CN112795644B - miRNA生物标志物在心肌纤维化疾病诊断中的应用 - Google Patents

miRNA生物标志物在心肌纤维化疾病诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miRNA生物标志物在心肌纤维化疾病诊断中的应用，本发明通过高通量测序分析技术，筛选出心肌纤维化患者中差异表达的miRNA，hsa‑miR‑3074‑5p、hsa‑miR‑371b‑5p，本发明提供的miRNA生物标志物能够用于心肌纤维化的诊断中，有利于实现心肌纤维化的早期诊断，具有良好的临床应用价值。

Description

miRNA生物标志物在心肌纤维化疾病诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及miRNA生物标志物在心肌纤维化疾病诊断中的应用。
背景技术
心肌纤维化(Myocardial fibrosis，MF)是指心肌组织中细胞外基质过量沉积，胶原浓度和胶原容积(collagen volume fraction，CVF)显著增加，各型胶原比例失调以及排列紊乱(Daniels A,Van Bilsen M,Goldschmeding R,et al.Connective tissue growthfactor and cardiac fibrosis[J].Acta physiologica,2009,195(3):321-338.)。导致心肌纤维化的主要原因是肌成纤维细胞对α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的高表达以及细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)异常。ECM由心肌成纤维细胞分泌，发挥着为心肌提供营养、传导、且维持心脏功能的作用，此外，还参与心肌损伤后修复，因此，ECM含量及成分的改变是诱发心肌纤维化发生的病理基础。当心肌发生损伤时，心肌细胞的坏死或凋亡会导致肌成纤维细胞激活，组织修复系统会自发运行。在正常生理状态下，组织修复后肌成纤维细胞消失；但在特殊情况下，肌成纤维细胞持续存在，从而导致心肌纤维化。目前，心肌纤维化的机制尚不完全清楚。
微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是在真核生物中发现的一类可调控基因表达的内源性非编码单链小分子RNA，参与细胞增殖、分化、免疫调节、凋亡、机体代谢等病理生理过程。其进化上高度保守，通过与调控靶标互补配对而在转录后对基因的表达进行稳定而精细的调节。由于miRNA在血液中表达，并且其片段较短，仅约19-22个核苷酸，且受到RISC复合体的保护，不易降解，具有高度的稳定性，经测试在反复冻融及pH值等剧烈变化的环境中，仍然能够保持稳定，因此，是一种较为理想的疾病相关的生物标志物。如果可以早期诊断心肌纤维化，在不可逆损伤发生以前，尽早评估疾病，区分类型干预治疗，可降低治疗难度，因此，心肌纤维化疾病的早期精确诊断意义重大。鉴于此，本发明针对现有技术存在的问题，通过高通量测序分析技术，筛选出患有心肌纤维化疾病的患者中差异表达的miRNA，hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p，本发明提供的miRNA生物标志物有利于实现心肌纤维化的早期诊断。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供miRNA生物标志物在心肌纤维化疾病诊断中的应用。本发明通过高通量测序分析技术，筛选出心肌纤维化患者中差异表达的miRNA，hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p，本发明提供的miRNA生物标志物有利于实现心肌纤维化的早期诊断。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种心肌纤维化的诊断试剂。
进一步，所述诊断试剂包括能够检测样本中miRNA标志物的表达水平的试剂；
优选地，所述miRNA标志物为hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p；
优选地，所述样本包括血液、组织液、脑脊液、尿液、泪液、唾液、汗液；
更优选地，所述样本为血液。
进一步，所述诊断试剂选自：
特异性识别上述miRNA标志物的寡核苷酸探针；或
特异性扩增上述miRNA标志物的引物。
进一步，所述诊断试剂采用高通量测序方法和/或基因芯片法和/或定量PCR方法和/或探针杂交方法检测样本中miRNA标志物hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p的表达水平；
优选地，所述定量PCR方法中使用的试剂包括特异性扩增上述miRNA标志物的引物；
优选地，所述探针杂交方法中使用的试剂包括特异性识别上述miRNA标志物的寡核苷酸探针。
进一步，对所述诊断试剂采用的方法作如下解释：
高通量测序方法又称下一代测序方法，是对传统测序的一次革命性改变，高通量测序方法一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大地提高了测序效率。这类大规模测序技术极大地提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)，高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。
基因芯片法是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的方法，其测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
定量PCR方法又称实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR，RT-PCR)，荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。
探针杂交方法的基本原理是将经标记的探针与miRNA样本进行杂交，进而进行信号检测，确定miRNA的表达水平。所述探针杂交方法包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。
本发明第二方面提供了一种心肌纤维化的诊断产品。
进一步，所述诊断产品包括本发明第一方面所述的诊断试剂；
优选地，所述诊断产品包括试剂盒、芯片、试纸。
