CN109295052A - 瓢鸡无尾基因及检测瓢鸡无尾性状的方法、引物、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于突变或遗传工程；遗传工程涉及的DNA或RNA，载体技术领域，公开了一种瓢鸡无尾基因及检测瓢鸡无尾性状的方法、引物、试剂盒，提供了瓢鸡IRX1基因Mbo II和Ava II的2个检测标记。本发明首次采用位置克隆技术，在全基因组关联分析的基础上，通过对相关区间内全部基因的序列测定和遗传变异分析，揭示了IRX1基因为瓢鸡无尾性状的功能基因，建立了简单、省时、低成本的快速有效PCR‑RFLP检测标记，为瓢鸡无尾基因的纯化及良种繁育体系的建立具有积极的指导意义。本发明的2个标记，可用于瓢鸡无尾性状的基因检测与分子标记辅助育种，具有早期筛选、快速鉴定、节省时间、成本低廉、准确性高等特点。

Description

瓢鸡无尾基因及检测瓢鸡无尾性状的方法、引物、试剂盒

技术领域

本发明属于突变或遗传工程；遗传工程涉及的DNA或RNA，载体技术领域，尤其涉及一种瓢鸡无尾基因及检测瓢鸡无尾性状的方法、引物、试剂盒。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：瓢鸡是中国“十一五”时期畜禽品种资源调查时发现中国特有珍稀鸡种，其产区为云南省普洱市镇沅县，相邻的宁洱县、景东县、景谷等县也有小量分布。瓢鸡因缺少尾部羽毛，包括尾羽和大小镰羽，形似瓢状，故称作“瓢鸡”，当地人也称其为“团鸡”。解剖发现，尾椎骨、尾棕骨、尾脂腺在瓢鸡均不存在。与正常鸡相比，瓢鸡臀部丰满圆润，肉多骨少，繁殖速度快，肉质香甜细腻，适应性强，早熟等特点，属于地方特色优质鸡类型。据镇沅县县志记载，1941年就有瓢鸡被饲养。由于瓢鸡尾羽和鸡翘的不足，长期以来被认为不祥，所以种群数量一直较小。2006年畜禽遗传资源调查时发觉仅存201只，濒临灭绝。瓢鸡基本采用农户散养，后经政府扶持和畜牧部门技术指导，建立瓢鸡保种场，瓢鸡种群数量逐年上升，2012年瓢鸡存栏已达102024只。因其独特的外貌特征和较高的经济价值，瓢鸡于2009年11月通过了国家家禽遗传资源委员会鉴定，并与2014年列入“国家级家禽遗失资源保护名录”且是云南省优先发展的6大名鸡之一。到目前为止，瓢鸡是国内首个发现和认定的无尾鸡品种，国际上，也仅有起源于智利现饲养在美国的阿劳干鸡(Araucana)有无尾性状。阿劳干鸡，源自于智利，现饲养在欧洲和美国等多个国度和地域，该鸡种以其无尾、簇状耳羽和蓝壳蛋而著称。阿劳干鸡臀部成圆形、无明显的尾部特征，由于没有相应的尾椎骨、尾综骨等骨骼支持，尾羽及尾脂腺也不复存在。外貌及剖解观察发现，还存在一类介于无尾和有尾之间的中间类型，可能受修饰基因影响。克莱姆森大学Clark博士研究团队2012年采用基因芯片全基因组关联方法定位了阿劳干无尾性状基因。该团队采用60K鸡基因组芯片，对40只无尾鸡、11只有尾鸡、7只中间类型鸡进行了全基因组基因分型，将无尾基因定位在鸡2号染色体88.77MB至89.51MB之间，该区间共有740kb，含有191个SNP，包括IRX1、IRX2两个候选基因。无尾基因(Rp)基因全基因组关联分析(GWAS)定位在鸡2号染色体87.99～90.13Mb区间内，共有2.14MB，检测到191个SNP；单倍型区间精细定位在88.78～89.51Mb区间，包括13个SNP，共有0.74MB。无尾基因Rp基因定位2号染色体的全基因关联显著Praw值为2.45×10^-10，单个染色体的显著Pgenome值为0.00575。IRX1和IRX2属于易洛魁(Iroquois)基因家族，该基因家族包含有2个基因簇，1个为A簇，含有IRX1，IRX2和IRX4三个基因，1个为B簇，包含IRX3，IRX5和IRX6三个基因。IRX家族在脊椎动物胚胎发育的早期起重要的作用，主要影响中枢神经系统和骨骼发育系统。基因表达模式揭示，同一族成员在胚胎发育过程中协调表达，共同参与了机体发育的同化和特化，IRX2还参与了神经板的分化。在非洲爪蟾胚胎研究中，IRX1通过抑制Bmp4的表达调控神经区域和背侧中胚层。IRX1和IRX2在果蝇和非洲爪蟾中已筛选出突变基因并鉴定了突变预模式。在基因功能研究方面，通过对小鼠和斑马鱼IRX基因敲除，发现IRX基因在其发育过程中具有抑制脊索和体节的形成，但对尾部发育影响不明显。对无尾瓢鸡和仙居鸡的雏鸡进行了解剖观察，结果显示瓢鸡雏鸡腰荐部椎骨数目与正常有尾鸡相比明显缺失，且该缺失变异在胚胎期形成，因此瓢鸡可作为椎骨发育研究的重要模式动物。由于瓢鸡资源发现较晚，数量和分布有限，目前对该鸡的基础研究相对较少。采用PCR产物直接测序技术对云南省镇沅县50只瓢鸡样品的线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)高变区序列进行了分析，共检测到27个核苷酸多态位点，序列存在13种单倍型，表明瓢鸡群体内遗传变异较丰富，在遗传组成上具有5个母系血统来源。对无尾瓢鸡和仙居鸡的雏鸡进行了解剖观察，结果显示瓢鸡雏鸡腰荐部椎骨数目与正常有尾鸡相比明显缺失，且该缺失变异在胚胎期形成，因此瓢鸡可作为椎骨发育研究的重要模式动物。