CN102250889B - 鸡屠体性状相关的snp及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及鸡屠体性状相关的SNP及其应用。本发明提供了10个鸡SREBF2基因的单核苷酸多态性标记，以及应用所述的单核苷酸多态性标记检测鸡群体屠体性状的方法。本发明还提供用于检测所述单核苷酸多态性标记的引物及其含有所述引物的试剂盒。本发明提供的单核苷酸多态性标记可用于鸡的分子标记辅助育种，能快速准确的辅助筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

Description

鸡屠体性状相关的SNP及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及鸡屠体性状相关的SNP及其应用。

背景技术

随着生活水平的提高，人们对肉品质的要求也越来越高，而脂肪性状是优质鸡肉品质评价的重要指标。地方品种鸡以其肉质优良，味道鲜美，营养丰富而闻名，吸引着越来越多的消费者。经过多年对优质肉鸡的科学选育，优质肉鸡的生产性能有了显著提高。但是，在鸡生产性能提高的同时，随之而来的是肉品质的降低(Rance K.et al.，2002)。肉鸡皮下脂肪和腹脂沉积增多，而肌内脂肪含量减少。度量这些脂肪性状的常规方法步骤都比较繁琐，花费较高，选择难以方便有效的进行。目前，育种研究中初步应用的标记辅助选择着眼于遗传物质DNA，可以避免环境的影响，选择直接有效(Zhang X.et al.，2007)。因此，寻找与脂肪代谢显著相关的遗传标记，对高效选择肌内脂肪含量和皮脂厚度适当、腹脂率低的个体，培育肉质优良的肉鸡品种具有重要意义。

SREBFs作为脂肪代谢信号转导通路上非常重要的转录因子，其多态性的变化可能导致下游靶基因转录水平的改变从而影响脂质的合成与沉积。现在针对SREBFs基因家族多态性的研究大多集中在SREBF1基因上。陈杰等在对SREBF1基因进行PCR-SSCP分析时发现在苏太猪的SREBF1基因的374和347位点存在单核苷酸多态性，与猪肌内脂肪、皮脂率以及屠宰率均呈显著相关(陈杰等，2004)。李长龙等在对3个猪群进行多态性研究时进一步证明SREBF1基因多态性与肌内脂肪显著相关，而与背膘厚没有显著的相关(李长龙等，2006)。刘世强等用PCR-DHPLC技术发现猪SREBF1基因序列中产生的Eam1104I酶切位点，并在8个品种中进行了多态性研究，发现此位点的多态性与皮脂率和屠宰率显著相关(刘世强，陈赞谋，2008)。J.Chen等在对二花脸和苏太猪的研究中发现了一个SNP与肌内脂肪含量显著相关(Chen J.et al.，2008)。

目前，针对SREBF2基因多态性的研究还较少，大多集中在人类疾病上。Miserez等、Duan等研究发现SREBF2基因的G1784C突变引起其蛋白的G595A突变与血液中胆固醇过高的人的血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平密切相关(Duan X.et al.，2004；Miserez A.R.et al.，2002)。Yaju等对这个位点进一步研究发现，在中国广西的黑衣壮族和汉族中，基因型和等位基因的频率表现出显著的品种差异，在汉族中G等位基因比C等位基因表现出更高的血脂水平，而在黑衣壮族中没有这种差异(Yaju D.et al.，2009)。Robinet等在对SREBF2基因进行多态性研究时发现了6个SNP，其中G1784C突变与早期颈动脉粥样硬化相关，结合Muller等的研究认为此位点可以作为动脉粥样硬化遗传性研究的候选位点(Muller P.& Miserez A.，2002；Robinet P.et al.，2003)。

上述研究结果表明，SREBFs基因可作为脂肪性状的候选基因。因此，推测其家族基因的突变位点也可能对鸡的脂肪性状具有显著遗传效应，并且针对SREBF2基因多态性的研究还很少，在动物上的研究几乎没有。通过对鸡SREBF2基因CDS区进行SNPs检测，并在优质肉鸡中分析不同单倍型与屠宰和肉质性状的关系，目的在于寻找与脂肪沉积高度相关的遗传标记，为优质肉鸡的分子育种提供理论依据。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种鸡屠体性状相关的SNP及其应用。

