CN101643791A - microRNA-328及其反义核苷酸在诊断、防治心脏疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了microRNA－328及其反义核苷酸在诊断、防治心脏疾病中的用途。本发明人通过大量的实验证明microRNA－328在重大心脏疾病(心房颤动，缺血再灌注或心肌纤维化)中的改变及其致病作用，以及其反义核苷酸AMO－328对上述心脏疾病起到的防治作用，将其作为一种新型的药物作用靶点，最终确定检测外周血液microRNA－328可以作为一种新的生物标志物在心脏疾病的诊断和预防。还可以通过荧光定量PCR，银染增强的纳米微球技术检测病人外周血液中miRNA－328的表达水平，用于对房颤，长QT综合征，缺血再灌注，心肌纤维化等心脏疾病的诊断和预防。

Description

microRNA-328及其反义核苷酸在诊断、防治心脏疾病中的用途

技术领域

本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新医药用途，尤其涉及microRNA-328及其反义核苷酸在诊断和防治心脏疾病中的用途，属于心脏病的诊断、预防和治疗领域。

背景技术

心脏疾病是一个高度流行的疾病与具有较高的发病率，死亡率，并导致社会经济负担加重。关于心脏疾病的预防、诊断和治疗工作，目前尚存在巨大的不足。房颤，缺血再灌注心律失常以及长QT综合征是临床上心脏疾病的主要表现形式，目前治疗效果不佳，死亡率高。

心肌纤维化作为一个主要的病理学原因参与到心衰，心律失常等多种心脏疾病之中。心脏疾病发病机制错综复杂，每一种发病机制可导致一种或多种疾病的表现形式，而多种疾病的表现形式可能由单一发病机制所导致，这给此类疾病的预防和治疗带来难度。因此目前为止针对单一靶点的药物治疗，尚不能达到让人满意的效果。随着近来microRNAs研究的热潮，这种内源性的非编码小RNAs已经作为一个基因表达调节的中心因子显露，参加许多重要的生理过程。由于单一的microRNA可负向调控多个基因mRNA的表达，使得针对在以不同疾病中关键microRNA为靶点的药物可通过调节多个参与心脏疾病发生的基因的表达，从而为心脏疾病的防治带来新的希望，因此发现不同病理生理情况下起关键调节作用的microRNA亚型变化，并阐明其功能，将会对该疾病的治疗带来新的靶标和产生新的干预策略。尽管越来越多的microRNAs作为人类疾病的生物标志物、决定因素和治疗靶点被发现，但在心房颤动，缺血再灌注和心肌纤维化心脏疾病中的关键microRNA亚型仍没有确定，其所发挥的功能仍是对该领域科研人员的挑战。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，确定或发现在心房颤动，缺血再灌注和心肌纤维化等心脏疾病中起关键作用的microRNA亚型种类。

本发明人通过大量的实验发现，在实验性房颤、缺血再灌注和心肌纤维化等心脏疾病中microRNA-328表达异常上调。本发明人用腺病毒和转基因方法强迫microRNA-328表达，结果发现，microRNA-328过表达可导致房颤、长QT综合征和心肌纤维化的发生，给予microRNA-328反义核苷酸AMO-328，可减弱或逆转上述病理过程。另外，本发明人还发现具有心律失常(房颤、长QT综合征)和心肌纤维化的动物和患者外周血(全血，血浆和血清)中的microRNA-328的表达水平显著上升。

具体的，本发明人发现microRNA-328(5’-CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU-3’(SEQ ID NO：1))在房颤动物模型中显著增高，并且过表达microRNA-328的小鼠伴有房颤的发生。接着发现microRNA-328在缺血再灌注动模模型中显著增高，导致再灌注心律失常及QT间期时间的延长。心衰，心肌纤维化，心房颤动的患者和动物体外周血液(全血，血浆和血清)中的microRNA-328的水平显著升，这意味着microRNA-328可作为一种早期诊断和早期预防心肌纤维化，心律失常的生物标志物。在此基础上，本发明人通过实验确证microRNA-328的反义核苷酸AMO-328(AMOs：5’-GACCGGGAGAGACGGGAAGGCA-3’(SEQ ID NO：2))对心房颤动，心肌纤维化和缺血再灌注损伤具有保护作用，AMO-328可成为一种治疗心律失常，预防心肌纤维化的药物。

