CN106011303A

CN106011303A - 一种与儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用

Info

Publication number: CN106011303A
Application number: CN201610640360.7A
Authority: CN
Inventors: 郭锡熔; 尤梁惠; 季晨博; 崔县伟; 祝丽君; 李沄
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2016-08-08
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-08-08
Also published as: CN106011303B

Abstract

本发明公开了一种与儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用。所述标志物为miR‑26b、miR‑222、miR‑146a、miR‑146b中一种或多种的组合。本发明还提供了一种儿童肥胖早期诊断试剂盒。本发明的标志物从微观角度诊断儿童肥胖及预警儿童发生肥胖的风险，并且操作简单，结果精确客观可靠，能够很好地将肥胖组和正常组区分开，可以准确、敏感的评价儿童肥胖、预警肥胖发生风险，仅需提供血样即可进行，无需其他组织样本，大大提高了临床应用的可能性与可行性，为临床医生制定早期预防和干预方案提供指导依据。

Description

一种与儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及的是基因工程和医学领域，具体涉及一种与儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物及其应用。

背景技术

随着国家的繁荣富强，我国居民的生活水平日益提高，特别是改革开放以来，人们生活方式也发生了巨大的变化。经济水平的提高以及机械化进程加快，导致居民劳动强度和体力活动水平下降，生活水平的提高导致以高脂肪、低碳水化合物为主流饮食；使肥胖发生率在城乡各类人群中迅速提高，成为严重危害居民健康的流行病。肥胖流行的危害也日益被广大群众认知，肥胖不仅是可以导致心血管疾病和糖尿病，而且是癌症等慢性疾病的诱因。儿童期肥胖会使成年期肥胖、早逝和残疾出现的几率更大。除了未来风险升高之外，肥胖儿童还会经历呼吸困难、骨折风险升高、高血压、心血管疾病的早期征兆、胰岛素抵抗及心理影响。肥胖目前已被世界卫生组织列为威胁人类健康的十大疾病之一。然而，作为一个迅速变胖的国家，目前人缺乏有效的治疗方法；因此寻找有效的防治手段成为研究者关注的焦点。

关于肥胖人群的组成分析发现，一个显著的特征吸引了研究者的注意，全球儿童肥胖呈不断增加的趋势。据世界卫生组织(WHO)统计，全球5岁以下的超重和肥胖儿童约有2200万，发展中国家有1700万，而且近年来呈现快速的增长趋势。这种快速的增长方式并非局限在发达国家，中东地区和北非，加勒比海和拉丁美洲的儿童肥胖发生率已逼近发达国家水平。我国肥胖人群同样呈现低龄化趋势，肥胖儿童成为重要的组成部分。据一项在关于儿童及小学生肥胖情况调查显示，北京、上海等城市的儿童肥胖率、超重率分别为13.1％和12.9％，小学男、女生肥胖率分别为15.8％和10.3％，超重率分别为14.2％和11％。调查显示，男生发生肥胖的危险性约为女生的1.5倍，男生肥胖率在12岁时达到峰值，为19.3％；女生肥胖率在13岁时达到峰值，为13.1％^[9]。调查还显示，小学生肥胖率为13.6％，明显高于学龄前儿童10.7％和初中生10.2％的肥胖率。另据介绍，我国少年儿童肥胖率东北地区最高，为13.2％；华东地区次之，为12.2％；中南地区最低，为10.2％。以上统计可见，我国的儿童肥胖防治工作已迫在眉睫。

目前，用于诊断肥胖的方法主要分为两大类：简易测量法和仪器测量法。简易测量法中常用的肥胖指标分别是：体质指数(Body Mass Index，BMI)、腰臀比、腰围、腰围身高比、皮褶厚度；仪器测量法中的主要测量方法为：断层摄像法、超声波法、双能X线吸收法、生物电阻抗分析法等。简易测量法简便且易操作，因此也多采用此法。在流行病学研究和医疗机构大多采用体质指数来判定超重与肥胖及分析体重与疾病的关系。2006年4月，世界卫生组织发布了0～5岁儿童生长发育参照标准，包括年龄别体重、身长别体重、年龄别体重、年龄别身长和年龄别BMI曲线。由于受不同种族和不同地域的影响，同一BMI水平对人体的影响并不完全一致。长期以来不同国家和研究者使用的儿童青少年超重肥胖的判定指标和标准不统一，从而导致出现不同的患病率。在根据肥胖流行趋势采取公共卫生措施时，要充分认识到由于诊断方法学不同导致检出率的迥异。因此发现一种明确而有效的生物标志，对诊断儿童肥胖的发生具有重要意义，有助于肥胖及心血管疾病、肌肉骨骼疾患、胰岛素抵抗等非传染疾病的预防、早期干预和控制。

