CN112813158B - 心肌纤维化疾病辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用 - Google Patents

心肌纤维化疾病辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了心肌纤维化疾病辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用，通过高通量测序分析技术，筛选出在患有心肌纤维化疾病的患者中差异表达的hsa‑miR‑6802‑3p、hsa‑miR‑1229‑3p，进一步的细胞实验验证了miRNA生物标志物hsa‑miR‑6802‑3p、hsa‑miR‑1229‑3p能够用于临床上心肌纤维化的辅助诊断中，对早期诊断心肌纤维化具有重要意义，同时，也为临床上制备针对心肌纤维化的药物提供了药物靶点，有助于实现心肌纤维化的靶向治疗。

Description

心肌纤维化疾病辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及心肌纤维化疾病辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用。
背景技术
心血管疾病是全球头号致命的疾病，据国家心血管病中心发布的《中国心血管健康与疾病报告2019》显示，心血管疾病死亡是中国人排名第一位的死亡原因，该疾病的种类繁多，病因复杂。其中，由中、重度的冠状动脉粥样硬化性狭窄所引起心肌纤维持续性和/或反复加重的缺血缺氧将导致心肌纤维化(Myocardial fibrosis，MF)疾病，其特征是心肌成纤维细胞过度增殖，心肌成纤维细胞活化为肌成纤维细胞，并分泌Ⅰ型胶原蛋白，导致Ⅰ型胶原蛋白过度沉积。已有相关动物实验研究确定早期心肌纤维化可以被血管紧张素转化酶抑制剂所预防和逆转，因此，及时有效的对受试者是否患有心肌纤维化疾病做出诊断至关重要。理想的生物标志物具备检测方法简易、提供更多临床信息、指导临床诊疗等特征。通过对受试者血液中某些生物标志物的检测，可望实现对心肌纤维化的早期发现、早期干预。
随着现代分子生物学技术的快速发展，现已有越来越多的研究发现特异性的基因能够成为诊断和治疗心肌纤维化疾病的生物标志物，如中国专利申请201410196658.4(申请号)提供了一种miRNA在治疗或诊断心肌纤维化疾病中的应用，中国专利申请200910170215.7(申请号)提供了一种microRNA-328及其反义核苷酸在诊断和治疗心脏疾病(如房颤、长QT综合征、缺血再灌注、心肌纤维化等)中的应用，中国专利申请201210513097.7(申请号)提供了一种miRNA-874及其反义核苷酸在诊断和治疗重大心脏疾病(如心肌肥大、心肌纤维化等)中的应用，中国专利申请201910391352.7(申请号)提供了一种miRNA-361及其反义核苷酸在诊断和治疗心脏疾病(如心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚、心肌纤维化等)中的应用，目前，仍缺乏心肌纤维化疾病相关的有效的生物标志物，以及时有效的对受试者是否患有心肌纤维化疾病做出诊断。
鉴于此，本发明通过高通量测序分析技术，筛选出在患有心肌纤维化疾病的患者中差异表达的miRNA，本发明涉及的miRNA生物标志物包括hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p，目前，hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p和心肌纤维化疾病之间的相关性均未见报道。进一步的细胞实验验证了miRNA生物标志物hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p能够用于临床上心肌纤维化的辅助诊断中，对早期诊断心肌纤维化具有重要的意义，同时，也为临床上制备针对心肌纤维化的药物提供了药物靶点，有助于实现心肌纤维化的靶向治疗。
发明内容
为了弥补现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供心肌纤维化疾病辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用。本发明通过高通量测序分析技术，筛选出在患有心肌纤维化疾病的患者中差异表达的miRNA，本发明涉及的miRNA生物标志物包括hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p，进一步的细胞实验验证了miRNA生物标志物hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p能够用于临床上心肌纤维化的辅助诊断中，对早期诊断心肌纤维化具有重要的意义。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了检测miRNA的试剂在制备诊断心肌纤维化的产品中的应用。
进一步，所述miRNA选自hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p中的至少一种；
作为一种可选择的实施方式，所述miRNA为hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p中的任意一种；
作为一种优选的实施方式，所述miRNA为hsa-miR-6802-3p和hsa-miR-1229-3p。
进一步，所述检测miRNA的试剂包括特异性扩增hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的引物；特异性识别hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的探针。
本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响上述miRNA功能的条件下，对上述miRNA进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。此外，本领域技术人员可以预期，初始miRNA、前体miRNA将可以获得与成熟miRNA同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA，因此，所述成熟miRNA对应的初始miRNA、前体miRNA在诊断和治疗心肌纤维化疾病中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第二方面提供了一种诊断心肌纤维化的产品。