进一步，所述试剂盒包括针对miRNA生物标志物hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p的引物和/或探针。
进一步，所述试剂盒还包括使用说明书或标签、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂；所述说明书或标签详细记载了如何使用所述试剂盒进行检测以及所述试剂盒用于检测心肌纤维化。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前本发明中所列举的试剂，只要是基于hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p的检测来诊断心肌纤维化的试剂均包含在本发明的范围内。
进一步，所述芯片的制备可采用本领域技术人员已知的生物芯片的常规制备方法，包括(但不限于)：采用修饰玻片或硅片的固相载体，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明所述的miRNA芯片。
本发明的第三方面提供了一种预防或治疗心肌纤维化的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包括抑制hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p表达的试剂。
进一步，所述药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，主要依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)：乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的第四方面提供了一种筛选预防或治疗心肌纤维化的候选药物的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)用待测物质处理表达或含有hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p的体系；
(2)检测步骤(1)所述的体系中hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p的表达水平；
(3)选择可降低hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p表达水平的待测物质为候选药物。
进一步，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
进一步，所述待测物质包括(但不限于)：针对hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物。
本发明的第五方面提供了hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p在制备心肌纤维化诊断试剂中的应用。
进一步，所述心肌纤维化诊断试剂如本发明第一方面所述的诊断试剂。
本发明的第六方面提供了hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p在制备心肌纤维化诊断产品中的应用。
进一步，所述心肌纤维化诊断产品如本发明第二方面所述的诊断产品。
本发明的第七方面提供了hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p在制备预防或治疗心肌纤维化的药物组合物中的应用。
进一步，所述预防或治疗心肌纤维化的药物组合物如本发明第三方面所述的药物组合物。
本发明的第八方面提供了hsa-miR-3074-5p、和/或hsa-miR-371b-5p在筛选预防或治疗心肌纤维化候选药物中的应用。
进一步，所述筛选预防或治疗心肌纤维化候选药物的方法如本发明第四方面所述的筛选方法。
除非另有定义，本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不是旨在于限制本发明，此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“表达水平”，是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一个或多个被分析血液中的浓度。
本文中使用的术语“差异表达”，是指miRNA在靶样本中的表达水平与在对照样本中相比是改变的，所述对照样本可以是健康人的样本，其可以是上调(即在靶样本中miRNA浓度增加)或下调(即在靶样本中miRNA浓度降低或消失)。在本发明中，所述miRNA特指代为hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p。
本文中使用的术语“生物标志物”，是指具有特异性生物学特性、生物化学特征或者其他方面特性的分子指示物，其可用于确定存在或不存在某种特定疾病或状况和/或某种特定疾病或状况的严重程度。
本文中使用的术语“治疗”，是指涉及人类或动物(例如，被兽医所应用)的治疗，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明公开的miRNA生物标志物hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p的序列均可在miRBase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中进行查询，其中，hsa-miR-3074-5p的序列如SEQ ID NO.1所示，hsa-miR-371b-5p的序列如SEQ ID NO.2所示；
hsa-miR-3074-5p的序列：
GUUCCUGCUGAACUGAGCCAG(SEQ ID NO.1)
hsa-miR-371b-5p的序列：
ACUCAAAAGAUGGCGGCACUUU(SEQ ID NO.2)
本发明提出了miRNA hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p作为诊断心肌纤维化的生物标志物，血液中的miRNA作为生物标志物相比于其他类型的生物标志物具有以下优势：
(1)更稳定：miRNA在血浆、血清中的稳定性好，经过煮沸、反复冻融、强酸、强碱、DNA酶、RNA酶等多种极端条件的处理，其含量仍然能够保持相对稳定；
(2)更敏感：相关研究发现某些miRNA在疾病早期已有变化，可预示疾病的发生，而且核酸体外扩增技术的发展使得低丰度分子的检测成为可能；
(3)更特异：miRNA具有组织表达和病理过程的特异性，不同疾病有各自特异的循环miRNA表达谱，而且基于碱基配对的序列特异性扩增避免了技术上的假阳性；
