CN107385033A

CN107385033A - piRNA‑5938及其反义核酸在诊断、预防、治疗、预后评估缺血性心脏疾病中的应用

Info

Publication number: CN107385033A
Application number: CN201710583492.5A
Authority: CN
Inventors: 李培峰; 孙腾; 王建勋; 范长江; 于万鹏; 常文光
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2017-07-17
Filing date: 2017-07-17
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-07-17
Also published as: CN107385033B

Abstract

本发明提供一种piRNA及其反义核酸在诊断、预防、治疗、预后评估缺血性心脏疾病中的用途。本发明提供的piRNA为包含如SEQ ID No.2所示序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体；该piRNA可以作为一种新的生物标志物应用于缺血性心脏疾病的诊断和/或预后评估。此外，该piRNA的反义核酸可以作为一种新型的药物用于缺血性心脏疾病的预防和/或治疗。

Description

piRNA-5938及其反义核酸在诊断、预防、治疗、预后评估缺血性心脏疾病中的应用

技术领域

本发明属于生物医药工程领域，涉及一种内源性的非编码小分子RNA 及其反义核酸的新用途，具体涉及一种piRNA(piwi-interacting RNA)及其反义核酸在诊断和/或预防和/或治疗和/或预后评估缺血性心脏疾病中的用途。

背景技术

心血管疾病是威胁人类生命健康的重大疾病，其发病率、死亡率均居各种疾病之首。目前中国心血管病患病人数约为2.9亿，并且患病率及死亡率仍在持续上升。每年用于心血管疾病的医疗费用高达1300亿元人民币，给国家、人民造成巨大经济和社会负担。因此，加强心脏疾病的研究意义重大，其研究成果将为心脏疾病的防治提供理论和临床依据。

缺血性心脏病是由于心肌缺血引起心肌损伤最终导致的心脏疾病，包括冠心病、心肌梗死、心律失常、心力衰竭等等。目前临床上缺乏有效治愈缺血性心脏病的手段。近年来研究表明细胞凋亡是缺血性心肌损伤中的重要病理事件。如何减少心肌细胞凋亡已成为心肌保护的研究热点之一。

细胞凋亡是一种由基因决定的细胞主动而有序的死亡方式。在缺血性心肌损伤中，细胞凋亡受细胞周围的刺激信号诱导或抑制，并由特定的基因控制。因此，阻断心肌缺血性损伤中心肌细胞凋亡的信号转导能够减少心肌细胞凋亡，抑制心肌缺血性损伤，对临床预防和治疗缺血性心脏病提供新的希望。

Piwi-interacting RNA(简称piRNA)是一类长度约26-31nt的单链非编码RNA，在转座子抑制和基因表达调控方面行使重要功能。研究表明piRNA 的调控网络已经涉及包括生殖系统、神经系统和心血管系统在内的多个领域，同时piRNA通过调控基因转录、翻译或沉默转座子，参与了乳腺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌等多种肿瘤的发生发展。

值得关注的是，piRNA在细胞凋亡和心肌损伤中发挥重要调控作用。 piRNA特异性结合蛋白piwil2能够与转录因子p38形成蛋白复合体，进而抑制Fas介导的细胞凋亡，Piwil2还能通过靶向p38抑制p53磷酸化，参与细胞凋亡调控。Hsa_piR_011186与甲基转移酶DNMT1、Suv39H1蛋白相互结合形成沉默复合物，调控cdkn2b基因启动子的甲基化，进而抑制细胞凋亡。piRNA-823的抑制显著下调了DNA甲基转移酶DNMT3A和3B的表达水平，引起细胞周期调控因子和凋亡相关蛋白的功能紊乱。这些结果提示piRNA与细胞凋亡具有密切的关系。最新研究报道表明piRNA调控了心肌缺血性损伤过程。piRNA可以抑制心脏中反转座子LINE-1的表达， LINE-1的抑制激活了Akt/PKB信号通路，从而抑制细胞凋亡，减小心脏的缺血性损伤。

