ARTI事件判断标准为时间间隔至少为30天。根据以上标准，从4407例ARTI儿童中记录了192个发生至少两次ARTI的儿童，列为易感儿童(多次ARTI组)，其中有160例发生2次ARTI，23例发生3次，8例发生4次，1例发生5次。其余4215例在所研究时间内发生单次ARTI，为非易感儿童。为保证各组的个体数目接近，选取了30个发生2次ARTI的儿童、所有发生2次以上的儿童共计61个作为易感儿童(多次ARTI)组，选取了48个发生单次ARTI的作为非易感儿童(单次ARTI)组，同时加入了20个来自同一地区的健康儿童作为对照组。所有的筛选儿童以及纳入后续分析的易感和非易感儿童组的主要人口及临床指标列于表1。

结果表明所选取的非易感儿童组、易感儿童组以及最初的样本来源总体之间，在人口特征以及主要临床症状上并没有显著的差异，表明分组筛选没有明显的特异偏差，可进行后续的血清标志物的分析和筛选。

表1

2.2主要细胞因子、趋化因子、受体以及生长因子的血清浓度测定

所有血清样本均采集自个体治疗前，利用Raybiotech公司的蛋白检测芯片(QAHCUST)检测所有受试者的血清细胞因子水平，包括：白介素1α(interleukin-1α,IL-1α),白介素1β(IL-1β),白介素1Rα(IL-1Rα),白介素2(IL-2),白介素4(IL-4),白介素5(IL-5),白介素6(IL-6),白介素6R(IL-6R),白介素7(IL-7),白介素8(IL-8),白介素9(IL-9),白介素10(IL-10),白介素11(IL-11),白介素12p40(IL-12p40),白介素12p70(IL-12p70),白介素13(IL-13),白介素15(IL-15),白介素16(IL-16),白介素17A(IL-17A),白介素23(IL-23),B细胞趋化因子1(B cell-attracting chemokine 1,BLC-1),嗜酸性粒细胞趋化因子1(Eotaxin-1),嗜酸性粒细胞趋化因子2(Eotaxin-2),Fractalkine,粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF),粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF),巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF),细胞间黏附分子1(intercellularcell adhesion molecule,ICAM-1),趋化因子I-309,干扰素诱导蛋白10(interferon-induced protein10,IP-10),单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1),干扰素诱导单核蛋白(monokine induced by gamma interferon,MIG),巨噬细胞炎性蛋白1α,β,δ(macrophage inflammatory protein,MIP-1α,β,δ),血小板衍生生长因子BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB),T细胞激活性低分泌因子(RANTES),组织金属蛋白酶抑制剂1,2(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP-1,2),肿瘤坏死因子α,β(tumor necrosis factor,TNF-α,β),肿瘤坏死因子受体RI,RII(TNF RI,TNFRII),转化生长因子β1(transforming growth factor,TGF-β1),干扰素β,γ(IFN-β,γ),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor basic,bFGF).芯片上所有的样本及相应的因子检测均为4个重复，检测信号采用InnoScan 300Microarray Scanner，并用相应的软件Mepix收集处理。

1.3筛选与ARTI易感儿童相关的血清标志物

利用Graphpad Prism软件，通过非参数单因素差异分析确定在易感和非易感儿童中差异表达的因子(图1和2)，选取p值小于0.1的差异表达因子，对其进行log化处理，以消除由于不同因子本身表达差异的区别带来的误差。通过SPSS软件，将得到的结果纳入多重逻辑回归分析模型中，判断各种差异表达因子与ARTI易感儿童的相关性。最后纳入逻辑回归分析方程并具有显著性的为3种细胞因子(表2)：TIMP-1,PDGF-BB和IL-6。其中TIMP-1,PDGF-BB具有极高的比值比(OR,odds ratio)，可以作为后需进一步判断其诊断价值的血清标志物。

表2

实施例2.