(4)更方便：蛋白类标志物的检测需要筛选和制备特异性抗体，而miRNA可以直接测定，因此，相比于其他类型的生物标志物，miRNA用作疾病诊断的生物标志物更方便。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次筛选出了在患有心肌纤维化疾病的患者中呈现显著性差异表达的miRNA，分别为hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p，所述差异表达的miRNA能够用于心肌纤维化疾病的诊断中。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示的是hsa-miR-3074-5p的相对表达水平结果图；
图2显示的是hsa-miR-371b-5p的相对表达水平结果图；
图3显示的是hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p对细胞增殖能力影响的结果图；
图4显示的是hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p对细胞迁移能力影响的结果图；
图5显示的是hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p对细胞侵袭能力影响的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1筛选与心肌纤维化相关的生物标志物
1、研究对象
收集3例医院心内科室提供的患有心肌纤维化疾病的患者，并分别取其血液样本，同时收集体检健康者3例，作为健康对照组，并分别取其血液样本。所有患者均排除恶性肿瘤、急性感染、外伤及严重肝、肾疾病、脑栓塞、肺栓塞、下肢静脉栓塞、DIC和急性肾功能不全等疾病。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书，并通过了本院的组织伦理委员会的同意。
2、测序实验
测序实验采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法进行链特异文库构建，所用到的仪器试剂见表1。
表1仪器和试剂
Figure BDA0002972863240000091
从组织样品中提取总RNA，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
从总RNA里通过跑胶提取出18-30bp范围内的RNA，然后两端加上接头后再进行反转录PCR扩增，之后再库检、环化后使用BGISEQ-500平台，SE50策略进行测序。流程如下：
(1)RNA片段选择:将总RNA使用PAGE电泳切胶分离18-30nt的RNA。
(2)3’接头连接：使用5-adenylated，3-blocked的单链DNA接头连接到(1)中RNA的3’端。
(3)逆转录引物退火：将RT引物加入(2)体系中，与连接在RNA上的3’接头杂交，并与多余的游离3’接头杂交。
(4)5’接头连接：5’接头连接至(3)中产物的5’端，由于接头优先连接于单链分子，而不与3’接头和RT引物的杂交链连接，极大减少了接头自连。
(5)一链cDNA合成：以(3)中RT引物进行逆转录延伸，合成一链cDNA。
(6)PCR扩增：使用高敏聚合酶对cDNA进行扩增，富集同时连接有3’接头和5’接头的cDNA，放大文库产量。
(7)文库片段选择：使用PAGE电泳分离100-120bp范围PCR产物，有效去除了引物二聚体等副产物。
(8)文库定量及pooling环化。
(9)上机测序：BGISEQ-500平台上机测序，SE50策略。
3、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用Fastx-Toolkit对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
(2)用Rfam对测得的小RNA进行注释。成熟miRNA和miRNA前体序列下载自miRBase；
(3)用miRDeep2定量已知miRNA的表达；
(4)在R环境下用DEGSeq2包比较两组的表达差异。
4、测序数据的质量控制
由于原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，这将严重影响后续组装的质量。为保证后续的生物信息分析的准确性，首先对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据(clean data)以保证后续分析的顺利进行，具体步骤及顺序如下：
(1)去除reads中的adapter序列；
(2)剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；
(3)修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；
(4)去除含N的比例达到10％的reads；
(5)舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。
5、Rfam数据库比对
使用Rfam(11.0，http://Rfam.sanger.ac.uk/)数据库对测得的小RNA进行注释，去除其中非miRNA序列，如rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA等，同时也对比对上的非miRNA序列进行种类和数目统计。分析软件：BLAST，版本为v 2.3.0，(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
6、miRNA表达定量与差异表达分析
(1)miRNA表达量评估：将去除rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA等序列后的小RNA序列与miRBase数据库(miRBase 21，http://www.mirbase.org/)中人类的miRNA前体及成熟体序列进行比对，统计map到成熟体区域的序列数，并预测其二级结构。随后对各样本已知miRNA进行表达量统计分析，并利用TPM进行表达量的均一化处理。
公式：
Figure BDA0002972863240000111
分析软件：Bowtie，版本为v 1.2.1.1，(http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)，RNAfold，版本为v 2.1.8，(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)，miRDeep2，版本为v 0.1.0,(https://github.com/Drmirdeep/drmirdeep.github.io/issues)。
