CN112852946A

CN112852946A - 一种诊断生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN112852946A
Application number: CN202110056506.4A
Authority: CN
Inventors: 李向东; 刘亚静
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2021-05-28

Abstract

本发明提供一种多囊卵巢综合征诊断用circRNA生物标志物，所述circRNA生物标志物为hsa_circ_0000284。本发明检测了PCOS病人和正常人卵巢颗粒细胞中hsa_circ_0000284的表达情况，发现hsa_circ_0000284表达水平显著降低。在人卵巢颗粒细胞中沉默hsa_circ_0000284的表达可以抑制颗粒细胞增殖，降低雌激素的产生。本研究表明，hsa_circ_0000284可以作为多囊卵巢综合征的生物标志物，为临床诊断治疗提供靶点，为制药提供理论基础。

Description

一种诊断生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及hsa_circ_0000284作为多囊卵巢综合征诊断生物标志物及其应用。

背景技术

不孕不育在世界范围内已经成为继癌症、心血管疾病之后严重影响人类健康的第三大疾病。其中女性不孕占40％。女性不孕中，排卵障碍率占25％-30％。多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期女性最常见的生殖内分泌紊乱性疾病,5％～10％的育龄期女性易患此病,在无排卵不孕症患者中约占75％。

多囊卵巢综合征(PCOS)临床上以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征。雌\雄激素比例失调引起的体内雄激素水平过高是导致PCOS的主要原因。环状RNA(circRNA)是一类在物种进化中高度保守、内源性的环形非编码RNA,表达具有组织特异性、发育特异性和疾病特异性,广泛存在于哺乳动物组织和体液中。因其特殊的共价闭合环状结构以及RNA酶逃逸性,使其比之其他线性的ncRNA(如miRNA、lncRNA等)在体内存在更丰富和稳定。目前circRNA在疾病中的研究已在肿瘤、心血管领域中取得了具有诊疗价值的成果，同时一些研究表明PCOS患者卵泡液、颗粒细胞、外泌体中含有极其丰富且具有大量潜在生物信息的circRNA,但具体的相关circRNA在PCOS中的功能机制方面国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供多囊卵巢综合征诊断用circRNA生物标志物及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的多囊卵巢综合征诊断用circRNA生物标志物，所述circRNA生物标志物为hsa_circ_0000284。hsa_circ_0000284是由HIPK3基因第2号外显子反向剪接所形成，环化序列有1099个碱基。

本发明还提供hsa_circ_0000284在制备或筛选人多囊卵巢综合征的诊断及治疗药物中的应用。

本发明进一步提供一种多囊卵巢综合征诊断用试剂盒，所述试剂盒中包括一种或多种特异性检测hsa_circ_0000284表达水平的引物。

所述引物是基于实时定量PCR法检测hsa_circ_0000284而设计的，所述引物序列如下：

hsa_circ_0000284-F:5′-TCGGCCAGTCATGTATCAAA-3′

hsa_circ_0000284-R:5′-TGCTTGGCTCTACTTTGAGTTTC-3′。

本发明的有益效果有：1)首次发现hsa_circ_0000284可作为多囊卵巢综合征诊断生物标志物和药物治疗靶点；2)与正常人相比，hsa_circ_0000284在多囊卵巢综合征病人的卵巢颗粒细胞中表达下调；3)本发明的结果表明干扰hsa_circ_0000284可以抑制颗粒细胞的增殖和雌激素的生成，表明hsa_circ_0000284在多囊卵巢综合征中发挥作用，为临床治疗多囊卵巢综合征提供了新的靶点。

circRNA在女性生殖医学方面已经开始起步,有研究者发现circRNA与胚胎质量有相关性。一些可作为预测活产率的临床指标,并发现这些作为预测活产率显著差异表达的circRNA亲本基因功能都与葡萄糖代谢、有丝分裂细胞周期和卵巢类固醇生成相关。因此,circRNA在临床诊疗中可作为潜在的卵泡微环境指标,并对妊娠结局进行预测。研究表明，hsa_circ_0000284在PCOS病人颗粒细胞中低表达，低表达的hsa_circ_0000284抑制颗粒细胞的增殖和雌激素的生成。hsa_circ_0000284在颗粒细胞的低表达，导致颗粒细胞增殖被抑制，芳香化酶CYP19A表达降低，雌激素分泌失调，引起多囊卵巢综合征。