本发明提供的鸡SREBF2基因的单核苷酸多态性标记，其为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10，其中SNP1为自SEQ ID No.1所示序列5’端起12578位为的A或T；SNP2为自SEQ ID No.1所示序列5’端起13984位为T或C；SNP3为自SEQ ID No.1所示序列5’端起11310位为A或G；SNP4为自SEQ ID No.1所示序列5’端起7213位为A或G；SNP5为自SEQ ID No.1所示序列5’端起5196位为G或A；SNP6为自SEQ ID No.1所示序列5’端起1098位为C或T；SNP7为自SEQ ID No.1所示序列5’端起8574位为A或G；SNP8为自SEQ ID No.1所示序列5’端起176位为T或C；SNP9为自SEQ ID No.1所示序列5’端起1247位为A或G；SNP10为自SEQ ID No.1所示序列5’端起7037位为C或G。

本发明还提供这一种检测鸡群体屠体性状的方法，其通过检测鸡的上述的单核苷酸多态性(SNP)，确定鸡群体的屠体性状。

通过对SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SP5、SNP7、SNP10进行标记-性状关联分析，结果显示：SNP1对全净膛重的遗传效应达到极显著水平(P＜0.01)，TT基因型个体的全净膛重极显著高于AA和AT基因型个体(P＜0.01)；SNP2对全净膛重的遗传效应达到显著水平(P＜0.05)，TT基因型个体的全净膛重显著高于CT和CC基因型个体(P＜0.05)；SNP4对活重的遗传效应达到显著水平(P＜0.05)，对屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重和腿肌重的遗传效应达到极显著水平(P＜0.01)，AA基因型个体的活重显著高于AG基因型个体(P＜0.05)，屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重极显著高于AG基因型个体(P＜0.01)，腿肌重极显著高于AG和GG基因型个体(P＜0.01)；SNP3、SNP5、SNP7和SNP10对各种屠宰性状的遗传效应都没有达到显著水平(P＞0.05)。

将SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP7和SNP10构建单倍型后进行分析发现，单倍型H21H21是活重、屠体重、半净膛重、全净膛重和腿肌重的优势单倍型，H13H21是胸肌重的优势单倍型，而H4H21是皮脂厚的劣势单倍型，提示单倍型H21(A-T-G-A-G-G-G)对于提高肉鸡的生产性能有正向作用。

本发明还提供用于鉴定所述的单核苷酸多态性标记的引物，其核苷酸为SEQ ID No.2～21所示的引物。

本发明还提供含有上述引物的试剂盒。

本发明提供的单核苷酸多态性标记可用于鸡的分子标记辅助育种，能快速准确的辅助筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。本发明的SNP及其单倍型与屠体性状紧密相连，可用于分子标记辅助育种。

附图说明

图11％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA结果。

图21％琼脂糖电泳检测SREBF2基因10对引物扩增产物结果。

图3所示为SREBF2基因10对引物扩增产物的SSCP带型图。

图4所示为SREBF2基因多态位点测序结果，图中箭头处表示发生碱基替代的位置。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

二郎山山地鸡：SD01×SD02系，SD03系，SD02系，SD01×SD03系购于四川农业大学家禽厂和四川隆生集团。饲养全阶段由专人管理，单笼饲养，管理及营养水平一致，自由采食，91日龄时随机在各群体挑选公母各15只，共120个个体进行屠宰。

四川大恒优质肉鸡：S01系、S02系、S03系、S05系、S06系、D99系购于四川大恒家禽育种公司，每个群体选公母各15只，共180个个体作为试验素材。饲养全阶段由专人管理，单笼饲养，管理及营养水平一致，自由采食，91日龄时屠宰。

实施例1 SREBF2基因多态位点的获得

鸡翅静脉采血，所采血样均为1mL/只、EDTA抗凝，血样于-20℃冷冻保存。采用常规酚-氯仿法从上述的鸡血液中提取基因组DNA，用1.0％琼脂糖电泳检测，可以看到DNA条带清晰、明亮、无杂带，完全符合后续PCR实验的要求(图1)

根据本试验获得的二郎山山地鸡SREBF2基因cDNA序列和GenBank中预测的鸡SREBF2基因mRNA序列(Gene ID：XM_4162222)，以及GenBank中SREBF2基因DNA序列(Gene ID：NC_006088.2)，进行引物设计，共17对。引物详细信息见表1。

