CN104548136A - 一种piRNA药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种piRNA药物组合物及其用途，piRNA序列为：5’-UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’；该药物组合物包括感染滴度为1016PFU过表达piRNA载体、病毒或辅料；所述载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体；病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。该药物组合物用于预防和治疗心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰，其配方合理，药理可靠，制作工艺简单，治疗效果明显，应用范围广，使用环境友好。
Description
技术领域：
本发明涉及一种内源性非编码小RNAs的新药及其用途，特别是一种piRNA治疗心脏疾病的药物组合物及其用途，属于生物制药技术领域。
背景技术：
心血管疾病主要包括高血压、冠心病和充血性心力衰竭等，心血管疾病是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因，预防和治疗心血管疾病仍然是医学与生物学的重大任务。心肌肥大是指组织水平上心肌组织的增厚和细胞水平上心肌细胞体积的增大的总称，是由于心肌细胞体积增大而导致心脏体积增大所发生的一种疾病。该病是由一些生理和病理因素的共同刺激而发生的，是许多心血管疾病的综合性表现；心肌肥大是心肌病的一种，是心肌细胞针对于血液动力学增加的一种应答反应，多种情况可引起人体内血液动力的增加，如高血压，心脏瓣膜疾病。长期的超负荷血液动力刺激会引起以心肌细胞体积增大为特征的心肌细胞重塑过程，就是心肌肥大。现在一般认为存在两种情况的心肌肥大，一种是正常的生理性肥大，比如出生后伴随着发育发生的心肌肥大，还有体育锻炼引起的心肌肥大；另外一种是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室间隔增厚，心肌收缩功能增强，因此被视为代偿性肥大,如果病情一直未得到缓解，心肌肥大后期会发生心室壁间质纤维化、心肌细胞收缩功能失调以及能量代谢，基因表达和电生理特征的异常，最终导致心脏功能衰竭。鉴于心肌肥大的发生是一个进行性不可逆过程，而且最终会引起心力衰竭，现代医学已经把它作为心脏发生临床病变的一个里程碑式的心肌形态变化，认为它是导致心脏疾病和心脏猝死的一个危险因素。
2006年，Aravin等人通过吸附柱方法分离出雄性小鼠睾丸中的小RNA，长度范围在24到30个核苷酸长度的位置，这些小RNA的表达特别高，由此发现了一类新的小RNA，他们根据这些小RNA与Piwi蛋白家族的成员MILI相互作用，从而被命名为Piwi相互作用RNAs(Piwi-interacting RNAs)，即piRNAs。除了特征性的长度外，这些小RNA还有许多其他特点，比如它的作用不依赖Dicer而是和Piwi蛋白结合而发挥调控作用，此外它还有自我正反馈的特点。关于Piwi蛋白在许多研究中包括斑马鱼、埃及伊蚊等不同类型的动物中发现大量的同源蛋白，并行使类似的功能。起初的研究表明这些piRNA序列主要源于转座子和重复序列元件，后来发现除rasiRNA以外，复杂的DNA序列也可以转录出piRNA。功能上研究一直是piRNA研究中最重要的一环，由于生殖细胞RNA表达库的特异性，在小鼠、斑马鱼和果蝇中关于piRNA对于发育的影响走在了相关研究的最前列，在临床上，也开始有人试图探索piRNA和生育疾病的关系，这是piRNA功能应用前景最重要的一面。此外，参与piRNA功能的蛋白也被发现在体细胞中有调控基因表达的功能，甚至有研究表明它可能参与学习和记忆等高等生物的功能调节，最近研究毫无异议地证明piRNA对生殖支持细胞确实有影响。由于小RNA的表达可能有很强的组织和时间特异性，而piRNA和进化密切相关，所以从功能学方面进行研究，对于探索piRNA在人体生殖疾病病因与机制研究中把握组织特异性，尤其是时间表达特异性方面有很大的意义。在果蝇的卵巢，piRNA的基因定位位于端粒偏中心位置和端粒位点，这些位点和转座子高度相关。piRNA和Piwi蛋白以及Aubergine蛋白高度相关，此外，Agonaute3参与piRNA的循环，剪切点位于第10个核苷酸。“Ping-Pong”模型是现在接受的piRNA模型。小鼠的卵巢piRNA的研究基本确定了在哺乳动物中也有类似的piRNA模型。最近的研究在不同程度上揭示piRNA结合蛋白的辅助蛋白也有调节作用。
