CN109735633A

CN109735633A - Fshr基因特异snp标记、吐鲁番黑羊产羔数性状的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN109735633A
Application number: CN201910130965.5A
Authority: CN
Inventors: 刘武军; 马海玉; 方超; 刘玲玲; 王琼; 曹行; 吕士鹏; 于茜; 黄开飞; 蒋芳芳
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2019-02-20
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-02-20
Also published as: CN109735633B

Abstract

本发明公开了一种FSHR基因特异SNP标记、吐鲁番黑羊产羔数性状的检测方法及其应用，涉及分子育种领域。本发明SNP标记来源于吐鲁番黑羊FSHR基因，SNP标记位于第3号染色体上第75320741位，原始碱基为C，变异碱基为T；SNP标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。SNP位点的TT基因型个体的产羔数显著高于CC基因型。本发明引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2‑4。本发明将上述SNP标记、引物和试剂盒应用于吐鲁番黑羊产羔性状检测，通过检测SNP标记基因型来确定待测黑羊的产羔性状如何；本发明的上述SNP、引物、试剂盒及检测方法可用于育种，筛选出产羔数较多的品种。

Description

FSHR基因特异SNP标记、吐鲁番黑羊产羔数性状的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，尤其涉及一种FSHR基因特异SNP标记、吐鲁番黑羊产羔数性状的检测方法及其应用。

背景技术

吐鲁番黑羊俗称“托克逊黑羊”，是小型地方品种绵羊，成年公羊体重46kg，具有生长速度快、肉质独特等特点，是新疆地方优良肉羊品种。然而新疆地区夏季冬季均长达近半年，最高温度高达42℃度，且最冷可达零下35至零下40℃，自然条件恶劣，许多优良品种在这里无法生存。而吐鲁番黑羊就是在这样一个特殊的条件下，通过长期的自然和人工选择而形成的，既适应夏季酷热、冬季严寒的吐鲁番盆地气候；能耐受粗纤维多、木质化强、的牧草植物，且能快速增膘和迅速生长的优良地方绵羊品种。吐鲁番黑羊肉质鲜美，且由于其放牧草场天然无污染，可通过生产有机羊肉，打入高端市场，以此来增加当地农牧民的经济收入，进而提高和改善生活水平。近年来羊肉供不应求，价格居高不下。因此，对于解决优质羊肉供不应求、少数民族生活小康意义重大。

吐鲁番黑羊作为新疆代表性优良品种，具有其独特性，应做好本地品种资源的有效保护，此外，其优良产肉特性没有得到合理的开发利用，极大地不利于当地经济和新疆肉羊产业的发展。因此，运用先进生物技术，结合现代育种技术和传统育种方法，发展新疆优势畜牧业，提高绵羊选育程度，培育高产肉羊专门化品种，提高羊肉畜产品质量，以加速新疆山羊产业的发展进程。在我国肉羊业快速发展的过程中，其核心问题是提高肉羊的质量、增加商品的出栏数量，二者的核心是肉羊的繁育技术的优化与运用。肉羊的繁育技术的核心是如何发挥肉羊的繁殖性状的表现潜力。繁殖性能是绵羊的重要经济性状之一，其中产羔数是影响生产效益的一个重要因素，其受到基因控制，且为加性-显性基因作用模式。

目前基因组学成为研究家畜性状的方法之一，利用基因组学技术对影响目标性状的基因进行预测，通过分子标记技术寻找影响目标性状的具体突变位点，对提高牧民经济收入，全面提高羊的产羔水平都具有现实的意义。国内外对于绵羊产羔数的SNP标记研究较少，多集中在BMP15、BMPR-IB、GDF9的功能基因方面的研究；其中对于影响吐鲁番黑羊产羔数SNP标记的研究未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种FSHR基因特异SNP标记、吐鲁番黑羊产羔数性状的检测方法及其应用。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种FSHR基因特异SNP标记，所述SNP标记来源于吐鲁番黑羊FSHR基因，所述SNP标记位于吐鲁番黑羊第3号染色体上第75320741位，原始碱基为C，变异碱基为T；所述SNP标记所在的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

作为优选，所述SNP位点的TT基因型个体的产羔数显著高于CC基因型个体的产羔数。

另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测上述SNP标记的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-4。

再一方面，本发明实施例提供了一种用于检测上述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒中包含上述引物。

又一方面，本发明实施例提供了上述SNP标记、上述引物或上述试剂盒在吐鲁番黑羊选育中的应用。

又一方面，本发明实施例提供了一种检测吐鲁番黑羊产羔数性状的方法，所述方法包括：通过对待测吐鲁番黑羊基因中的上述SNP标记进行检测来确定所述黑羊的产羔数性状。

作为优选，所述方法包括以下步骤：

提取待测吐鲁番黑羊的基因组DNA；

以所述DNA为扩增模板，以权利要求3所述的引物为扩增引物，进行竞争性等位基因特异性PCR分型，获得PCR分型结果CC型、CT型和TT型，根据分型结果确定SNP标记的所有基因型，根据所述基因型来判断所述待测吐鲁番黑羊的产羔数性状。