随着piRNA研究的热潮，这种内源性非编码小RNAs已经作为一个基因表达调控的关键因子显露，参加许多重要的生理病理过程。piRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的piRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，piRNA作为心脏疾病的诊断、预防和治疗靶点，开发相关诊断试剂盒和治疗药物具有及其重要的意义和应用前景。

针对现有技术中存在的上述问题，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种piRNA-5938及其反义核酸在诊断、预防、治疗、预后评估缺血性心脏疾病中的应用，确定了piRNA-5938是在缺血性心肌损伤中表达上调的piRNA，将piRNA-5938及其反义核酸应用到心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心肌纤维化、冠心病和心力衰竭等心脏疾病的诊断、预防和治疗中。

本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗缺血性心脏疾病的药物组合物。

本发明的第三个目的在于提供一种用于诊断和/或预后评估缺血性心脏疾病的试剂盒。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

piRNA-5938反义核酸在制备用于预防和/或治疗缺血性心脏疾病药物中的应用；所述piRNA-5938反义核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

预防和/或治疗缺血性心脏疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物含有具有如SEQ ID No.1所示序列的piRNA反义核酸的核酸，生物活性功能片段或变体，

所述缺血性心脏疾病包括绞痛心肌梗死，急性心肌梗死，室性心律失常和冠状动脉粥样硬化中的一种或几种。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

优选地，所述药学上可接受的载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。

优选地，所述药物的给药方式选自口服或注射；所述注射方式包括静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或心肌注射。

piRNA-5938在制备用于诊断和/或预后评估缺血性心脏疾病试剂盒中的应用，所述piRNA-5938的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

用于诊断和/或预后评估缺血性心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒含有具有如SEQID No.2所示序列的piRNA-5938；

优选地，所述试剂盒还包括用于特异性检测piRNA-5938的探针或引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID No.4所示。

上述的缺血性心脏疾病包括绞痛心肌梗死，急性心肌梗死，室性心律失常和冠状动脉粥样硬化中的一种或几种。

本发明的有益效果如下：

本发明发现piRNA-5938在缺血性心肌损伤及双氧水诱导的心肌细胞凋亡过程中表达水平显著上调。通过转染piRNA-5938反义核酸抑制 piRNA-5938的表达可以抑制心肌细胞凋亡，即piRNA-5938反义核酸通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，piRNA-5938反义核酸对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。

附图说明

图1为piRNA-5938在结扎冠状动脉左前降支进行缺血再灌注处理的 C57小鼠心脏中表达情况；

图2为piRNA-5938在双氧水处理的原代心肌细胞中表达情况；

图3为piRNA-5938在缺氧处理的原代心肌细胞中表达情况；

图4为piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了piRNA-5938的表达水平；

图5为piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了双氧水诱导的细胞死亡；

图6A为piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了双氧水诱导的细胞凋亡的TUNNEL实验检测结果；

图6B为piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了双氧水诱导的细胞凋亡的TUNNEL阳性细胞的统计图；

图7为过氧化氢诱导了piRNA-5938与促凋亡因子P53的结合；

图8为过氧化氢诱导了piRNA-5938与促凋亡因子P53的结合。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的发明人发现piRNA-5938反义核酸通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用。在缺血性心肌损伤、双氧水诱导心肌细胞凋亡和缺氧诱导心肌细胞凋亡过程中，piRNA-5938表达水平显著上调，piRNA-5938 的上调可能诱导了心肌细胞凋亡的发生。心肌细胞中转染piRNA-5938反义核酸下调了piRNA-5938的表达水平，piRNA-5938表达水平的下调抑制了过氧化氢和缺氧诱导的心肌细胞凋亡。将piRNA-5938反义核酸与适当的载体结合形成药物，导入心脏或体内，对许多心脏疾病将具有预防及治疗作用。可以考虑将piRNA-5938反义核酸与壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等组合形成药物分子，通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射的方式，用于防治缺血性心脏病、改善心脏功能、阻止心肌纤维化及心肌重构的发生。

本发明中将piRNA-5938反义核酸用于制备预防和/或治疗缺血性心脏疾病药物；所述piRNA-5938反义核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明中的缺血性心脏疾病包括绞痛心肌梗死，急性心肌梗死，室性心律失常和冠状动脉粥样硬化中的一种或几种。