microRNA(miRNAs)是一类重要的基因表达调控因子，长度大小在18-22个碱基的非编码单链小分子RNA，它由一段具有发夹结构的单链RNA前体经Drosha酶和Dicer酶剪切产生。通过与靶mRNA3’端非编码区互补配对，使靶mRNA分子的翻译受到抑制或引起特异性切割，从而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，且成熟的miRNA在不同物种间进化上高度保守。miRNA不仅存在于各种组织和细胞中，还可以稳定存在于循环血液中。作为21世纪生命科学研究重大发现之一，近年来已经鉴定出了大量的miRNA，研究表明miRNA在许多生物学过程中发挥着至关重要的作用，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等，并与多种人类疾病存在重要的关联。

肥胖作为一种严重的代谢性疾病，主要由于白色脂肪组织在体内的过度积聚造成的；而脂肪组织的积累在细胞水平上主要取决于脂肪细胞数目的多少和脂肪细胞体积的大小。间充质干细胞经定向分化为脂肪前体细胞，脂肪前体细胞经诱导分化为成熟的脂肪细胞；脂肪细胞的数量主要取决于间充质干细胞的分化，脂肪细胞的体积主要取决于前体脂肪细胞分化。因此，脂肪细胞的成脂分化(Adpogennesis)一直都是肥胖研究的热点。已有的研究证实，无论人还是动物脂肪细胞分化前后，miRNA表达水平存在显著差异，miRNA可以通过调控靶基因表达促进或抑制脂肪细胞的分化，参与肥胖的发生。

哪些miRNA在脂肪细胞分化前后存在差异，成为大家首先关注的方向。新的筛选技术如测序、芯片技术等不断出现，为研究者提供了丰富的手段。借助基因芯片技术研究，2004年，Esau等发现人前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞的miRNA表达254种miRNA，其中有22种表达的miRNA差异显著。随后Kajimoto等检测了3T3-L1前体脂肪细胞、诱导分化第1天细胞和诱导分化成熟第9天细胞中miRNA的表达，筛选出80种差异表达的miRNA。结合文献报道对其中22种miRNA进行了验证，发现miR-422b、miR-183、miR-224在成熟脂肪细胞中表达显著上调，而miR-182和miR-181a表达显著下调。研究者还矛盾的发现，在成脂分化过程中表达水平升高的miRNA(如miR-107、miR-103、miR-30c、miR-30a-5p、miR-422b、miR-148a和miR-143)，在肥胖患者脂肪组织中表达水平降低，而在成脂分化过程中表达水平降低的miRNA(如miR-222和miR-221)则表达水平上调。分析原因认为可能与脂肪组织局部的慢性炎症环境有关。

这些差异表达的miRNA是否具有真正的生物学功能，成为大家进一步研究的目标。研究发现，miRNA-143随人脂肪前体细胞(网膜脂肪来源)分化成熟而表达逐渐增加，成为首个报道的与脂肪细胞分化相关的miRNA。RNA干扰miRNA-143表达抑制后可上调PPARγ、LPL、GLUT4和AP2等脂肪细胞分化关键基因的表达，双荧光素酶报告系统结果显示ERK5是miR-143的作用靶基因。miR-27家族成员miR-27a、miR-27b在ob/ob肥胖模型小鼠脂肪组织中显著高表达，在成脂分化过程中表达水平逐渐降低，提示其可能与肥胖发生密切相关。miR-27a过表达可以下调其靶基因PPARγ的表达抑制脂肪细胞分化，由于PPARγ作用发生在早期，因而miR-27a也主要影响早期分化。miRNA调控脂代谢的途径是复杂多样的，首先miRNA可以从脂质的合成、运输和氧化3个方面调控，其次miRNA调控靶基因的形式可以为“一对多”或“多对一”，也就是说一种miRNA可以调控多种靶基因表达，同时多种miRNA也可以调控一种mRNA。

