CN106250717B - 急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型及其构建方法和应用。该构建方法包括获取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的差异表达的miRNA及差异表达的转录因子、以及构建miRNA‑转录因子调控网络的模型，得到核心miRNA与核心转录因子等步骤。构建得到的miRNA与转录因子模型可以构建诊断探针、芯片或试剂、设备等，为急性髓性白血病患者诊断提供中间结果信息或参考信息。本发明的急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型丰富了microRNA介导的网络调控内容，揭示了microRNA与转录因子介导的调控网络在AML中的作用机制。研究结果将为开发抗白血病药物或生物制品奠定基础，具有良好的应用价值。

Description

急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统及其构建方法和 应用

技术领域

本发明涉及一种疾病研究领域，尤其是涉及一种急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型及其构建方法和应用。

背景技术

急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一类髓系造血干/祖细胞起源的克隆增生性的急性血液系统恶性肿瘤，好发于中、老年人。65岁以上的老年患者约占AML的54％。与实体瘤的局部浸润性生长不同，AML容易全身播散，侵犯各器官、组织并导致致命性的感染、出血，恶性程度高，其死亡率在血液系统恶性肿瘤中居于首位，约占15％。60岁以下的AML患者其远期生存率为30％～40％，60岁以上的患者远期生存率仅为10％，而未经治疗的患者平均生存期仅3个月左右，预后较差。AML严重危害着人类健康，需要长期化疗或进行骨髓/干细胞移植，给患者及家庭造成了沉重的心理压力和经济负担。AML病因复杂，其发病机制尚未完全清楚，可能涉及染色体异常、基因突变、放射、化学因素等多种机制。随着近年来对AML发病机制研究的不断深入，发现了一些具有价值的诊断标志物和治疗的分子靶点，同时也提出了一些更有针对性的治疗方案且取得了一定的效果。但对于老年的AML患者，包括化疗、自体外周血干细胞移植等多种方法都不能提高总体的疗效，其预后在最近30年间没有明显改善，尤其是65岁以上的患者其诊断后l、2年内的死亡率分别为86％、94％。因此，迫切需要对急性髓性白血病的致病机理进行研究，以寻找新的分子靶点和治疗方法。

发明内容

基于此，有必要提供一种可用于急性髓性白血病致病机理研究的急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型及其构建方法和应用。

一种急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型的构建方法，包括如下步骤：

步骤S1：获取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的差异表达的miRNA及差异表达的转录因子；

步骤S2：根据所述差异表达的miRNA，获取各miRNA对应的靶基因；

步骤S3：将得到的各miRNA对应的靶基因与急性髓性白血病相关的基因和转录因子取交集，得到miRNA→靶基因配对及miRNA→靶转录因子配对；

步骤S4：提取miRNA→靶基因配对及miRNA→靶转录因子配对中相应的miRNA及其靶基因进行转录因子结合位点的分析判断；

步骤S5：将分析判断得到的转录因子与所述差异表达的转录因子取交集，并根据所述miRNA→靶基因配对及miRNA→靶转录因子配对中提取的所述miRNA及其靶基因，得到转录因子→miRNA配对及转录因子→靶基因配对；

步骤S6：合并所述转录因子→miRNA配对、所述转录因子→靶基因配对、所述miRNA→靶基因配对及所述miRNA→靶转录因子配对，构建miRNA-转录因子调控网络的模型，得到由核心miRNA与核心转录因子构成的miRNA-转录因子调控网络的模型。

在其中一个实施例中，在所述步骤S1中，获取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的差异表达的miRNA包括如下步骤：

步骤S111，提取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的总RNA；

步骤S112，对提取的所述总RNA构建小分子RNA文库；

步骤S113，对构建的小分子RNA文库进行DNA簇生成和测序分析；

步骤S114，对测序分析结果进行去杂处理，得到干净序列；

步骤S115，将得到的所述干净序列与人类基因组序列进行比对分析，去除非miRNA的非编码序列和mRNA的降解片段，得到miRNA序列；

步骤S16，比较急性髓性白血病患者与健康对照组的miRNA表达量，得到差异表达的miRNA。

在其中一个实施例中，在所述步骤S1中，获取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的差异表达的转录因子包括如下步骤：