对无尾瓢鸡和仙居鸡进行了杂交，对F2代杂交鸡进行屠宰观察，对尾部骨骼进行X光成像分析，结果显示无尾性状的基因为显性及尾部形态结构。随着全基因组测序的完成，大量动物基因组测序工作延续开展，鸡基因组测序草图与注释也于2004年完成，使人们对鸡基因组有了初步认识。鸡基因组单倍体容量1.2×109DNA碱基对，有20000～23000个基因，分布在39对染色体上。2006年对该草图做了修订，补测了Z染色体及微小染色体的序列，填补了近800个基因组间隔(Gap)，注释了更多的基因信息如基因的结构和功能等内容。目前正在进行第3版的修订，预计不久将在NCBI公共信息平台公布(Build 3.0)，为研究者提供更为精确和详细的鸡基因组信息。与鸡基因组测序完成几乎同步，研究人员通过3个家鸡品种与红色原鸡序列的对比，构建了鸡基因组的遗传变异图谱，发现鸡基因组中含有280万个SNPs。基于鸡全基因组的遗传变异，全基因组的SNP基因芯片得以开发。美国Illumina公司2011年首次推出鸡60K SNP检测芯片(60K Illumina SNP BeadChip)，该芯片共有57636个SNPs^[60]。最近，Affymetrix公司又推出了鸡600K分型芯片(600KHD)，可检测SNPs的数量上升到580，954个，其中包括21，534个编码区变异。据该公司介绍，600HD高密度芯片将成为第一个商业化的鸡SNPs芯片，可用于基因组选择(GS)，基因组关联分析(GWAS)，选择特征分析(selection signatureanalyses)，QTL精细作图和拷贝数变异的检测等研究。GWAS的试验设计主要有两类：一类是单阶段设计(One-stage design)，另一类是两阶段设计(Two-stage design)。二者相比，两阶段是一种即经济又高效的研究策略。基因分型有对个体DNA直接分型和混合DNA池检测两种策略。后者是将具有表型差异分组的个体DNA混合在一起构成不同DNA池，检测两个DNA池间的基因频率差异，差异显著并相互连锁的标记被认为可能存在表型效应，该方法适于质量性状或高低极端表型明显的数量性状分析。GWAS分析一般只是鉴定出和目标性状相关的染色体片段，往往不是影响表型变异的主效基因或致因变异。因此，通过后续研究，如精细定位、位置克隆、表达谱分析、基因功能分析等，有利于揭示变异位点影响表型的作用机理，也可以直接应用于资源保护和育种工作。全基因组关联研究(GWAS)使用高通量的基因分型技术在基因组范围内搜索SNP，从整个基因组水平上检测SNP以及整体分析关联性，探讨其与表型以及复杂性状的关系，具有检测速度快、结果更加可靠等优点，成为目前人们研究的热点，在包括鸡在内的许多家养动物的QTL定位和QTN鉴别方面已取得一系列研究成果。美国爱荷华州立大学动物科学系Abasht和lamont(2007)首次使用3000个SNPs对2个鸡F2群体的腹脂率性状进行了GWAS分析，发现39个SNPs位点[19]。随后，在鸡体重、生长、免疫、繁殖等性状方面都陆续开展了全基因组关联分析。美国海兰蛋鸡公司Wolc等(2014)运用42KIllumina SNP芯片对褐壳产蛋母鸡连续8个世代13000只母鸡进行全基因组GWAS分析，记录的性状包括产蛋量、11个蛋品质指标和初产母鸡体重，采用Bayesian全基因组预测模型进行统计分析，结果显示，在鸡4号染色体78M处检测到1个大效应QTL，该QTL可解释32％的表型差异，另外，在鸡17，12，和2号染色体也检测到与产蛋量、蛋壳颜色及蛋白高度相关的QTL，表型差异解释率在5-7％之间。对北京油鸡和科宝肉鸡构建的F2资源群体，对93日龄鸡胫围和胫长的全基因组关联研究发现13号染色体上的NKX2-5基因可能影响胫长；4号染色体上LDB2、BOD1L1和QDPR等基因与胫围显著或潜在关联。利用Illumina 60K SNP Beadchip对724只北京油鸡的16个肉质性状开展全基因组关联分析，发现在4号染色体上存在7个显著SNPs，4个候选基因(LCORL，LAP3，LDB2，TAPT1)与胴体重和内脏重量相关，此外还预测了GJA1基因可能影响油鸡的胸肌发育。(2012)对鸡马立克病(Marek’s disease，MD)采用病例对照的方法进行了全基因组关联研究，在全基因组显著水平和极显著水平上分别检测到1个SNP，基因注释结果表明这两个位点分别落在SMOC1和PTPN3基因内。与对照组相比，SMOC1基因在病例组的脾脏中显著上调差异表达，由此推测该基因在MD中发挥重要作用。采用个体基因分型与DNA混合池分型相结合的GWAS分析是今后鉴定疾病和经济性状基因的一个重要趋势，该技术在不损失检测效应的同时可大大降低检测费用。(2013)对美国Virginia鸡生长性状双向选择50代以上的体重大和体重小的两个类群开展GWAS及生物信息学分析，结合个体与DNA混合池的60K SNP芯片分型技术，成功鉴定了10个与生长性状相关的主效基因(GCG，IGFBP2，GRB14，CRIM1，FGF16，VEGFR-2，ALG11，EDN1，SNX6，BIRC)。在鸡体型外貌等质量性状的基因定位和筛选方面，GWAS也大大提高了检测效率。