生物标记物是随着分子生物学技术和免疫学技术的发展而提出的一类细胞生物特异性标记。例如：来自凯斯西储大学的研究人员鉴别出了miRNA-181a生物标记物，证实其有望用于预测一种常见的卵巢癌形式的治疗反应，改善患者的预后；另有研究人员鉴别出了与基底细胞样乳腺癌密切相关的生物标记物START3，为开发出新的疗法治疗这种致命的癌症提供了靶点，这些生物标记物的鉴定展现了潜在的临床应用价值。虽然肿瘤组织中的miRNA可以作为一种新的肿瘤标记物，但是肿瘤组织的miRNA就必需要进行手术或穿刺等才能获得，所以组织miRNA不能满足早期诊断需要，不能适用于广泛的筛查和预防。基于此，研究人员将目光投向了常规体检就可以收集到的血液。2008年研究人员从血清/血浆中发现了大量稳定的来源于组织/器官的miRNA，之后多项研究从血清/血浆中鉴别出了包括恶性肿瘤、心血管疾病、风湿、阿兹海默症等疾病的miRNA生物标记物，对疾病的预测、预后以及诊断都具有一定的临床应用价值。而且血清/血浆的检测是无创的，非侵入的，因此其中的miRNA适用于普查和预防，为早期诊断服务。因此从血清/血浆中筛选到可以用于诊断儿童肥胖的早期标记物可以准确、敏感的评价早期、低水平的损害，提供早期预警，在很大程度上为临床医生制定早期预防和干预方案提供依据。

发明内容

技术问题：针对现有技术的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种与儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物。

本发明还要解决的技术问题是提供上述miRNA标志物的引物及探针。

本发明还要解决的技术问题是提供了上述miRNA标志物及其引物或探针在制备儿童肥胖诊断试剂盒中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种儿童肥胖诊断试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供的一种儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物，所述标志物为miR-26b、miR-222、miR-146a、miR-146b中一种或多种的组合。

上述的miRNA的序列分别为：miR-26b：UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU(SEQ ID NO.1)；miR-222：AGCUACAUCUGGCUACUGGGU(SEQ ID NO.2)；miR-146a：UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU(SEQ ID NO.3)和miR-146b：UGAGAACUGA AUUCCAUAGG CU(SEQ ID NO.4)。

其中，上述标志物为miR-26b、miR-222、miR-146a和miR-146b。

上述的儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物的引物或探针。这些单独的引物或探针可以通过商业渠道购买获得，也可以在了解这些miRNA序列之后由技术人员自行设计合成，根据已知miRNA序列设计合成引物或探针的方法为本领域技术人员熟知的方法。

其中，上述该miR-26b的探针为：Assay ID：000407；miR-222的探针为：AssayID：002276；miR-146a的探针为Assay ID：000468；miR-146b的探针为Assay ID：001097。(上述探针Assay均购自美国ABI公司)。

其中，上述的血清或血浆miRNA标志物在制备儿童肥胖早期诊断试剂盒中的应用。

上述的儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物的引物或探针在制备儿童肥胖早期诊断试剂盒中的应用。

上述的儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物的探针在制备儿童肥胖早期诊断试剂盒中的应用。

一种儿童肥胖早期诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清或血浆中miR-26b、miR-222、miR-146a和miR-146b。

其中，上述该诊断试剂盒含有血清或血浆中miR-26b、miR-222、miR-146a和miR-146b的引物或探针。

其中，上述该试剂盒含有所述的血清或血浆miRNA标志物的探针：该miR-26b的探针为：Assay ID：000407；miR-222的探针为：Assay ID：002276；miR-146a的探针为Assay ID：000468；miR-146b的探针为Assay ID：001097。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：miRNA区别于传统生物标志物，可以在血清/血浆中稳定存在，易于分离提取，不容易受反复冻融或pH变化的影响；并且血清/血浆的获得是微创的，将在很大程度上减轻患者的痛苦；最重要的是定量准确，将大大提高疾病诊断的灵敏度与特异度，因此该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于儿童肥胖的辅助诊断。本发明通过深度测序及RT-qPCR的方法发现肥胖儿童血清/血浆中异常表达的miRNAs，并且表达水平与儿童体质量指数及体脂指数具有显著相关性，揭示其在儿童肥胖诊断中的宝贵价值。本发明获得了肥胖儿童特异的血清/血浆中的miRNA标志物，为临床诊断儿童肥胖及预警儿童发生肥胖的风险等提供了巨大的便利。本发明的标志物从微观角度诊断儿童肥胖及预警儿童发生肥胖的风险，并且操作简单，结果精确客观可靠，能够很好地将肥胖组和正常组区分开，可以准确、敏感的评价儿童肥胖、预警肥胖发生风险，仅需提供血样即可进行，无需其他组织样本，大大提高了临床应用的可能性与可行性，为临床医生制定早期预防和干预方案提供指导依据。