步骤S121，提取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的组织核蛋白；

步骤S122，分别对得到的两组组织核蛋白进行转录因子芯片杂交分析；

步骤S123，对两组所述转录因子芯片杂交分析的结果进行比对分析，得到差异表达的转录因子。

在其中一个实施例中，在所述步骤S2中，应用miRanda、TargetScan、PicTar及miRTarBase四个数据库，选择miRNA差异表达倍数不小于2的miRNA进行靶基因分析，具体是将miRanda、TargetScan及PicTar三个数据库中的任意两个数据库分析得到的靶基因与miRTarBase数据库中分析得到的靶基因取并集，得到所述各miRNA对应的靶基因，并且在配对过程中，将转录因子也作为基因参与miRNA的靶基因分析。

在其中一个实施例中，在所述步骤S3中，是将得到的所述miRNA对应的靶基因与MalaCards数据库中的急性髓性白血病相关的基因和转录因子取交集，得到miRNA-靶基因配对及miRNA-靶转录因子配对。

在其中一个实施例中，在所述步骤S4中，是取基因转录起始点上游5000bp到下游1000bp的区域，应用UCSC Genome Browser中的TFBS Conserved Track数据库进行转录因子结合位点的分析判断。

在其中一个实施例中，在所述步骤S5中，是将分析判断得到的转录因子与所述差异表达的转录因子中差异表达倍数不小于2的转录因子取交集。

在其中一个实施例中，在所述步骤S6中，使用Gephi软件对构建的miRNA-转录因子调控网络的模型进行分析处理。

一种如上述任一实施例所述的急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型的构建方法得到的急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型，该模型由miR-335-5p、miR-124-3p、miR-16-5p、miR-30a-5p、miR-26b-5p、miR-23b-3p、miR-15a-5p、miR-23a-3p、miR-338-5p、miR-30c-5p、miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-181b-5p、miR-20a-5p、miR-144-3p、miR-192-5p、miR-424-5p、let-7e-5p、miR-125b-5p、miR-186-5p、miR-195-5p及miR-9-5p中的至少一个表达上调或下调的核心miRNA及TCF3、MYC、MEF2A、NFKB1、MAX、FOXO1、NFKB2、NFE2、NR2F1、NKX2-2及FOXL1中的至少一个表达上调或下调的核心转录因子构成。

上述急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型在制备诊断急性髓系白血病的试剂或芯片中的应用。

上述构建的miRNA与转录因子模型可以构建诊断探针、芯片或试剂、设备等，为急性髓性白血病患者诊断提供中间结果信息或参考信息。由于急性髓性白血病也是一种涉及多器官的综合性病征，在诊断是否是急性髓性白血病时，还需要结合其他的诊断结果进行判定。本发明的miRNA与转录因子模型丰富了miRNA介导的网络调控内容，揭示了miRNA与转录因子介导的调控网络在AML中的作用机制。该研究结果将为开发抗白血病药物或生物制品奠定基础，具有良好的应用价值。

附图说明

图1为样本总RNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2为miRNA测序流程图；

图3为miRNA测序数据分析流程图；

图4为急性髓性白血病miRNA表达谱散点图；

图5为急性髓性白血病miRNA测序结果的qPCR验证结果图；

图6为转录因子芯片操作及数据分析流程图；

图7为急性髓性白血病转录因子表达谱散点图；

图8为急性髓性白血病转录因子芯片检测结果的qPCR验证结果图；

图9为急性髓性白血病miRNA-转录因子调控网络的构建与分析流程图；

图10为急性髓性白血病的miRNA-转录因子调控网络示意图；

图11为GO分析网络节点主要参与的生物学过程示意图；

图12为GO分析网络节点主要分布的细胞组分示意图；

图13为GO分析网络节点主要的分子功能示意图；

图14为网络节点富集的急性髓性白血病信号通路示意图；

图15为网络节点富集的癌症信号通路示意图；

图16为网络节点富集的Jak-STAT信号通路示意图；

图17为中心节点miR-335-5p介导的miRNA-转录因子亚调控网络示意图；

图18为中心转录因子MYC介导的miRNA-转录因子亚调控网络示意图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型及其构建方法和应用作进一步详细的说明。