(2012)通过连锁分析和全基因组关联研究发现鸡凤头性状的QTL位于E22C19W28连锁群上，且HOXC基因簇与其关联。通过对26个不同品种的凤头鸡和非凤头鸡的组织表达分析发现HOXC8在胚胎发育期颜骨皮肤中异位表达，由此推断凤头的产生是由H0XC8异位表达的顺式作用元件突变引起的。(2012)通过GWAS鉴定阿劳干鸡(Araucan chicken)无尾羽和耳絨毛性状的候选基因。其中鸡2号染色体2.14Mb的单倍型中两个易洛魁族(Iroquois)同源盒基因(homeobox genes)，IRXl和IRX2基因，在无尾羽阿劳干鸡具有一致的单倍型。具有耳绒毛性状的鸡共有一个0.58Mb的单倍型，包含7个基因，其中TBX1和GNB1L可能是该性状的重要候选基因。此外，GWAS分析已定位多个质量性状，如鸡的多趾、羽色、黑色素沉积、凤头等性状相关基因或QTL都已成功定位。值得一提的是，鸡600K Affymetrix Axiom HD genotyping array芯片开始用于GWAS分析，并已显示高分辨率优越性。最近，(2014)用600K SNP芯片定位id基因，在Z染色体78.5to79.2Mb区间内发现3个SNP与id基因紧密连锁。可以预见，600K Affymetrix Axiom HD高密度SNP芯片将在鸡基因组分析领域应用越来越广泛。瓢鸡是中国畜禽品种资源特有珍稀鸡种,其产区为云南省普洱市镇沅县，相邻的宁洱县、景东县、景谷等县也有小量分布。到目前为止，瓢鸡是国内首个发现和认定的无尾鸡品种。瓢鸡因缺少尾部羽毛，包括尾羽和大小镰羽，形似瓢状，故称作“瓢鸡”，当地人也称其为“团鸡”。解剖发现，尾椎骨、尾棕骨、尾脂腺在瓢鸡均不存在。与正常鸡相比，瓢鸡臀部丰满圆润，肉多骨少，繁殖速度快，肉质香甜细腻，适应性强，早熟等特点，属于地方特色优质鸡类型。由于瓢鸡尾羽和鸡翘的缺失，长期以来被认为不祥，所以种群数量一直较小。2006年畜禽遗传资源调查时发觉仅存201只，濒临灭绝。瓢鸡于2009年11月通过了国家家禽遗传资源委员会鉴定，并与2014年列入“国家级家禽遗失资源保护名录”且是云南省优先发展的6大名鸡之一。目前对该鸡的基础研究相对较少。贡潘偏抽等(2011)采用PCR产物直接测序技术对云南省镇沅县50只瓢鸡样品的线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)高变区序列进行了分析，共检测到27个核苷酸多态位点，序列存在13种单倍型，表明瓢鸡群体内遗传变异较丰富，在遗传组成上具有5个母系血统来源。对无尾瓢鸡和仙居鸡的雏鸡进行了解剖观察，结果显示瓢鸡雏鸡腰荐部椎骨数目与正常有尾鸡相比明显缺失，且该缺失变异在胚胎期形成，因此瓢鸡可作为椎骨发育研究的重要模式动物。对无尾瓢鸡和仙居鸡进行了杂交，对F2代杂交鸡进行屠宰观察，对尾部骨骼进行X光成像分析，结果显示无尾性状的基因为显性及尾部形态结构。在瓢鸡羽色与肤色等色素性状研究方面，分析了黑色素受体(MC1R)基因、酪氨酸酶(TYR)基因与可溶性载质转运蛋白(SLC24A5)3个基因在瓢鸡不同羽色和肤色类群间的遗传差异，建立了MC1R基因TaqI、TYR基因HindIII和SLC24A5基因NheI 3个PCR-RFLP标记。在生长发育、屠宰性能和体尺测定方面，研究了类胰岛素生长因子受体1(IGFI)基因和线粒体DNA氧化酶基因(COX3)与上述性状的相关性。瓢鸡IGF1基因相对保守，没有检测到瓢鸡IGF1基因变异位点。在瓢鸡线粒体COX3基因检测到C10669T多态位点，建立了EcoRV PCR-RFLP分子标记，利用该标记对300日龄具有生长和屠宰性状记录的82只瓢鸡个体进行了基因分型，发现瓢鸡EcoRVPCR-RFLP标记与体重、龙骨长、屠体重与胸肌率4个性状相关显著。在瓢鸡疾病抵抗力方面，分离到瓢鸡特有肠炎沙门氏菌菌株，鉴定了鸡白痢易感群体和抗性群体，分析了杀菌蛋白基因(BPI)多态性与瓢鸡12项血液生理指标的相关分析，研究表明，瓢鸡BPI基因存在高度变异，在所测定的BPI基因3200bp序列中共检测到18个SNP位点，有4个SNP位点在沙门氏菌抗性群体和易感群体间基因频率存在显著差异。国际上，也仅有起源于智利现饲养在美国的阿劳干鸡(Araucana)有无尾性状，该鸡种以其无尾、簇状耳羽和蓝壳蛋而著称。阿劳干鸡臀部成圆形、无明显的尾部特征，由于没有相应的尾椎骨、尾综骨等骨骼支持，尾羽及尾脂腺也不复存在。外貌及剖解观察发现，还存在一类介于无尾和有尾之间的中间类型，可能受修饰基因影响。2012年采用基因芯片全基因组关联方法定位了阿劳干无尾性状基因。该团队采用60K鸡基因组芯片，对40只阿劳干无尾鸡、11只有尾鸡、7只中间类型鸡进行了全基因组基因分型，无尾基因(Rp)基因全基因组关联分析(GWAS)定位在鸡2号染色体87.991～90.13Mb区间内，共有2.14MB，检测到191个SNP；单倍型区间精细定位在88.78～89.51Mb区间，包括13个SNP,共有0.74MB。无尾基因Rp基因定位2号染色体的全基因关联显著Praw值为2.45×10-10，单个染色体的显著Pgenome值为0.00575。

