CN109722474A - 与骨代谢疾病相关的miRNA标志物miR-19b及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域。首次揭示了miR‑19b在成骨细胞分化中起重要作用，可以作为防治骨代谢疾病(包括骨质疏松、骨质增生、成骨分化异常、骨量丢失等)的靶标。本申请公开了与骨代谢疾病相关的miRNA标志物miR‑19b及其应用，miR‑19b的表达水平可以区分相关骨代谢疾病人群和健康人群。

Description

与骨代谢疾病相关的miRNA标志物miR-19b及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体而言，涉及一种与骨代谢疾病相关的 miRNA标志物miR-19b及其应用。

背景技术

骨质疏松症是最常见的中老年疾病之一，以单位体积内骨组织量减少为主要特点。骨质疏松症最常见的一个并发症是脊柱压缩性骨折(Vertebral compressionfractures，VCFs)，骨折后可引起长期的慢性疼痛、活动受限甚至危及生命。2013年中国骨质疏松骨折防治蓝皮书报道，VCFs在我国的危险性高达30％～40％，每年新发病约180余万人，预计到2020年，累计病人数将达约3675万人。据深圳人民医院统计数据显示，每年在该医院进行VCFs治疗的患者高达500多例，进行开放及微创手术的病人超过300例，且逐年增多，平均的发病年龄有年轻化趋势。骨质疏松症常引起腰背部疼痛、压缩性骨折及骨盆骨折等，甚至导致瘫痪，给社会和家庭造成沉重的负担。

骨密度这一概念与骨质疏松是紧密联系在一起的，医学上的骨密度就是测量人体骨盐，主要由钙和磷两种无机物组成，存在形式为高度结晶形成的羟磷灰石。常用的有骨矿含量(BMC)和骨密度(BMD)这两个概念。骨矿含量是指沿骨轴线方向，每厘米骨段所含的骨矿物质，包括骨的矿物质量和有机质量，单位为g/cm；骨密度是指垂直测量射线入射方向上单位面积骨的矿物质面密度，单位g/cm²。通过定义可以看出采用“骨密度”这一医学概念可以避免不同位置的骨宽差异，使得同一骨段不同扫描位置的数据具有可比性，并可用于不同个体、群体间的比较以及标准值范围的建立。双能X射线骨密度仪(Dexa)被广泛用于骨质疏松的诊断以及后续治疗，一般由扫描系统、探测系统和计算系统组成，包括X光机、探测器、扫描床(全身骨密度测量)或扫描架(小部位测量)以及电脑主机等设备。X光机与探测器精确准直，探测部位放置在扫描床或扫描架上，使用系统设置的能量与速度，与对待测部位进行扫描，探测数据经过核电子学采集系统采集并传输到电脑主机上，通过系统算法得到精确的、准确的骨密度扫描结果，提供骨质疏松临床诊断所需要的骨密度及骨矿含量。因此，双能X射线骨密度仪是被美国 FDA通过的唯一可以称为骨密度仪并允许用来测量骨密度和监控骨密度变化的仪器，同时被世界卫生组织称为骨密度测量的“金标准”，已有大量国际化临床实验。

然而，临床Dexa结果通常都是病人在骨质疏松中晚期或骨量丢失后才发现，所以这并不利于目前国家提倡的预防为主的医疗措施，也不利于病人疾病的诊疗和康复，不可避免的增加医疗成本和白白浪费社会资源。所以，骨质疏松的临床诊断和治疗，亟待早期准确的预测和在骨质疏松发生前的精准评估和预防。