本发明人通过大量的实验证明microRNA-328在重大心脏疾病(心房颤动，缺血再灌注或心肌纤维化)中的改变及其致病作用，以及其反义核苷酸AMO-328对上述心脏疾病起到的防治作用，将其作为一种新型的药物作用靶点，最终确定检测外周血液(全血，血浆，血清)microRNA-328可以作为一种新的生物标志物在心脏疾病(心房颤动、缺血再灌注和心肌纤维化)的诊断和预防中应用。具体的，可以合成反义AMO-328并与适当载体(胆固醇，纳米颗粒，壳聚糖，脂质体等)连接形成药物，通过口服、静脉或肌肉注射的方式，对房颤，长QT综合征，缺血再灌注，心肌纤维化等心脏疾病进行治疗。还可以通过荧光定量PCR，银染增强的纳米微球技术检测病人外周血液(全血，血浆和血清)中miRNA-328的表达水平，用于对房颤，长QT综合征，缺血再灌注，心肌纤维化等心脏疾病的诊断和预防。

附图说明

图1AF模型的建立；A犬心电图；B AF发生率和持续时间。

图2犬A-TP组和Ct1组相比差异表达的miRNA；A RNA质量检测；B利用芯片检测差异表达的miRNA；C利用qRT-PCR验证差异表达的miRNA。

图3腺病毒构建的检测；A穿梭质粒与骨架质粒共转染后GFP的表达；B病毒液接种HEK-293细胞后GFP的表达。

图4利用心电监测仪检测注射腺病毒后犬心电图的变化以及AF的持续时间。

图5利用real time PCR检测在体注射腺病毒表达载体后犬心房肌miR-328的表达水平。

图6TG小鼠miR-328的表达及心电图特点；A利用real timePCR检测TG小鼠心房肌miR-328的表达水平；B利用心电监测仪检测TG小鼠心电图的变化以及AF的发生率。

图7miR-328对正常大鼠(7A)、心肌缺血再灌注后大鼠心电图(7B)及心律失常持续时间的影响。

图8大鼠心脏腺病毒在体转染(A，B)/脂质体在体转染(C，D，E)0h及转染后8h心电图QT间期及R-R间期变化对比，及miR-328过表达转基因鼠(F，G)心电图QT间期及R-R间期变化。A.转染腺病毒空病毒组(Adv-pDC-316)；B.转染腺病毒mir-328组(Adv-miR-328)；C.脂质体转染空白对照组(Lipo-NegativeControl)；D.脂质体转染miR-328组(Lipo-miR-328)；E.脂质体转染AMO-328组(Lipo-AMO-328)；F.B6转基因小鼠野生型(WildType，WT)；G.miR-328过表达转基因鼠(miR-328Tg mice)。

图9大鼠心脏腺病毒在体感染/脂质体在体转染及miR-328过表达转基因鼠心电图QTc比值统计。A.腺病毒转染空病毒组(Adv-pDC-316)及mir-328组(Adv-miR-328)0h及转染后8hQTc比值变化对比；B.脂质体转染空白对照组(Lipo-NegativeControl)/miR-328组(Lipo-miR-328)/AMO-328组(Lipo-AMO-328)，0h及转染后8h QTc比值变化对比；C.B6转基因小鼠野生型(Wild Type，WT)与miR-328过表达转基因鼠(miR-328Tgmice)QTc比值。

图10基因芯片筛选及qRT-PCR技术验证心肌缺血再灌注损伤过程中大鼠心室肌细胞中变化的microRNAs。

图11Masson染色结果。

图12HE染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1房颤(AF)中miRNA表达的筛查

本实验采用心房快速起搏法建立AF模型，将起搏电极缝植于右心耳进行起搏(400次/分)，术后进行动态心电监测。27只犬完成整个实验。1只犬因起搏器故障而终止实验；2只犬因囊袋血肿于术后第2周死亡；2只犬术后感染死亡；1只犬于术后第5周突然死亡，尸检发现左、右心耳有较多新鲜血栓，考虑和血栓栓塞有关。起搏前所有犬经程序刺激均未诱发出AF。

在犬心房植入起搏器，起搏前，所有犬期前程序刺激检查均未发生AF。心房快速起搏8周后，A-TP组17只犬中12只出现了自发性AF，Ct1组没有犬出现自发性AF。经电刺激诱导AF时，A-TP组AF的发生率为100％(*p＜0.05vs.对照，图1)，AF持续时间为3000±180sec，而A-TP组AF的发生率只有40％，AF持续时间为3.8±3.4sec。心电图显示，A-TP组P波消失，RR间隔不等，心律100-190次/分。