综上所述，现有技术存在的问题是：

目前尚无瓢鸡无尾性状的检测方法。

解决上述技术问题的难度和意义：

瓢鸡起源于云南省普洱市镇沅县，是中国唯一的无尾鸡品种，具有无尾羽、无尾椎骨、无尾脂腺等无尾鸡特征。研究瓢鸡无尾性状的遗传规律、鉴定无尾性状功能基因、建立检测无尾性状的遗传标记，对阐明无尾性状的遗传基础、遗传资源保护利用具有重要定的理论和实践意义。本发明采用外貌观察、解剖鉴定、X-射线拍照等表型鉴定方法，对瓢鸡的纯无尾、中间类型与有尾3种尾部特征进行了详细的界定；通过瓢鸡与白洛克鸡的正反交杂交试验以及瓢鸡与海兰蛋母鸡的测交试验，共产生1071只杂交后代，其中无尾鸡478只，有尾鸡593只，在无尾鸡内又包括纯无尾鸡482只，中间类型96只。瓢鸡杂交试验提示，瓢鸡的无尾性状受一对常染色体基因控制，无尾基因对有尾基因为显性。同时，中间类型鸡的存在说明，瓢鸡的无尾性状还受修饰基因影响，中间类型性状的外显率约为8～18％；利用位置基因克隆技术，对瓢鸡2号染色体86.6～87.14Mb区间内的4个位置候选基因(IRX1基因、IRX2基因、LOC101747598基因、gp95基因)进行了全部外显子和大部分内含子的序列测定，通过对3种尾部类型鸡基因序列的比较，共检测到27个SNP位点，SNP位点基因型与3种尾部类型的关联分析提示，IRX1基因为控制瓢鸡无尾性状的关键基因；针对IRX1基因两个显著相关的SNP位点，建立了Mbo II和Ava II两个PCR-RFLP遗传标记。利用这两个标记，对瓢鸡与有尾鸡的杂交后代进行了基因分型，结果提示，两个遗传标记的基因型与杂交后代尾部性状具有共分离模式，从而验证了IRX1基因的2个SNP为瓢鸡无尾性状的功能SNP位点；生物信息学分析显示，瓢鸡IRX1基因的多态信息含量(PIC)为0.7813，平均杂合度(Ave-Het)为0.2075，香农信息指数(I)为0.3101。单倍型分析揭示了IRX1基因共存在10个单倍型，其中单倍型4和单倍型5是无尾性状的主要单倍型。本发明还分析了瓢鸡、当地原鸡、白洛克鸡、海兰蛋鸡、武定鸡、茶花鸡、拉伯高脚鸡的IRX1基因序列和单倍型类型。综上所述，瓢鸡是中国特有的无尾鸡品种，保护无尾性状具有重要的理论和实际意义。然而，对于瓢鸡无尾性状的遗传规律及其基因基础尚不清楚。特别是瓢鸡的无尾性状属于显性性状，无尾鸡的纯合基因型和杂合基因型从表型鉴定中难以区分，对瓢鸡的保种选育带来很大困难。因此，急需揭示瓢鸡无尾性状的功能基因，寻找变异位点，建立基因检测标记，从分子水平上对纯种无尾鸡进行准确鉴别。本发明具有准确性高、早期鉴别、快速简便、费用较低等优点，对瓢鸡无尾性状的基因纯化、资源保护以及产业化发展具有重要的理论和实践意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种瓢鸡无尾基因及检测瓢鸡无尾性状的方法、引物、试剂盒。