附图说明

图1、肥胖组儿童血清/血浆与对照组儿童血清/血浆中miR-26b表达qPCR验证图；

图2、肥胖组儿童血清/血浆与对照组儿童血清/血浆中miR-222表达qPCR验证图；

图3、肥胖组儿童血清/血浆与对照组儿童血清/血浆中miR-146a表达qPCR验证图；

图4、肥胖组儿童血清/血浆与对照组儿童血清/血浆中miR-146b表达qPCR验证图；

图5、儿童血清/血浆中miR-26b表达水平与儿童体质量指数相关性比较图；

图6、儿童血清/血浆中miR-222表达水平与儿童体质量指数相关性比较图；

图7、儿童血清/血浆中miR-146a表达水平与儿童体质量指数相关性比较图；

图8、儿童血清/血浆中miR-146b表达水平与儿童体质量指数相关性比较图；

图9、儿童血清/血浆中miR-26b表达水平与儿童体脂含量相关性比较图；

图10、儿童血清/血浆中miR-222表达水平与儿童体脂含量相关性比较图；

图11、儿童血清/血浆中miR-146a表达水平与儿童体脂含量相关性比较图；

图12、儿童血清/血浆中miR-146b表达水平与儿童体脂含量相关性比较图；

图13、用于儿童肥胖发生诊断效率的miR-26b的ROC曲线图。

图14、用于儿童肥胖发生诊断效率的miR-222的ROC曲线图。

图15、用于儿童肥胖发生诊断效率的miR-146a的ROC曲线图。

图16、用于儿童肥胖发生诊断效率的miR-146b的ROC曲线图。

图17、用于儿童肥胖发生诊断效率的miR-26b、miR-222、miR-146a和miR-146b组合的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1：

1、试验材料：Trizol reagent，TaqMan逆转率试剂盒，Universal MasterMix II均购自Life technologies公司；氯仿，无水乙醇均购自国药集团药业股份有限公司；DEPC水购自上海碧云天生物技术有限公司。

2、样本收集和样本资料的整理：

本发明共计使用儿童血液样本352例，其中肥胖组样本136例，正常组样本216例；两组样本之间年龄无显著差异(P>0.05)，BMI差异显著(P<0.001)，此外两组间血脂、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白均差异显著(P<0.05)。分别选取肥胖儿童和正常儿童血清样本各15例，抽提总RNA后，每5个样本混合为一个样本进行深度测序分析(Deep sequencing)。

3、血清总RNA的抽提

1)取300μl血清样本，于去酶EP管中，冰上放置；加入3倍体积的Trizol，充分震荡后加入终浓度为10^-4pmol/μl人工合成的线虫cel-mir-39作为外参，用于标准化提取、反转录及控制后续的定量检测全过程操作的样本间差异(1.2ml体积中加入10μl 0.2μM的cel-mir-39)，分成2个EP管继续后续实验。

2)静置15分钟后加入等体积的氯仿，充分震荡，静置15分钟后，12000g，4℃，离心15分钟(上清可再次加入等体积氯仿萃取)；

3)将上清转移至新的去酶EP管中，加入1.5倍体积无水乙醇，轻轻混匀转移700μl至QIAGEN miRNA抽提试剂盒吸附柱上，≥8000g，4℃，离心30s，弃液(重复此步骤)；

4)取700μl Buffer RWT于吸附柱上，≥8000g，4℃，离心30s，弃液；取500μl Buffer RPE于吸附柱上，≥8000g，4℃，离心30s，弃液；取500μl Buffer RPE于吸附柱上，≥8000g，4℃，离心30s，弃液；将吸附柱置于新的EP管中，≥8000g，4℃，离心2min。

