CN104673902A - 与鸡胸肌重和胸肌率相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与鸡胸肌重和胸肌率相关的SNP分子标记及其应用。本发明基于鸡全基因组关联等分析发现GJA1基因中存在与胸肌重和胸肌率显著相关的SNP分子标记。本发明提供了检测该SNP分子标记的试剂盒，其含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的一对引物。本发明还提供了一种利用GJA1基因SNP位点筛选具有较高胸肌重和胸肌率的优质鸡纯系的方法：获得鸡基因组DNA；用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对检测GJA1基因SNP T1289C位点的基因型；选择优势基因型CC的个体。本发明试剂盒操作简单，灵敏度高，准确性强，检测成本低，具有重要应用价值。

Description

与鸡胸肌重和胸肌率相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与鸡胸肌重和胸肌率相关的SNP分子标记及检测该分子标记的试剂盒，以及该SNP分子标记和试剂盒的应用。

背景技术

黄羽肉鸡(也称优质肉鸡)产业是具有中国特色的传统产业，已占据我国肉鸡生产的近半壁江山。对优质肉鸡的遗传改良工作，是在保持肌肉品质的前提下，对其相对不足的产肉量等其他性能进行选择提高。如北京油鸡等地方优质肉鸡品种，以肌内脂肪含量高等肌肉品质性状优良而闻名，却一直存在胸肌不发达、胸肌率低、导致产肉量偏低和上市胴体不美观等问题。

要改良胸肌重和胸肌率这一类胴体性状，传统的方法是根据胸角宽度推断或红外测量仪器间接测量胸肌面积的方法。这两种方法都受限于测定人员判断的主观性，不同人之间判断标准差异大，要求技术人员有较丰富的经验积累，因此，测定准确性不稳定，不利于推广应用。

利用分子标记技术进行辅助选择提高是最理想的方法之一。获得与主选性状相关的分子标记，即可以实现目标性状的早期选择，并实现与性状相关等位基因的快速纯和，加快遗传选择进展。培育品系的相应等位基因位点处于纯和状态，在新品系应用于配套系创制过程中，还可较大程度上避免出现商品代性状分离的问题。

单核苷酸多态性标记(SNP)，主要是指基因组上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年逐渐成熟的一种方法。分子标记辅助选择在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以更高效地选育出性状优良的家畜家禽品种。已有多种方法可用于SNP检测，目前比较常用的有基因芯片方法、DNA测序法、质谱法、以及TaqMan荧光定量方法等。不同方法根据所依据的原理不同适用于不同的研究。芯片和质谱技术适用于大规模的多态信息检测。而测序和TaqMan技术适用于高精度、高准确性的判定SNP多态信息。

综上所述，在当前家禽饲养成本(饲料、人工、环境控制等)急剧飙升的大背景下，利用分子标记辅助选择法对复杂性状进行选择提高，即可节省新品系选育的成本，又可以提高配套制种的成功率。

发明内容

本发明的目的是提供一种与鸡胸肌重和胸肌率相关的SNP分子标记及其应用。

本发明的另一目的在于提供检测该分子标记的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供鉴定具有高鸡胸肌重和胸肌率的鸡品系的方法。

本发明利用全基因组关联分析(GWAS)等方法获得鸡GJA1基因中存在与鸡胸肌重和胸肌率显著相关的SNP分子标记，位于该基因T1289C位点。

本发明提供了上述SNP分子标记在检测鸡胸肌重和胸肌率中的应用。

进一步地，上述应用中，当GJA1基因T1289C位点表现为CC基因型时，表明个体具有较高胸肌重和胸肌率。

更进一步地，本发明提供了上述SNP分子标记在鸡育种中的应用。

本发明提供了用于检测本发明SNP分子标记的引物对，其核苷酸序列为：

上游引物：5’-ACAGTGCGGAGCAGAATAGG-3’，(SEQ IDNO.1)

下游引物：5’-ACCACCTCCACTGGAACAAG-3’(SEQ IDNO.2)。

含有本发明引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述试剂盒在鸡育种中的应用。

本发明提供一种检测鸡胸肌重和胸肌率基因型的方法，利用SEQID NO.1-2所述的引物对，采用PCR方法对待测鸡GJA1基因T1289C位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型。

上述方法中，PCR方法的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，32个循环；72℃终延伸10min。

PCR反应体系以20μl计为：模板DNA 0.5μl，10pmol/μl上游引物0.5μl，10pmol/μl下游引物0.5μl，2×Master mix 10μl，ddH₂O8.5μl。