本发明是这样实现的，一种瓢鸡无尾基因，所述瓢鸡无尾基因及其位置克隆为IRX1；所述IRX1的基因检测标记，其为Mbo II标记和Ava II标记，其中Mbo II标记为SEQ IDNo.1所示序列5’端起2540位SNP的G或A；Ava II标记为SEQ ID No.1所示序列5’端起4524位SNP的C或A。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述瓢鸡无尾基因的检测瓢鸡无尾性状的方法，所述检测瓢鸡无尾性状的方法通过检测RX1基因的Mbo II标记和Ava II标记，确定瓢鸡的无尾和有尾性状。

进一步，所述检测瓢鸡无尾性状的方法具体包括：Mbo II标记的GG基因型与GA基因型为无尾性状，AA基因型为有尾性状。MboⅡ检测标记的GG基因型为500bp一个片段，AA基因型为252bp、248bp的2个片段，GA基因型为500bp、250bp、248bp的3个片段；Ava II标记的AA基因型与AC基因型为无尾性状，CC基因型为有尾性状。AvaⅡ检测标记的AA基因型为639bp、177bp 2个片段，CC基因型为318bp、321bp和177bp的3个片段，CA基因型为639bp、318bp、321bp和177bp的4个片段。

进一步，Hap5和Hap8是无尾鸡性状特有单倍型，Hap3、Hap4、Hap7、Hap9是有尾性状特有单倍型，Hap1是无尾性状优势单倍型，Hap2是有尾性状优势单倍型。其中，Hap1的SNP组合为CTACAGCCC，Hap2的SNP组合为CTGCAGCAC，Hap3的SNP组合为CTGCCGCAC，Hap4的SNP组合为CGGCCGCAC，Hap5的SNP组合为CGGTAGAAC，Hap7的SNP组合为CGGTCGCAA，Hap8的SNP组合为CGGTCAAAA，Hap9的SNP组合为CGGTCACAA。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定所述的IRX1基因检测标记的引物和检测标记，所述引物的核苷酸为SEQ ID No.2～7；IRX1基因检测标记Mbo II的识别碱基为SEQ IDNo.8，IRX1基因检测标记Ava II的识别碱基为SEQ ID No.9。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述引物和检测标记的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种所述IRX1的基因检测标记的鸡选育方法。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明得到了国家自然科学基金项目(批准号：31560629)资助。

本发明首次采用位置克隆技术，在全基因组关联分析的基础上，通过对相关区间内全部基因的序列测定和遗传变异分析，揭示了IRX1基因为瓢鸡无尾性状的功能基因，基因型与杂交试验的共分离模式验证了IRX1基因的两个功能SNP位点，并建立了简单、省时、低成本的快速有效PCR-RFLP检测标记，为瓢鸡无尾基因的纯化及良种繁育体系的建立具有积极的指导意义。

本发明提供了瓢鸡IRX1基因Mbo II和Ava II的2个检测标记，以及应用所述标记检测瓢鸡无尾性状的方法。本发明还提供用于检测所述标记的特定引物、特定限制性内切酶及相关试剂的试剂盒。本发明提供了IRX1基因的2个标记，可用于瓢鸡无尾性状的基因检测与分子标记辅助育种，具有早期筛选、快速鉴定、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

附图说明

图1是本发明实施例提供的瓢鸡无尾基因的位置克隆与功能SNP位点的鉴定方法流程图。

图2是本发明实施例提供的瓢鸡基因组DNA电泳检测图。

图3是本发明实施例提供的瓢鸡IRX1基因3对引物扩增产物结果示意图。

图4是本发明实施例提供的瓢鸡IRX1基因SNP测序结果，箭头指向为SNP碱基替换位置示意图。

图5是本发明实施例提供的鸡IRX1基因Mbo II检测标记电泳图。

图6是本发明实施例提供的鸡IRX1基因Ava II检测标记电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

云南以其独特的地理环境和民族特色，形成了丰富多彩的家鸡遗传资源。云南既有现存于滇西南边境地区的家鸡野生祖先红原鸡，也有与红原鸡关系密切的原始品种茶花鸡，还有形态外貌各异、经济用途不同的20余个地方鸡品种，丰富的鸡遗传多样性在中国乃至世界都占有重要地位。云南瓢鸡因其没有尾羽而独具特色，是国内唯一报道和认定的无尾鸡品种。本发明利用IRX1和IRX2基因鉴定无尾性状关键基因和致因变异，并在SNP水平上揭示瓢鸡的基因多样性与检测标记。瓢鸡成为阐明尾巴的发展提供了一个形态学和分子学机制的生物模型，为家禽重要质量性状关键基因的定位和鉴定提供新的研究思路和方法。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的瓢鸡无尾基因及其位置克隆为IRX1；所述IRX1的基因检测标记，其为Mbo II标记和Ava II标记，其中Mbo II标记为SEQ ID No.1所示序列5’端起2540位SNP的G或A；Ava II标记为SEQ ID No.1所示序列5’端起4524位SNP的C或A。

本发明实施例提供的瓢鸡无尾基因的检测瓢鸡无尾性状的方法通过检测RX1基因的Mbo II标记和Ava II标记，确定瓢鸡的无尾和有尾性状。

如图1所示，本发明实施例提供的瓢鸡无尾基因的检测瓢鸡无尾性状的方法包括以下步骤：

S101：Mbo II标记的GG基因型与GA基因型为无尾性状，AA基因型为有尾性状。MboⅡ检测标记的GG基因型为500bp一个片段，AA基因型为252bp、248bp的2个片段，GA基因型为500bp、250bp、248bp的3个片段；Ava II标记的AA基因型与AC基因型为无尾性状，CC基因型为有尾性状。AvaⅡ检测标记的AA基因型为639bp、177bp 2个片段，CC基因型为318bp、321bp和177bp的3个片段，CA基因型为639bp、318bp、321bp和177bp的4个片段；