一、急性髓性白血病的microRNA(即miRNA)与转录因子的调控机制的研究

样本来源：15例急性髓性白血病患者的骨髓标本(病例组)来自于深圳市人民医院2012年8月～2014年2月的患者，其中男性9例，女性6例，年龄18～77岁，平均年龄40.0岁。全部AML患者均符合FAB国际分型的诊断标准，且均为初发病例，在采样前均未接受化疗或放疗。10例骨髓象正常的贫血或发热查因患者的骨髓标本(健康对照组)收集自广东医学院附属医院2012年3月～2014年1月的住院患者，其中男性6例，女性4例，年龄10～73岁，平均年龄39.0岁。本实施例的研究通过了深圳市人民医院以及广东医学院伦理委员会的讨论通过，并且取得了患者的同意。

可理解，在其他实施例中，该骨髓样本也可以取自一些癌症样本冻存库或者癌症治疗机构。

1、miRNA测序、数据分析及测序结果的验证

1.1样本总RNA提取和定量

(1)骨髓样本的预处理：向骨髓样本中加入2ml的TRIzol试剂，用电动匀浆器进行匀浆。然后按TRIzol说明书提取组织总RNA，并加入无RNase的DNaseI进行处理以去除基因组DNA的污染。

(2)使用NanoDrop ND-1000(美国NanoDrop公司)全波长紫外/可见分光光度计在230nm、260nm以及280nm波长分别测定提取的总RNA的吸光度(OD)值，计算RNA样本的浓度并分析其纯度，结果如表1所示。

表1样本总RNA的质量分析

(3)使用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，如图1所示，结果证明提取的总RNA完整。

1.2miRNA测序

测序流程如图2所示，具体包括如下步骤：

(1)测序文库的构建及质量评估：将总RNA样本在T4RNA连接酶的作用下在3’端和5’端分别加上small RNA(小分子RNA)测序接头其中，5'接头序列：GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC，3'接头序列：TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG，所得产物经RT-PCR扩增以及聚丙烯胺凝胶电泳纯化生成small RNAs文库，然后通过Agilent 2100Bioanalyzer(美国Agilent公司)对文库进行定量和质量分析。片段长度峰值在130～155nt且定量≥1fmol，说明文库质量完好，可用于测序文库的簇生成以及Illumina测序分析。

(2)DNA簇生成和Illumina测序：将small RNAs文库样本稀释至8pmol，使用Illumina cBot簇生成系统(美国Illumina公司)按TruSeq Rapid SR cluster试剂盒(美国Illumina公司)说明书进行测序文库的克隆扩增，然后在Illumina HiSeq 2000测序仪(美国Illumina公司)上按照TruSeq Rapid SBS试剂盒(美国Illumina公司)说明书进行高通量深度测序。

1.3测序数据分析

测序数据分析流程如图3所示，具体包括如下步骤：

(1)将Illumina HiSeq 2000测序所得的扫描图像输入Off-Line Basecaller软件进行图像分析，读取碱基序列，获得原始数据；并进行去接头、去污染、去低质量、去冗余、合并重复序列等处理，获得高质量的干净序列，序列长度为16～30nt，然后进行序列长度分布分析。

(2)利用SOAP 2.0软件将高质量干净序列与人基因组序列进行比对分析(最多允许2个碱基错配)，再将匹配序列分别与基因组重复序列、GenBank数据库、Rfam数据库、UCSC数据库和piRNA数据库进行比对，尽可能去除rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA、piRNA非编码序列和mRNA降解片段；余下序列与miRBase数据库进行比对分析，然后再按照rRNAetc(上述rRNA、tRNA、snRNA及snoRNA等非编码RNAs)＞known miRNA(已知miRNA)＞repeat(重复序列片段)＞exon(外显子)＞intron(内含子)的优先级顺序对small RNAs分子进行分类注释，没有注释的匹配small RNAs序列用“Unanno”表示。

(3)样本间miRNA的差异表达分析：首先对miRNA的表达丰度作标准化处理[公式：标准化表达丰度(TPM)＝miRNA表达丰度/样本中全部miRNA的总表达丰度×10⁶]。在每一个miRNA的标准化表达丰度值中都加入10TPM来计算差异表达比值，计算公式为：miRNA差异表达比值＝(AML组miRNA的标准化表达丰度值+10TPM)/(对照组miRNA的标准化表达丰度值+10TPM)。若miRNA在两组样本间的差异表达比值≥2.0或≤0.5，则认为该miRNA在两组样本间具有明显的表达差异，其中，差异表达比值≥2.0表示差异表达倍数≥2.0且表达上调；差异表达比值≤0.5表示差异表达倍数≥2.0且表达下调；而0.5＜比值＜2.0则为表达差异不显著。若miRNA在两组样本中的标准化表达丰度都小于1TPM，则该miRNA不参与差异表达分析。