本发明提供了上述检测鸡胸肌重和胸肌率基因型的方法在鸡育种中的用途。

本发明还提供了一种鉴定具有高胸肌重和胸肌率的鸡品系的方法，利用SEQ ID NO.1-2所述的引物对，PCR方法对待测鸡GJA1基因T1289C位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型，当基因型为CC时，说明待测鸡具有高胸肌重和胸肌率。

上述方法中，PCR方法的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，32个循环；72℃终延伸10min。

PCR反应体系以20μl计为：模板DNA 0.5μl，10pmol/μl上游引物0.5μl，10pmol/μl下游引物0.5μl，2×Master mix 10μl，ddH₂O8.5μl。

本发明提供了上述鉴定具有高胸肌重和胸肌率的鸡品系的方法在鸡育种中的应用。

本发明首次在北京油鸡中得到与鸡胸肌重和胸肌率相关的SNP分子标记，为GJA1基因1289位(Genbank收录号：NM_204586.2)的T/C突变，包括检测该突变位点的一对引物，利用这对引物检测GJA1_SNP T1289C位点的基因型，在生长早期即可选择优势基因型CC的个体，从而大大地提高新品系选育效率；本发明的检测方法操作简单，费用低廉，准确度高，为优质鸡的标记辅助选择提供了新的方法。

附图说明

图1为鸡胸肌GJA1基因表达与胸肌重变化呈显著相关线性图，其中横坐标的1-6分别指鸡4、8、10、12、14、16周龄。

图2为鸡GJA1基因SNP C1289T位点的TT基因型测序图。

图3为鸡GJA1基因SNP C1289T位点的CC基因型测序图。

图4为鸡GJA1基因SNP C1289T位点的CT基因型测序图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1与鸡胸肌重和胸肌率相关的SNP标记的确定以及检测该位点方法的建立

1、全基因组关联分析(GWAS)获得GJA1基因附近存在与胸肌重和胸肌率显著相关的SNP分子标记。

1)实验动物和目标性状测定

利用北京油鸡保种群组建随机资源群体。50只公鸡、250只母鸡，按公母比例1：5组建50个公鸡家系。雏鸡性别鉴定后只选取公鸡饲养，共得到子代公鸡个体728只。饲养过程中采用自由采食和饮水，日粮参考黄羽肉鸡饲养标准(NY/T33-2004)。

试验鸡翅静脉采血，用于基因组DNA提取。使用Illunima公司的鸡60K全基因组iSelect SNP芯片测定全基因组SNP，借助其Infinium全基因组SNP检测系统进行SNP基因型判断，完成样本全基因组60K SNP芯片的基因型测定工作。

子代公鸡于100日龄屠宰。测定记录728个个体的全净膛重、胸肌重、计算胸肌率(胸肌重/全净膛重)。利用索氏提取法(Soxhle)测定胸肌肌内脂肪含量。结果见表1。

表1 胴体表型性状的描述性统计分析

2)全基因组SNP与目标性状相关性分析

对728只鸡胸肌重和胸肌率的表型描述性统计分析结果如表1。利用GWAS方法评估各基因组SNP与胸肌重和胸肌率相关性，即利用TASSEL软件中的压缩混合线性模型(compressed MLM)进行GWAS分析，确定与目标性状相关的SNP位点。

结果得到与胸肌重和胸肌率显著相关的共12个SNP位点，其中达极显著相关(P<5.19×10^-8)的位点有7个(如表2)，这些位点主要集中分布在3号染色体59.8-68.5Mb之间的区域，这一区域内包含有4个基因(TPD52L1、FABP7、GJA和ASF1A)。进一步利用生长期不同阶段胸肌组织(4、8、10、12、14周龄)为素材，对这一区域包括的4个基因进行mRNA时空表达检测，发现仅GJA1基因表达变化与胸肌重变化趋势一致，相关系数R²＝0.951。因此判定该基因可能是影响肌肉发育的重要效应基因(如图1)，可以进一步在该基因内部筛选与目标性状相关的SNP标记。

表2 GWAS分析获得与胸肌重和胸肌率相关性达到5％基因组水平显著的SNP位点

2、PCR和测序检测获得GJA1基因内部SNP标记与胸肌重和胸肌率显著相关

设计多对引物对GJA1基因全mRNA全序列(Genbank登录号：NM_204586.2)进行测序，找到GJA1内部1289位置上存在T/C碱基突变位点，见图2-图4。

从上述728只鸡中随机挑选200的只鸡基因组DNA。利用上游引物5’ACAGTGCGGAGCAGAATAGG和下游引物5’ACCACCTCCACTGGAACAAG，进行PCR扩增，在BioThermocycler热循环仪中进行。PCR反应程序为：95℃10min,95℃30s，60℃30s，72℃50s，共32个循环；72℃10min。PCR反应体系以20μl计为：模板DNA 0.5μl，10pmol/μl上游引物0.5μl，10pmol/μl下游引物0.5μl，2×Master mix 10μl，ddH₂O 8.5μl。采用直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，进行该位点等位基因分型。