进一步，所述产品包括检测hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p表达水平的试剂。
作为一种可选择的实施方式，所述试剂包括检测hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p中任意一种表达水平的试剂；
作为一种优选的实施方式，所述试剂包括检测hsa-miR-6802-3p和hsa-miR-1229-3p表达水平的试剂。
进一步，所述产品包括通过高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的表达水平；
优选地，所述样本包括血液、组织液、黏液、唾液、脊髓液；
更优选地，所述样本为血液。
进一步，所述基于定量PCR方法检测样本中hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p表达水平的试剂包括特异性扩增hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的引物；所述基于探针杂交方法检测样本中hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p表达水平的试剂包括特异性识别hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的探针。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。
进一步，所述试剂盒包括一种或多种用于检测hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p基因转录水平的引物、探针或芯片。
进一步，根据本发明的所述的miRNA的序列，可以生成用于给定miRNA的RNA印记杂交的合适探针，包括但不限于，与目标miRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针。
进一步，所述试剂盒还包括使用说明书或标签、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂；所述说明书或标签详细记载了如何使用所述试剂盒进行检测以及所述试剂盒用于检测心肌纤维化。
进一步，所述试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。
进一步，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括一种或多种用于检测hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p基因转录水平的针对hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p基因的寡核苷酸探针。
在本发明中，所述芯片的制备可采用本领域已知的制备生物芯片的常规方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
进一步，所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，包括(但不限于)：尼龙膜、经活性基团(例如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
本发明的第三方面提供了hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p在制备治疗心肌纤维化的药物组合物中的应用；
优选地，所述药物组合物包括促进hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p表达或增强hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p功能的试剂；
更优选地，所述试剂包括hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的模拟物、hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的激动剂、过表达hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的载体。
本发明的第四方面提供了一种药物组合物。
所述药物组合物包括促进hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p表达或增强hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p功能的试剂；
优选地，所述试剂包括hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的模拟物、hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的激动剂、过表达hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的载体。
进一步，所述药物组合物还可包括药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的第五方面提供了hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p在筛选预防或治疗心肌纤维化的候选药物中的应用。
进一步，所述筛选候选药物的步骤如下：
(1)用待测物质处理表达或含有hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的体系；
(2)检测步骤(1)所述的体系中hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的表达水平；
