CN105969845A

CN105969845A - 眼肌面积性状相关基因svep1的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN105969845A
Application number: CN201610268222.0A
Authority: CN
Inventors: 李长春; 罗文哲; 邹成; 李菁璇; 张皓源; 吴宇; 胡岸; 赵书红; 余梅; 李新云
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2036-04-27
Also published as: CN105969845B

Abstract

本发明涉及猪分子标记制备领域，具体地指一种眼肌面积性状相关基因SVEP1的分子标记及其应用。本发明利用SVEP1基因序列中包含一个SNP位点，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1的第44660bp处，该位点为A/G的碱基突变，导致SfanⅠ‑RFLP多态性。这个碱基突变位于SVEP1基因第3内含子中，不改变其翻译的氨基酸序列。故在SVEP1基因序列的SNP位点附近设计引物，得到分子标记序列SEQ ID NO.2，从而鉴定眼肌面积性状。本专利利用现有的PCR‑RFLP技术，在SVEP1基因第44660bp处发现一个A/G突变，且发现此多态位点与眼肌面积性状显著相关，对猪生长性状的研究有一定帮助。

Description

眼肌面积性状相关基因SVEP1的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及猪分子标记制备领域，具体地指一种眼肌面积性状相关基因SVEP1的分子标记及其应用。

背景技术

畜牧业在现代农业发展中占据着非常重要的地位，其在农业生产中所占有的比值通常用来衡量一个国家和地区发展程度的重要指标。猪肉作为我国最主要的肉类来源，生猪养殖产业在我国畜牧业中占据着举足轻重的地位。在20世纪80年代中期，我国肉类产量约2000万吨，猪肉约占85％，2012年猪肉产量达到了5335万吨，约占肉类总量63.63％。虽然猪肉所占比重逐渐下降，但其始终占据主导地位。

随着社会的发展和消费水平的提高，消费者对猪肉品质的要求日益增高，使猪肉生产者和猪育种者要更加关注胴体品质和肉质性状的改良。背膘薄、眼肌面积大一直以来都是猪育种工作中的重点目标性状，随着百年来的育种工作进展，肉品质优良成为我国地方猪种的优良特性之一。我国地方猪种甚至含地方猪种血统的培育品种及杂交品系都因其优良的肉品质，广受消费者欢迎。眼肌也叫背最长肌，是猪全身最鲜嫩的肉，营养丰富，味美，易消化。眼肌面积的遗传力也很强，与家畜产肉性能有强相关关系，眼肌面积越大，饲料利用率与瘦肉率也越高(蒋德旗,秦丽梅和朱丽岚.2015.维生素E添加对猪眼肌面积影响的分析.[J].食品工业(02),202-204.)。然而绝大多数胴体性状只能依靠屠宰法进行性能测定，传统选育方法很难取得较大遗传进展，分子标记辅助育种是肉质改良的有效途(刘欣.猪胴体性状全基因组关联分析及背膘厚主要基因筛选研究:[D].北京:中国农业大学,2014)。在猪的育种方法中大体可以分为三类，表型选择、基因型选择和标记辅助，表型选择阶段经历了很长时间，主要通过猪的外形来判断父系与母系猪不同的生产性能，使用方便但外形选择毕竟是一种“见好就收”的表型选择，没涉及遗传基础，因此遗传进展较慢；基因型选择阶段，随着对基因型有关理论的了解和计算机技术的发展，人们可以透过复杂的表面现象(表型与表型值)，剖析其遗传基础，估算其能遗传的部分。基因型选择相比表型选择阶段拥有更多遗传学理论支撑，选种选育更加科学，但由于存在世代间隔等原因，因此仍然有耗时长的缺点；标记辅助选择阶段，随着分子生物技术的发展,人们逐渐将DNA重组技术、转基因技术、分子标记技术用于猪育种领域，形成了分子育种技术。将有利基因的分子标记用于选种，形成了标记辅助选择。(柳小春.猪的分子育种及应用前景.猪业科学.2011(07):100-3.)通常情况下，眼肌面积一般通过屠宰法进行测量，可是在大规模育种中，该方法不但费时费力，而且只能测定宰后的个体，局限性很大。尽管目前A超、B超在测定活体猪眼肌面积方面有一定应用，但该测定结果易受到各方面影响，如：猪只无法完全保定、易受测量环境影响而产生应激等等，因此在规模化育种工作中利用此类方法会引入大量不准确因素，最终影响选育效果(杨秀娟，邓斌等.猪背膘厚与眼肌厚活体A超测量技术研究:[J].西北农林科技大学学报,2014,42(5):23-27；刘炜，吴昊昊等.猪活体背膘厚和眼肌面积不确定度评定:[J].上海畜牧兽医通讯,2013,6:77)。

