CN110438243A

CN110438243A - 延边黄牛肉质相关的fabp4基因snp分子标记、引物对、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110438243A
Application number: CN201910764085.3A
Authority: CN
Inventors: 夏广军; 徐红艳; 徐畅; 邵静; 尹宝珍
Original assignee: Yanbian University
Current assignee: Yanbian University
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2039-08-19
Also published as: CN110438243B

Abstract

本发明提供了延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用，属于黄牛肉质筛选技术领域。FABP4基因SNP分子标记，含有位于FABP4基因第3496bp的多态性为A/C位点、第3533bp的多态性为A/T位点、第3711bp的多态性为G/C位点、第3745bp的多态性为T/C位点和第3767bp的多态性为T/C位点的核苷酸序列。上述5个多态性位点位于第三外显子，且处于强连锁不平衡状态，具有相似的遗传效应。应用于筛选育肥牛时，当基因型为杂合基因型时，选择脂肪含量和大理石花纹等级作为筛选育肥牛的检测指标。

Description

延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于黄牛肉质筛选技术领域，具体涉及延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用。

背景技术

随着生活水平的不断提高，人们对肉品质提出了更高的要求，不仅要求肉质鲜嫩、口味好，而且要求肉品质符合绿色食品的标准，因此世界各国对肉品质进行了广泛的研究。“高档牛肉”、“育肥牛”已成为当前的消费时尚。

牛肉品质涉及多项指标，每个国家对高档牛肉的定义是不同。一般把色泽、新鲜度好、脂肪含量高、大理石状明显、嫩度好、食用价值高的牛肉称为“高档牛肉”。国外肉牛业发达国家都有符合各国高档牛肉生产的肉质等级评定标准，具有代表性的是美国和日本的肉质等级评定标准。美国依据生理成熟度和肋眼肌肉的大理石纹脂肪含量将牛肉分成极佳级、特选级、可选级、合格级、商用级、可用级、切块级、制罐级八级。只有极佳级和特选级可作为高档牛肉。生理成熟度以年龄决定，年龄越小肉质越嫩，级别越高，共分为A、B、C、D和E5级。大理石纹是决定牛肉品质的主要因素，因而品质的评定以大理石纹为代表。大理石纹的测定部位为第12肋骨眼肌横切面，以标准板为依据，分为丰富、适量、适中、少、较少、微量和几乎没有这七个级别。当生理成熟度和大理石纹决定后就可判定其等级了，年龄愈小，大理石纹愈丰富级别愈高，反则越低。日本和牛肉分级包括三个产肉率等级A、B、C(A良好、B一般、C差)和五个肉质等级(从高到低为5、4、3、2、1，5级最高)。产肉率等级评定依据产肉率方程。肉质等级评级项目包括肉色、脂肪颜色和光泽、紧凑度、大理石花纹。评定结果表示为A1、A2、A3、A4、A5，5个级别，A5为最高级别。只有A4级以上作为高档牛肉。我国肉牛饲养业起步较晚，尚未形成独立的产业，因此尚无统一的标准。南京农业大学、中国农科院畜牧所和中国农业大学共同制定了中国牛肉等级标准。牛肉质量等级评定在牛胴体冷却排酸后进行，以12～13脊肋处背最长肌截面的大理石花纹和牛的生理成熟度为主要评定指标，以肉色、脂肪色为参考指标。根据眼肌横切面的肌间脂肪的多少将大理石花纹等级划分如下：肌间脂肪极丰富为1级，丰富为2级，少量为3级，几乎没有4级，介于两者之间设为0.5级。根据脊椎骨(主要是最后三根胸椎)棘突末端软骨的骨质化程度和门齿变化情况将生理成熟度分为A、B、C、D和E五个级别。肉色和脂肪色分别设有9个级别，其中肉色以3、4两级为好，脂肪色以1、2两级为好。大理石花纹越多，生理成熟度越小，即年龄越小，牛肉级别越高。此外，可根据肉色和脂肪色对等级作适当调整。但此标准在肉牛生产中应用性不强。为了适应消费市场需求及生产的便利化，不同的肉牛品种、不同的牛肉生产企业均制定了各自的高档牛肉等级标准。延边黄牛牛肉生产实践中高档牛肉等级评定标准主要依据大理石花纹评分。肉眼观察第12～13胸肋肌肉横切面，对照牛肉大理石花纹等级评定图谱确定眼肌大理石花纹等级(图8)。按6个等级进行评定。1级最好，6级最差。可根据肌内脂肪含量对等级作适当调整：1级：大理石花纹丰厚，肌内脂肪含量13％或以上；2级：大理石花纹较丰厚，肌内脂肪含量11％～13％；3级：大理石花纹适度，肌内脂肪含量4％～11％；4级：大理石花纹中等，肌内脂肪含量3％～4％；5级：大理石花纹轻度或少量，肌内脂肪含量2.5％～3％；6级：大理石花纹微量或无，肌内脂肪含量2.5％或以下。

