CN106916885A - 用于检测心脏病的piRNA组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测心脏病的piRNA组合及其应用，所述piRNA组合包含如1‑16所示的16种RNA序列的一种或多种；及piRNA组合在制备用于预测、诊断、鉴别和/或治疗心脏病的药物或试剂盒中的应用。本发明为找到在心肌缺血损伤和心肌梗死中起到关键调节作用的piRNA，研究他们的调控机理提供了一套完整的方法。本发明的研究方法有助于阐明心肌梗死发病机制及为心肌梗死的预防和诊断提供了新的思路，特别是开发piRNA作为治疗心脏疾病的药物具有重要的意义。

Description

用于检测心脏病的piRNA组合及其应用
技术领域
本发明涉及用于检测心脏病的RNA，尤其涉及一种用于检测心脏病的piRNA组合及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
心肌梗塞，是一种严重的缺血性心脏疾病，是人类健康的重大威胁。在我国居民主要疾病死亡构成比中，心血管疾病占居首位，估计我国现有心血管病患人数至少2.3亿。随着人口老龄化的增长，我国心血管疾病的发生数将大幅上升，估计在2030年，我国的心血管病患者将增加2130万，心血管病患死亡人数将增加770万。
缺血性心肌损伤是由于冠脉循环改变引起冠脉血流和心脏需求之间不平衡而导致心肌损害，而部分心肌的血液循环突然全部中断而引发心肌细胞损伤，造成心肌梗塞。
目前心梗发生后唯一治疗的方式是采取溶栓治疗，恢复血液供应，这种现象即为缺血-再灌注(ischemia reperfusion，IR)。缺血一定时间的心肌再重新恢复血液供应后，心肌不一定都会恢复其正常功能和结构，反而出现心肌细胞损伤加重的表现，即缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)，这一损伤是心脏外科、冠脉搭桥术等手术期间心肌损伤的主要因素，其损伤表现为心肌细胞的坏死、凋亡、线粒体功能障碍自由基大量生成，并导致恶性心率失常发生，左心室收缩力减弱、导致心力衰竭。
piRNA(piwi-interacting RNA)是近年来新发现的一类非编码小RNA分子，总数超过4万种，长度约26～3lnt，序列5’端具有尿嘧啶偏向性(约86％)，piRNA成簇形成基因座(loci)分布于基因组上，特异性地同Argonuat蛋白家族中的Piwi亚家族蛋白结合，并因此而得名。2006年首次在小鼠精子细胞分离得到，最初发现piRNA主要在生殖 细胞系中表达，对维持生殖DNA完整、抑制转座子转录、抑制翻译、参与异染色质的形成、执行表观遗传调控和生殖细胞发生等均有重要作用。随着研究的深入，人们发现piRNA可以在很多体细胞组织中广泛或者特异性表达，包括心脏、脑、肝脏、脾脏、肾脏、肺、胃、小肠、结肠、卵巢、子宫、睾丸。
至今在果蝇、小鼠、斑马鱼、线虫、涡虫、人体内都发现了piRNA，但在果蝇和小鼠中研究的比较多。已有研究表明果蝇中piRNA通路相关基因的突变会破坏干细胞维持、卵巢形成和胚胎轴发育，piRNA结合蛋白piwi的突变也会导致严重的卵巢缺陷，包括生殖干细胞的丢失。另外，无性研究显示干细胞的维持和分裂需要体细胞表达piwi蛋白来形成干细胞壁龛，如果缺少了piwi蛋白，将会降低干细胞分裂的速率。例如，zucchini基因和squash基因的突变会使生殖干细胞缺失。piRNA还对维持生殖细胞DNA完整性有重要作用，果蝇中aubergine,spindle E,armitage,maelstrom,krimper,zucchini和squash基因的异常会破坏一些部位RNA的定位。通过对减数分裂DNA修复基因的研究，一定程度上阐明了piRNA和DNA损伤之间的信号传送机制。