常规提取犬心房的总RNA，利用紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行检测。28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

miRNA表达谱芯片由康成生物有限公司提供，利用miRCURY^TM芯片标记试剂盒和RNeasy Mini试剂盒进行miRNA标记及浓缩标记样品，采用miRCURY^TM芯片微点阵试剂盒进行miRNA芯片杂交，并在635nm处激发荧光，利用Genepix 4000B进行图像扫描并使用Genepix Pro 6.0进行数据分析。实验组标准值与正常组标准值相比高于2倍或低于0.5倍即认为存在显著性上调或下调趋势。通过对miRNA芯片分析，发现和Ct1组相比，犬A-TP组差异表达的miRNA共有10个，其中上调4个，下调6个(图2B)。

利用real time PCR方法对筛选出的差异表达的miRNA进行验证，其的结果与芯片检测结果相一致(miR-517没有检测到，图2C)，其中，miR-328变化最明显。

实验例2腺病毒载体的构建

利用脂质体2000将构建好的pDC316-EGFP-U6穿梭质粒(请给出“pDC316-EGFP-U6穿梭质粒”的具体构建方法；如果该穿梭质粒的具体构建方法在文献中已公开，诶出该文献的具体出处即可)与pBHGlox骨架质粒(请给出“pBHGlox骨架质粒”的商业购买来源或具体的构建方法)按7-8∶1共转染HEK-293细胞，6d到细胞出现明显细胞病变，且有GFP的表达。更换无血清MEM，收集细胞，反复冻融3次裂解细胞，10000g离心收集上清既为病毒液，用于感染实验，感染4d后观察GFP的表达(图3)。

选用体重20-30kg成年健康杂种犬，分为三组：(1)空载体组(Adv-pDC316)；(2)腺病毒注射组(Adv-pre-miR-328)；(3)Adv-pre-miR-328+AMO-328共注射组(Adv-pre-miR-328+AMO-328)。无菌条件下正中开胸，切开心包，行心包吊床术，将上述腺病毒构建的miR-328(100MO)和脂质体包裹的AMO-328(10nM)用小号注射器注入到左房游离壁(每cm²注射10个点)。将刺激电极固定于注射的部位，12h后记录心电图。实验结果显示(图4)注射Adv-pre-miR-328后犬的心电图发生了明显的变化，AF的持续时间明显升高达到1113±222sec(*p＜0.05vs Adv-pDC316)，而注射Adv-pDC316后AF的持续时间仅仅为20±5sec，同样显著的是Adv-pre-miR-328+AMO-328共注射后，AF的维持时间显著降低，达到190±54sec(*p＜0.05vs Adv-pre-miR-328)。

利用real time PCR检测注射Adv-pre-miR-328后miR-328的表达水平。实验结果显示(图5)：和Adv-pDC316相比，Adv-pre-miR-328注射到犬左心房游离壁12h后miR-328的表达量升高4.9倍(*p＜0.05vs Adv-pDC316)；Adv-pre-miR-328+AMO-328共注射后，与只注射Adv-miR-328组相比，miR-328的表达量明显降低(+p＜0.05vs Adv-pre-miR-328)。可见，这种在体转导方法可用于后续蛋白表达及心电监测的实验中。

实验例3miR-328心脏过表达TG小鼠模型的构建

利用real time PCR检测TG小鼠各脏器中miR-328的表达量，结果显示(图6A)：与非转基因小鼠(WT)相比，TG小鼠左心房miR-328的表达量升高至少17倍(*p＜0.05vs.WT)，因此本发明人应用阳性的TG小鼠进行心电监测的实验。应用心电监测仪记录了14只阳性TG小鼠和14只WT小鼠的心电变化，结果显示(图6B)：所有14只阳性TG小鼠均出现自发性AF，即P波消失，R-R间期不等。在WT小鼠中没有检测到上述的改变。

实验例4microRNA-328及其反义核苷酸AMO-328在缺血再灌注性心律失常作用

一、大鼠心肌缺血-再灌注模型记录心电图

将各组大鼠开胸后结扎冠状动脉左前降支，分别记录结扎前ECG和结扎1h后再灌注后的心电图(图7B)。动物冠状动脉结扎后逐渐出现ST段抬高，说明大鼠左室前壁有明显缺血；同时伴有多种类型的室性心律失常，平均持续时间为(953.75±348.71ms)，给予在体转染miR-328后再给予缺血再灌注后，出现剧烈的室性心律失常，其发生率为100％，持续时间为(2477.70±725.68ms)。单独给予AMO-328在体转染后，再给予大鼠缺血再灌注，动物室性心律失常发生率明显降低，持续时间为(345.90±208.02ms)。给予正常大鼠在体转染miR-328后，出现多种类型的室性心律失常，持续时间为(1375.34±504.41ms)(图7A)，单独给予AMO-328后，大鼠只表现明显的前壁心肌缺血表现，ST段抬高，而几乎无室性心律失常出现(32.61±49.91ms)。说明miR-328可诱发大鼠室性心律失常发生，并可加重心肌缺血再灌注性心律失常的发生，而AMO-328可以逆转miR-328的致室性心律失常效应。