近年来，microRNA(miRNA)逐渐被人们熟知，miRNA在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，引起越来越多的研究关注。 miRNA最先由Lee等发现，是一种含有茎环结构的、非蛋白编码的小RNA 分子(21～23个核苷酸)，类似于小干扰RNA。miRNA基因类似于许多编码蛋白基因，通常是在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录，最初产物为大的具有5′帽子结构和3′多聚腺苷酸尾的微小RNA前体(pri-miRNA)。Pri-miRNA 在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下，5′帽子结构和3′多聚腺苷酸尾被剪切，变为约70个核苷酸组成pre-miRNA。RAN-GTP和转运蛋白 (exportin)将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer将其茎环结构剪切，产生约为22个核苷酸长度的miRNA：miRNA*双链。Dicer将成熟的RNA双链释放后，很快被一组蛋白反应结合形成RNA-蛋白复合物被称为miRNA诱导沉默复合物。在miRNA诱导沉默复合物中，一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中，它能识别位于靶mRNA上3′端非编码区的结合位点。加工成熟后miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能。miRNA以及RNA-蛋白质复合物在动物和植物中广泛表达。miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，具有组织特异性和时序性，决定着组织和细胞的功能特异的调节过程中起重要作用。

miRNAs与骨的胚胎期发育，调节干细胞成骨作用和软骨细胞代谢，和破骨细胞关系显著。miRNA调节人骨髓多潜能干细胞分化及白血病抑制因子的表达；当向成骨细胞分化时，19种miRNA表达水平上调；向脂肪细胞分化时，20种miRNA表达水平上调；hsa-mir199a和hsa-mir346抑制白血病抑制因子的分泌。有研究发现miR-29b能直接下调组蛋白脱乙酰化酶、转化生长因子β3、ⅡA型活化素A受体等蛋白生成量，这些蛋白作为成骨细胞分化抑制物，表达水平降低有利于促进成骨细胞分化。同时，miR-29b减少COL1A1、 COL5A3、COL4A2的3端非编码区序列活性，从而减少或抑制胶原的合成。当胶原蛋白分泌达到一个稳定期时，miR-29b浓度升高，抑制胶原蛋白的合成，促进骨质矿化，利于骨质生成。miR-223通过调节NFI-A和巨噬细胞集落刺激因子受体水平，而达到对破骨细胞的分化进行调节。

有研究报道miR-194-5p、miR-21、miR-23a、miR-24、miR-25、miR-100 和miR-125b是与骨质疏松密切相关的生物标志物。其它还有很多与骨质疏松有关的miRNAs。Xiao P等人发现骨细胞中的miR-422a和miR-133a也可以作为低骨密度骨质疏松患者的生物标志物。miR-133a和miR-21与绝经期妇女骨质疏松的发生有密切关系。miRNAs通过作用其相关信号通路对骨质疏松过程产生影响。MiR-29a被证实通过调节Runx2促进成骨分化，研究发现miR-20a 也有类似的机制。Runx2作为骨代谢中重要的参与基因，是多种miRNA的作用靶点，还包括miR-204、miR-705、miR-103等。MiRNA还可以通过影响 BMP-2的水平来参与骨代谢过程的调节，包括miR-34c、miR-17、miR-106 等。此外，miRNA也会通过RANK影响破骨细胞的活性，如MiR-503可以抑制破骨细胞生成。综上，miRNA在骨代谢过程中，起着重要作用。

且血清(或血浆)中的某些miRNAs已经被研究证实可以作为一些疾病，如癌症，糖尿病，骨质疏松及骨关节炎的生物标志物用于诊断和预防。血清 miRNA能够作为癌症或其他疾病的血清生物标志物，其重要意义在于提供一种非损伤性的诊断手段。现有成熟的实验室技术，能快速的建立起miRNA为基础的早期检测系统，这种新技术相对于其他早期诊断系统更易于检测。除此以外，标本更易获得，用量低等特点，都使miRNA表达谱作为一种新检测思路的参考，得到临床的广泛肯定。