小鼠中编码三种piwi同源蛋白：Miwi、Miwi2、Mili(也称为Piwil1、Piwil4、Piwil2)。这三种蛋白在睾丸中高水平表达，三种蛋白基因的各自突变均会导致雄性生殖细胞系的凋亡损伤，而体细胞不受任何影响。另外，piRNA在转座子沉默方面也有重要作用。已有研究表明DNA甲基酶家族(DNMT3a、DNMT3b及DNMT3L)在转座子甲基化的形成中起主要作用，其中DNMT3a和DNMT3b的催化活性在生殖细胞及体细胞内均非常重要，DNMT3L则是生殖细胞内甲基化形成的一个核心调控子。实验发现鼠的MILI和MIWI2蛋白对于其睾丸中LINE-1和IAP转座子成分的沉默是必需的，MILI或MIWI2的缺失可以使转座子甲基化标识丢失，而且突变鼠的表型与DNMT3L缺失鼠的表型一致；在甲基化形成的关键时期，MIWI2始终定位于细胞核内了；小RNA序列分析显示MILI和MIWI2均作用于DNMT3L 的上游，随后作用于DNMT3a和DNMT3b的上游。上述实验结果证实Piwi/piRNA复合体能介导转座子甲基化的形成，且Piwi途径位于DNA甲基化调节因子的上游，piRNA是生殖细胞内DNA甲基化的特异性决定子。
最初发现piRNA仅仅在睾丸组织中表达并发挥作用，随着研究的深入，有研究者在卵巢体细胞中也发现了piRNA。最近，有研究者通过RT-PCR的方法在小鼠全身多种组织中检测到了大约60种piRNA的表达，这些组织包括心脏、脑、肝脏、脾脏、肾脏、肺、胃、小肠、结肠、卵巢、子宫、睾丸。
心肌梗塞有多种调控方式，其中小RNA调控基因的翻译是一个重要的调控方式，很多蛋白都不知道是否受到了这种调控，对于小RNA来说，其调控方式的特点决定了它的靶基因不会只有一个，而是一对多的方式，这就使得小RNA的功能研究非常丰富。在小RNA的表达调控层面，microRNA的研究虽然已经取得了一定的成果，但仍然还有很多问题尚未解决，其机制还有待进一步阐明，而piRNA则存在很多潜在的功能需要我们探索。
对于心脏小RNA的研究具有非常广泛的实践意义与应用价值。首先，对小RNA的功能研究有利于发现新的调控心肌梗塞的机制，加深人们对现有信号途径的了解。其次，对心脏特异性小RNA的研究有利于发现新的药物作用靶点和药物。现在，很多研究者都利用人工合成的小RNA抑制剂对小RNA进行功能研究。这种经过诸如甲基化、胆固醇修饰的抑制剂在体内代谢时间长，特异地作用于靶标小RNA，能够有效地抑制小RNA的表达，因而具有成为治疗性药物的可能性。这种抑制剂结构简单，在体内不会产生免疫反应，具有很高的药用开发价值。
鉴于小RNA在心脏发育以及心肌梗塞过程中扮演着重要的调节角色，而现在很多小RNA例如我们着重研究的piRNA在心脏中的表达调控以及功能尚且不为人们所知，我们想对这类在心脏中表达的小RNA进行表达调控以及功能的研究，从而加深人们对心肌梗塞分子机制的了解，提供新的药物作用靶点。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供用于检测心脏病的piRNA组合及其应用，piRNA在心肌缺血中的作用及其表达信息应用，发现和确认piRNA在心脏中的表达、调控，进一步确认piRNA具有预测、诊断、鉴别和/或治疗心脏病的作用，为心脏病的治疗提供了新的药物作用靶点。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种小RNA在心肌缺血中的作用及其表达信息应用，
除非特别指明，本文中的“piR”均指“piRNA”。
除非特别指明，本文中的“miR”均指“miRNA”。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明主要进行了以下几方面的工作：
(1)心脏缺血和梗死的情况下研究心脏中piRNA表达量的变化；
(2)高通量测序的方法快捷地筛选正常心肌组织与缺血再灌注诱导的心肌梗塞组织差异表达的piRNA；
(3)将筛选到的差异表达的piRNA应用于检测心脏病的诊断试剂盒。
本发明详述如下：
一种用于检测心脏病的piRNA组合，所述piRNA组合包含如
1 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGC
2 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCC
3 GGTCGATGATGAGAGCTTTGTTCTGAGC
4 TATCTGTGAGGATAAGTAACTCTGAGG
5 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTC
6 TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCG
7 TGGAAAGGATGAACGAACTTGGCCTGACC
8 TTACTTGATGATAGTAAAAGATCTGATG
9 GTTTCCGTAGTGTAGTGGTTATCACGTTCGC