本发明还提供一种预防和/或治疗缺血性心脏疾病的药物组合物，该药物组合物含有具有如SEQ ID No.1所示序列的piRNA反义核酸的核酸，生物活性功能片段或变体；该药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

在一个优选实施例中，药物组合物含有如下任一种物质：

I、SEQ ID No.1所示的RNA分子；

II、编码I所示RNA分子的重组载体；

III、编码I所示RNA分子的重组病毒；

Ⅳ、编码I所示RNA分子的重组病毒载体；

在一个优选实施例中，药学上可接受的载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。

在一个优选的实施例，药物组合物中包含的piRNA反义核酸的含量为 0.5-2μg。

在一个优选的实施例中，药物的给药方式选自口服或注射；所述注射方式包括静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或心肌注射。

本发明还提供了piRNA-5938在制备用于诊断和/或预后评估缺血性心脏疾病试剂盒中的应用，所述piRNA-5938的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述piRNA-5938的核苷酸序列如下：

5′-UCCCUGGUGGUCUAGUGGUUAGGAUUCGGCAC-3′(SEQ ID No.2)。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估缺血性心脏疾病的试剂盒，该试剂盒含有具有如SEQ ID No.2所示序列的piRNA-5938，该试剂盒还包括用于特异性检测piRNA-5938的探针或引物，所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ IDNo.3所示，下游引物的序列如SEQ ID No.4所示。

在一个优选的实施例中，该试剂盒含有如SEQ ID No.2所示的RNA分子；

本发明使用的实验材料和试剂如下：

Dulbecco’s modified Eagle medium/F-12:GIBCO；

FBS(胎牛血清)：Life Technologies；

Poly-L-lysin(L-多聚赖氨酸):Sigma Aldrich；

Pancreatin(胰液素)：Sigma Aldrich；

Collagenase Type II(II型胶原酶)：Worthington；

Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶):Sigma Aldrich；

piRNA反义核酸(antagomir)：GenePharma Co.Ltd.；

Lipofectamine 2000：Life Technologies；

TUNEL kit：Roche；

Trizol试剂：Life Technologies；

DEPC处理水：Life Technologies；

反转录酶：Toyobo；

RNase Inhibitor：Takara；

dNTP mix：Takara；

SYBR Green Realtime PCR Master Mix：Takara；

C57BL/6成年小鼠：中国医学科学院实验动物科学研究所；

SD大鼠乳鼠：中国医学科学院实验动物科学研究所。

实施例1

piRNA-5938在结扎冠状动脉左前降支进行缺血再灌注处理的C57小鼠心脏中表达增加

1、建立结扎冠状动脉左前降支缺血再灌注模型

1)C57小鼠称重并麻醉，2％水合氯醛，剂量为0.2mL/10g；

2)待小鼠充分麻醉后，将小鼠固定在手术台上，同时连接心电图，以检测心跳情况；

3)将小鼠胸前和颈部毛剃掉，涂抹碘伏以消毒；

4)气管插管，在小鼠颈部正中的皮肤剪开，然后用镊子分离脂肪层和肌肉，暴露气管并在气管下穿线；用手术剪在气管上方剪开一个小口子，将呼吸机的插管插入气管中，用手术线捆绑固定，打开呼吸机，参数为呼吸频率100次/分，潮气量6-10mL，呼吸比为1：2：5)开胸，在小鼠左胸第二和第三根肋骨间，顺着肋骨方向捡来肌肉，然后用撑皮器撑开肋骨，暴露心脏；用镊子撕开心包膜；

6)结扎，结扎冠状动脉左前降支；大概位置如下：找到左心耳，在左心耳左下角出下方0.5-1mm处自左向右穿针，深度约0.5-1mm。然后在结扎处垫一个小塑料管，防止勒断心肌，系一个活扣，此时，心尖变白，心电图中ST段抬高；