本发明检测PCOS病人和正常人颗粒细胞中hsa_circ_0000284的表达，发现hsa_circ_0000284水平降低。可将hsa_circ_0000284作为多囊卵巢综合征的生物标志物，为临床制药提供理论基础。

附图说明

图1为本发明中环状RNAhsa_circ_0000284的模式图；

图2为使用hsa_circ_0000284引物对多囊卵巢综合征病人颗粒细胞中hsa_circ_0000284的表达水平检测结果图；

图3为使用设计的hsa_circ_0000284si序列si-circ-284能够在不影响母本基因HIPK3表达的情况下，特异性敲降hsa_circ_0000284的表达；

图4为hsa_circ_0000284低表达可以抑制人颗粒细胞(KGN)中芳香化酶CYP19A的表达；

图5为hsa_circ_0000284低表达抑制人颗粒细胞(KGN)雌激素的分泌；

图6为hsa_circ_0000284低表达抑制人颗粒细胞(KGN)增殖。

具体实施方式

以下实施举例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

1.1样本的收集

在北京大学第三医院收集13例多囊卵巢综合征患者的卵巢颗粒细胞(hGC)和8例正常女性卵巢颗粒细胞(hGC)。

1.2细胞总RNA的提取与反转录

利用Trizol法提取细胞的总RNA，利用Nano Drop测定RNA浓度。

反转录体系如下：

以上试剂混匀后37℃反应30min，结束后加入1μL EDTA，65℃反应10min。

加入以上试剂，总体系20μL，震荡混匀后按下表反应条件进行反转录步骤：

反转录完成后，可将产物短时间保存在-20℃冰箱中或进行Real-Time PCR反应。

1.3cDNA稀释

反转录后，每孔加40μL RNase free H₂O稀释。

1.4荧光定量PCR

设计hsa_circRNA_0000284跨剪切点引物:设计合成了三对跨剪切点引物(由生工生物公司合成)，进行PCR检测，从中优选引物扩增条带明确且单一的引物组合，如下：

F:5'-TCGGCCAGTCATGTATCAAA-3'

R:5'-TGCTTGGCTCTACTTTGAGTTTC-3'

经测序确定PCR产物有跨剪切点序列(图1)。

利用SYBR Green Mixture(GenStar公司)以为GAPDH内参检测hsa_circRNA_0000284的相对表达，以2^-△△Ct法计算相对表达量。

荧光定量PCR引物序列如下：

荧光定量PCR体系如下：

PCR条件

95℃，2min；40个PCR循环(95℃，15秒；60℃，15秒(收集荧光))。扩增反应结束后，从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)，以获得PCR产物的熔解曲线。

实施例2

2.1hsa_circRNA_0000284在多囊卵巢综合征患者颗粒细胞中的表达

利用SYBRGreen Mixture(GenStar公司)以为GAPDH内参检测收集到的原代人颗粒细胞(hGC)中hsa_circRNA_0000284的相对表达，以2^-△△Ct法计算相对表达量(图2)。

2.2hsa_circRNA_0000284特异siRNA的设计

基于hsa_circRNA_0000284的序列，设计跨hsa_circRNA_0000284成环剪切点的siRNA序列si-circ-284及作为对照的siRNA序列si-NC(由吉玛基因公司合成)。其序列如下：

hsa_circ_0000284siRNA序列:

F:5′-GGUACUACAGGUAUGGCCUTT-3′

R:5′-AGGCCAUACCUGUAGUACCTT-3′

si-NC序列:

F:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′

R:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′

2.3siRNA转染细胞

使用Invitrogen公司生产的lipofectamine^TM 3000，按说明书操作(以12孔板为例，共A、B两组，每组一个孔为例，实际转染时每个处理组分别设置3个复孔)：

转染前24h接种细胞(1×10⁵个/孔)，培养于含血清培养基，24h后细胞贴壁率约为70％-80％；转染分以下A、B两组进行，C组为稀释的转染试剂。

A：1μL si-NC+75μL无血清DMEM/F12培养基

B：1μL si-circ284+75μL无血清DMEM/F12培养基

C：3μL Lipofectamine^TM 3000+75μL无血清DMEM/F12培养基

以上两组预混液配好后吹打混匀，室温静置5min。分别将A、B两组预混液与C组预混液等体积混合，得到约150μL转染试剂(小RNA混合液)，吹打混匀，室温孵育5min，每孔加入150μL上述配制的转染试剂，37℃培养箱中孵育6h后，换成正常含有10％FBS的DMEM/F12培养基继续培养18-48h，48h后收集细胞上清并且提取细胞RNA反转录后荧光定量PCR检测hsa_circRNA_0000284、HIPK3(图3)及芳香化酶CYP19A(图4)的表达。