10 CCGGGTGATGCGAATCGTAATCTGAGC
11 TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGC
12 GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCG
13 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCT
14 GGTCGATGATGAGAGCTTTGTTCTGAGC
15 TCCCACATGGTCTAGCGGTTAGGATTCC
16 TCCCATATGGTCTAGCGGTTAGGATTCC
1-16所示的16种RNA序列的一种或多种。
进一步的，一种用于检测心脏病的piRNA组合，所述piRNA组合包含如
1 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGC
2 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCC
3 GGTCGATGATGAGAGCTTTGTTCTGAGC
4 TATCTGTGAGGATAAGTAACTCTGAGG
5 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTC
6 TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCG
7 TGGAAAGGATGAACGAACTTGGCCTGACC
8 TTACTTGATGATAGTAAAAGATCTGATG
9 GTTTCCGTAGTGTAGTGGTTATCACGTTCGC
10 CCGGGTGATGCGAATCGTAATCTGAGC
11 TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGC
12 GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCG
13 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCT
14 GGTCGATGATGAGAGCTTTGTTCTGAGC
15 TCCCACATGGTCTAGCGGTTAGGATTCC
16 TCCCATATGGTCTAGCGGTTAGGATTCC
1-16所示的16种RNA序列的两种或两种以上。
进一步的，上述一种用于检测心脏病的piRNA组合，所述piRNA组合包含如
7 TGGAAAGGATGAACGAACTTGGCCTGACC
12 GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCG
15 TCCCACATGGTCTAGCGGTTAGGATTCC
16 TCCCATATGGTCTAGCGGTTAGGATTCC
所示的4种RNA序列的两种或两种以上。
4、根据权利要求1所述的一种用于检测心脏病的piRNA组合，其特征在于，所述心脏病为心肌梗塞。
上述用于检测心脏病的piRNA组合在心脏病检测方面的应用。
上述用于检测心脏病的piRNA组合在心脏病检测药物制备方面的应用。
上述用于检测心脏病的piRNA组合在制备用于预测、诊断、鉴别和/或治疗心脏病的药物或试剂盒和/或制备用于区分正常心脏组织和心脏病组织的试剂盒方面的应用。
进一步的，用于检测所述的piRNA组合的荧光定量探针组合，所述探针组合包含如
17-32所示的16种荧光定量探针序列的一种或多种。
一种用于检测心脏病和/或用于区分正常心脏组织和心脏病组织的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求8所述的探针组合。
进一步的，所述探针组合及其试剂盒在制备用于预测、诊断、鉴别和/或治疗心脏病的药物或试剂盒和/或制备用于区分正常心脏组织和心脏病组织的试剂盒中的应用。相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本实验室通过建立小鼠心脏缺血-再灌注模型来研究心肌梗塞这一疾病。心肌梗塞涉及复杂的分子机制，最近的研究显示，梗死的心肌组织与正常心肌组织相比较，小RNA的表达谱具有差异，这表明小RNA在心肌梗塞过程中扮演重要角色。