若所述待测物质可提高hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的表达水平，则表明该物质为预防或治疗心肌纤维化的候选药物。
进一步，所述待测物质包括(但不限于)：针对hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p或其上游或下游基因设计的促进hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p表达的试剂、结合分子、小分子化合物等。
本发明的第六方面提供了一种筛选预防或治疗心肌纤维化的候选药物的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)用待测物质处理表达或含有hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的体系；
(2)检测步骤(1)所述的体系中hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的表达水平；
若所述待测物质可提高hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p的表达水平，则表明该物质为预防或治疗心肌纤维化的候选药物。
进一步，步骤(1)中所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
进一步，所述待测物质包括(但不限于)：针对hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p或其上游或下游基因设计的促进hsa-miR-6802-3p、和/或hsa-miR-1229-3p表达的试剂、结合分子、小分子化合物等。
除非另有定义，本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不是旨在于限制本发明，此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“表达水平”，是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一个或多个被分析血液中的浓度。
本文中使用的术语“差异表达”，是指特定miRNA在对应疾病患者的靶样本中的表达水平与在对照样本中相比是改变的，所述对照样本可以是健康人的样本，所述特定miRNA可以是上调(即在靶样本中miRNA浓度增加)或下调(即在靶样本中miRNA浓度降低或消失)。
本文中使用的术语“miRNA”，是指微小RNA，即小的非编码RNA分子，是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。主要在转录后水平调控基因表达(大约调控1/3的蛋白编码基因)，从而控制细胞的凋亡、增殖、分化、代谢以及个体的发育和肿瘤的发生、发展以及耐药。microRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA，即microRNA前体，长度大约为70～90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24nt的成熟miRNA。
本文中使用的术语“和/或”，是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本文中使用的术语“探针”，是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与目标核酸形成双链。所述探针可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。
本文中使用的术语“生物标志物”，是指具有特异性生物学特性、生物化学特征或者其它方面特征的分子指示物，其可用于确定存在或不存在某种特定疾病或状况和/或某种特定疾病或状况的严重程度。
本发明公开的miRNA生物标志物hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p的序列均可在miRBase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中进行查询。本发明中所述的hsa-miR-6802-3p的序列如SEQ ID NO.1所示，hsa-miR-1229-3p的序列如SEQ ID NO.2所示；
hsa-miR-6802-3p的序列：
UUCACCCCUCUCACCUAAGCAG(SEQ ID NO.1)
hsa-miR-1229-3p的序列：
CUCUCACCACUGCCCUCCCACAG(SEQ ID NO.2)
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明首次发现hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p和心肌纤维化之间存在相关性，进一步的细胞实验验证了miRNA生物标志物hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p能够用于临床上心肌纤维化的辅助诊断中。
(2)本发明提供的miRNA生物标志物hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p与心肌纤维化高度相关，在心肌纤维化的诊断中具有较好的应用价值，为临床上早期筛查和诊断心肌纤维化提供了理论支持。
(3)本发明提供的新的miRNA生物标志物hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p，相比于传统的检测方法，基因诊断更能及时、特异、灵敏地对心肌纤维化作出早期的诊断。
(4)本发明提供的miRNA生物标志物hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p为临床上制备针对心肌纤维化的药物提供了药物靶点，有助于实现心肌纤维化的靶向治疗。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示的是hsa-miR-6802-3p的相对表达水平结果图；