1.4miRNA测序结果

如图4所示，本实施例已经完成对急性髓性白血病的miRNA测序工作，与健康对照组相比，从中鉴定出差异表达的miRNA 346个，其中，265个的表达量上调(即表达上调)，81个的表达量下调(即表达下调)。

1.5miRNA测序结果的验证

为验证miRNA测序结果的可靠性，本实施例选择6个在测序检测中呈差异表达的miRNA，运用Stem-loop qPCR技术对病例组和健康对照组骨髓样本的miRNA表达水平进行分析。

(1)采用M-MLV反转录试剂盒(美国promega公司)进行miRNA的逆转录；在去RNase的PCR管中加入5×RT buffer 4μl，逆转录混合液3.5μl，miRNA逆转录引物(引物序列见表2)0.5μl，总RNA 1μg，然后用RNase-free水补充至20μl，轻轻混匀，在30℃10min，42℃60min，85℃10min条件下进行逆转录反应。

表2miRNA的逆转录引物序列

(2)在ABI PRISM 7500型qPCR仪(美国ABI公司)上进行qPCR反应。20μl的qPCR反应体系由5.0μl cDNA(1:20)、各0.5μl的上下游引物(引物序列见表3)、10μl的2×SYBR GreenSuperMix(美国Invitrogen公司)以及4μl RNase-free水所组成。

表3miRNA的qPCR引物序列

(3)以U6ncRNA作为内参照，采用2^－△△Ct法计算qPCR检测结果。

(4)如图5所示，qPCR检测结果验证了miRNA测序结果的可靠性。

2、转录因子(Transcription factors，TFs)芯片检测、数据分析及芯片结果的验证

2.1组织核蛋白的提取和定量

按照组织核蛋白抽提试剂盒(美国Panomics公司)说明抽提骨髓样本的组织核蛋白，使用Bradford法检测蛋白浓度，定量后分装，-80℃冻存。

2.2转录因子芯片杂交与检测

采用美国TranSignal^TM Protein/DNA转录因子芯片(美国Panomics公司，商品型号MA1215)进行芯片的杂交与检测。转录因子芯片操作流程见图6，具体包括如下步骤：

(1)组织核蛋白与探针的混合及孵育：将25μg的组织核蛋白抽提物与生物素标记的DNA探针混匀，15℃孵育30min，得到核蛋白/DNA探针复合物。

(2)分离探针：核蛋白/DNA探针复合物经20g/L琼脂糖凝胶在0.5×TBE电泳缓冲液中120V电泳20min，回收并纯化核蛋白/DNA探针复合物；然后按照Spin column separationsystem试剂盒(美国Panomics公司)说明书洗脱、分离出游离的探针。

(3)杂交：洗脱下来的探针95℃变性3min后迅速放置在冰上2min，随后置入杂交瓶里与芯片膜42℃杂交24h。

(4)检测：1×封闭缓冲液室温封闭芯片膜15min，加入HRP偶联链酶素亲和素抗体(1:500)，室温孵育15min，显影，X光片曝光。

2.3芯片检测结果分析

数据分析流程见图6，具体包括如下步骤：

(1)X光片上的图像用ImageScanner扫描仪扫描并转化成灰度的TIFF格式文件，用ScanAlyze软件将TIFF格式的图片的点阵灰度转换成数据。

(2)通过扣除扫描仪获取的背景值来修正原始数据，采用中值标准化修正值，即标准值。实验组标准值/对照组标准值比值≥2.0或≤0.5均判定差异有意义，其中比值≥2.0为表达上调，比值≤0.5为表达下调。

(3)如图7所示，本实施例已经完成急性髓性白血病的转录因子芯片检测工作，从中鉴定出差异表达的转录因子85个，其中76个呈表达上调，9个呈表达下调。

2.4芯片检测结果的验证

为验证转录因子芯片检测结果的可靠性，本实施例选择6个在芯片检测中呈差异表达的转录因子，运用qPCR技术对病例组和健康对照组骨髓样本的转录因子mRNA(信使RNA)表达水平进行分析，具体包括如下步骤：