5)取适量Depc水(30μl)于吸附柱上，静置2分钟，≥8000g，4℃，离心1min，测量RNA浓度，冰上放置待用或-80℃保存。

4、深度测序(Deep sequencing)：本实验样本测序在华大基因进行。小分子RNA是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。基于HiSeq高通量测序技术的小RNA数字化分析，采用边合成边测序(SBS-sequencing by synthesis)，可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，一次性获得数百万条小分子RNA序列，能够快速全面地鉴定该物种在该状态下的小分子RNA并发现新的小分子RNA，构建样品之间的小分子RNA差异表达谱，为小分子RNA功能研究提供有力工具。

5、根据Deep sequencing测序结果，依据miRNA差异性和表达丰度高低，我们选择miR-222、miR-375、miR-27a、miR-30a、miR-130b、miRNA-206、miRNA-26b、miRNA-320a、miRNA-197、miRNA-19a、miRNA-30d、miRNA-146a、miRNA-99b、miRNA-146b、let-7d、miRNA-15b、miRNA-21和miRNA-20a等18个miRNA设计逆转录和qRT-PCR的探针(探针ID分别为Taqman MicroRNAassay-has-mir-197(Assay ID:000497)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-146a(AssayID:000468)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-130b(Assay ID:000456)，TaqmanMicroRNA assay-has-mir-222(Assay ID:002276)，Taqman MicroRNAassay-has-mir-486(Assay ID:001278)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-148a(AssayID:000470),Taqman MicroRNA assay-has-mir-21(Assay ID:000397),TaqmanMicroRNA assay-has-mir-375(Assay ID:000564)，Taqman MicroRNAassay-has-mir-146b(Assay ID:001097)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-99b(AssayID:000436),Taqman MicroRNA assay-has-mir-30a(Assay ID:000416)，TaqmanMicroRNA assay-has-mir-27a(Assay ID:000408)，Taqman MicroRNAassay-has-mir-30d(Assay ID:000420),Taqman MicroRNA assay-has-mir-let-7d(AssayID:002283)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-26b(Assay ID:000395)，TaqmanMicroRNA assay-has-mir-15b(Assay ID:000390),Taqman MicroRNAassay-has-mir-19a(Assay ID:000395)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-20a(AssayID:000580)，均购自美国ABI公司)。对“肥胖儿童”组和“正常儿童”组血清单个个体进行miRNA的实时荧光定量PCR检测。用探针法进行qRT-PCR检测，每个样本连续检测3次，对整个实验过程严格质控，并采用盲法，以避免偏倚出现。

6、探针法：使用ABI公司的逆转录试剂盒(Taqman MicroRNAreversetranscription kit+Taqman gene expression master mix+Taqman assay-has-mir-26b/Taqman MicroRNA assay-has-mir-222/Taqman MicroRNA assay-has-mir-146a/TaqmanMicroRNA assay-has-mir-146b/+Taqman MicroRNA assay-cel-mir-39)。

1)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录体系为：100mM dNTPs0.15μl，50U/μl Reverse Transcriptase 1.00μl，10*Reverse Transcription Buffer 1.50μl，20U/μl RNase Inhibitor 0.19μl，Nuclease-free water 4.16μl以及3μl逆转录引物和5μl上述提取的RNA样品。逆转录反应热循环为：16℃孵育30分钟，42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟，4℃维持至取出，-20℃保存备用。

2)q-PCR：探针法的q-PCR的反应体系为：cDNA 1μl，miRNAs的探针1μl，Taqman gene expression master mix 10μl及DEPC水8μl。反应步骤为95℃，5min预变性进行一个循环，95℃、15s变性，60℃、1min退火延伸进行45个循环，使用QuantStudio^TM6Flex荧光定量PCR仪操作。

7、数据处理与分析

7.1)采用IBM SPSS 20.0统计软件进行录入及数据处理，计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，采用t检验分析两组样本间差异，采用Pearson相关分析分析数据相关性。

7.2)深度测序分析(Deep sequencing)：肥胖组儿童目的miRNA的相对表达量(H2)与正常儿童目的miRNA的相对表达量(H1)比值的对数值(以2为底数)大于1者(表示上调)；或者小于0者(表示下调)进行探针法qRT-PCR验证实验。共选出18个miRNAs。(见表1)