本发明为找到在心肌缺血损伤和心肌梗塞中起到关键调节作用的piRNA，研究他们的调控机理提供了一套完整的方法。本发明的研究方法有助于阐明心肌梗塞发病机制及为心肌梗塞的预防和诊断提供了新的思路，特别是开发piRNA作为治疗心脏疾病的药物具有重要的意义。
附图说明
图1为正常心脏组织和梗死组织的总体piRNA表达差异；
图2为14种piRNA在心肌细胞中的荧光定量PCR表达检测；
图3为piRNA在各组织中的荧光定量PCR表达检测，其中，图3a为小鼠不同组织中SEQ ID NO4的piRNA(既piRNA-4)的相对表达水平，图3b为小鼠不同组织中SEQ ID NO7的piRNA(既piRNA-7)的相对表达水平，图3c为小鼠不同组织中SEQ ID NO12的piRNA(既piRNA-12)的相对表达水平；
图4为piRNA在不同细胞中的荧光定量PCR表达检测，图中，ES表示小鼠胚胎干细胞，CF表示小鼠心肌成纤维细胞，MC表示小鼠乳鼠原代心肌细胞，AD表示小鼠成鼠心肌 细胞；
图5为piRNA在心脏中分布的荧光定量PCR表达检测，其中，检测piRNA-4、piRNA-7和piRNA-12在小鼠心肌梗死(缺血再灌注，I/R)情况下心脏，正常心脏，正常心脏左心室，正常心脏右心室中的表达；
图6为SEQ ID NO：7、12、15、16所示的4种piRNA在正常心脏和梗死心脏中的表达，图6a为piRNA-荧光定量PCR法检测这4种piRNA在正常心脏和梗死心脏中的表达；图6b为piRNA-荧光定量PCR检测方法与深度测序的比较。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
如图1所示，
除非特别指明，以下实施例中所用的C57小鼠和SD大鼠购自北京维通利华和北京斯贝福公司。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1通过高通量测序的方法快捷地筛选缺血再灌模型下差异表达的心脏 piRNA
取8周以上C57成熟雄小鼠，按照本实验室的方法制作心肌梗死模型，即小鼠开胸后结扎其左心室的左前降支使之左心室缺血45分钟，然后松开结扎，再灌注3小时，观察并确定其心肌的梗死情况。取梗死组织和正常对照心脏组织迅速置于液氮中并将此样品送到深圳华大基因公司进行进一步的RNA提取，检测和测序。使用的测序方法为高通量Solexa深度测序，该测序方法可以在短时间内获得大量的小RNA信息。Solexa深度测序所得的小RNA(sRNA)几乎涵盖所有RNA，包括miRNA、siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、repeatassociate sRNA、外显子或内含子降解片段等。通过与已知piRNA数据库进行比对获得梗死组织和正常对照心脏组织的信息，其中正常心脏组织中piRNA总体的表达情况统计见表1，心脏梗死组织中piRNA总体表达情况统计见表2。
表1正常心脏组织中piRNA总体表达情况统计
小RNA s的种类 百分比(％) 小RNAs的总量 百分比(％)
piRNA 1292 0.26％ 322695 1.75％
其他 500924 99.74％ 18088928 98.25％
所有sRNA 502216 100％ 18411623 100％
表2心脏梗死组织中piRNA总体表达情况统计
小RNA s的种类 百分比(％) 小RNAs的总量 百分比(％)
piRNA 1243 0.30％ 920943 5.42％
其他 417322 99.70％ 16076687 94.58％
所有sRNA 418565 100％ 16997630 100％
上述结果表明，心脏梗死组织中piRNA的表达要远远高于正常心脏组织中piRNA的表达，因此，一种或几种piRNA组合可以作为检测心肌梗死风险的小分子标记。如图1所示，piRNA的长度为26-31nt，在此长度范围内的的小RNA在心肌梗死组织中显著上调；图1中也包含的18-25nt小RNA，这部分小RNA与长链piRNA具有相似的序列，在深度测序中一同被测定出来，由于长度的不同，认为它是piRNA的片段或其他形式小RNA。表1和表2为正常心脏组织和心肌梗死组织的piRNA表达统计，正常心脏组织中piRNA的种类为1292种、表达总量为322695，平均表达量为250/种，占心脏组织中所有小RNA表达量的1.75％； 而心肌梗死组织中piRNA的种类为1243种、表达总量为920943，平均表达量为740/种，占梗死心脏组织中所有小RNA表达量的5.42％；表1和表2的数据对比表明，在心肌梗死条件下piRNA的表达种类变化不大，然而单种piRNA的表达显著上调，上调的平均值为740/250，约为3：1，因此，我们选择表达量大于740或者上调比例大于3的16种piRNA。具体信息见表3