骨基质的有机成分中90％是有I型胶原组成的，在正常的骨代谢过程中，骨基质进行着有序的合成与分解，骨组织在持续不断地重建，维持着骨吸收与骨形成间的平衡。对于骨质疏松症患者而言，骨标志物可以很好的反应失衡的骨重建过程。I型胶原交联羧基端肽(CTXI)和I型前胶原氨基端原肽 (PINP)是反应骨代谢关键步骤的重要生物标志物。在骨成熟过程中，CTXI 是胶原降解的特异产物，因此，CTX可用于检测骨质疏松。PINP是I型胶原蛋白沉淀指示剂，是骨形成的特异标志物，同样可用于骨质疏松的检测。这些非侵入性骨标志物的检测对于骨质疏松的诊断和治疗评价是一种非常有用的工具。但在临床使用过程中，由于其水平昼夜节律变化，应用时对取样时间，样品处理操作要求都更为严格。此外，CTXI和PINP的水平受肝肾功能的影响，无法绝对反映骨组织中骨细胞及骨膜活性变化，PINP生物差异度也更大。

因此，相较于传统临床手段，结合多项前沿技术的优势,利用miRNAs 的与骨骼密切关系和早期变化优势，通过血浆miRNA反映骨质疏松症的方法，操作方法更为简单。miRNA在骨骼发育和衰老中扮演着重要的角色，通过与靶基因3URT区互补结合，对靶基因产生转录后抑制，参与细胞的分化、生长、凋亡、代谢等调控过程，进而对细胞、组织及个体水平产生影响，参与了多种疾病的发生、发展。血浆miRNA在循环中可与脂蛋白结合，或以外泌体包裹的形式，在酸碱，冻融循环过程中保持自身稳定，保证结果的准确性。另有研究表明，血浆外泌体在同类人群中具有很好的重复性，具有良好的应用前景。

因此，研制早期无创骨质疏松检测试剂盒，是十分必要和迫切的需求。尤其，采用无创快速，基于外周血的早期骨质疏松和骨质疏松骨折检测，将满足更多的病患，包括骨质疏松病人和老年性骨肌肉退变人群的早期预警，具有成本低、操作性强，易于临床推广的独特优势，正是目前市场所急需的检测手段。面对日益老龄化的人口结构，该项目的成功研发，可应用于广泛的骨质疏松人群，具有极大市场前景和社会经济价值。

发明内容

因此，针对上述现有技术中的诸多问题，本发明的目的在于提供一种应用miRNA辅助诊断骨代谢相关疾病的新技术。

为了实现以上目的，本发明的一个方面提供一种与骨代谢疾病相关的miRNA标志物，该标志物为miR-19b。

本发明还提供了一种所述的miRNA标志物的引物或探针。这些引物或探针可以通过商业渠道购买获得，也可以在了解这些miRNA的序列之后由技术人员自行设计合成，根据已知miRNA序列设计合成引物或探针的方法为本领域技术人员熟知的方法。

根据本发明的另一方面，提供一种所述的miRNA标志物在制备骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供一种所述的miRNA标志物的引物或探针在制备骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒中的应用。

根据本发明的又一方面，提供一种骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清和/或血浆中miR-19b的表达水平。本发明人通过分离和研究正常人群以及骨质疏松人群血清和/或血浆中的miRNAs，研制出可便于临床应用的骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒。该辅助诊断试剂盒包括这些血清和/或血浆miRNAs及其相应探针，以及常用的酶和试剂等。

进一步地，所述试剂盒含有miR-19b的引物或探针。

更优选地，所述试剂盒还可以包括检测反应常用的酶和试剂。具体可根据采用的检测技术确定，这些技术均可采用现有的检测血清和/或血浆miRNA 的技术。

具体地，所述骨代谢相关疾病包括骨质疏松、骨质增生、成骨分化异常、骨量丢失。

有益效果

相较于传统临床手段，本发明，通过血清和/或血浆miRNA反映骨质疏松症的方法，操作方法更为简单。血清和/或血浆miRNA在循环中可与脂蛋白结合，或以外泌体包裹的形式，在酸碱，冻融循环过程中保持自身稳定，保证结果的准确性。血浆miRNA作为生物标志物，更易获得，而且用量低、同时还稳定易于检测且定量精确，可以极大地提高疾病诊断的敏感性和特异性。本申请还提供了由所述血浆miRNA及其引物或探针构成的辅助诊断试剂盒，操作简单，结果可靠，可以便利于临床诊断。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，将会更加清楚的理解本发明的上述及其他目的、特征和其他优点，其中，