对候选的易感ARTI儿童血清标志物诊断价值的评价

对筛选得到的候选标志物TIMP-1和PDGF-BB利用SPSS软件进行受试者工作特征曲线模型分析(receiver operating characteristic curve,ROC)。

通过ROC曲线下的面积(area under the ROC curve,AUC)、灵敏度(sensitivity)、特异性(specificity)、阳性似然比(positive likelihood ratio)和阴性似然比(negative likelihood ratio)进行整合分析(图4)，评价单一指标TIMP-1或者PDGF-BB，以及联合指标(TIMP-1合并PDGF-BB)对易感ARTI儿童和非易感儿童、易感ARTI儿童和健康儿童的诊断价值。结果发现，单一指标TIMP-1(AUC＝0.78)或者PDGF-BB(AUC＝0.72)能够较好的区分易感ARTI儿童和非易感儿童；联合指标效果更佳(AUC＝0.81)。同时单一TIMP-1和联合指标对于易感ARTI儿童和健康儿童也有较好的诊断价值(TIMP-1：AUC＝0.83，联合：AUC＝0.83)。

实施例3.

验证血清标志物诊断价值的独立性

ARTI大部分是由呼吸道病毒感染引起，有研究表明一些病毒(如呼吸道合胞体病毒、鼻病毒)可能是呼吸道疾病(如哮喘、过敏性鼻炎等)的危险因素，儿童早期感染这些病毒会与后续疾病的发生显著相关。为排除病毒因素可能对儿童易感ARTI造成影响，本发明对主要呼吸道病毒(鼻病毒HRV，肠道病毒HEV，流感病毒IFV，呼吸道合胞体病毒RSV)以及其它呼吸道中大量存在指环病毒(TTV，TTMV和TTMDV)进行分析。

3.1常见病毒的检测

对上述易感儿童(48人，48份样本)和非易感儿童(61人，164份样本)的对应鼻咽拭子样本就行处理，采用Qiagen viral mini kit提取总核酸，-80度保存备用。

采用RT-qPCR方法对鼻病毒HRV，肠道病毒HEV，流感病毒IFV，呼吸道合胞体病毒RSV进行检测，每个反应加入5ul待测核酸。具体反应步骤为50℃30分钟，95℃ 15分钟，94℃下循环45次15秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒。采用高通量测序(NGS)方法检测指环病毒(TTV，TTMV和TTMDV)，待测核酸利用Illumina Hiseq2000进行测序。

3.2病毒与儿童易感ARTI相关性分析

将易感ARTI组和非易感组的几种病毒进行比较(图5)，采用Fisher精确检验，结果发现这7种常见的呼吸道病毒并不与儿童的ARTI易感性相关。

3.3病毒对候选血清标志物的影响

对上述这7种常见的呼吸道病毒对候选血清标志物TIMP-1和PDGF-BB的表达影响进行分析(图6)，非参数检验结果表明所有检测的病毒不管是阴性或者阳性，均不会对易感儿童和非易感儿童血清中TIMP-1和PDGF-BB的表达造成显著的影响。

综上所述，血清标志物TIMP-1和PDGF-BB，尤其是联合两者时可作为独立的、具有较好的灵敏度和特异性的，用来评估判断儿童对ARTI易感性的参考指标。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种生物标志物集合的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于评估待测对象的ARTI患病风险或待测对象ARTI诊断，其中，所述生物标志物集合包括选自下组的1种或2种生物标志物：TIMP-1、PDGF-BB、或其组合，所述的对象为婴幼儿。

2.一种ARTI疾病早期辅助筛查系统，其特征在于，所述系统包括：

(a)ARTI相关疾病特征输入模块，所述ARTI相关疾病特征输入模块用于输入某一对象的ARTI相关疾病特征；

其中所述的ARTI相关疾病特征包括选自下组A的1种或2种：TIMP-1、PDGF-BB、或其组合；

(b)ARTI相关疾病判别处理模块，所述处理模块对于输入的ARTI相关疾病特征，按预定的判断标准进行评分处理，从而获得风险度评分；并且将所述风险度评分与ARTI相关疾病的风险度阈值进行比较，从而得出辅助筛查结果，其中，当所述风险度评分高于所述风险度阈值时，则提示该对象患ARTI相关疾病的风险高于正常人群；当所述风险度评分低于所述风险度阈值时，则提示该对象患ARTI相关疾病的风险高于正常人群；和

(c)辅助筛查结果输出模块，所述输出模块用于输出所述的辅助筛查结果，所述的对象为婴幼儿。

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