7)结扎时间设置梯度，0，10min,30min,60min，将结扎绳松开；

8)缝合，关胸；撤掉呼吸机；

9)Sham组实验，即不进行结扎冠状动脉左前降支，其余步骤与实验组相同。

2、提取总RNA

1)提前准备无RNase的枪头、EP管、DEPC处理水、无RNase水；全程在无RNase环境中进行，如无特别说明，全部在冰上操作；

2)将细胞中的培养基弃掉，加入适量的Trizol试剂(以1mL为例)，吸打，细胞裂解下来，转移至无RNase的EP管中，为了保证RNA的提取效率，最好是用新鲜的组织或细胞，如果实验无法连续进行，此步骤的样品放在-80℃保存；

3)室温静置5min，保证细胞充分裂解，DNA和蛋白质分离；

4)800rpm,4℃离心5min，上清转移至新的EP管中，弃掉沉淀，沉淀为细胞碎片；

5)加入200μl三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温静置10min；

6)12000rpm,4℃离心15min，离心后，液体分为三层，上层为含有RNA 的水相，将上层水相吸出转移至新的EP管中，注意一定要小心，不要吸到中间的蛋白质层，否则会影响最终RNA的纯度；

7)加入等体积的冰乙醇，上下颠倒混匀，冰上静置30min；

8)12000rpm,4℃离心15min；

9)弃上清，沉淀中加入1mL 75％的冰乙醇，12000rpm，4℃离心5min；

10)重复步骤9)一次；

11)弃掉上清，冰上晾干；

12)加入适量体积的无RNase水溶解RNA，混匀，-80℃保存。

3、piRNA-5938的cDNA制备

将提取的总RNA用Dnase I消化，去除基因组。然后进行反转录，反转录体系为：5×RT Buffer 4μL；dNTP(2.5mM)8μL；RT Primer 1μL；RNase Inhibitor 1μL；ACE反转录酶1μL；RNA 1μg；DEPC水补充至20μL； 42℃反应1h，100℃灭活。U6作为内参。

piRNA-5938反转录(RT)引物序列如下：

5‘-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA CGTGCCG-3’(SEQ IDNo.5)，

U6反转录(RT)引物序列如下：

5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID No.6)；

4、实时荧光定量PCR检测piRNA-5938表达量

反应体系为：SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5μL；ROX 4μL；PrimerF 0.5μL；Primer R 0.5μL；cDNA 2μL；三蒸水补充至25μL

piRNA-5938进行实时荧光定量PCR的引物序列如下：

正向引物：5’-TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAG-3’(SEQ ID No.3)

反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID No.4)；

U6进行实时荧光定量PCR的引物序列如下:

正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3’(SEQ ID No.7)

反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID No.8)；

反应仪器为ABI Prism 7000sequence detection system(Applied biosystems)仪器；

反应条件：95℃，60s；95℃，15s；60℃，60s；72℃，45℃；72℃， 10min；4℃，∞，40个循环。

结果如图1所示，图1为在8周龄C57小鼠心脏中结扎冠状动脉左前降支，分别缺血0min、10min、30min、60min，再灌注24h，提取缺血区和边界区心脏组织RNA，Realtime-PCR法检测piRNA-5938表达水平，U6为内参，*代表p<0.05，结果显示，随着心肌缺血时间的递增，piRNA-5938 的表达量逐渐上升，具有显著差异。

实施例2

piRNA-5938在双氧水处理的原代心肌细胞中表达增加

1、原代心肌细胞分离

1)高压灭菌实验用的器材，包括剪刀、镊子、刀片、玻璃平皿、260目过滤网、50mL锥形瓶、小转子、枪头、移液管；准备好实验用所有试剂；准备好冰盒、37℃气浴摇床；

2)用Poly-L-lysin处理最终要培养心肌细胞的培养皿，37℃，1小时，然后用无菌三蒸水洗2-3次，晾干；Poly-L-lysin的作用是使培养皿利于心肌细胞贴壁；

3)在超净台中准备好一个冰盒，将4个盛有1×ADS buffer的培养皿放在冰盒上预冷；

4)杀鼠，将1-2天的SD大鼠乳鼠，不分雌雄，放进75％酒精中清洗消毒2次，最后淹死；

5)左手将小鼠抓住，暴露前胸，右手用剪刀在小鼠左胸剪一刀，左手轻轻一捏，将小鼠心脏挤出胸腔，拿无菌镊子将心脏心尖大部分夹下来，在1 ×ADS buffer中清洗3次，镊子轻轻挤压心脏，将血挤尽，最后放在干净预冷的5mL 1×ADS buffer中，按照这个方法，取出所有小鼠的心脏；