图1示出了在miScript HiSpec Buffer中将成熟miRNA选择性转化为 cDNA的示意图；

图2示出了临床血浆样本提取的RNA质量鉴定图；

图3示出了血浆中miRNA表达谱的生物信息学分析火山图；

图4示出了血浆中miRNA表达聚类图；

图5示出了miR-19b在不同类型病人中的表达水平图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1人血液样本的收集与分离

采血管采血：取一支采血管，在采血管壁上标注被采血者姓名(不可松动采血管帽)。对被采血者的肘静脉进行局部消毒。取一支采血针，拔下静脉针护套，将针刺入静脉，可见有血流入软管中。将另一侧采血针连同软护套一起刺入采血管中，血液会自动流入采血管中。采血约5ml，待血液不再流入采血管后，拔出采血管。拔出静脉针，并将采血管垂直放置。

血浆分离：将采血管垂直放置于4℃冰箱中，让其自然沉淀2小时。将收集的样本对称放入离心机的采血管护套中。调整离心机转速1900转，工作温度4℃，离心10分钟。待离心机停止后，取出采血管(不可颠倒)。吸取上层血浆至无RNA酶EP管中，调整离心机转速12000转，工作温度4℃，离心10分钟。吸取上清至新的无RNA酶EP管中，做好标记，将其放入-80℃冰箱中冷冻保存。

2MiRNA的提取

利用QIAGEN miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒，血清和血浆样本溶于其1/5体积的QIAzol Lysis Reagent中。加入氯仿后，混匀后，室温静置5min。以1.6×10⁸拷贝数/μL终浓度加入适量miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control作为内参。在血清或血浆样本中miRNA将合成的miRNA导入RNA 样品中，以帮助监测RNA回收率和反转效率。QIAGEN推荐miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control作为血清或血浆miRNA表达谱的内参。miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control是C.elegans miR-39miRNA类似物，使用miScript PCR System配合Ce_miR-39_1miScript Primer Assay(miRNeasy Serum/PlasmaKit中提供)通过RT-PCR可轻松检测。加入与样本等体积氯仿，涡旋15min，室温静置2-3min。调整离心机转速12000转，工作温度4℃，离心15分钟。裂解液离心后分成水相和有机相。RNA位于上层水相，DNA位于中间相，蛋白位于下层有机相或中间相。

提取上层水相后，加入1.5倍体积的100％乙醇混匀，乙醇可以提供RNA 结合的合适条件，RNA分子大于18个核苷酸。样品再加入RNeasy MinElute 离心柱，总RNA结合到膜上，苯酚和其他污染物被有效洗去。高品质RNA 在小体积不含RNase水中洗脱。血清和血浆中主要含有小RNAs，因此无需分开纯化小RNA和大RNA组分。

3cDNA的制备

利用QIAGEN miScript II RT Kit将提取出的RNA转换成cDNA以备后续检测。图1示出了在miScript HiSpec Buffer中将成熟miRNA选择性转化为 cDNA的示意图。成熟miRNA是一类天然、大约为22个碱基的非编码RNA。它们在转录后对基因表达进行调控。与mRNA不同，miRNA本身不是聚腺苷酸。成熟miRNA由poly(A)聚合酶合成聚腺苷酸，再由oligo-dT引物反向转录成cDNA。聚腺苷酸合成和反转录反应在同一试管内同时进行。oligo-dT 引物的3’端含有几个简并的碱基，5’端具有一个通用标记，可用于实时PCR 反应时扩增成熟miRNA。聚腺苷酸和通用标记的完美结合可确保不会检测基因组DNA。

1)冰上融化RNA模板。在室温融化无RNase的水，10x miScript Nucleics Mix和5xmiScript HiSpec Buffer。

用手轻敲将溶液混匀，短暂离心将溶液沉集到试管底，放在冰上待用。

2)根据下表准备反转录反应溶液。

反应体系如下：

注意：miScript Reverse Transcriptase Mix应在反应前从-20℃的冰箱中取出。轻轻混匀，放在冰上待用。用完后，应立即放回-20℃的冰箱中。所备反应溶液的体积应超出所需体积的10％。