S102：Hap5和Hap8是无尾鸡性状特有单倍型，Hap3、Hap4、Hap7、Hap9是有尾性状特有单倍型，Hap1是无尾性状优势单倍型，Hap2是有尾性状优势单倍型。其中，Hap1的SNP组合为CTACAGCCC，Hap2的SNP组合为CTGCAGCAC，Hap3的SNP组合为CTGCCGCAC，Hap4的SNP组合为CGGCCGCAC，Hap5的SNP组合为CGGTAGAAC，Hap7的SNP组合为CGGTCGCAA，Hap8的SNP组合为CGGTCAAAA，Hap9的SNP组合为CGGTCACAA。

本发明实施例提供的IRX1基因检测标记的引物和检测标记，其特征在于，所述引物的核苷酸为SEQ ID No.2～SEQ ID No.7；IRX1基因检测标记Mbo II的识别碱基为SEQ IDNo.8，IRX1基因检测标记Ava II的识别碱基为SEQ ID No.9。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

瓢鸡来源于云南省镇沅县云岭广大瓢鸡原种保种场。共收集无尾鸡625只，有尾鸡375只，在无尾鸡里又分422只纯无尾鸡与203只中间类型鸡。每只鸡都详细记录尾部特征、系谱信息、性别、年龄、羽色等性状，并对每只采样瓢鸡拍照记录。

实施例1瓢鸡杂交试验及其遗传规律

杂交试验1：瓢鸡公鸡与白洛克母鸡杂交试验，该次杂交试验在云南省小哨祖代肉种鸡场进行。杂交组合的的父本来自镇沅云岭广大瓢鸡原种保种场无尾瓢鸡，母本为狄高配套系的白洛克母鸡。

杂交试验2：白洛克公鸡与瓢鸡母鸡杂交试验，该次杂交试验在镇沅云岭广大瓢鸡原种保种场进行。杂交组合的的父本为云南省小哨祖代肉种鸡场的狄高配套系白洛克公鸡，母本为无尾瓢鸡母鸡。

杂交试验3：瓢鸡公鸡与海兰蛋母鸡杂交试验，该次杂交试验在云南省小哨祖代肉种鸡场进行。杂交组合的的父本来自镇沅云岭广大瓢鸡原种保种场无尾瓢鸡，母本为海兰蛋母鸡。孵化时单独套袋孵化，出雏后每只雏鸡佩戴脚号。因杂交子代无尾个体既有公鸡又有母鸡。

表1杂交试验结果

表2杂交试验统计分析表

采用适合性卡方分析检验杂交后代无尾及有尾是否符合1：1的理论比例。由表3-2可见，3个杂交试验的结果以及总和结果均符合1:1的比例关系。

外显率是指某个性状出现的次数占总个体数的百分比。三次杂交试验中间类型的外显率分别为8.2％、8.3％、17.1％，中间类型的总和外显率11.4％。

瓢鸡杂交试验提示，瓢鸡的无尾性状受一对常染色体基因控制，无尾基因对有尾基因为显性。同时，中间类型鸡的类型说明，瓢鸡的无尾性状还受修饰基因影响，中间类型性状的外显率约为8～18％。

瓢鸡无尾基因Rp为显性，正常有尾基因rp，RP基因对rp基因为显性。当两个显性基因RpRp纯合时，表现为纯无尾性状，显性基因与隐性基因杂合时表现为无尾性状杂合类型，两个隐性基因rprp纯合时为正常有尾鸡类型。

实施例2瓢鸡IRX1基因多态性位点的获得

1鸡血液样品采集

在对样品采集是详细记录每只鸡的性别、年龄、羽色、尾部性状及系谱信息，利用肝素钠抗凝真空采血管从翅静脉采集全血2～3ml，4℃运至试验室，然后在-20℃进行存储。

2基因组DNA提取

鸡翅静脉采血，所采血样均为1mL/只、EDTA抗凝，血样于-20℃冷冻保存。采用常规酚-氯仿法从上述的鸡血液中提取基因组DNA，用1.0％琼脂糖电泳检测，可以看到DNA条带清晰、明亮、无杂带，完全符合后续PCR试验的要求(图2)。

3引物设计与合成

根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)发布的鸡(Gallus gallus)全基因组序列(build 3.1)的IRX1基因编码区序列，利用primer3(V.0.4.0)引物设计软件设计了3对引物。引物序列、扩增产物大小见表3，引物由上海生工生物工程公司合成(上海，中国)，Tris.HCL溶解至浓度为50μmol/L，-20℃保存。

表3瓢鸡IRX1基因引物信息表

4PCR反应体系与基因扩增

按以下顺序配制PCR反应混合物(总体积50μl)

表4 PCR扩增反应体系

PCR循环参数：

以瓢鸡血液基因组DNA为模板，IRX1基因用引物IRX1-F1/F2、IRX1-F2/R2和IRX1-F3/R3进行扩增。基因扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，Marker为DL2000；每个样品取4μl点样，100恒压电泳40min左右，凝胶成像拍照。PCR扩增得到产物与预期片段大小一致，扩增效果良好，样品直接送至昆明擎科生物科技有限公司纯化测序。扩增结果如图3。