(1)在去RNase的PCR管中加入5×RT buffer 4μl，Oligo(dT)0.5μl，10mmol/L的dNTP 2μl，RNase inhibitor 0.5μl，M-MLV0.5μl，总RNA 1μg，然后用RNase-free水补充至20μl，轻轻混匀，在30℃10min，42℃60min，85℃10min条件下进行逆转录反应。

(2)在ABI PRISM 7500型qPCR仪上进行qPCR反应。20μl的qPCR反应体系由5.0μlcDNA(1:20)、各0.5μl的上下游引物(引物序列见表4)、10μl的2×SYBR Green qPCRSuperMix(美国Invitrogen公司)以及4μl RNase-free水所组成。

表4转录因子的qPCR引物序列

(3)以18srRNA作为内参照，采用2^－△△Ct法计算qPCR检测结果。

(4)如图8所示，qPCR检测结果验证了转录因子芯片结果的可靠性。

3、miRNA-转录因子调控网络的构建与分析

miRNA-转录因子调控网络的构建与分析流程如图9所示，具体包括如下步骤：

3.1差异表达miRNA的靶基因预测

(1)应用miRanda(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi)以及miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)四个数据库，选择miRNA测序中差异表达倍数≥2的miRNA进行靶基因预测。其中，转录因子也作为基因参与miRNA的靶基因预测(因所有的基因包括转录因子都可能成为miRNA作用的靶基因，即预测得到的miRNA靶基因里，有一部分为转录因子。)。

(2)为了提高靶基因预测的准确性，将miRanda、TargetScan、PicTar三个数据库中任意两个数据库预测到的靶基因与miRTarBase数据库中已经实验验证的靶基因取并集获得候选的miRNA及其靶基因。

3.2获取与AML相关的miRNA→靶基因配对以及miRNA→靶转录因子配对

为了减少冗余，将上述候选的miRNA靶基因与MalaCards数据库(http://www.malacards.org/)中AML相关的基因和转录因子取交集，获取与AML相关的miRNA→靶基因配对以及miRNA→靶转录因子配对。

“miRNA→靶基因配对以及miRNA→靶转录因子配对”中的“→”有指向意义，分别表示miRNA与其作用的靶基因所构成的配对以及miRNA与其作用的靶转录因子所构成的配对。

3.3转录因子结合位点的预测

(1)提取miRNA→靶基因配对以及miRNA→靶转录因子配对中的相应miRNA以及靶基因进行转录因子结合位点的预测。

(2)取基因转录起始点上游5000bp到下游1000bp区域，应用UCSC Genome Browser中的TFBS Conserved Track数据库(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables？hgsid＝350051003&hgta_doSchemaDb＝hg19&hgta_doSchemaTabl e＝tfbsConsFactors)进行转录因子结合位点的预测。

3.4生物信息学预测的转录因子与转录因子芯片检测中差异表达转录因子的合并

为了提高转录因子结合位点预测的准确性，将生物信息学预测的转录因子与转录因子芯片检测中差异表达倍数≥2的转录因子取交集，然后提取相应的miRNA以及靶基因获得与AML相关的转录因子→miRNA配对以及转录因子→靶基因配对。

“转录因子→miRNA配对以及转录因子→靶基因配对”中的“→”有指向意义，分别表示转录因子与其作用的miRNA所构成的配对以及转录因子与其作用的靶基因所构成的配对，下同。

3.5构建miRNA-转录因子调控网络、亚调控网络及网络节点分析

(1)合并转录因子→miRNA配对、转录因子→靶基因配对、miRNA→靶基因配对以及miRNA→靶转录因子配对，构建miRNA-转录因子调控网络，并利用Gephi软件(http://gephi.github.io/)绘制调控网络图，结果如表5和图10所示。

表5AML相关的miRNA与转录因子调控网络相关性总结

注：a表示miRNA对基因表达的抑制作用(miRNA repression of geneexpression)。

b表示miRNA对转录因子表达的抑制作用(miRNA repression of geneexpression)。

c表示转录因子对基因表达的调控作用(TF regulation of gene expression)。

d表示转录因子对miRNA表达的调控作用(TF regulation of miRNAexpression)。

(2)如表6和表7所示，在miRNA-转录因子调控网络中，本实施例鉴定出1156个前馈环以及13个反馈环调控模块，并发现33个新的核心调控因子，包括22个核心miRNA和11个核心转录因子。