实施例3

3.1细胞激素测定

转染细胞培养48h后，收集细胞上清，送至北京北方生物技术研究所，测定细胞上清中雌二醇的含量。通过测定发现hsa_circ_0000284低表达抑制雌二醇的分泌(图5)。

3.2CCK-8检测细胞增殖

准备4块96孔板,向每孔加入100μL细胞悬液(每孔含2000个细胞),每组细胞设5个复孔，18h后细胞贴壁率约为70％-80％进行细胞转染，细胞转染步骤同上。用CCK8增殖实验检测hsa_circ_0000284对颗粒细胞增殖的影响，具体操作步骤为：使用中国碧云天生物公司生产的CCK8试剂，按说明书操作：转染前取出第一块96孔板,弃去原培养基,每孔加入100μL 100mL/L CCK8液(将CCK8原液用完全培养基做10倍稀释使用)，置培养箱中孵育2h后用酶标仪检测450nm处的吸光度值(OD值),此为0h OD值。其余各孔板转染6h后换用完全培养基100μL,并依次在24h、48h和72h以同样的方法检测相应的OD值。

通过测定发现，hsa_circ_0000284低表达抑制KGN颗粒细胞的细胞增殖(图6)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种诊断生物标志物及其应用

<130> MP21000718Z

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 928

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaagggtag tgcttttcag acaaagatac catttaatag acctcgagga cacaactttt 60

cattgcagac aagtgctgtt gttttgaaaa acactgcagg tgctacaaag gtcatagcag 120

ctcaggcaca gcaagctcac gtgcaggcac ctcagattgg ggcgtggcga aacagattgc 180

atttcctaga aggcccccag cgatgtggat tgaagcgcaa gagtgaggag ttggataatc 240

atagcagcgc aatgcagatt gtcgatgaat tgtccatact tcctgcaatg ttgcaaacca 300

acatgggaaa tccagtgaca gttgtgacag ctaccacagg atcaaaacag aattgtacca 360

ctggagaagg tgactatcag ttagtacagc atgaagtctt atgctccatg aaaaatactt 420

acgaagtcct tgattttctt ggtcgaggca cgtttggcca ggtagttaaa tgctggaaaa 480

gagggacaaa tgaaattgta gcaatcaaaa ttttgaagaa tcatccttct tatgcccgtc 540

aaggtcaaat agaagtgagc atattagcaa ggctcagtac tgaaaatgct gatgaatata 600

actttgtacg agcttatgaa tgctttcagc accgtaacca tacttgttta gtctttgaga 660

tgctggaaca aaacttgtat gactttctga aacaaaataa atttagtccc ctgccactaa 720

aagtgattcg gcccattctt caacaagtgg ccactgcact gaaaaaattg aaaagtcttg 780

gtttaattca tgctgatctc aagccagaga atattatgtt ggtggatcct gttcggcagc 840

cttacagggt taaagtaata gactttgggt cggccagtca tgtatcaaag actgtttgtt 900

caacatatct acaatctcgg tactacag 928

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcggccagtc atgtatcaaa 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcttggctc tactttgagt ttc 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gguacuacag guauggccut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggccauacc uguaguacct t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.多囊卵巢综合征诊断用circRNA生物标志物，所述circRNA生物标志物为hsa_circ_0000284；其特征在于，所述环状RNA的circBase ID为hsa_circ_0000284，由HIPK3宿主基因第2号外显子反向剪接环化产生，其环化成熟序列长度为1099bp，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.权利要求1所述的circRNA生物标志物在制备或筛选人多囊卵巢综合征的诊断及治疗药物中的应用。

3.权利要求1所述的circRNA生物标志物在制备人多囊卵巢综合征检测试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测试剂选自用于southern印迹法、northern印迹法、PCR法、逆转录酶PCR法、实时定量PCR法、纳米阵列法、宏阵列法、放射自显影法或原位杂交法检测生物标志物hsa_circ_0000284的相关试剂。

5.多囊卵巢综合征诊断用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括一种或多种特异性检测hsa_circ_0000284表达水平的引物和/或探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括利用实时定量PCR法检测hsa_circ_0000284的引物，所述引物序列如下：

hsa_circ_0000284-F:5′-TCGGCCAGTCATGTATCAAA-3′

hsa_circ_0000284-R:5′-TGCTTGGCTCTACTTTGAGTTTC-3′。