6)用刀片将切碎所有心脏组织，大约切15min，最终心脏组织块约1mm3 大小，注意心脏组织块不宜太大或太小，否则会影响后面的消化效果；

7)用移液器将组织块和ADS缓冲液转移至50mL锥形瓶，加入8mL消化液，37℃气浴摇床中摇晃消化5min；取出锥形瓶，静止1min，将上清全部弃掉，此时上清中大部分为残留的血细胞和杂质；

8)加入10mL消化液，吸打混匀，37℃气浴摇床,摇晃消化15min，取出锥形瓶，静止1min，吸取上清转移至盛有3mL马血清的50mL离心管中，终止消化，终止消化的细胞放在冰上；

9)组织块中继续加入8mL消化液，吸打混匀，37℃气浴摇床中摇晃消化10min；取出锥形瓶，静止1min，吸出上清转移至盛有马血清的离心管中，终止消化；

10)重复以上步骤，每次的消化液体积和消化时间分别为：8mL/10min； 8mL/10min；8mL/10min；8mL/10min；8mL/10min；5mL/5min至结束，结束标志为心脏组织几乎完全消失；

11)将收集的细胞离心，800rpm，5min，弃上清；

12)加入含5％马血清的DMEM/F12，吸打混匀细胞进行清洗，800rpm 离心5min，弃上清；

13)重复上述步骤一次；

14)加入10mL含5％马血清的DMEM/F12重悬细胞，然后用260目细胞筛过滤到10cm培养皿中，37℃培养箱中培养1小时；

15)根据心肌细胞贴壁慢，非心肌细胞贴壁快的原理，差速贴壁1小时后，将上清吸出转移至50mL离心管中；

16)在上清细胞中，加入10-4M的Brdu，混匀，分装到Poly-L-lysin处理过的培养皿中，细胞浓度约为1×105/mL，37℃培养箱中培养过夜，Brdu 的作用是抑制非心肌细胞生长，进一步去除非心肌细胞；

17)次日，在心肌细胞培养约20小时后，给细胞换液，用1×ADS buffer 清洗一次，换液后便可以进行实验了。

2、双氧水处理原代心肌细胞

100μM双氧水处理原代心肌细胞，设置时间梯度0，1h，3h，6h，9h， 12h；

3、提取总RNA，操作方法与实施例1中的该步骤相同；

4、piRNA-5938的cDNA制备，操作方法与实施例1中的该步骤相同；

5、实时荧光定量PCR检测piRNA-5938的表达量，操作方法与实施例 1中的该步骤相同。

结果如图2所示，图2为分离1-2天SD大鼠乳鼠原代心肌细胞，100μM 过氧化氢分别处理0h、1h、3h、6h、9h、12h，收集细胞，提取RNA， Realtime-PCR法检测piR-5938的表达水平，U6为内参，*代表p<0.05，结果显示，随着双氧水处理时间的递增，piRNA-5938的表达量逐渐上升，具有显著差异。

实施例3

piRNA-5938在缺氧处理的原代心肌细胞中表达增加

1、原代心肌细胞分离，操作方法与实施例2中的该步骤相同；

2、缺氧处理原代心肌细胞

在低氧培养箱中(氧浓度低于1％)对大鼠乳鼠原代心肌细胞进行培养，培养规模为10cm培养皿，每个培养皿的细胞量约为1×10⁶个，培养时间持续0，10min，30min，60min；

3、提取总RNA，操作方法与实施例1中的该步骤相同；

4、piRNA-5938的cDNA制备，操作方法与实施例1中的该步骤相同；

5、实时荧光定量PCR检测piRNA-5938的表达量，操作方法与实施例 1中的该步骤相同；

结果如图3所示，图3为分离1-2天SD大鼠乳鼠原代心肌细胞，缺氧条件分别处理0min、10min、30min、60min，收集细胞，提取RNA， Realtime-PCR法检测piR-5938的表达水平，U6为内参，*代表p<0.05，结果显示，随着缺氧处理时间的递增，piRNA-5938的表达量逐渐上升，具有显著差异。