SVEP1基因在2006年被Shur I等发现在骨骼组织、骨膜、骨髓以及骨髓间叶基质细胞中表达，在肌肉和软骨中表达很低或不表达，可作为CAMs的组分调节细胞间黏附作用(Shur I,Socher R,Hameiri M,Fried A,Benayahu D.Molecular and cellularcharacterization of SEL-OB/SVEP1in osteogenic cells in vivo and in vitro[J].JCell Physiol,2006Feb；206(2):420-7)。随后，Glait-Santar C等发现SVEP1基因参与间叶细胞的粘附过程，可以传导微环境中与细胞活性相关的信号，该基因在肌原细胞融合和肌管形成过程中表达，表达量随着肌管成熟而减少(Shefer G,Benayahu D.SVEP1is a novelmarker of activated pre-determined skeletal muscle satellite cells[J].StemCell Rev.2010Mar；42-9)。2012年，Glait-Santar C等发现SVEP1module在骨骼组织和各种乳腺癌细胞中表达，参与调控骨骼微环境的交互网络，是骨小生境中生理病理交互的调节因子(Glait-Santar C,Pasmanik-Chor M,Benayahu D.Expression pattern ofSVEP1alternatively-spliced forms[J].Gene.2012Aug；137-45)。最新研究表明，SVEP1基因参与到脂肪酸储存以及葡萄糖代谢过程(Kokosar M,Benrick A,Perfilyev A,FornesR,Nilsson E,Maliqueo M,Behre CJ,Sazonova A,Ohlsson C,Ling C,Stener-VictorinE.Epigenetic and Transcriptional Alterations in Human Adipose Tissue ofPolycystic Ovary Syndrome[J].Sci Rep.2016Mar 15；6:22883)，推测SVEP1可能通过控制肌原细胞的早期分化来控制肌纤维的形成与成熟，改变肌纤维束的状态，从而影响眼肌面积。因此可以研究SVEP1基因是否对猪眼肌面积性状产生影响，这对改良猪的经济性状和分子标记辅助育种有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供了一种眼肌面积性状相关基因SVEP1的分子标记及其应用。本申请中，我们发现SVEP1基因中的一个SNP位点，该位点与眼肌面积显著相关，因此可以用作群体育种的分子标记，可以进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性，因此在动物育种中具有广阔的应用价值。本发明利用该分子标记可迅速预测不同基因型群体猪之间眼肌面积的差别，同时在猪育种工作中，该分子标记可作为眼肌面积的可靠标记，可以进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

为实现上述目的，本发明提供的一种眼肌面积性状相关基因SVEP1的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中，该分子标记的核苷酸序列的433bp处还有一个SNP位点G/A。

本发明提供了用于获得上述分子标记的引物对，所述引物对为：

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：

5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’。

本发明还提供了一种上述分子标记的获得方法，其特征在于：以具有SVEP1基因的猪基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：

5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

进行PCR扩增，其所获得的分子标记为SEQ ID NO.2。

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：

5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

进行PCR扩增，其中，具有579bp条带的猪，其具有SVEP1基因，如SEQ ID NO.1。

一种与胴体性状相关的分子标记的获得：

1)猪SVEP1基因的引物设计与部分DNA序列扩增

用猪SVEP1基因序列信息(GenBank收录号：ENSSSCG00000005455)作为引物设计的模板序列，利用生物学引物设计软件Oligo7.0设计引物，引物序列如下：

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

2)PCR扩增反应：

利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒(购自美国invitrogen公司)从纯种美系大白阉割猪实验群体(该群体来源于湖北金林育种场，)(屠宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计207头，全部为美系纯种大白阉割公猪)耳组织中提取基因组DNA，具体操作方法参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。

PCR反应：PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,PCRmix 5μl，最后加入去离子水至总体积10μl；PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环31次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸36s；最后72℃延伸5min；PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分SVEP1片段，长度为579bp，其序列为SEQ IN NO.2所示。

3)PCR产物的纯化、测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自北京百泰克公司)纯化PCR产物。将纯化后的DNA溶液送至铂尚生物技术有限公司正反向测序。

用引物扩增猪基因组DNA得到了579bp特异性扩增片段，如图2所示，正反向测序结果发现该片段所在的SVEP1基因(SEQ ID NO.1所示)的第44660位置发现一个A-G转换(如图3所示)，造成一个Sfan I酶切位点(GCATC(N5)^)。