5PCR产物的纯化与DNA序列测定

采用PCR快速纯化试剂盒纯化PCR产物，PCR产物纯化后送至昆明硕擎生物技术有限公司(昆明，中国)进行正、反链双向测序。

对IRX1基因PCR扩增产物测序，结果与NCBI Blast同源性比较，所测序列与GenBank的IRX1基因序列的同源性达99％以上，证明扩增的产物为鸡IRX1基因。对瓢鸡和正常有尾鸡个体间序列比对后结果显示，在IRX1-F1/R1基因扩增区序列共5个SNPs，分别是C2337A、T2512G、A2540G、C2706T、A2786C。在IRX1-F2/R2基因扩增区序列共2个SNPs，分别是A3222G、C3331A。在IRX1-F3/R3基因扩增区序列共2个SNPs，分别是C4524A、C4534A，IRX1基因部分SNP位点测序结果见图4。其中A3222G和C3331A引起氨基酸变异,由异亮氨酸(I)变异为亮氨酸(L)、甘氨酸变异(G)为谷氨酸(E)，IRX1基因变异位点检测结果见表5。

表5鸡IRX1基因变异位点

实施例3IRX1基因单个SNP与无尾性状的关联分析

采用SPSS中单因素方差分析的方法分析单个SNP与鸡尾部发育的关联分析，若P<0.05，则表示有显著。

运用逻辑回归方法，在共显性(Codominant)遗传模式下分析IRX1基因单个SNPs与瓢鸡无尾性的相关性，发现SNP2和SNP5位点与瓢鸡无尾性状有显著相关性(P<0.05)；SNP3和SNP8位点与瓢鸡无尾性状有极显著相关性(P<0.01)，其他均无相关性(P>0.05)。IRX1基因SNP3位点基因型G/G的有尾组的频率(95.5％)极显著高于无尾组0(0％)频率，提示G/G型为有尾基因型；IRX1基因SNP8位点基因型A/A的有尾组的频率(95.5％)极显著高于无尾组0(0％)频率，提示A/A型为有尾基因型，结果见表6。

表6 IRX1基因多态性位点与瓢鸡无尾性状的相关性分析

实施例4IRX1基因单倍型与无尾性状的关联分析

基于逻辑回归方法，采用在线软件SNPstats分析IRX1基因单倍型与瓢鸡无尾之间的相关性，IRX1基因共发现9个变为位点，组成9个单倍型，频率小于0.01的单倍型不做分析，除单倍型3、5与瓢鸡无尾性状无显著相关(P>0.05)，其他均相关性(P<0.05)。

结果显示，单倍型5、8是无尾鸡性状特有单倍型，单倍型3、4、7、9是有尾性状特有单倍型，单倍型1是无尾性状优势单倍型，单倍型2是有尾性状优势单倍型，结果见表7。

表7 IRX1基因SNPs位点单倍型与无尾的关联分析

实施例5 IRX1基因检测标记建立及验证

1瓢鸡IRX1基因MboⅡ检测标记建立

针对G2540A位点，采用第一段引物(IRX1-F1/R1)PCR扩增瓢鸡所有个体，由于在383bp处的G/A转换形成一个MboⅡ限制性内切酶酶切位点，经MboⅡ酶切后，出现3种基因型，GG型为500bp，AA型为252bp、248bp，GA型为500bp、250bp 2个片段。根据酶切片段的类型确定基因型。鸡IRX1基因MboⅡPCR-RFLP电泳检测结果见图5。

2瓢鸡IRX1基因Ava II检测标记建立

针对C4524A位点，采用第三段引物(IRX1-F3/R3)PCR扩增瓢鸡所有个体，由于在179bp处的A/C转换形成一个AvaⅡ限制性内切酶酶切位点，经AvaⅡ酶切后，出现3种基因型，AA型为639bp、177bp2个片段，CC型为318bp、321bp和177bp3个片段，CA型为639bp、318bp、321bp和177bp4个片段。根据酶切片段的类型确定基因型。鸡IRX1基因AvaⅡPCR-RFLP电泳检测结果见图6。

3两个检测标记的验证

3.1两个IRX1基因检测标记在第一个杂交试验中的验证

在瓢鸡公鸡与白洛克母鸡杂交试验中，运用逻辑回归方法，在共显性(Codominant)遗传模式下分析IRX1基因2个检测标记与无尾性状的相关性，发现Mbo II和Ava II检测标记均与瓢鸡无尾性状在都有极显著相关性(P<0.01)。

从瓢鸡公鸡与白洛克母鸡杂交后代的基因型频率可以看出，Mbo II检测标记在有尾组基因型A/A(100％)极显著高于无尾组和中间类型组的基因组频率(0％)，所以A/A基因型代表鸡的有尾性状；因是瓢鸡与有尾鸡的杂交后代所以无尾和中间类型的基因型为杂合子G/A其基因频率都为100％，并且代表无尾的基因型G/G基因型频率为0％，结果见表8。