表1 SREBF2基因SNP扫描所用引物详细信息

用上述17对引物对提取的DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系(10μL)：2×Taq PCRMasterMix 5μL(天根生化科技(北京)有限公司)、ddH₂O 3.4μL、引物(10pmol/μL)各0.4μL、模板DNA(50ng/mL)0.8μL。PCR扩增参数：94℃4min，[94℃30s，58℃(根据所设计引物而确定温度)30s，72℃1min]35个循环，72℃8min。

对扩增产物进行PCR-SSCP分析，结果有P3、P4、P5、P8、P9、P10、P11、P12、P13和P16引物的扩增产物表现出多态性，其PCR扩增结果和SSCP结果分别如图2和图3所示。P3、P4、P5、P8、P9、P10、P11、P12、P13和P16引物的扩增产物在12％的聚丙烯酰胺凝胶上分别呈现三种带型，凝胶图依次分别为a、b、c、d、e、f、g、h、i、j。

将上述呈现不同带型的扩增产物送上海英骏生物公司测序，结果找到10个单核苷酸突变位点(见图4)，分别为自SEQ ID No.1所示序列5’端起12578位的A/T碱基突变；自SEQ IDNo.1所示序列5’端起13984位的T/C碱基突变；自SEQ ID No.1所示序列5’端起11310位的A/G碱基突变；自SEQ ID No.1所示序列5’端起7213位为A/G的碱基突变；自SEQ ID No.1所示序列5’端起5196位的G/A碱基突变；自SEQ ID No.1所示序列5’端起1098位的C/T碱基突变；自SEQ ID No.1所示序列5’端起8574位的A/G碱基突变；自SEQ ID No.1所示序列5’端起176位的T或C碱基突变；自SEQ ID No.1所示序列5’端起1247位的A/G碱基突变；自SEQ ID No.1所示序列5’端起7037位的C/G碱基突变。经与dbSNP数据库比对分析，发现10个SNP均为新的SNP。

实施例2 SREBF2基因多态位点的基因型频率和等位基因频率

2.1基因型频率和基因频率

(1)基因型频率：指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。由于PCR-SSCP方法的检测结果为共显性等位基因。因此，表型频率即为基因型频率。

基因型频率＝基因型个数/检测群体总数

(2)等位基因频率：记为Pi，表示在一个群体中某一等位基因的数量与占据同一基因座位的全部等位基因总数的比例，取值0～1之间。

Pi＝[2(ii)+(ij1)+(ij2)+……(ijn)]/2N

Pi：第i个等位基因的频率

i：纯合复等位基因

j1、j2、……jn：与i共显的第1到第n个等位基因

(3)基因位点χ²独立性检验：用SAS软件包(SAS Institute Inc.，SAS version8.0)进行SREBF2基因型在各品种(系)间分布的差异显著性检验。

${\mathrm{\χ}}^2=\underset{I=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{\left(\right|E-O|-0.5)}^2}{E}(\mathrm{df}=1)$ ${\mathrm{\χ}}^2=\underset{I=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(E-O)}^2}{E}(\mathrm{df}>1)$