图2显示的是hsa-miR-1229-3p的相对表达水平结果图；
图3显示的是hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p对细胞增殖能力影响的结果图；
图4显示的是hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p对细胞迁移能力影响的结果图；
图5显示的是hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p对细胞侵袭能力影响的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1筛选与心肌纤维化相关的生物标志物
1、研究对象
收集3例医院心内科室提供的患有心肌纤维化疾病的患者，并分别取其血液样本，同时收集体检健康者3例，作为健康对照组，并分别取其血液样本。所有患者均排除恶性肿瘤、急性感染、外伤及严重肝、肾疾病、脑栓塞、肺栓塞、下肢静脉栓塞、DIC和急性肾功能不全等疾病。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书，并通过了本院的组织伦理委员会的同意。
2、测序实验
测序实验采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法进行链特异文库构建，所用到的仪器试剂见表1。
表1仪器和试剂
Figure BDA0002972858890000091
从组织样品中提取总RNA，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
从总RNA里通过跑胶提取出18-30bp范围内的RNA，然后两端加上接头后再进行反转录PCR扩增，之后再库检、环化后使用BGISEQ-500平台，SE50策略进行测序。流程如下：
(1)RNA片段选择:将总RNA使用PAGE电泳切胶分离18-30nt的RNA。
(2)3’接头连接：使用5-adenylated，3-blocked的单链DNA接头连接到(1)中RNA的3’端。
(3)逆转录引物退火：将RT引物加入(2)体系中，与连接在RNA上的3’接头杂交，并与多余的游离3’接头杂交。
(4)5’接头连接：5’接头连接至(3)中产物的5’端，由于接头优先连接于单链分子，而不与3’接头和RT引物的杂交链连接，极大减少了接头自连。
(5)一链cDNA合成：以(3)中RT引物进行逆转录延伸，合成一链cDNA。
(6)PCR扩增：使用高敏聚合酶对cDNA进行扩增，富集同时连接有3’接头和5’接头的cDNA，放大文库产量。
(7)文库片段选择：使用PAGE电泳分离100-120bp范围PCR产物，有效去除了引物二聚体等副产物。
(8)文库定量及pooling环化。
(9)上机测序：BGISEQ-500平台上机测序，SE50策略。
3、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用Fastx-Toolkit对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
(2)用Rfam对测得的小RNA进行注释。成熟miRNA和miRNA前体序列下载自miRBase；
(3)用miRDeep2定量已知miRNA的表达；
(4)在R环境下用DEGSeq2包比较两组的表达差异。
4、测序数据的质量控制
由于原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，这将严重影响后续组装的质量。为保证后续的生物信息分析的准确性，首先对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据(clean data)以保证后续分析的顺利进行，具体步骤及顺序如下：
(1)去除reads中的adapter序列；
(2)剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；
(3)修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；
(4)去除含N的比例达到10％的reads；
(5)舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。
5、Rfam数据库比对
使用Rfam(11.0，http://Rfam.sanger.ac.uk/)数据库对测得的小RNA进行注释，去除其中非miRNA序列，如rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA等，同时也对比对上的非miRNA序列进行种类和数目统计。分析软件：BLAST，版本为v 2.3.0，(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
6、miRNA表达定量与差异表达分析
(1)miRNA表达量评估：将去除rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA等序列后的小RNA序列与miRBase数据库(miRBase 21，http://www.mirbase.org/)中人类的miRNA前体及成熟体序列进行比对，统计map到成熟体区域的序列数，并预测其二级结构。随后对各样本已知miRNA进行表达量统计分析，并利用TPM进行表达量的均一化处理。
公式：
Figure BDA0002972858890000111
分析软件：Bowtie，版本为v 1.2.1.1，(http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)，RNAfold，版本为v 2.1.8，(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)，miRDeep2，版本为v 0.1.0,(https://github.com/Drmirdeep/drmirdeep.github.io/issues)。
(2)miRNA表达量分布：对各个样本的表达量做密度分布图、箱型图以及提琴图，进而能在整体水平上检查不同实验条件下TPM分布的情况。