(2)miRNA表达量分布：对各个样本的表达量做密度分布图、箱型图以及提琴图，进而能在整体水平上检查不同实验条件下TPM分布的情况。
(3)miRNA表达差异分析：首先对原始的read count进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正；通过统计学模型进行假设检验概率(P-value)的计算；进行多重假设检验校正(BH)，得到padj值(错误发现率)。分析软件：DEGseq2，miRNA采用Pvalue<0.05，|log2FC|≥1作为差异表达筛选标准，用于后续分析。
7、实验结果
实验结果显示，用差异表达筛选标准进行筛选，得到差异miRNA36个，其中表达上调miRNA有16个，表达下调的miRNA有20个，本发明涉及的miRNA生物标志物hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p差异表达的结果见表2，与健康对照组相比，hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p在患有心肌纤维化的患者的血液中显著高表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
表2 hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-371b-5p差异表达的统计结果
Figure BDA0002972863240000121
实施例2检测miRNA对心脏成纤维细胞增殖和迁移的影响
1、细胞培养
将液氮中保存的人原代心脏成纤维细胞(HCF)取出后进行复苏接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、95％湿度及含5％CO2的细胞培养箱中传代培养，取对数生长期的细胞用于实验。
2、原代心脏成纤维细胞的消化、传代
当细胞的融合率达到全培养皿底部面积的80％-90％左右，培养液变黄时，吸尽培养皿内的液体，加入4mL胰酶，放入培养箱内消化2min，取出后置于显微镜下观察，待细胞回缩、细胞间隙变宽后，迅速吸尽胰酶并加入2mL含10％胎牛血清的培养液，终止消化；吹打混匀皿底的细胞，使细胞分散为单个细胞，再将细胞悬液吸入离心管内，放入低速离心机，800rpm离心5min；弃去上层液体，将细胞用培养液重悬后，平均分到4个培养皿中，补足至10mL培养液，放入37℃、95％湿度及含5％CO2的细胞培养箱中继续培养。
3、细胞转染
实验中所用的miR-3074-5p inhibitor、miR-371b-5p inhibitor和inhibitor NC(阴性对照)均由上海吉玛公司合成。根据LipofectamineTM 3000转染试剂说明书进行细胞转染，具体步骤如下：
(1)转染前1天将生长状态良好，处于对数生长期的心脏成纤维细胞接种于6孔板中，置于37℃、95％湿度及含5％CO2的细胞培养箱中培养过夜，转染时的细胞融合度达到50％；
(2)将无血清、无抗生素的Opti-MEM培养基置于室温下平衡；
(3)配制转染物。在9μL miR-3074-5p inhibitor、9μL miR-371b-5p inhibitor、9μL inhibitor NC中分别加入125μL无血清、无抗生素的Opti-MEM培养基，每孔加入5μL的LipofectamineTM 3000试剂，充分吹打混匀后，室温下静置孵育5min；
(4)用吸管吸去6孔板中的培养液，然后在每孔中加入提前配好的800μL含10％胎牛血清的培养液和转染物；
(5)轻轻晃动培养板，使试剂充分混合，置于37℃、95％湿度及含5％CO2的细胞培养箱中继续培养，6h后，更换新鲜的培养液。
4、QPCR检测细胞中miRNA的表达情况
采用TRIzol法提取细胞总RNA，具体步骤如下：
(1)吸去细胞培养液，用1×PBS洗2遍，吸尽PBS；
(2)加入1mL Trizol，混匀，用1ml注射器反复抽取以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min后，将液体吸至Ep管中；
(3)在各Ep管中加入200μL氯仿，震荡后室温静置5min，4℃，12000rpm离心15min；
(4)将离心后液体的上层水相吸至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置5～10min后，4℃，12000rpm，离心15min后，取出Ep管；
(5)弃去上清，加入1mL 75％乙醇，混匀，4℃，10000rpm，离心5min，弃去上清，将Ep管倒置在吸水纸上，室温放置5min后，加入70μL DEPC水；
(6)充分溶解后，取2μL所得RNA，于紫外分光光度计下检测OD260、OD280并计算其比值，以确定RNA的浓度及纯度，于-80℃保存备用。
逆转录合成miRNA cDNA，具体步骤如下：
(1)将1μg的细胞RNA样品(总RNA)配置逆转录反应液，所述反应液的体系包括如下组分：1μL总RNA、1μL RT引物工作液(U6+miRNA)(500nM)、无核糖核酸酶水(RNase freeddH2O)，总体积最后为10μL；
(2)将逆转录反应液置于70℃水浴上10min，冰浴2min；
(3)在逆转录反应液中加入逆转录反应体系，反应体系包括如下组分：4μL 5×Prime Script Buffer、1μL Prime Script RT Enzyme Mix、4μL无核糖核酸酶水(RNaseFree ddH2O)，总体积最后为20μL；
(4)反应条件：42℃60min；70℃10min。反应结束后立即将产物取出，快速置冰上冷却，后续步骤均在冰上进行操作。
miRNA的荧光定量PCR检测，具体步骤如下：
(1)引物设计
扩增miR-3074-5p的引物
正向引物：5’-GCCGAGGTTCCTGCTGAACTG-3’(SEQ ID NO.3)
反向引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’(SEQ ID NO.4)
扩增miR-371b-5p的引物
正向引物：5’-TCGGCAGGACTCAAAAGATGGCG-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’(SEQ ID NO.6)
扩增U6 snRNA的引物
正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO.7)