其中E-为理论值，O-为观察值，n-为等位基因数。

计算SREBF2基因不同位点在不同品系的基因型频率和等位基因频率，结果见表2。在SNP1，除品系S05和SD01×SD03外，其余品系均未发现TT基因型，并且AA基因型频率也明显高于AT基因型，因此在所有品系中A等位基因的频率均明显高于T等位基因，卡方检验发现所有品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP2，品系S01、S02、S03、S06和D99中未发现TT基因型，所有品系中CC基因型的频率均明显高于其它基因型，C等位基因的频率也明显高于T等位基因，卡方检验发现所有品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP3，除品系SD01×SD02外，其余品系均为AG基因型高于AA和GG基因型，除SD02和SD01×SD02外，均为A等位基因频率高于G等位基因，卡方检验发现除SD01×SD02外，其余品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP4，品系S02和SD02中未发现GG基因型，S05、S06、SD03、SD01×SD02和SD01×SD03中AG基因型频率最高，其余品系均为AA基因型频率最高，所有品系的A等位基因频率均明显高于G等位基因，卡方检验发现所有品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP5，品系S01和SD02中未发现AA基因型，除S06和SD01×SD02外，GA基因型频率均高于GG和AA基因型，除品系S02和D99外，其余品系均为G等位基因频率高于A等位基因，卡方检验发现除S01、S02和SD02外，其余品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP6，所有品系中均未发现TT基因型，S03、SD03、SD01×SD02和SD01×SD03中也未发现CT基因型，其它品系中CC基因型和C等位基因的频率明显高于CT基因型和T等位基因，卡方检验发现除S03、SD03、SD01×SD02和SD01×SD03外，其余品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP7，品系S05、S06、SD02和SD01×SD02中均未发现AA基因型，除SD02外，GG基因型频率均明显高于其它基因型，所有品种中的G等位基因频率均明显高于A等位基因，卡方检验发现所有品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP8，所有品系中均未发现TT基因型，S01和S02中也未发现TC基因型，其余品系中的CC基因型和C等位基因频率均明显高于TC基因型和T等位基因，卡方检验发现除S01、S02外，其余品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP9，所有品系除S06外均未发现AA基因型，S01、S03、D99、SD02和SD01×SD02中也未发现AG基因型，除S06外，其它品系均为GG基因型和G等位基因明显高于AG基因型和A等位基因，卡方检验发现只有S02、S05、SD03和SD01×SD03的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)；在SNP10，所有品系除S06、SD03和SD01×SD02外均未发现CC基因型，除S05、S06和SD01×SD02外，其余品系均为GG基因型频率高于GC基因型，所有品系的G等位基因频率均明显高于C等位基因，卡方检验发现除S05外，其余品系的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。

表2 SREBF2基因各位点不同群体间的基因型和基因频率

实施例3 SREBF2基因各位点多态信息含量(PIC)

PIC用于对标记基因多态性的估计，是表示DNA变异程度高低的一个指标，PIC＞0.5为高度多态；0.25＜PIC＜0.5为中度多态；PIC＜0.25为低度多态。

$\mathrm{PIC}=1-\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^2\right)-\left(\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}\underset{j=i+1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{2P}_i^2{P}_j^2\right)$

其中i，j为第i，j个等位基因；Pi和Pj分别为第i和第j个等位基因的频率；n为等位基因数。

多态信息含量是衡量等位基因多态性的理想指标，它是衡量基因突变变异程度高低的指标。PIC高、杂合度大，说明群体内基因型一致性差，遗传变异大，选择潜力大，应用于动物遗传育种研究效果就好；PIC低、杂合度小，说明群体内遗传变异小，选择潜力也小。由表3可知，10个位点中，SNP3、SNP4、SNP5、SNP7为中度多态(0.25＜PIC＜0.5)，其余位点为低度多态(PIC＜0.25)。

实施例4 SREBF2基因单突变位点对屠宰性状的遗传效应

用SAS Version 8.0软件包GLM程序计算SREBF2基因多态位点对鸡屠宰性状和肉质性状遗传效应分析，分析结果用最小二乘均数和标准误表示。固定模型如下：

Y＝μ+B+S+G+bX+e

其中，Y：个体屠宰性状的观测值；μ：屠宰及肉质性状的群体均值；B：品种或品系效应；S：性别效应；G：基因型效应；b：影响屠体重的回归系数；X：屠体重(协变量，只用于屠宰性状)。e：随机残差效应。

由于SNP6、SNP8、SNP9三个位点的优势等位基因和基因型极其显著，且PIC＜0.1，故将这三个位点剔除，仅针对SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SP5、SNP7、SNP10进行标记-性状关联分析。

最小二乘分析结果显示(见表4)：SNP1对全净膛重的遗传效应达到极显著水平(P＜0.01)，TT基因型个体的全净膛重极显著高于AA和AT基因型个体(P＜0.01)；SNP2对全净膛重的遗传效应达到显著水平(P＜0.01)，TT基因型个体的全净膛重显著高于CT和CC基因型个体(P＜0.05)；SNP4对活重的遗传效应达到显著水平(P＜0.01)，对屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重和腿肌重的遗传效应达到极显著水平(P＜0.01)，AA基因型个体的活重显著高于AG基因型个体(P＜0.05)，屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重极显著高于AG基因型个体(P＜0.01)，腿肌重极显著高于AG和GG基因型个体(P＜0.01)；SNP3、SNP5、SNP7和SNP10对各种屠宰性状的遗传效应都没有达到显著水平(P＞0.05)。