利用SAS软件对该位点基因型与相关性状(胸肌重、胸肌率、肌内脂肪含量、腿肌重)分别进行最小二乘法统计分析。优势型等位基因(CC型)在该群体中频率较高(32.1％)，有利于群体中优势个体的选留。如表3所示，具有该基因型群体胸肌重极显著高于TT型(P<0.01)，可提高17.57％；胸肌率显著高于TT型(P<0.05)，可提高8.05％。优势基因型腿肌重也显著高于TT型(P<0.05)，且对优势基因型进行胸肌重和胸肌率的选择不会改变主要肉质性状指标肌内脂肪含量(P>0.05)。

表3 GJA1_SNP T1289C不同基因型与相关性状关联分析(n＝200)

注：不同位点同列数据，肩标字母不同者，大写字母表示差异极显著(P＜0.01)；小写字母表示差异显著(P＜0.05)

实施例2利用不同群体对该标记的有效性进行验证

选取北京油鸡选育系(主选性状肌内脂肪高的鸡只，未对胸肌重和胸肌率进行选择)群体160只，公母比例1：1。依照实施例1中的方法，于90日龄屠宰测定胸肌重、全净膛重、腿肌重、胸肌肌内脂肪含量。同时采静脉血，提取基因组DNA。采用实施例1中引物和PCR反应进行扩增，直接测序法测序，对GJA1_SNP T1289C位点基因型进行分型。

利用SAS软件对该位点基因型与相关性状(胸肌重、胸肌率、肌内脂肪含量)分别进行最小二乘法统计分析。优势型等位基因(CC型)在该群体中频率较适中(28.1％)，有利于群体中优势个体的选留。如表4所示，具有该基因型群体胸肌重极显著高于TT型(P<0.01)，可提高16.06％；胸肌率显著高于TT型(P<0.05)，可提高7.52％。且各基因型间肌内脂肪含量差异不显著，即利用优势基因型进行的胸肌重和胸肌率选择不会改变主要肉质性状指标肌内脂肪含量(P>0.05)。

表4 GJA1_SNP T1289C不同基因型与相关性状关联分析(n＝160)

注：不同位点同列数据，肩标字母不同者，大写字母表示差异极显著(P＜0.01)；小写字母表示差异显著(P＜0.05)

实施例3利用本发明的SNP分子标记辅助选择提高胸肌重和胸肌率的育种方法

1、待选择群体

随机挑选待检测鸡300只，公母比例1：1。于20日龄左右翅静脉采血，加入ACD抗凝剂，-20℃保存备用。

2、DNA提取

采用常规酚仿法提取基因组DNA,溶于TE缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度,然后稀释至浓度50ng/μl。

3、PCR反应及序列测定

采用实施例1中引物和PCR反应进行扩增，直接测序法测序，对GJA1_SNP T1289C位点基因型进行分型。采用直接测序法对扩增产物进行等位基因测序。根据基因分型结果选留GJA1_SNP T1289C位点为CC基因型的健康公母鸡。

按照每个世代不低于30只公鸡，公母比例不低于1:3的数量留种，产蛋高峰期组建新的家系繁种。

上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种与鸡胸肌重和胸肌率相关的SNP分子标记，其特征在于，位于鸡GJA1基因T1289C位点。

2.权利要求1所述SNP分子标记在鉴定鸡胸肌重和胸肌率基因型中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，当GJA1基因T1289C位点表现为CC基因型时，表明个体具有较高胸肌重和胸肌率。

4.权利要求1所述SNP分子标记在鸡育种中的应用。

5.用于检测权利要求1所述SNP分子标记的引物对，其特征在于，其核苷酸序列为：

上游引物：5’-ACAGTGCGGAGCAGAATAGG-3’，

下游引物：5’-ACCACCTCCACTGGAACAAG-3’。

6.含有权利要求5所述引物对的试剂盒。

7.权利要求6所述试剂盒在鸡育种中的应用。

8.一种检测鸡胸肌重和胸肌率基因型的方法，其特征在于，利用权利要求5所述的引物对，PCR方法对待测鸡GJA1基因T1289C位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型。

9.一种鉴定具有高胸肌重和胸肌率的鸡品系的方法，其特征在于，利用权利要求5所述的引物对，PCR方法对待测鸡GJA1基因T1289C位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型，当基因型为CC时，说明待测鸡具有高胸肌重和胸肌率。

10.权利要求8或9所述方法在鸡育种中的应用。