从瓢鸡公鸡与白洛克母鸡杂交后代的基因型频率可以看出，Ava II检测标记在有尾组基因型C/C(100％)极显著高于无尾组和中间类型组0(0％)频率，所以C/C基因型代表鸡的有尾性状；因是瓢鸡与有尾鸡的杂交后代,所以无尾和中间类型的基因型为杂合子G/A其基因频率都为100％，并且代表无尾的基因型A/A的基因型频率为0％，结果见表8。

表8两个IRX1基因检测标记在第一个杂交试验中的验证

3.2两个IRX1基因检测标记在第二个杂交试验中的验证

从白洛克公鸡与瓢鸡母鸡杂交后代的基因型频率可以看出，Mbo II检测标记有尾组基因型A/A(100％)极显著高于无尾组和中间类型组的基因组频率(0％)，所以A/A基因型代表鸡的有尾性状；因是瓢鸡与有尾鸡的杂交后代所以无尾和中间类型的基因型为杂合子G/A其基因频率都为100％，并且代表无尾的基因型G/G基因型频率为0％，结果见表9。

从白洛克公鸡与瓢鸡母鸡杂交后代的基因型频率可以看出，Ava II检测标记基因型C/C(100％)极显著高于无尾组和中间类型组0(0％)频率，所以C/C基因型代表鸡的有尾性状；因是瓢鸡与有尾鸡的杂交后代,所以无尾和中间类型的基因型为杂合子G/A其基因频率都为100％，并且代表无尾的基因型A/A的基因型频率为0％，结果见表9。

表9两个IRX1基因检测标记在第二个杂交试验中的验证

3.3两个IRX1基因检测标记在第三个杂交试验中的验证

从瓢鸡公鸡与海兰蛋母鸡杂交后代的基因型频率可以看出，Mbo II检测标记的有尾组基因型A/A(100％)极显著高于无尾组和中间类型组的基因组频率(0％)，所以A/A基因型代表鸡的有尾性状；因是瓢鸡与有尾鸡的杂交后代所以无尾和中间类型的基因型为杂合子G/A其基因频率都为100％，并且代表无尾的基因型G/G基因型频率为0％，结果见表10。

从瓢鸡公鸡与海兰蛋母鸡杂交后代的基因型频率可以看出，Ava II检测标记的有尾组基因型C/C(100％)极显著高于无尾组和中间类型组0(0％)频率，所以C/C基因型代表鸡的有尾性状；因是瓢鸡与有尾鸡的杂交后代,所以无尾和中间类型的基因型为杂合子G/A其基因频率都为100％，并且代表无尾的基因型A/A的基因型频率为0％，结果见表10。

表10两个IRX1基因检测标记在第三个杂交试验中的验证

实施例6适用于瓢鸡无尾性状的IRX1基因检测标记试剂盒

Mbo II检测试剂盒

Mbo II检测试剂盒包含以下试剂

Ava II检测试剂盒

Ava II检测试剂盒包含以下试剂

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种瓢鸡无尾基因，其特征在于，所述瓢鸡无尾基因及其位置克隆为IRX1；所述IRX1的基因检测标记，其为Mbo II标记和Ava II标记，其中Mbo II标记为SEQ ID No.1所示序列5’端起2540位SNP的G或A；Ava II标记为SEQ ID No.1所示序列5’端起4524位SNP的C或A。

2.一种应用权利要求1所述瓢鸡无尾基因的检测瓢鸡无尾性状的方法，其特征在于，所述检测瓢鸡无尾性状的方法通过检测IRX1基因的Mbo II标记和Ava II标记，确定瓢鸡的无尾和有尾性状。

3.如权利要求2所述的检测瓢鸡无尾性状的方法，其特征在于，所述检测瓢鸡无尾性状的方法具体包括：Mbo II标记的GG基因型与GA基因型为无尾性状，AA基因型为有尾性状。MboⅡ检测标记的GG基因型为500bp一个片段，AA基因型为252bp、248bp的2个片段，GA基因型为500bp、250bp、248bp的3个片段；Ava II标记的AA基因型与AC基因型为无尾性状，CC基因型为有尾性状。AvaⅡ检测标记的AA基因型为639bp、177bp 2个片段，CC基因型为318bp、321bp和177bp的3个片段，CA基因型为639bp、318bp、321bp和177bp的4个片段。

4.如权利要求3所述的检测瓢鸡无尾性状的方法，其特征在于，Hap5和Hap8是无尾鸡性状特有单倍型，Hap3、Hap4、Hap7、Hap9是有尾性状特有单倍型，Hap1是无尾性状优势单倍型，Hap2是有尾性状优势单倍型。其中，Hap1的SNP组合为CTACAGCCC，Hap2的SNP组合为CTGCAGCAC，Hap3的SNP组合为CTGCCGCAC，Hap4的SNP组合为CGGCCGCAC，Hap5的SNP组合为CGGTAGAAC，Hap7的SNP组合为CGGTCGCAA，Hap8的SNP组合为CGGTCAAAA，Hap9的SNP组合为CGGTCACAA。

5.一种鉴定权利要求1所述的IRX1基因检测标记的引物和检测标记，其特征在于，所述引物的核苷酸为SEQ ID No.2～7；IRX1基因检测标记Mbo II的识别碱基为SEQ ID No.8，IRX1基因检测标记Ava II的识别碱基为SEQ ID No.9。

6.一种包含权利要求5所述引物和检测标记的试剂盒。

7.一种如权利要求1所述IRX1的基因检测标记的鸡选育方法。