二、miR-328在体转染对大鼠QT间期变化的影响

分别用腺病毒、脂质体给予大鼠心脏在体转染mir-328，AMO-328，记录转染前及转染后8小时心电图中QT间期及R-R间期变化，以及miR-328过表达转基因小鼠心电图中QT间期及R-R间期变化，并通过Bazett′s公式计算：实测QT/RR1/2。计算得到心率校正的QT间期(QTc)。结果显示：腺病毒在体感染miR-328组，在感染后8h，QTc值(220.14±27.72ms)较未注射前0h，QTc值(147.66±14.26ms)明显延长(p＜0.01)；脂质体转染mir-328组，在转染后8h QTc值(198.76±4.93ms)较未转染前0h QTc值(183.38±22.61ms)明显延长(p＜0.05)；miR-328过表达转基因鼠QTc值(125.73±12.96ms)较野生型B6小鼠QTc值(101.00±14.67ms)明显延长(p＜0.01)。此结果说明，miR-328参与大鼠心电图QT间期延长的病理过程(图8、图9)。

三、基因芯片检查缺血再灌注大鼠心室细胞肌microRNA的表达变化及qRT-PCR技术验证

分别取正常大鼠心室肌组织和缺血再灌注区域心室肌组织，采用miRCURY^TM Array microarray kit，筛查与正常组大鼠相比上调或下调2倍以上的microRNA，芯片筛查结果显示：心肌缺血再灌注损伤导致33个microRNA的表达变化2倍以上，其中20个上调，13个下调，尤以miR-1、miR-328及miR-499变化显著(图10)。

实验例5microRNA-328过表达TG小鼠心肌纤维化改变

1.Masson染色

通过对小鼠正常组、转mir-328的2个月组及3个月组的左室取材进行Masson染色结果比较，转mir-328的2个月组与3个月组均呈现出不同程度的纤维化，并且呈现趋势为转mir-328的3个月组纤维化程度高于2个月组(图11)。

2.HE染色

通过对小鼠正常组、转mir-328的2个月组及3个月组的左室取材进行HE染色结果比较，转mir-328的2个月组与3个月组均呈现出不同程度的纤维化，并且呈现趋势为转mir-328的3个月组纤维化程度高于2个月组(图12)。

实验例6心房颤动，缺血再灌注损伤动物模型外周血液，血浆，血清microRNA-328的测定

采用定量PCR方法，引物序列如表1所示。相对定量即采用2^{- ΔΔT}法，通过模型组与正常组的比值来分析miRNA表达量的变化；绝对定量是通过标准品得到标准曲线，从而得到每个检测样品的miRNA的实际表达量。

表1心房颤动犬外周血液(血浆)microRNA-328的测定

miR-328	GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACGGAA
		U6	CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT

表2缺血再灌注损伤大鼠外周血液(血浆)miRNA-328的测定

表3缺血再灌注损伤大鼠外周血液(血浆)miRNA-328的测定

KLPI090530_3

序列表

<110>哈尔滨医科大学

<120>microRNA-328及其反义核苷酸在诊断、防治心脏疾病中的用途

<130>KLPI05689

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>homo sapiens

<400>1

CUGGC CCUCU CUGCC CUUCC GU    22

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>homo sapiens

<400>2

GACCG GGAGA GACGG GAAGG CA    22

Claims (6)

1、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在制备诊断、预防或治疗心脏疾病药物中的用途。

2、按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的心脏疾病包括房颤，长QT综合征，缺血再灌注或心肌纤维化。

3、一种预防或治疗心脏疾病的药物组合物，由有效量的权利要求1所述的核苷酸序列和药学上可接受的载体或赋料组成。

4、SEQID NO：2所示的核苷酸序列在制备预防或治疗心脏疾病药物中的用途。

5、按照权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的心脏疾病包括房颤，长QT综合征，缺血再灌注或心肌纤维化。

6、一种预防或治疗心脏疾病的药物组合物，由有效量的权利要求4所述的核苷酸序列和药学上可接受的载体或赋料组成。

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