实施例4

piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了piRNA-5938的表达水平

1、合成piRNA-5938反义核酸(antagomir)序列如下：

5’-GUGCCGAAUCCUAACCACUAGACCACCAGGGA-3’(SEQ ID No.1)

2、阴性对照NC的序列如下:

5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID No:9)

3、转染piRNA-5938反义核酸(antagomir)

1)分离1-2天SD大鼠乳鼠原代心肌细胞；

2)次日，将细胞培养液换成无血清的DMEM/F12，无双抗；

3)将待转染RNA用DMEM/F12培养基稀释，总体积为250μL，用移液枪吸打20次，混匀，室温静置5min；

4)将2μL LipofectamineTM 2000转染试剂加,250μL DMEM培养基中。用移液枪吸打20次，混匀，室温静置5min；

5)将RNA稀释液和转染试剂稀释液混合，移液枪吸打20次，混匀，室温静置15min；

6)将上述混合物加入原代心肌细胞中，RNA终浓度100nM；5％CO₂， 37℃培养箱中培养；

7)6小时后，将培养基换成含5％FBS的DMEM/F12培养基；

8)24小时后，即可进行后续实验。

4、提取总RNA，操作方法与实施例1中的该步骤相同；

5、piRNA-5938的cDNA制备，操作方法与实施例1中的该步骤相同；

6、实时荧光定量PCR检测piRNA-5938的表达量，操作方法与实施例 1中的该步骤相同。

结果如图4所示，图4为合成piRNA-5938反义核酸(antagomir)转染原代心肌细胞，NC作为阴性对照。24小时后，收集细胞，提取RNA， Realtime-PCR法检测piRNA-5938的表达水平，U6作为内参，*代表p<0.05，结果显示，piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了piRNA-5938的表达水平，具有显著差异。

实施例5

piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了双氧水诱导的细胞死亡

1)分离1-2天SD大鼠乳鼠原代心肌细胞；

2)转染piRNA-5938反义核酸(antagomir)；

3)100μM双氧水处理原代心肌细胞6h；

4)台盼兰染色法检测细胞死亡情况，步骤为：配制台盼兰染液，工作浓度为0.4％；常规细胞操作的胰酶消化下细胞后，同细胞培养液混合均匀，取出部分细胞悬浊液与0.4％的台盼兰溶液按照1：1的比例等量混合，静置三分钟，均匀的取出少量液体滴在血细胞计数板上，在光学显微镜下计数；由于活细胞与死细胞的细胞膜通透性不同，因此以此来区分细胞的状态；台盼兰无法进入到活细胞中，活细胞为无色透明，而死细胞细胞膜通透性增强，被染成蓝色。在光学显微镜下，通过对蓝色的细胞和无色透明的细胞分别计数，即计算出细胞死亡的比率。

结果如图5所示，图5为合成piRNA-5938反义核酸(antagomir)转染原代心肌细胞，24小时后，100μM过氧化氢处理细胞诱导凋亡，收集细胞， TUNEL法鉴定细胞凋亡情况，*代表p<0.05，结果显示，piRNA-5938反义核酸(antagomir)显著抑制了双氧水诱导的细胞死亡。

实施例6

piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了双氧水诱导的细胞凋亡

1)分离1-2天SD大鼠乳鼠原代心肌细胞；

2)转染piRNA-5938反义核酸(antagomir)；

3)100μM双氧水处理原代心肌细胞6h；

4)TUNNEL法检测细胞凋亡情况，采用罗氏公司的TUNNEL试剂盒。具体步骤由试剂盒中附带的说明书上所提供。当细胞发生凋亡时，细胞内的基因组DNA会发生断裂，暴露出3’-OH；在具备有末端脱氧核苷酸转移酶的条件下，暴露出的3’-OH可以经转移酶的催化，加上dUTP。此时的dUTP是经过绿色荧光或红色荧光标记的，可以在荧光显微镜下检测到；因此，TUNEL通过荧光标记dUTP，标记了发生了DNA断裂的细胞，即发生了凋亡的细胞。