对于心脏的piRNA的研究具有非常广泛的实践意义与应用价值。首先，对piRNA的功能研究有利于发现新的调控心肌梗死的机制，加深人们对现有信号途径的了解。其次，对心脏特异性piRNA的研究有利于发现新的药物作用靶点和药物。现在，很多研究者都利用人工合成的piRNA抑制剂对piRNA进行功能研究。这种经过诸如甲基化、胆固醇修饰的抑制剂在体内代谢时间长，特异地作用于靶标piRNA，能够有效地抑制piRNA的表达，因而具有成为治疗性药物的可能性。这种抑制剂结构简单，在体内不会产生免疫反应，具有很高的药用开发价值。鉴于非编码RNA在心脏发育以及心肌梗死过程中扮演着重要的调节角色，而现在很多非编码RNA，例如我们着重研究的piRNA在心脏中的表达调控以及功能尚且不为人们所知，我们通过对这类在心脏中表达的piRNA进行表达调控以及功能的研究，从而加深人们对心肌肥大等相关心脏疾病的了解，提供新的药物作用靶点。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种piRNA药物组合物及其用途，确定或发现调控心肌细胞肥大的在心脏中表达的piRNA，进一步确定其在心脏疾病中的作用，并将其应用于心脏疾病的防治药物中。
为了实现上述发明目的，本发明设计的piRNA序列如下列SEQ ID NO:1所示：5’-UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’；采用常规工艺配成药物组合物，包括感染滴度为1016PFU过表达piRNA载体、病毒或辅料；所述载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体；病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种；
药物剂型为口服制剂、注射制剂、片剂、干粉剂型中的一种或多种，优选的为注射用小水针剂或注射用冻干粉针。
本发明的piRNA药物组合物，通过口服或注射用于预防和治疗心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰。
本发明涉及的药物组合物在肥大的心肌细胞和心脏肥厚中表达显著下调，通过合成piRNA的反义核苷酸来降低piRNA的表达，发现piRNA的抑制在细胞水平能诱导心肌细胞肥大的发生，肥大基因的表达与对照组相比有明显的升高；对其进行肥大指标的检测发现，心肌肥大的指标如细胞表面积，蛋白/DNA的比值及肌小节的重组也与对照组相比都有明显的升高，能够诱导心肌肥大的发生，作为早期诊断和早期预防心肌肥大、心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物；对心肌肥厚和心肌纤维化具有保护作用，在细胞水平通过转染piRNA发现，能够抑制肥大刺激因子所诱导的心肌细胞肥大，包括肥大指标如细胞表面积，蛋白/DNA的比值及肌小节的重组也与对刺激组相比都有明显的降低；在动物水平通过注射外源piRNA也能够抑制肥大模型的肥大效应包括心脏表型、心脏体重比、边缘区的心肌细胞横截面积(WGA染色)和心肌纤维化(Masson染色)都有明显的降低，同时心功能也有明显的改善。
本发明与现有技术相比，其药物组合物配方合理，药理可靠，制作工艺简单，治疗效果明显，应用范围广，使用环境友好。
附图说明：
图1为经心脏肥大刺激因子PE(苯肾上腺素)诱导的心肌细胞肥大过程中piRNA表达水平的变化；
图2为经piRNA反义核苷酸抑制剂转染的原代细胞进行心肌细胞肥大效应的检测结果示意图；
图3为经piRNA转染的原代细胞进行PE处理，在细胞水平上对PE所诱导的肥大的抑制情况；
图4为小鼠静脉注射piRNA能抑制PE所诱导的肥大模型的检测结果示意图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作出进一步阐述。
实施例1、
piRNA过表达腺病毒载体及阴性对照腺病毒构建，本实施例采用人工合成piRNA序列,亚克隆连入Ambion公司的pSi lencer Adeno 1.0-CMV系统，构建piRNA过表达腺病毒。其piRNA序列如下列SEQ ID NO:1所示：5’-UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’；