表6AML相关的miRNA与转录因子调控网络中的核心miRNA

表7AML相关的miRNA与转录因子调控网络中的核心转录因子

上述研究发现的33个新的核心调控因子(即22个核心miRNA和11个核心转录因子)可以用于构建急性髓性白血病的miRNA与转录因子模型，并可用于制备诊断急性髓性白血病的试剂或芯片等应用中，用于急性髓性白血病的初步诊断，并可结合其他诊断结果判断是否为患有急性髓性白血病。

(3)网络节点的生物信息学分析：利用基因功能注释工具DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)对网络节点进行GO(Gene Ontology，基因本体论)分析和Pathway分析，查找与AML相关的信号通路以及基因功能分类。如图11所示，网络节点的GO分析表明，网络节点主要参与了细胞的正性调控、发育以及生物学的正性调控等生物学过程；如图12所示，网络节点主要分布在细胞核、核质以及核腔等细胞组分；如图13所示，网络节点主要具有序列特异性的DNA结合、序列特异性的转录因子结合活性以及核酸结合转录因子活性等分子功能。如图14、图15、图16及表8所示，Pathway分析表明，网络节点主要富集在急性髓性白血病通路、癌症通路以及Jak-STAT信号通路等33个信号通路。

表8AML相关的miRNA与转录因子调控网络中网络节点的Pathway分析

(4)连通度(node degree)是描述生物网络的最基本的一个拓扑性质。某一结点的连通度(node degree)是指该节点直接与其它节点在网络中的连接数量。在网络中，连通度较大的结点称为中心节点(hub node)。如图17和图18所示，本实施例使用结点的连通度来描述miRNA-转录因子调控网络的拓扑属性，并选择连通度≥15的节点作为中心节点，构建miRNA-转录因子中心节点亚调控网络并绘制亚调控网络图。亚调控网络分析表明，连通度≥30的4个miRNA(包括miR-335-5p、miR-124-3p、miR-16-5p以及miR-30a-5p)和11个转录因子(包括TCF3、MYC、MEF2A、NFKB1、MAX、FOXO1、NFKB2、NFE2、NR2F1、NKX2-2和FOXL1)作为基因调控的核心，可能通过作用于相应的靶基因/靶microRNA在急性髓性白血病发生、发展过程中发挥关键作用。

二、结果分析

miRNA(即microRNA)是一类在真核生物中普遍存在的长度为19～25个核苷酸的内源性单链非编码RNA分子，具有高度保守性、时序性和组织特异性。其在体内具有重要的生理功能，参与生长发育、分化、细胞增殖、细胞凋亡、脂类代谢等多种生物学过程。miRNA可在转录水平或转录后水平调节基因表达，属于广义的表观遗传学范围。其作用方式主要是通过5'端的“种子序列”以碱基配对的方式结合到靶基因mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)，从而降解靶mRNA或抑制其翻译。

研究发现，多种miRNA在AML中呈高表达并可作为原癌基因促进肿瘤细胞增殖，如miR-125b在AML中呈高表达，它可以通过作用于其靶基因P53以及前凋亡蛋白基因Bak1和Bmf等多种方式抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生。AML常伴有多种miRNA的表达变化，其表达谱具有一定的特异性，可作为诊断标志物和预后标志分子，有助于对AML进行分型、诊断及预后判断。研究发现，miR-127、miR-154和miR-299等7个miRNA在t(15；17)易位的急性早幼粒细胞白血病中呈特征性上调，而miR-17-3p、miR-185和miR-187等9个miRNA呈特征性下调，并以此区别于其他的AML亚型。急性淋巴细胞性白血病(ALL)与AML的miRNA表达谱比较分析表明，与AML相比miR-128a和miR-128b在ALL中呈明显表达上调，而let-7b和miR-223则明显下调，此4种miRNA中任意2个均可区分ALL与AML，其准确性可达97％～99％，提示此4种miRNA可作为AML与ALL分型和诊断的分子标志物。