作为优选，所述SNP的基因型中，TT基因型个体的产羔数显著高于CC基因型个体的产羔数。

作为优选，所述PCR的反应条件：95℃预变性10min，95℃变性20s、循环10次，61-55℃延伸1min，95℃变性20s、循环26次，55℃延伸1min；

所述PCR的反应体系：

所述上游引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；

所述上游引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；

所述下游引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

又一方面，本发明实施例提供了一种吐鲁番黑羊产羔数性状相关SNP标记在吐鲁番黑羊选育中的应用，选择所述SNP标记中基因型为TT的个体，选育出产羔数多的吐鲁番黑羊品种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用选择信号检测方法及KASP技术的方法，即利用简化基因组的方法筛选出与绵羊产羔数性状相关的基因，通过KASP分型方法对FSHR基因的Chr3:g.75320741位点进行分型，确定此位点在吐鲁番黑羊群体中出现突变；确定突变的碱基位置，利用生物学统计软件SPSS19.0，对不同基因型间吐鲁番黑羊的产羔数进行显著性检验，经显著性检验分析判断该SNP位点是否显著影响了吐鲁番黑羊的产羔数，最终确定和筛选出影响吐鲁番黑羊产羔数的SNP标记。本发明方法中确定的基因型为CC、CT、TT，选择TT和CT基因型个体，淘汰CC基因型个体，选育提高吐鲁番黑羊产羔数，选育多胎羊品种，为新疆畜牧业的可持续发展提供了科学依据。

附图说明

图1是本发明实施例方法中采用一般线性模型的全基因组关联分析的曼哈顿图；

图2是本发明实施例方法中采用混合线性模型的全基因组关联分析的曼哈顿图；

图3是本发明实施例方法中两种模型的QQ-plot检测图；

图4是本发明实施例方法中吐鲁番黑羊DNA检测凝胶电泳图；

图5A-5C是本发明实施例方法FSHR基因(Chr3:g.75320741位点C>T)的分型结构图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

本发明实施例中涉及的专业术语解释如下：

本发明SNP标记来源于吐鲁番黑羊FSHR基因，即促卵泡激素受体(FSHR)是G蛋白偶联受体超家族的糖蛋白家族成员，在动物卵泡发育中起重要作用，FSHR在超排羔羊和正常羔羊卵巢主要表达于卵泡颗粒细胞，且在原始卵泡就有阳性信号存在，正常成年羊在原始卵泡没有阳性信号存，在大的优势卵泡中FSHR的表达量降低。

KASP：其是竞争性等位基因特异性PCR的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中对SNPs和特定位点上的lnDels进行精准的双等位基因判断，从而进行基因分型；这项技术是基于引物末端碱基的特异性匹配来对SNP分型以及检测lnDels；使用中需要准备两条末端碱基不同的等位基因正向引物和一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序。KASP高通量基因分型技术拥有更高的通量、更快的速度、更低的成本及更准确的结果。

SLAF-seq测序技术：即特异性位点扩增片段测序，其是一套简化基因组测序技术，SLAF技术一起有效reads长、通量高、方案设计灵活等特点代表了简化基因组测序上的一次革命，带来了2x100bp的有效基因组读长，提供前所未有的酶切方案定制服务，并一次开发高达1万个标签，获取全基因组范围内最完整的变异图像(SNPs、lnDels)，让研究者可以选择最具有信息量和可靠的多态性标记，以实现重要农艺性状功能基因定位的卓越能力。

实施例1

试剂及仪器设备：磁力架(Life Technologies DynaMagTM-2)；

离心机(eppendorf Centrifuge 5424)；Douglas Scientific NEXAR；DouglasScientific Soellex；Douglas Scientific ARRAY；均由百迈客生物有限公司提供；

mix：KASP 2×Master Mix KBS-1016-011 1536FormulationV4.0(LGC公司提供)。

具体实验步骤如下：

(1)吐鲁番黑羊繁殖性状的筛选

基于吐鲁番黑羊参考基因组，利用SLAF-seq测序技术，经过Plink1.9软件质控后，利用一般线性模型和混合线性模型的方法进行全基因组关联分析，如图1-图2所示，在两种方法中均选择top1％的SNP位点，如图3中，两种方法均筛选出差异SNP位点；通过对选择的位点进行基因注释，筛选出FSHR基因可能是影响产羔性状的基因。

(2)吐鲁番黑羊基因组DNA的提取

利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集吐鲁番黑羊颈静脉血5ml，-20℃保存；利用试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存待用，基因组DNA检测结果见图4所示的凝胶电泳图。

(3)引物设计与合成

根据吐鲁番黑羊的FSHR基因(GenBank ID:443299)，参照所述SNP标记所在的核苷酸序列为SEQ ID NO.1利用prime3软件设计引物，在上海生物工程技术有限责任公司合成引物。

所述SNP标记所在的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：

CCTCACCTACCCCAGCCACTGCTGTGCCTTCGCAAACTGGAGGCGGCAAA

[C/T]GTGAGTGAGTCTTCCCTGTCCAGCCCTTGAGCCCTGTTTGGGCATTTCTC；

上述[C/T]表示突变碱基。

引物序列如下：

FSHR基因：

SEQ ID NO.2

上游引物1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATATTTCAAGAACCAGGATCCA-3’