本发明还提供了一种上述分子标记在猪胴体性状相关分子标记辅助育种中的应用。其应用方法如下：

采集样品的肩部背膘厚、失水率、PH1均值、眼肌面积、平均日增重及剩余采食量6项指标。根据采集样品的群体结构，运用混合模型来统计分析SVEP1基因SNP位点的基因型效应及其与上述6项性状之间的关系：

Y_ij＝μ+genotypei+ε_ij+G

其中，Y_ij为处理后性状值，μ为总体均值，εij为随机误差，G为批次效应，假定服从N(0，σ²)分布。即可分析出基因型效应，完成基因型效应的多重性比较。采用R语言软件(version：3.2.3)进行数据处理与统计分析。

统计分析发现该基因的A/G突变基因型，AG型与GG型的不同与眼肌面积显著相关(P＝0.0287)，与失水率、PH1均值、平均日增重及剩余采食量不显著相关。通过最小二乘均数对基因型为AA、GG、AG的个体进行两两比较，结果表明GG型基因型个体眼肌面积显著高于AG型基因型个体，AA型基因型个体与其他两种基因型个体之间无显著差异，此外，AA、GG、AG三种基因型个体之间在背膘厚性状上存在显著差异(p＝0.0034)，最小二乘均数比较发现GG型个体背膘厚有高于AG型个体的趋势，但未达到显著水平。

本发明还提供了一种上述分子标记的引物对在猪胴体性状相关分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种鉴定含有SVEP1基因的猪的方法，包括以下步骤：

1)引物对：

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：

5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

2)PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中待测猪基因组DNA模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,PCRmix 5μl，最后加入去离子水至总体积10μl；

3)PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环31次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸36s；最后72℃延伸5min；PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测；

4)RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物2μl，去离子水6.6μl，10×buffer 1μl，限制性内切酶Sfan I为0.4μl，将样品混匀后离心，36℃培养箱放置2h，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照；

SEQ ID NO.2序列中存在两个酶切位点，一个固有酶切位点位于155bp处，另外一个由于SNP突变产生的酶切位点位于433bp处。酶切产生三种基因型，AA基因型有155bp和424bp两条带，杂合子AG基因型有146bp、155bp、278bp和424bp四条带(由于155bp和146bp片段长度相差很小，这两条带会混合在一起，所以在紫外灯下拍照只显示出三条带，但不影响分辨基因型)，GG基因型有146bp、155bp和278bp三条带(由于146bp和155bp片段长度相差很小，这两条带会混合在一起所以在紫外灯下拍照只显示出两条带，但不影响分辨基因型)。

本发明原理

SVEP1基因序列中包含一个SNP位点，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1的第44660bp处，该位点为A/G的碱基突变，导致Sfan I-RFLP多态性。这个碱基突变位于SVEP1基因第3内含子中，不改变其翻译的氨基酸序列。故在SVEP1基因序列的SNP位点附近设计引物，得到分子标记序列SEQ ID NO.2，从而鉴定眼肌面积性状。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明利用现有的PCR-RFLP技术，在SVEP1基因第44660bp处发现一个A-G突变，且发现此多态位点与眼肌面积性状显著相关，对猪胴体性状的研究有一定帮助。

附图说明

图1为一种本发明技术流程图。

图2为猪SVEP1基因基因组扩增电泳结果示意图。

M：DL2000分子量标记。

图3为本发明中猪SVEP1基因测序发现的A>G突变。

图4为猪SVEP1基因外显子的Sfan I-RFLP的三种基因型(AA GG AG)电泳结果示意图。

M：2000bp DNA分子量标记。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

一种与眼肌面积性状相关的分子标记的获得：

1)猪SVEP1基因的引物设计与部分DNA序列扩增

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

2)PCR扩增反应：

利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒(购自美国invitrogen公司)从纯种美系大白阉割猪实验群体(该群体来源于湖北金林育种场)(屠宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计207头，全部为美系纯种大白阉割公猪)耳组织中提取基因组DNA，具体操作方法参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。

3)PCR产物的纯化、测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自北京百泰克公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是按照100mg胶块加入400μl GS Buffer的比例加入GS Buffer，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500μl Wash Buffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μl Wash Buffer溶液洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心1min；小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管(DNA溶液)置于-20℃保存备用。将纯化后的DNA溶液送至铂尚生物技术有限公司正反向测序。

用引物扩增猪基因组DNA得到了579bp特异性扩增片段，如图2所示，正反向测序结果发现该片段所在的SVEP1基因(SEQ ID NO.1所示)的第44660位发现一个A-G转换(如图3所示)，造成一个Sfan I酶切位点(GCATC(N5)^)。