3)将RNA模板加入含反转录反应溶液的试管中。轻轻混匀，

短暂离心，然后放在冰上保存。

4)在37℃反应60分钟。

5)在95℃反应5分钟以抑制反转录反应溶液活性，然后放在冰上保存。

6)用无RNase的纯净水稀释cDNA，立即进行实时PCR反应

4用实时PCR分析成熟miRNA的表达谱

1)在室温(15-25℃)解冻2x QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix，10xmiScript Universal Primer,Cdna引物,及无Rnase的纯净水，混匀每一溶液。

2)根据下表配置反应溶液。轻轻混匀。

3)按照下表设定PCR程序。

4)开始PCR程序。

5miRNA在人血浆中的表达谱

1)抽提的RNA通过质检后，使用miRCURYTM Array Power Labeling kit(Cat#208032-A,Exiqon)对miRNA进行标记。具体步骤如下：

a,1微克的RNA加水至2μL加1μL的CIP buffer and CIP酶(Exiqon)。混合后置于37℃下30min。

b,将样品置于95℃下5min终止反应。加入3μL的labeling buffer，1.5μL 的fluorescent label(Hy3^TM)，2.0μL的DMSO,2.0μL的labeling enzyme。在 16℃下反应1h。

c,将样品置于65℃下15min终止反应。

2)标记完成后，将样品与miRCURYTM LNA Array(v.18.0) (Exiqon)芯片杂交，根据Exiqon的实验方法进行。

a，25μL的样品与25μL的杂交缓冲液混合，95℃下变性2min，然后置于冰上2min。

b，与芯片在56℃下杂交16-20h，杂交系统为Nimblegen Systems,Inc., Madison,WI,USA。

c，杂交完成后，使用Wash buffer kit(Exiqon)清洗芯片。

3)使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。

数据分析方法：使用GenePix Pro 6.0读取芯片扫描图像，并提取探针的信号值。相同的探针取中值合并。保留在所有样品中均>＝30.0的探针，对全部芯片进行中值标准化，筛选差异表达探针。使用Fold change和P-value筛选两组样品间(有重复)的差异表达miRNA，即p-values<0.05并且fold change values≥2or≤0.5的miRNAs为显著差异表达的miRNA。使用Fold change筛选两个样品间(没有重复)的差异表达miRNAs。最后，对差异表达miRNAs 进行聚类并绘制聚类图。

图3示出了血浆中miRNA表达谱的生物信息学分析火山图，其中红色代表在不同类型样本中差异表达的miRNA；图4示出了血浆中miRNA表达聚类图，其中，红色代表在不同类型样本中高表达水平的miRNA，绿色代表在不同类型样本中低表达水平的miRNA；图5示出了miR-19b在不同类型病人中的表达水平图，其中，Hea表示健康人群；OP表示骨质疏松病人；OPcata 表示骨质疏松性骨折病人。尤其是，由图5可以明显看出，健康人群明显具有较高的miR-19b表达水平，骨质疏松性骨折病人的miR-19b表达水平最低，说明可以利用miR-19b作为标志物，辅助诊断骨代谢相关疾病，尤其是骨质疏松，从而可以利用miR-19b作为标志物或者miR-19b的引物或探针制备骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种与骨代谢疾病相关的miRNA标志物，该标志物为miR-19b。

2.权利要求1所述的miRNA标志物的引物或探针。

3.权利要求1所述的miRNA标志物在制备骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒中的应用。

4.权利要求2所述的miRNA标志物的引物或探针在制备骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒中的应用。

5.一种骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测血清和/或血浆中miR-19b的表达水平。

6.如权利要求5所述的骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有miR-19b的引物或探针。

7.如权利要求5所述的骨代谢相关疾病辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述骨代谢相关疾病包括骨质疏松、骨质增生、成骨分化异常、骨量丢失。