延边黄牛是我国五大地方优良品种之一，具有耐寒、耐粗饲、抗病力强、适应性强、屠宰率高、肉质优良等特点，是我国畜禽品种基因库中一份及其珍贵的财富。近些年延边黄牛肉用新品系和新品种的培育，加速了延边黄牛的产业化进程，而由于延边黄牛重要经济性状相关基因和遗传标记研究工作的滞后，国内外先进的分子育种技术的快速发展，并未在延边黄牛品种选育过程中得到高效利用。因此，利用分子标记对高档育肥牛进行早期选择，对高档牛肉生产具有重要意义。

基因多态性是一种与生物性状有密切相关的一种分子标记，通过与生物性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高筛选准确性的目的。脂肪酸结合蛋白4(FABP4)为脂肪酸结合蛋白家族(fatty acidbinding protein，FABPs)的一员，又称为脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acidbinding protein，A-FABP)，FABP4基因在脂肪组织中表达水平相对较高，在成熟的脂肪细胞中，FABP4是尤为重要的胞质蛋白。主要分布在动物脂肪、骨骼肌和心肌细胞中，可与脂肪酸结合，促进游离脂肪酸转运，参与细胞内脂质代谢。FABP4是脂肪细胞和巨噬细胞中表达水平较高的一种脂质分子伴侣，对动物的新陈代谢可有效的进行调控。

目前，对FABP4基因在不同的物种上的多态性检测研究较多。罗桂芬等在鸡的FABP4基因上进行了多态性检测，结果发现的多个突变位点均显著影响鸡肌内脂肪含量等性状。张海波等对不同鸭品种群体的FABP4基因进行多态性检测。Gerbens等对猪FABP4基因进行了大量的研究，多个研究结合证实了FABP4基因为主要影响猪肌内脂肪沉积的候选基因。魏胜娟研究表明，FABP4基因在转录水平正向调控ADIPOQ(adiponectin)与LEP(leptin)基因的表达，在牛的脂肪细胞脂质代谢调控网络中起着重要作用。由以上研究可知，FABP4基因在动物基因多态性与肉质性状分析上有广泛的研究空间。但是目前还没有关于延边黄牛FABP4基因多态性及其相关的生物性状的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的延边黄牛FABP4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用，所述SNP分子标记与延边黄牛的牛肉品质性状相关。

本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记，含有位于FABP4基因第3496bp的多态性为A/C位点、第3533bp的多态性为A/T位点、第3711bp的多态性为G/C位点、第3745bp的多态性为T/C位点、第3767bp的多态性为T/C位点的核苷酸序列。

优选的，含有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的第138位多态性为A/C位点，第175位的多态性为A/T位点、第353位多态性为G/C位点，第387位的多态性为T/C位点和第409bp的多态性为T/C位点。

本发明提供了一种用于扩增延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种用于检测延边黄牛肉质的试剂盒，包括所述的引物对。

优选的，还包括2×TaqPCRMastermix。

本发明还提供了所述的FABP4基因SNP分子标记、所述的引物对或所述试剂盒在辅助筛选延边黄牛育肥牛中的应用。

优选的，所述筛选延边黄牛育肥牛的方法，包括以下步骤：

1)以延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，用所述的引物对进行普通PCR扩增，得到扩增产物；