实施例2：

一种基于与眼肌面积性状相关的分子标记的检测方法，其步骤如下：

PCR-RFLP诊断方法建立

1)引物序列

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

该引物扩增片段长度579bp，其序列为SEQ ID NO.2所示。

2)PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中待测猪基因组DNA模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,PCRmix 5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环31次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸36s；最后72℃延伸5min；PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

3)RFLP检测

实施例3

一种与眼肌面积性状相关的分子标记在不同猪群体多态性检测中的应用，其步骤是：

利用PCR-Sfan I-RFLP检测了纯种美系大白阉割猪实验群体(该群体来源于湖北金林育种场)(207个美系纯种大白阉割公猪群体)。该突变位点在实验群体中的基因型和基因频率如表1所示，检测结果显示，SVEP1基因在实验群体中存在三种基因型，其中AA型个体有47头，AG型个体有99头，GG型个体有61头，酶切分型的检测结果与测序结果相符,本发明的检测方法可靠。此结果表明SVEP1基因在纯种美系大白阉割猪实验群体中等位基因G占优势。

实施例4

一种眼肌面积性状相关的分子标记与胴体性状的关联分析

本实施例的猪群来自本湖北金林育种场纯种美系大白阉割猪，屠宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计207头，全部为美系纯种大白阉割公猪。

所分析的性状主要是部分生长性状及与饲料转化效率性状相关的性状，包括：背膘厚、失水率、PH1均值、眼肌面积、平均日增重及剩余采食量6项指标。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析SVEP1基因SNP位点的基因型效应及其与部分生长和胴体性状的关系：

Yij＝μ+genotypei+ε_ij+G

其中，Yij为处理后性状值，μ为总体均值，εij为随机误差，G为批次效应，假定服从N(0，σ²)分布。即可分析出基因型效应，完成基因型效应的多重性比较。采用R语言软件(version：3.2.3)进行数据处理与统计分析。

对猪SVEP1基因Sfan I-RFLP多态性位点与部分生长及胴体性状进行关联分析，由表1知：在207个个体中AA型个体有47头，AG型个体有99头，GG型个体有61头。

本实施例采用R语言软件中的广义线性模型对猪SVEP1基因的A>G突变位点的多态在美系大白阉割猪群体中对部分生长及肉质性状进行了初步的关联分析。初步分析结果见表1。统计分析发现该基因的A/G突变基因型，AG型与GG型的不同与眼肌面积显著相关(P＝0.0287)，与失水率、PH1均值、平均日增重及剩余采食量不显著相关。通过最小二乘均数对基因型为AA、GG、AG的个体进行两两比较，结果表明GG型基因型个体眼肌面积显著高于AG型基因型个体，AA型基因型个体与其他两种基因型个体之间无显著差异，此外，AA、GG、AG三种基因型个体之间在背膘厚性状上存在显著差异(p＝0.0034)，最小二乘均数比较发现GG型个体背膘厚有高于AG型个体的趋势，但未达到显著水平。

表1SVEP1基因多态性位点基因型与部分生长性状及胴体性状的关联分析检测

注：表中的性状均值为平均数±标准差。RFI：剩余采食量。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种眼肌面积性状相关基因SVEP1的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中，该分子标记的核苷酸序列的433bp处还有一个SNP位点G/A。

2.用于获得权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对为：

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：

5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’。

3.按权利要求1或2所述分子标记的获得方法，其特征在于：以具有SVEP1基因的猪基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：

5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

进行PCR扩增，其所获得的分子标记为SEQ ID NO.2。

4.按权利要求1或2所述分子标记的获得方法，其特征在于：以具有SVEP1基因的猪基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：

5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

5.权利要求1所述的分子标记在猪胴体性状相关分子标记辅助育种中的应用。

6.权利要求2所述的分子标记的引物对在猪胴体性状相关分子标记辅助育种中的应用。

7.一种鉴定含有SVEP1基因的猪的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)引物对：

正向引物：5’-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3’；

反向引物：

5’-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAACATC-3’；

2)PCR扩增条件

4)RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物2μl，去离子水6.6μl，10×buffer 1μl，限制性内切酶SfanⅠ为0.4μl，将样品混匀后离心，36℃培养箱放置2h，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照；

SEQ ID NO.2序列中存在两个酶切位点，一个固有酶切位点位于155bp处，另外一个由于SNP突变产生的酶切位点位于433bp处。酶切产生三种基因型，AA基因型有155bp和424bp两条带，杂合子AG基因型有146bp、155bp、278bp和424bp四条带，GG基因型有146bp、155bp和278bp三条带。