真核基因的转录调节蛋白也称为转录因子，其是一类能与基因上游启动子区域的特定DNA序列(即转录因子结合位点)结合从而调节基因转录效率的反式作用蛋白。转录因子通常含有两种结构域：DNA结合结构域和转录调控结构域。DNA结合结构域可识别和结合靶基因上游的转录因子结合位点；转录调控结构域主要调控靶基因的转录效率，促进或抑制靶基因的转录。

miRNA与转录因子关系密切。转录因子较一般基因更有可能成为miRNA调控的靶标，其作为潜在靶标的概率较一般基因高出2倍左右。miRNA可通过与转录因子mRNA的3'UTR结合下调其基因表达；而miRNA在转录阶段也可受到同一转录因子的调控，转录因子可通过与miRNA基因启动子的转录因子结合位点结合，调节miRNA的转录；两者之间形成一种反馈调控关系，这种调控关系模块称之为反馈环(feedback loop，FBL)。此外，转录因子除了直接调控靶基因，还可通过调节miRNA转录间接调控同一靶基因表达，这样转录因子、miRNA和靶基因三者之间就形成了一种前馈调控关系，这种调控关系模块称之为前馈环(feed-forward loop，FFL)。

miRNA与转录因子的前馈环和反馈环共调控作用是哺乳动物体内一种重要的基因调控模式。据估计哺乳动物体内可能存在上千个由miRNA和转录因子组成的共调控模块。全基因组的预测分析发现，人类基因组存在638个miRNA和转录因子组成的前馈环。miRNA与转录因子的共调控作用在神经系统发育、癌症发生、细胞增殖与分化、细胞周期调控等过程中具有重要作用，中脑多巴胺能神经元分化与功能相关的miR-133b和转录因子Pitx3构成的反馈环、乳腺癌中与细胞增殖及细胞周期调控相关的细胞周期调节蛋白D1和miR-17/20组成的反馈环、成纤维细胞增殖相关的miR-22/Myc/MXD4前馈环、控制肌原细胞分化的miR-378/MyoR/MyoD前馈环、成骨细胞分化相关的miR-370/BMP-2/Ets1前馈环等多个反馈和前馈功能模块已经被实验证实。

癌症的发生发展是一种涉及多基因表达异常的复杂的生物学过程。但由于生命科学和技术的限制，癌症的研究主要局限在宏观的临床表现和局部的形态学的观察上，未能从整体水平上阐明其发生的分子机制。近年来，随着人类基因组计划的完成和癌基因解剖计划的开展，积累了大量分子水平的实验数据和研究成果，建立了多个癌症相关的分子数据库，为癌症发生分子机制的全面揭示奠定了基础。使用整合医学和复杂网络的系统生物学研究模式来探索癌症的本质及其分子机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点已经成为当前癌症研究的热点。

鉴于miRNA-转录因子共调控的普遍性及其在癌症等复杂疾病中的重要作用，本实施例运用miRNA测序、转录因子芯片结合生物信息学分析的系统生物学方法首次构建AML的miRNA与转录因子调控网络，从中鉴定出核心的调控因子并对调控模块进行分析，从整体水平上阐述miRNA和转录因子对AML相关基因的调控机制，并探寻可以用于AML诊断和治疗的潜在靶标。

在人类白血病中，多种细胞遗传学缺陷均可引起转录因子的异常。研究发现，miRNA参与的基因表达调控在白血病的发生、发展中具有十分重要的作用。miRNA与转录因子常通过两者之间的相互作用更精确地调节靶基因的表达，这是哺乳动物体内一种重要的基因调控模式。因此，以miRNA与转录因子的调控作为切入点，从系统水平上研究AML的发病机制，为其诊断和治疗提供新的标志物和靶标，具有非常重要的理论和现实意义，同时也将为该病的诊断和治疗带来显著的社会效益。

以本实施例构建的miRNA与转录因子模型可以构建诊断探针、芯片或试剂、设备等，为急性髓性白血病患者诊断提供中间结果信息或参考信息，但由于急性髓性白血病也是一种涉及多器官的综合性病征，在诊断是否是急性髓性白血病时，还需要结合其他的诊断结果进行判定。本实施例丰富了miRNA介导的网络调控内容，揭示了miRNA与转录因子介导的调控网络在AML中的作用机制；同时，研究结果将为开发抗白血病药物或生物制品奠定基础，具有良好的应用价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明转录范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明转录的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1：获取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的差异表达的miRNA及差异表达的转录因子，具体包括如下步骤：