按照公司说明书步骤，将PacⅠ线性化的该载体与线性化的腺病毒骨架(AdenovirTsLacZ Backbone)共转染HEK-293细胞，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度；将空载体和腺病毒骨架按照上述步骤共转染HEK-293细胞，包装阴性对照腺病毒。
将上述所得的过表达piRNA的重组体腺病毒磷酸盐缓冲液稀释为感染滴度1x1016PFU/ml，按1ml量无菌分装到安瓿瓶内，即得。
实施例2、
在PE刺激下piRNA表达水平的变化，本实施例对于心肌细胞肥大模型，采用已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞(大鼠乳鼠购自北京医科大学，大鼠品系为Wistar，大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献：W.-Q.Tan,etal,Foxo3a InhibitsCardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem.2008October 31；283(44):29730-29739)，对心肌细胞用PE进行处理，在培养的不同时间，提取细胞的总RNA，实时荧光定量PCR技术检测piRNA的表达水平。如图1所示，大鼠乳鼠原代心肌细胞经PE处理后piRNA随时间的表达水平，纵坐标表示以未处理的大鼠原代心肌细胞中piRNA的表达水平为基准，在PE处理过程中大鼠原代心肌细胞中piRNA的表达水平。piRNA表达水平在PE处理6小时之内有显著的下降。
实施例3、
piRNA反义核苷酸能够在细胞水平上诱导的肥大，本实施例对原代心肌细胞转染piRNA反义核苷酸(anta-piRNA)后，能有效的抑制piRNA的表达，同时细胞用anta-piRNA对心肌细胞进行处理，及同时用piRNA反义核苷酸的阴性对照(anta-NC)处理，经过24小时之后，对心肌细胞进行心肌肥大指标的检测，如心肌细胞表面积(图2A)、蛋白/DNA(图2B)检测，实验结果证明piRNA反义核苷酸能够有效的诱导心肌细胞肥大。
实施例4、
piRNA能够在细胞水平上抑制PE所诱导的心肌细胞肥大，本实施例对原代心肌细胞感染piRNA腺病毒后，用PE对心肌细胞进行处理，经过处理24小时之后，对心肌细胞进行心肌肥大指标的检测，如心肌细胞表面积(图3A)、蛋白/DNA(图3B)检测，如图3所示，实验结果证明piRNA能够有效的抑制PE所诱导的心肌细胞的肥大。
实施例5、
小鼠静脉注射piRNA腺病毒能抑制PE所诱导的肥大模型，本实施例对小鼠用PE埋泵处理二周后，小鼠的心脏有明显的肥大表型，而同时加入piRNA可以明显减弱PE所诱导的肥大效应包括心肌细胞的横截面积大小(WGA染色)(如图4A)及心脏体重比(如图4B)；同时向小鼠注射piRNA的阴性对照和PE，并不能减弱PE的肥大效应，实验结果证实piRNA能够在整体水平抑制PE所诱导的心脏肥大的发生。5 -->
序列表
SEQ ID NO:1
5’- UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA -3’
Claims (3)
1.一种piRNA药物组合物，其特征在于piRNA序列为：5’-UGGUAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAA-3’；该药物组合物包括感染滴度为1016PFU过表达piRNA载体、病毒或辅料；所述载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体；病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种piRNA药物组合物，其特征在于药物剂型为口服制剂、注射制剂、片剂、干粉剂型中的一种或多种。
3.一种piRNA药物组合物的用途，其特征在于通过口服或注射用于预防和治疗心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰。
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