表3正常心脏组织和梗死组织的显著性差异表达的piRNA种类
如表3所示，在心肌梗死的情况下不仅整体的piRNA表达上调，见表1和表2，而且单种或多种piRNA也表达上调，特别地，有些piRNA表达上调非常显著，与正常心肌组织比较差异明显，这些在心肌梗死情况下差异表达的piRNA并未见报道，因此我们发现了一种潜在的心肌梗死生物标志物，这些表达上调的piRNA组合中的一种或多种可以用于心脏病的诊断和/或预后。
为了进一步验证上述结论，我们对这些piRNA进行了荧光定量PCR检测。
实施例2使用荧光定量PCR方法检测piRNA在原代心肌细胞中的表达情况
原代心肌细胞的制备具体步骤如下：剥离2天大的C57小鼠的心脏，切碎放入磷酸盐缓冲液(1L蒸馏水中含有NaCl 8g，KCl 0.2g，无水Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g) 中，然后在37℃下，HEPES-缓冲盐溶液(20mM/L HEPES-NaOH，pH7.6，130mM/L NaCl，3mM/LKCl，1mM/LNaH2PO4，4mM/L葡萄糖和重量体积比为0.15％的胰蛋白酶)中消化，离心后细胞重悬于含有5体积％热灭活马血清，100mM/L抗坏血酸、1mg/mL转铁蛋白、10ng/mL硒，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的DMEM/F12细胞培养基中。分离的心肌细胞先在37℃培养1小时，再根据实验需要，稀释成1×106细胞/毫升铺在培养皿中，培养液中加入0.1mM/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷抑制非心肌细胞生长，36小时后可以进行实验。
具体的检测步骤如下：将培养好的原代心肌细胞(10cm培养皿)每培养皿加入1mltrizol，按RNA提取操作规程分别提取RNA，使用Toyobo公司的反转录酶(Ace)将1μg RNA反转录获得cDNA。在反转录过程中要求使用表5的特异性的反转引物(RT-PH)具体反转录过程为，20μl反转录体系中加入5×RT缓冲液4μl，浓度为2.5mmol的dNTP 8μl，RNA酶抑制剂(40U/μl)0.5μl，RT-PH引物1μl，反转录酶1μl，1μgRNA与DEPC处理H2O共5.5μl，而后用表5中的PCR引物PH-F和loop-R进行实时定量PCR检测目的小RNA的表达水平，实时定量PCR使用Takara的SYBR荧光染料及其相关试剂，上述相关引物的设计和实时定量PCR参照Stem-loopqRT-PCR方法，具体为25μl的Realtime体系，加入SYBR mix12.5μl，PH-F引物0.5μl，loop-R引物0.5μl，荧光染料(RoxDye)0.5μl，前文表述的反转录模板2μl，ddH2O9μl，将混合好的试剂避光置于冰上，快速放入RealTimePCR仪中，95℃30秒，(95℃5秒，58℃30秒，72℃30秒，此为一个循环)，共计40个循环，55℃延伸5秒，4℃保存，结果如图2所示，具体地，每种piRNA荧光PCR定量使用的探针组合如表5所示。
图2检测了14种在心脏中高表达的piRNA，并以心脏中高表达的microRNA-23a和microRNA-499做对照，结果表明这14种piRNA确实是心脏中高表达的piRNA，piRNA-荧光定量的结果与深度测序的结果互为认证，较为一致。这也为我们进一步的使用piRNA-荧光定量的方法进行心脏病风险检测提供了方法基础。
图2表明，使用荧光定量PCR技术验证piRNA表达的可信性，也证明除生殖细胞和组织外，piRNA在心脏中稳定存在，且大量表达。
表4正常心脏组织和梗死组织的piRNA荧光定量PCR小鼠的引物
实施例3利用荧光定量PCR的方法检测piRNA在正常心脏和心肌梗死心脏中的表达 情况