表1深度测序结果

7.3)探针法qRT-PCR验证实验数据分析：

1)用方程-△△Ct表示两组样本血清miRNA的相对表达量，其中△△Ct＝△(C_T _肥胖-△C_Tcel-mir-39)-(△C_T正常-△C_Tcel-mir-39)，在每个样本提取RNA时加入人工合成的cell-mir-39的成熟RNA作为参照，计算血清/血浆中miRNA的相对表达量。以上数据，即Ct值均可用荧光定量检测仪配带的检测软件读出。最后数据用IBM SPSS 20.0进行统计分析。

2)将上面筛选出来的18条miRNAs，进行定量PCR验证，以化学合成的cel-miR-39做为外参。结果发现在136例肥胖儿童与216例正常儿童对照组中，有4条miRNAs在肥胖组儿童血清/血浆中表达高于对照组，且结果具有显著统计学意义。这4条miRNAs分别是miR-26b、miR-222、miR-146a、miR-146b(见图1-4)。

3)为了进一步证实这4种差异miRNA与肥胖发生的相关性，评估其作为儿童肥胖诊断的可能性和可行性。我们进一步借助统计相关性分析中Pearson相关性分析，分析这4种差异miRNAs的表达水平与儿童体质量指数以及体脂含量相关性。结果发现其中4条miRNAs(miR-26b、miR-222、miR-146a、miR-146b)表达水平与儿童体质量指数具有显著相关性，其中miR-26b(R＝0.416)、miR-222(R＝0.347)、miR-146a(R＝0.455)、miR-146b(R＝0.379)表达水平与体质指数相关性显著(见图5-8)；并且miR-26b(R＝0.315)、miR-222(R＝0.351)、miR-146a(R＝0.410)、miR-146b(R＝0.301)表达水平与体脂含量相关性显著(见图9-12)。

4)对这4个miRNAs用于儿童肥胖发生诊断效率，绘制ROC曲线(ReceiverOperating Curve)计算AUC(Area Under the ROC Curve)(见图13-16)。

miR-26b以78.8％的AUC将肥胖组和正常组儿童分开，最佳临界点的灵敏度为：73.6％，特异度为：75.7％。

miR-222以66.4％的AUC将肥胖组和正常组儿童分开，最佳临界点的灵敏度为：80.5％，特异度为：43.2％。

miR-146a以83.7％的AUC将肥胖组和正常组儿童分开，最佳临界点的灵敏度为：66.7％，特异度为：88.5％。

miR-146b以78.3％的AUC将肥胖组和正常组儿童分开，最佳临界点的灵敏度为：81.6％，特异度为：66.2％。

miR-26b、miR-222、miR-146a和miR-146b组合以85.4％的AUC将肥胖组和正常组儿童分开，最佳临界点的灵敏度为：82.8％，特异度为：75.7％。

以上结合附图对本发明的实施方式做出详细说明，但本发明不局限于所描述的实施方式。对本领域的普通技术人员而言，在本发明的原理和技术思想的范围内，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变形仍落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物，其特征在于，所述标志物为miR-26b、miR-222、miR-146a、miR-146b中一种或多种的组合。

2.根据权利要求1所述的儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物，其特征在于，所述标志物为miR-26b、miR-222、miR-146a和miR-146b。

3.权利要求1或2所述的儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物的引物或探针。

4.根据权利要求3所述的血清或血浆miRNA标志物的探针，其特征在于，所述miR-26b的探针为Assay ID：000407；miR-222的探针为Assay ID002276；miR-146a的探针为Assay ID：000468；miR-146b的探针为Assay ID：001097。

5.权利要求1或2所述的血清或血浆miRNA标志物在制备儿童肥胖早期诊断试剂盒中的应用。

6.权利要求3所述的儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物的引物或探针在制备儿童肥胖早期诊断试剂盒中的应用。

7.权利要求4所述的儿童肥胖相关的血清或血浆miRNA标志物的探针在制备儿童肥胖早期诊断试剂盒中的应用。

8.一种儿童肥胖早期诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测血清或血浆中miR-26b、miR-222、miR-146a和miR-146b。

9.根据权利要求8所述的儿童肥胖早期诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有血清或血浆中miR-26b、miR-222、miR-146a和miR-146b的引物或探针。

10.根据权利要求8所述的早期诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求4所述的血清或血浆miRNA标志物的探针。