步骤S121，提取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的组织核蛋白；

步骤S122，分别对得到的两组组织核蛋白进行转录因子芯片杂交分析；

步骤S123，对两组所述转录因子芯片杂交分析的结果进行比对分析，得到差异表达的转录因子；

步骤S2：根据所述差异表达的miRNA，获取各miRNA对应的靶基因；

步骤S3：将得到的各miRNA对应的靶基因与急性髓性白血病相关的基因和转录因子取交集，得到miRNA→靶基因配对及miRNA→靶转录因子配对；

步骤S4：提取miRNA→靶基因配对及miRNA→靶转录因子配对中相应的miRNA及其靶基因进行转录因子结合位点的分析判断；

步骤S5：将分析判断得到的转录因子与所述差异表达的转录因子取交集，并根据所述miRNA→靶基因配对及miRNA→靶转录因子配对中提取的所述miRNA及其靶基因，得到转录因子→miRNA配对及转录因子→靶基因配对；

步骤S6：合并所述转录因子→miRNA配对、所述转录因子→靶基因配对、所述miRNA→靶基因配对及所述miRNA→靶转录因子配对，构建miRNA-转录因子调控网络的系统，得到由核心miRNA与核心转录因子构成的miRNA-转录因子调控网络的系统。

2.如权利要求1所述的急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统的构建方法，其特征在于，在所述步骤S1中，获取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的差异表达的miRNA包括如下步骤：

步骤S111，提取急性髓性白血病患者与健康对照组的骨髓样本的总RNA；

步骤S112，对提取的所述总RNA构建小分子RNA文库；

步骤S113，对构建的小分子RNA文库进行DNA簇生成和测序分析；

步骤S114，对测序分析结果进行去杂处理，得到干净序列；

步骤S115，将得到的所述干净序列与人类基因组序列进行比对分析，去除非miRNA的非编码序列和mRNA的降解片段，得到miRNA序列；

步骤S16，比较急性髓性白血病患者与健康对照组的miRNA表达量，得到差异表达的miRNA。

3.如权利要求1所述的急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，应用miRanda、TargetScan、PicTar及miRTarBase四个数据库，选择miRNA差异表达倍数不小于2的miRNA进行靶基因分析，具体是将miRanda、TargetScan及PicTar三个数据库中的任意两个数据库分析得到的靶基因与miRTarBase数据库中分析得到的靶基因取并集，得到所述各miRNA对应的靶基因，并且在配对过程中，将转录因子也作为基因参与miRNA的靶基因分析。

4.如权利要求1所述的急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统的构建方法，其特征在于，在所述步骤S3中，是将得到的所述miRNA对应的靶基因与MalaCards数据库中的急性髓性白血病相关的基因和转录因子取交集，得到miRNA-靶基因配对及miRNA-靶转录因子配对。

5.如权利要求1所述的急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，是取基因转录起始点上游5000bp到下游1000bp的区域，应用UCSCGenome Browser中的TFBS Conserved Track数据库进行转录因子结合位点的分析判断。

6.如权利要求1所述的急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统的构建方法，其特征在于，在所述步骤S5中，是将分析判断得到的转录因子与所述差异表达的转录因子中差异表达倍数不小于2的转录因子取交集。

7.如权利要求1所述的急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统的构建方法，其特征在于，在所述步骤S6中，使用Gephi软件对构建的miRNA-转录因子调控网络的系统进行分析处理。

8.一种急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统，其特征在于，根据权利要求1～7任一项所述的构建方法得到，该系统由miR-335-5p、miR-124-3p、miR-16-5p、miR-30a-5p、miR-26b-5p、miR-23b-3p、miR-15a-5p、miR-23a-3p、miR-338-5p、miR-30c-5p、miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-181b-5p、miR-20a-5p、miR-144-3p、miR-192-5p、miR-424-5p、let-7e-5p、miR-125b-5p、miR-186-5p、miR-195-5p及miR-9-5p中的至少一个表达上调或下调的核心miRNA及TCF3、MYC、MEF2A、NFKB1、MAX、FOXO1、NFKB2、NFE2、NR2F1、NKX2-2及FOXL1中的至少一个表达上调或下调的核心转录因子构成。

9.一种权利要求8所述的急性髓性白血病的miRNA与转录因子的系统用于制备诊断急性髓系白血病的试剂或芯片。