反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO.8)
(2)PCR反应体系的配置，按照表3配置PCR反应体系，其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表3 PCR反应体系
Figure BDA0002972863240000141
(3)反应条件：95℃ 2min；95℃ 15s，60℃ 30s，45cycles；95℃ 2min，55℃ 30s，95℃ 30s。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以U6 snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、细胞增殖实验检测miRNA对细胞增殖的影响
本实施例采用CCK-8实验检测miRNA对细胞增殖的影响，具体步骤如下：
(1)将实验分为4组，分别为阴性对照NC组、miR-3074-5p inhibitor组、miR-371b-5p inhibitor组和空白对照组，每组均设5个复孔；
(2)转染后的心脏成纤维细胞培养72h后，用0.25％胰酶消化进行细胞计数，将细胞接种于96孔板中，浓度为1×104/mL，每孔加100μL；
(3)避光条件下，96孔板中每孔加入10μL的CCK8试剂，晃动培养板3min,然后将培养板放入培养箱中继续培养，2h后取出，在酶标仪450nm波长处测定OD值。
6、细胞迁移和侵袭实验检测miRNA对细胞迁移和侵袭的影响
本实施例采用Transwell迁移和侵袭实验检测miRNA对细胞迁移和侵袭的影响，具体步骤如下：
(1)制备Transwell小室，无菌条件下Matrigel冰浴融化后按1:8比例稀释Matrigel胶，在Transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后迅速移入37℃的细胞培养箱中温育至其凝固成胶状；
(2)将实验分为4组，分别为阴性对照NC组、miR-3074-5p inhibitor组、miR-371b-5p inhibitor组和空白对照组，每组均设3个复孔；
(3)上室加入数量为2×104个细胞的悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，37℃下恒温培养箱内培养48h；
(4)染色，取出Transwell用PBS洗3遍，使用多聚甲醛固定30min后用PBS洗3遍，加入结晶紫染色30min用纯净水终止染色，放入荧光显微镜下观察并计数。
7、统计学分析
采用统计学软件SPSS20.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图。两组间比较采用配对T检验，三组及以上采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。所有实验重复三次，以P<0.05为差异具有统计学意义。
8、实验结果
细胞转染的结果显示，转染miR-3074-5p inhibitor的实验组的miR-3074-5p的表达水平显著下调，转染miR-371b-5p inhibitor的实验组的miR-371b-5p的表达水平显著下调(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照NC组之间则无显著的差异(见图1和图2)。
CCK-8细胞增殖实验的结果显示，与空白对照组和阴性对照NC组相比，转染miR-3074-5p inhibitor的实验组和转染miR-371b-5p inhibitor的实验组的心脏成纤维细胞增殖活性显著降低(P<0.05)(见图3)，表明抑制miR-3074-5p、miR-371b-5p的表达能有效抑制心脏成纤维细胞的增殖。
Transwell实验的结果显示，与空白对照组和阴性对照NC组相比，转染miR-3074-5p inhibitor的实验组和转染miR-371b-5p inhibitor的实验组的心脏成纤维细胞的迁移和侵袭能力明显降低(P<0.05)(见图4和图5)，表明抑制miR-3074-5p、miR-371b-5p的表达能有效抑制心脏成纤维细胞的迁移和侵袭。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
序列表
<110> 石家庄市人民医院
<120> miRNA生物标志物在心肌纤维化疾病诊断中的应用
<141> 2021-03-11
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
guuccugcug aacugagcca g 21
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
acucaaaaga uggcggcacu uu 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccgaggttc ctgctgaact g 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcaactggt gtcgtgga 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcggcaggac tcaaaagatg gcg 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtgcaggg tccgaggtat 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (3)

1.一种筛选预防心肌纤维化的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 用待测物质处理表达或含有hsa-miR-3074-5p和/或hsa-miR-371b-5p的体系；
(2) 检测步骤(1)所述的体系中hsa-miR-3074-5p和/或hsa-miR-371b-5p的表达水平；
(3) 选择可降低hsa-miR-3074-5p和/或hsa-miR-371b-5p表达水平的待测物质为候选药物。
2.hsa-miR-3074-5p和/或hsa-miR-371b-5p在制备预防心肌纤维化的药物组合物中的应用。
3.hsa-miR-3074-5p和/或hsa-miR-371b-5p在筛选预防心肌纤维化的候选药物中的应用。
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