实施例5 SREBF2基因单倍型构建及其对屠宰性状的遗传效应

根据获得的7个SNP位点，采用PHASE 2.0软件构建单倍型。

30种单倍型被获得见表5。其中，主要的4种单倍型H4(A-C-G-A-A-A-C)、H10(A-C-A-A-C-G-C)、H13(A-C-A-A-A-G-G)和H16(A-C-A-G-G-G-G)占总数的49.79％。同时，将所有样品的遗传状态用单倍型组合的形式表示。通过已知的30种单倍型，一共获得117种复合单倍型，其中频率大于1％的27种单倍型占总观察数的61.47％(见表6)。标记-性状关联分析结果显示(见表7)：其中H21H21是活重、屠体重、半净膛重、全净膛重和腿肌重的优势单倍型，H13H21是胸肌重的优势单倍型，H10H10是腹脂重的优势单倍型，H7H13是皮脂厚的优势单倍型；而H3H13是活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重和腹脂重的劣势单倍型，H4H21是皮脂厚的劣势单倍型，提示单倍型H21(A-T-G-A-G-G-G)对于提高肉鸡的生产性能有正向作用。

表5鸡SREBF2基因单倍型构建

表6鸡SREBF2基因单倍型频率

Claims (7)

1.一种鸡屠体性状相关的单核苷酸多态性标记，其为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10，其中SNP1为自SEQ IDNo.1所示序列5’端起12578位为A或T；SNP2为自SEQ ID No.1所示序列5’端起13984位为T或C；SNP3为自SEQ ID No.1所示序列5’端起11310位为A或G；SNP4为自SEQ ID No.1所示序列5’端起7213位为A或G；SNP5为自SEQ ID No.1所示序列5’端起5196位为G或A；SNP6为自SEQ ID No.1所示序列5’端起1098位为C或T；SNP7为自SEQ ID No.1所示序列5’端起8574位为A或G；SNP8为自SEQ ID No.1所示序列5’端起176位为T或C；SNP9为自SEQ ID No.1所示序列5’端起1247位为A或G；SNP10为自SEQ ID No.1所示序列5’端起7037位为C或G。

2.一种检测鸡群体屠体性状的方法，其通过检测权利要求1所述的单核苷酸多态性标记，确定鸡群体的屠体性状。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，SNP1的TT基因型个体的全净膛重极显著高于AA和AT基因型个体；SNP2的TT基因型个体的全净膛重显著高于CT和CC基因型个体；SNP4的AA基因型屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重极显著高于AG基因型个体，腿肌重极显著高于AG和GG基因型个体。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，H21H21是活重、屠体重、半净膛重、全净膛重和腿肌重的优势单倍型，H13H21是胸肌重的优势单倍型，H4H21是皮脂厚的劣势单倍型，其中H4表示SNP1为A，SNP2为C，SNP3为G，SNP4为A，SNP5为A，SNP7为A，SNP10为G；H13表示SNP1为A，SNP2为C，SNP3为A，SNP4为A，SNP5为A，SNP7为G，SNP10为G；H21表示SNP1为A，SNP2为T，SNP3为G，SNP4为A，SNP5为G，SNP7为G，SNP10为G。

5.鉴定权利要求1所述的单核苷酸多态性标记的引物，其核苷酸如SEQ IDNo.2～21所示，其中，SEQ ID No.2、SEQ ID No.3对应SNP1；SEQ ID No.4、SEQID No.5对应SNP2；SEQ ID No.6、SEQ ID No.7对应SNP3；SEQ ID No.8、SEQID No.9对应SNP4；SEQ ID No.10、SEQ ID No.11对应SNP5；SEQ ID No.12、SEQ ID No.13对应SNP6；SEQ ID No.14、SEQ ID No.15对应SNP7；SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17对应SNP8；SEQ ID No.18、SEQ ID No.19对应SNP9；SEQID No.20、SEQ ID No.21对应SNP10。

6.含有权利要求5所述引物的试剂盒。

7.权利要求1所述的单核苷酸多态性标记在鸡选育中的应用。

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