分别提取正常心脏组织与心肌梗死心脏组织的总RNA，将1μg提取得到的RNA在RNA逆转录酶RTAce(Toyobo)的参与下使用相应的逆转录引物(表5，RT-PH)反转录，在42℃恒温水浴中逆转录1小时，99℃变性5分钟，具体的反转录过程见实施例2。反转录产物用表5中的PH-F和loop-R进行荧光定量PCR检测，具体过程见实施例2。这里我们优选了4种piRNA，SEQID NO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO16，即分别为piR-7、piR-12、piR-15和piR-16，对应的荧光PCR探针分别为SEQ ID NO17-20，每个样品重复3次。多次重复此实验后，将得到荧光定量PCR数据进行统计分析，从而检验目的piRNA在正常的心肌组织与梗死心肌组织中的表达差异情况。
根据piRNA深度测序结果，获得了16种piRNA(如表3所示)，这些piRNAs可能在正常心脏组织和心肌梗死组织具有重要的标志作用，我们优选了4种piRNA(SEQ ID NO7、SEQ IDNO12、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16，NO)，使用表5中的piRNA-荧光定量探针对它们进行检测以确认它们在正常和梗死心脏中是否有显著性的差异表达，以明确它们是否可以作为心肌梗死标志物，结果如图6a/b所示，piR-7(SEQ ID NO 7)、piR-12(SEQ ID NO 12)、piR-15(SEQ ID NO 15)和piR-16(SEQ ID NO 16)在心肌梗死条件下的表达量显著高于正常心脏(图6a)。I/R表达量/正常心脏表达量比例分别如下：piR-7为3.71、piR12为15.98、piR15为41.53，piR16为49.34，它们在心梗条件下的差异表达趋势(IR-piR-RT/Wt-piR-RT)与深度测序结果(IR-piR-seq/Wt-piR-seq)较为一致(图6b)。这些结果表明piR-7(SEQ ID NO 7)、piR-12(SEQ ID NO 12)、piR-15(SEQ ID NO 15)和piR-16(SEQ ID NO 16)具有心肌 梗死诊断标准物的特性，piRNA-荧光定量方法及其引物在心肌梗死的诊断检测中是可行的，具有简单、快捷，成本低廉的特点，适合于心肌梗死诊断的应用。
表5piRNA荧光定量探针组合
实施例4利用荧光定量PCR的方法检测目的piRNA在各组织中的表达情况
检测方法同实施例2。首先提取小鼠各组织的总RNA，使用实施例2中的反转录和piRNA-荧光定量方法，具体使用列表5中的荧光定量探针组合检测。我们选择深度测序 结果中正常心脏组织高表达的3种piRNA(测序表达量大于1000)，以检测它们具有组织广泛性或组织特异性。如图3所示，图3a为piR-4在各组织中的表达，图3b为piR-7在各组织中的表达，图3c为piR-12在各组织中的表达。荧光定量-PCR结果表明这三种piRNA在小鼠各个组织中表达量均较高，具有组织广泛性表达。
实施例5利用荧光定量PCR的方法检测目的piRNA在多种细胞中的表达情况
检测方法同实施例2。首先提取小鼠胚胎干细胞(ES)、小鼠心肌成纤维细胞(CF)、小鼠乳鼠原代心肌细胞(MC)、小鼠成鼠心肌细胞(AD)的总RNA，使用实施例2中的反转录和piRNA-荧光定量方法，具体使用列表5中的荧光定量探针组合检测。荧光定量-PCR检测piR-4、piR-7和piR-12分别在小鼠胚胎干细胞(ES)、小鼠心肌成纤维细胞(CF)、小鼠乳鼠原代心肌细胞、小鼠成鼠心肌细胞中的表达情况。研究结果如图4所示，piRNA在小鼠胚胎干细胞中低表达，在成体心肌细胞中高表达，表明细胞分化程度与3种piRNA的表达水平具有相关性，提示这3种piRNA可能涉及衰老和疾病过程。
实施例6利用荧光定量PCR的方法检测目的piRNA在心脏中的区域分布
心肌梗死发生区域为左心室，因此我们检测piRNA是否为心脏广泛分布的还是具有心脏区域特异性。检测方法同实施例2。首先提取正常心脏、梗死心脏、正常心脏左心室和正常心脏右心室的总RNA，使用实施例2中的反转录和piRNA-荧光定量方法，具体使用piRNA-荧光定量探针组合表5中的序列检测。piRNA荧光定量检测piRNA-4、piRNA-7和piRNA-12在正常心脏、梗死心脏、正常心脏左心室和正常心脏右心室中的表达。研究结果如图5所示，三种piRNA在正常心脏、左心室和右心室中的表达没有显著性差别，因此这三种piRNA在心脏中的区域分布是平均分布，在整个心脏中是具有代 表性的，而不仅仅是左心室。