结果如图6A和6B所示，图6A和6B为合成piRNA-5938反义核酸 (antagomir)转染原代心肌细胞，24小时后，100μM过氧化氢处理细胞诱导凋亡，收集细胞，台盼兰染色法检测细胞死亡情况，其中，图6A为 TUNNEL实验检测结果，图6B为TUNNEL阳性细胞的统计图；*代表p<0.05，结果显示，piRNA-5938反义核酸(antagomir)抑制了双氧水诱导的细胞凋亡。

实施例7

过氧化氢诱导了piRNA-5938与促凋亡因子P53的结合

分离1-2天SD大鼠乳鼠原代心肌细胞；用100μM过氧化氢处理原代心肌细胞诱导凋亡，设置时间梯度0，3h，6h；再用P53抗体进行免疫沉淀，提取RNA，qRT-PCR法检测沉淀物中piRNA-5938表达水平。选择miR-17 和miR-361作为阴性对照；其具体操作参见文献：Li J#,Aung LH#,Long B#, Qin D*,An S,Li PF*.miR-23a binds to p53and enhances itsassociation with miR-128promoter.Scientific Reports.2015Nov 10；5:16422.

miR-17的反转录(RT)引物序列如下：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA CCTACCT-3’(SEQ IDNo.10)；

miR-361的反转录(RT)引物序列如下：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA CGTACCC-3’(SEQ IDNo.11)；

miR-17的实时荧光定量PCR引物序列如下：

正向引物：5’-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG-3’(SEQ ID No.12)

反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID No.6)；

miR-361的实时荧光定量PCR引物序列如下：

正向引物：5’-TTATCAGAATCTCCAGGGGTAC-3’(SEQ ID No.13)

反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID No.6)；

结果如图7，图8所示，图7为分离1-2天SD大鼠乳鼠原代心肌细胞， 100μM过氧化氢分别处理细胞0h、3h、6h；收集细胞，使用P53抗体进行免疫沉淀实验。提取沉淀产物RNA，Realtime-PCR法检测piRNA-5938 表达水平；U6作为内参，*代表p<0.05；图8为100μM过氧化氢处理原代心肌细胞6h，收集细胞，使用P53抗体进行免疫沉淀实验，取沉淀产物 RNA，Realtime-PCR法检测piRNA-5938、miR-17和miR-365表达水平， U6作为内参，结果显示，过氧化氢诱导了piRNA-5938与促凋亡因子P53 的结合。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> piRNA-5938及其反义核酸在诊断、预防、治疗、预后评估缺血性心脏疾病中

的应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gugccgaauc cuaaccacua gaccaccagg ga 32

<210> 2

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ucccuggugg ucuagugguu aggauucggc ac 32

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccctggtgg tctagtggtt ag 22

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgtgccg 50

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcttcggcag cacatatact aa 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

caguacuuuu guguaguaca a 21

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctacct 50

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgtaccc 50

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caaagtgctt acagtgcagg tag 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttatcagaat ctccaggggt ac 22

Claims

1.piRNA-5938反义核酸在制备用于预防和/或治疗缺血性心脏疾病药物中的应用，其特征在于，所述piRNA-5938反义核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种预防和/或治疗缺血性心脏疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物包含具有如SEQ ID No.1所示序列的piRNA反义核酸的核酸、生物活性功能片段或变体；

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。

5.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物的给药方式选自口服或注射；所述注射方式包括静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或心肌注射。

6.piRNA-5938在制备用于诊断和/或预后评估缺血性心脏疾病试剂盒中的应用，其特征在于，所述piRNA-5938的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

7.一种用于诊断和/或预后评估缺血性心脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的piRNA-5938；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于特异性检测piRNA的探针或引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ IDNo.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID No.4所示。

9.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于，所述缺血性心脏疾病包括绞痛心肌梗死，急性心肌梗死，室性心律失常和冠状动脉粥样硬化中的一种或几种。