(3)miRNA表达差异分析：首先对原始的read count进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正；通过统计学模型进行假设检验概率(P-value)的计算；进行多重假设检验校正(BH)，得到padj值(错误发现率)。分析软件：DEGseq2，miRNA采用Pvalue<0.05，|log2FC|≥1作为差异表达筛选标准，用于后续分析。
7、实验结果
实验结果显示，用差异表达筛选标准进行筛选，得到差异miRNA36个，其中表达上调miRNA有16个，表达下调的miRNA有20个，本发明涉及的miRNA生物标志物hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p差异表达结果见表2，与健康对照组相比，hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p在患有心肌纤维化的患者的血液中显著低表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
表2 hsa-miR-6802-3p、hsa-miR-1229-3p差异表达的统计结果
Figure BDA0002972858890000121
实施例2检测miRNA对心脏成纤维细胞增殖和迁移的影响
1、细胞培养
将液氮中保存的人原代心脏成纤维细胞(HCF)取出后进行复苏接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、95％湿度及含5％CO2的细胞培养箱中传代培养，取对数生长期的细胞用于实验。
2、原代心脏成纤维细胞的消化、传代
当细胞的融合率达到全培养皿底部面积的80％-90％左右，培养液变黄时，吸尽培养皿内的液体，加入4mL胰酶，放入培养箱内消化2min，取出后置于显微镜下观察，待细胞回缩、细胞间隙变宽后，迅速吸尽胰酶并加入2mL含10％胎牛血清的培养液，终止消化；吹打混匀皿底的细胞，使细胞分散为单个细胞，再将细胞悬液吸入离心管内，放入低速离心机，800rpm离心5min；弃去上层液体，将细胞用培养液重悬后，平均分到4个培养皿中，补足至10mL培养液，放入37℃、95％湿度及含5％CO2的细胞培养箱中继续培养。
3、细胞转染
实验中所用的miR-6802-3p mimics、miR-1229-3p mimics和mimics NC(阴性对照)均由上海吉玛公司合成。根据LipofectamineTM 3000转染试剂说明书进行细胞转染，具体步骤如下：
(1)转染前1天将生长状态良好，处于对数生长期的心脏成纤维细胞接种于6孔板中，置于37℃、95％湿度及含5％CO2的细胞培养箱中培养过夜，转染时的细胞融合度达到50％；
(2)将无血清、无抗生素的Opti-MEM培养基置于室温下平衡；
(3)配制转染物。在9μL miR-6802-3p mimics、9μL miR-1229-3p mimics、9μLmimics NC中分别加入125μL无血清、无抗生素的Opti-MEM培养基，每孔加入5μL的LipofectamineTM 3000试剂，充分吹打混匀后，室温下静置孵育5min；
(4)用吸管吸去6孔板中的培养液，然后在每孔中加入提前配好的800μL含10％胎牛血清的培养液和转染物；
(5)轻轻晃动培养板，使试剂充分混合，置于37℃、95％湿度及含5％CO2的细胞培养箱中继续培养，6h后，更换新鲜的培养液。
4、QPCR检测细胞中miRNA的表达情况
采用TRIzol法提取细胞总RNA，具体步骤如下：
(1)吸去细胞培养液，用1×PBS洗2遍，吸尽PBS；
(2)加入1mL Trizol，混匀，用1ml注射器反复抽取以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min后，将液体吸至Ep管中；
(3)在各Ep管中加入200μL氯仿，震荡后室温静置5min，4℃，12000rpm离心15min；
(4)将离心后液体的上层水相吸至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置5～10min后，4℃，12000rpm，离心15min，取出Ep管；
(5)弃去上清，加入1mL 75％乙醇，混匀，4℃，10000rpm，离心5min，弃去上清，将Ep管倒置在吸水纸上，室温放置5min后，加入70μL DEPC水；
(6)充分溶解后，取2μL所得RNA，于紫外分光光度计下检测OD260、OD280并计算其比值，以确定RNA的浓度及纯度，于-80℃保存备用。
逆转录合成miRNA cDNA，具体步骤如下：
(1)将1μg的细胞RNA样品(总RNA)配置逆转录反应液，所述反应液的体系包括如下组分：1μL总RNA、1μL RT引物工作液(U6+miRNA)(500nM)、无核糖核酸酶水(RNase freeddH2O)，总体积最后为10μL；
(2)将逆转录反应液置于70℃水浴上10min，冰浴2min；
(3)在逆转录反应液中加入逆转录反应体系，反应体系包括如下组分：4μL 5×Prime Script Buffer、1μL Prime Script RT Enzyme Mix、4μL无核糖核酸酶水(RNaseFree ddH2O)，总体积最后为20μL；
(4)反应条件：42℃60min；70℃10min。反应结束后立即将产物取出，快速置冰上冷却，后续步骤均在冰上进行操作。
miRNA的荧光定量PCR检测，具体步骤如下：
(1)引物设计
扩增miR-6802-3p的引物
正向引物：5’-TCGGCAGGTTCACCCCTCTCAC-3’(SEQ ID NO.3)
反向引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO.4)
扩增miR-1229-3p的引物
正向引物：5’-GCCGAGCTCTCACCACTGCC-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO.6)
扩增U6 snRNA的引物
正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO.7)
反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO.8)