SEQ ID NO.3

上游引物2:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATATTTCAAGAACCAGGATCCG-3’

SEQ ID NO.4

下游引物1:5’-CAGCTTCTTAAGATTTTCTAAGCC-3’

PCR扩增见表1和表2所示。

表1.PCR扩增反应体系

反应物	体积
		2×Master Mix	2.5uL
引物	0.07uL
		DNA	30-50ug
水	补足5uL

表2.PCR扩增反应程序

(4)KASP分型

基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，利用英国LGC公司的Douglas平台，对SNPs进行双等位基因判断，从而进行基因分型；发现FSHR基因的Chr3:g.75320741位点在吐鲁番黑羊群体中突变为3种基因型；见图5A-图5C。

(5)关联分析及应用

利用软件SPSS19.0，对检测的FSHR基因SNP位点产生3种基因型：TT、CT、CC与吐鲁番黑羊的产羔数进行差异显著性检验，见如表3。

表3.PCR扩增反应程序

注：Mean±SD表示平均值±标准差；同行数据，肩标为不同小写字母时，表示差异显著(P<0.05)。

从表3中可以看出，FSHR基因的SNP位点与吐鲁番黑羊产羔数密切相关，TT基因型产羔数比CC型多，两者之间差异显著(P＜0.05)。

在实际生产应用中，可通过选择基因型为TT、CT的个体，淘汰基因型为CC的个体，提高吐鲁番黑羊的产羔数，加快新疆专门化多羔羊品种的培育。

本发明通过实施例1的方法确定了上述SNP分子标记来源于吐鲁番黑羊FSHR基因，具体位置为Chr3:g.75320741位点C>T(碱基C突变为碱基T)，其中，基因型TT的个体产羔数显著高于基因型CC的个体产羔数；本发明通过发现上述SNP分子标记可用来鉴定和筛选产羔数相对较多的羊品种。

本发明将上述SNP标记用于鉴定产羔数性状，同时也开发出可用于检测上述SNP标记的引物，两条正向引物(SEQ ID NO.2-3)和一条反向引物(SEQ ID NO.4)：

上游引物1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATATTTCAAGAACCAGGATCCA-3’

上游引物2:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATATTTCAAGAACCAGGATCCG-3’

下游引物1:5’-CAGCTTCTTAAGATTTTCTAAGCC-3’。

本发明可根据上述SNP标记制备一种用于检测产羔数性状的试剂盒。

本发明上述SNP标记、引物、试剂盒均可应用于检测产羔数性状或吐鲁番黑羊育种领域。

本发明可采用上述SNP标记、引物或试剂盒来检测吐鲁番黑羊的产羔性状，从中筛选出基因型TT个体作为多产品种，进而应用于吐鲁番黑羊育种中。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> FSHR基因特异SNP标记、吐鲁番黑羊产羔数性状的检测方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctcacctac cccagccact gctgtgcctt cgcaaactgg aggcggcaaa ctgtgagtga 60

gtcttccctg tccagccctt gagccctgtt tgggcatttc tc 102

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tgatatttca agaaccagga tcca 44

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tatatttcaa gaaccaggat ccg 43

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagcttctta agattttcta agcc 24

Claims

1.一种FSHR基因特异SNP标记，其特征在于，所述SNP标记来源于吐鲁番黑羊FSHR基因，所述SNP标记位于吐鲁番黑羊第3号染色体上第75320741位，原始碱基为C，变异碱基为T；所述SNP标记所在的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的一种FSHR基因特异SNP标记，其特征在于，所述SNP位点的TT基因型个体的产羔数显著高于CC基因型个体的产羔数。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-4。

4.一种用于检测权利要求1或2所述SNP标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求3所述的引物。

5.权利要求1或2所述的SNP标记、权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒在吐鲁番黑羊选育中的应用。

6.一种检测吐鲁番黑羊产羔数性状的方法，其特征在于，所述方法包括：通过对待测黑羊基因中SNP标记进行检测来确定所述黑羊的产羔数性状；其中，所述SNP标记为权利要求1或2所述的SNP标记。

7.如权利要求6所述的一种检测吐鲁番黑羊产羔数性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

提取待测吐鲁番黑羊的基因组DNA；

8.如权利要求7所述的一种检测吐鲁番黑羊产羔数性状的方法，其特征在于，所述SNP的基因型中，TT基因型个体的产羔数极显著高于CC基因型个体的产羔数。

9.如权利要求6所述的一种检测吐鲁番黑羊产羔数性状的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件：95℃预变性10min，95℃变性20s、循环10次，61-55℃延伸1min，95℃变性20s、循环26次，55℃延伸1min；

所述PCR的反应体系：

所述上游引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；

所述上游引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；

所述下游引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

10.权利要求1或2所述的一种吐鲁番黑羊产羔数性状的SNP标记在吐鲁番黑羊选育中的应用，其特征在于，选择所述SNP标记中基因型为TT的个体，选育出产羔数多的吐鲁番黑羊品种。