综上所述，我们发现了在心脏中具有高表达的piRNA(表1，图2)，并且在心肌梗死的情况下piRNA不仅在总量上显著上调(表2)，而且多数种类的piRNA表达量也显著上调(表3)，根据深度测序的结果我们推测piRNA作为一种潜在的心肌梗死风险的分子标记，可以用于心梗风险监测，但由于深度测序的高成本因素，我们发明了一种或多种piRNA荧光定量探针组合(表5)，运用该组合并采用荧光定量PCR的方法检测piRNA在心肌细胞(图2)，正常心脏和心肌梗死心脏中的表达(图5，图6a)，结果表明piRNA荧光定量探针及其方法适合piRNA的表达检测，进一步地，将荧光定量PCR的分析结果与piRNA深度测序的结果相互印证，检测结果与深度测序较为一致(图6b)。因此不仅piRNA深度测序结果具有代表性，而且piRNA荧光定量探针及其方法可以快速简单低廉的用于心梗风险检测和试剂盒的开发。
检测试剂盒应包含如下成分，用于反转录的piRNA荧光定量探针RT-PH(表5)，5×RTbuffer，dNTP，RNA酶抑制剂和DEPC处理H2O，用于荧光定量PCR的探针PH-F和loop-R，荧光染料及PCR酶，上述试剂及探针的使用如下。特异性的反转引物具体反转录过程为，20μl反转录体系中加入5*RTbuffer4μl，浓度为2.5mmol的dNTP8μl，RNA酶抑制剂(40U/μl)0.5μl，RT-PHprimer1μl，反转录酶1μl，1μg正常或心肌梗死组织的RNA与DEPC处理H2O共5.5μl，而后用表5中的荧光定量PCR探针PH-F和loop-R进行实时定量PCR检测目的piRNA的表达水平，实时定量PCR使用Takara的SYBR荧光染料及其相关试剂，上述相关引物的设计和实时定量PCR参照Stem-loopqRT-PCR方法，具体为25μl的实时定量PCR体系，加入SYBRmix12.5μl，PH-F探针0.5μl，loop-R探针0.5μl，荧光染料(RoxDye)0.5μl。前文表述的反转录模板2μl，ddH2O9μl,将混合好的试剂避光置于冰上，快速放入RealTimePCR仪中，95℃30秒，(95℃5秒，58℃30秒，72℃30秒，此为一个循环)，共计40个循环，55℃延伸5秒，4℃保存，得到结果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种用于检测心脏病的piRNA组合，其特征在于，所述piRNA组合包含如
1-16所示的16种RNA序列的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测心脏病的piRNA组合，其特征在于，所述piRNA组合包含如
1-16所示的16种RNA序列的两种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测心脏病的piRNA组合，其特征在于，所述piRNA组合包含如
所示的4种RNA序列的两种或两种以上。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测心脏病的piRNA组合，其特征在于，所述心脏病为心肌梗塞。
5.权利要求1所述用于检测心脏病的piRNA组合在心脏病检测方面的应用。
6.权利要求1所述用于检测心脏病的piRNA组合在心脏病检测药物制备方面的应用。
7.权利要求1所述用于检测心脏病的piRNA组合在制备用于预测、诊断、鉴别和/或治疗心脏病的药物或试剂盒和/或制备用于区分正常心脏组织和心脏病组织的试剂盒方面的应用。
8.一种用于检测权利要求1-4任一所述的piRNA组合的荧光定量探针组合，所述探针组合包含如
17-32所示的16种荧光定量探针序列的一种或多种。
9.一种用于检测心脏病和/或用于区分正常心脏组织和心脏病组织的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求8所述的探针组合。
10.权利要求8所述探针组合及其试剂盒在制备用于预测、诊断、鉴别和/或治疗心脏病的药物或试剂盒和/或制备用于区分正常心脏组织和心脏病组织的试剂盒中的应用。
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