(2)PCR反应体系的配置，按照表3配置PCR反应体系，其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表3 PCR反应体系
Figure BDA0002972858890000151
(3)反应条件：95℃3min；95℃5s，56℃10s，39cycles；95℃3min，55℃10s，95℃15s。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以U6snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、细胞增殖实验检测miRNA对细胞增殖的影响
本实施例采用CCK-8实验检测miRNA对细胞增殖的影响，具体步骤如下：
(1)将实验分为4组，分别为阴性对照NC组、miR-6802-3p mimics组、miR-1229-3pmimics组和空白对照组，每组均设5个复孔；
(2)转染后的心脏成纤维细胞培养72h后，用0.25％胰酶消化进行细胞计数，将细胞接种于96孔板中，浓度为1×104/mL，每孔加100μL；
(3)避光条件下，96孔板中每孔加入10μL的CCK8试剂，晃动培养板3min,然后将培养板放入培养箱中继续培养，2h后取出，在酶标仪450nm波长处测定OD值。
6、细胞迁移和侵袭实验检测miRNA对细胞迁移和侵袭的影响
本实施例采用Transwell迁移和侵袭实验检测miRNA对细胞迁移和侵袭的影响，具体步骤如下：
(1)制备Transwell小室，无菌条件下Matrigel冰浴融化后按1:8比例稀释Matrigel胶，在Transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后迅速移入37℃的细胞培养箱中温育至其凝固成胶状；
(2)将实验分为4组，分别为阴性对照NC组、miR-6802-3p mimics组、miR-1229-3pmimics组和空白对照组，每组均设3个复孔；
(3)上室加入数量为2×104个细胞的悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，37℃下恒温培养箱内培养48h；
(4)染色，取出Transwell用PBS洗3遍，使用多聚甲醛固定30min后用PBS洗3遍，加入结晶紫染色30min用纯净水终止染色，放入荧光显微镜下观察并计数。
7、统计学分析
采用统计学软件SPSS20.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图。两组间比较采用配对T检验，三组及以上采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。所有实验重复三次，以P<0.05为差异具有统计学意义。
8、实验结果
细胞转染的结果显示，转染miR-6802-3p mimics的实验组的miR-6802-3p的表达水平显著上调，转染miR-1229-3p mimics的实验组的miR-1229-3p的表达水平显著上调(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照NC组之间则无显著的差异(见图1和图2)。
CCK-8细胞增殖实验的结果显示，与空白对照组和阴性对照NC组相比，转染miR-6802-3p mimics的实验组和转染miR-1229-3p mimics的实验组的心脏成纤维细胞增殖活性显著降低(P<0.05)(见图3)，表明miR-6802-3p、miR-1229-3p对心脏成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用。
Transwell实验的结果显示，与空白对照组和阴性对照NC组相比，转染miR-6802-3p mimics的实验组和转染miR-1229-3p mimics的实验组的心脏成纤维细胞的迁移和侵袭能力明显降低(P<0.05)(见图4和图5)，表明miR-6802-3p、miR-1229-3p对心脏成纤维细胞的迁移和侵袭具有明显的抑制作用。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
序列表
<110> 石家庄市人民医院
<120> 心肌纤维化疾病辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用
<141> 2021-03-11
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
uucaccccuc ucaccuaagc ag 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
cucucaccac ugcccuccca cag 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcggcaggtt cacccctctc ac 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgagctct caccactgcc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (3)

1.hsa-miR-6802-3p和/或hsa-miR-1229-3p在制备预防心肌纤维化的药物组合物中的应用。
2.hsa-miR-6802-3p和/或hsa-miR-1229-3p在筛选预防心肌纤维化的候选药物中的应用。
3.一种筛选预防心肌纤维化的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 用待测物质处理表达或含有hsa-miR-6802-3p和/或hsa-miR-1229-3p的体系；
(2) 检测步骤(1)所述的体系中hsa-miR-6802-3p和/或hsa-miR-1229-3p的表达水平；
若所述待测物质可提高hsa-miR-6802-3p和/或hsa-miR-1229-3p的表达水平，则表明该物质为预防心肌纤维化的候选药物。
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