3)将步骤2)中扩增产物进行测序，得到片段序列；

4)根据所述片段序列中FABP4基因的多态性确定具体基因型；

5)根据不同种类的基因型判断延边黄牛育肥牛的指标：

当基因型为杂合基因型时，选择脂肪含量和大理石花纹等级作为筛选检测指标。

优选的，步骤2)中普通PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

优选的，步骤2)中普通PCR扩增的反应体系：2×TaqPCRMastermix 10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O补充至20μl。

本发明提供一种延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记，含有位于FABP4基因第3496bp的多态性为A/C位点、第3533bp的多态性为A/T位点、第3711bp的多态性为G/C位点、第3745bp的多态性为T/C位点、第3767bp的多态性为T/C位点的核苷酸序列。所述FABP4基因SNP分子标记的5个多态性位点位于第三外显子，经连锁不平衡(LD)分析发现，5个SNP位点处于强连锁不平衡状态，具有相似的遗传效应。其中第3533bpA/T位点与第3767bp T/C位点、第3711bp G/C位点与第3745bp T/C位点为连锁完全不平衡(r²值为1)，可作为一个整体遗传，观察一个标记位点便可得到另一个标记的全部信息。FABP4基因遗传效应统计分析，FABP4基因第3496bpA/C位点、第3533bpA/T位点、第3711bp G/C位点、第3745bp T/C位点、第3767bp T/C位点均为中度多态。经FABP4基因多态性与肉质性状关联分析，第3496bpA/C位点与延边黄牛的肌内脂肪含量和大理石花纹显著相关，表现为AC基因型的肌内脂肪含量显著高于AA型和CC型，AC基因型的大理石花纹显著优于CC基因型；第3533bpA/T位点与延边黄牛肌内脂肪含量和大理石花纹显著相关，表现为AT基因型的肌内脂肪含量显著高于AA型和TT型，AT基因型的大理石花纹显著优于TT基因型；第3691bp G/A位点与延边黄牛肌内脂肪含量显著相关，表现为GA基因型的肌内脂肪含量显著高于GG型和AA基因型。第3711bp G/C位点与延边黄牛的肌内脂肪含量和大理石花纹显著相关，表现为GC基因型的肌内脂肪含量显著高于GG型和CC基因型，GC型的大理石花纹要优于CC基因型；第3745bp T/C位点与延边黄牛的肌内脂肪含量和大理石花纹显著相关，表现为TC基因型的肌内脂肪含量显著高于TT型和CC基因型，TC基因型的大理石花纹显著优于CC型；第3767bp T/C位点显著影响延边黄牛的肌内脂肪含量和大理石花纹显著相关，表现为TC基因型的肌内脂肪含量显著高于TT型和CC型，TC基因型的大理石花纹显著优于CC基因型。即当基因型为杂合基因型时，选择脂肪含量和大理石花纹等级作为筛选优质育肥牛的检测指标。

附图说明

图1为本发明中提取基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2为FABP4基因SNP分子标记的扩增；

图3为FABP4基因3496bpA/C位点扩增产物测序峰图；

图4为FABP4基因3533bpA/T位点扩增产物测序峰图；

图5为FABP4基因3711bp G/C位点扩增产物测序峰图；

图6为FABP4基因3745bp T/C位点扩增产物测序峰图；

图7为FABP4基因3767bpT/C位点扩增产物测序峰图；

图8为大理石花纹评级图谱，其中1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别；

图9为FABP4基因SNPs连锁不平衡分析结果。

具体实施方式

本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记，含有位于FABP4基因第3496bp的多态性为A/C位点、第3533bp的多态性为A/T位点、第3711bp的多态性为G/C位点、第3745bp的多态性为T/C位点、第3767bp的多态性为T/C位点的核苷酸序列。在本发明中，所述FABP4基因SNP分子标记优选含有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列(acccctatgatgctattccacataaatttattatctatattctttcacagtatttttttttcaaatgcatgtttgtataatattctgatcataatatacatgtaattttgtatgttgtttttggcattcattgttttcttttgcaacattttcttgtaatttagaattgctaagtacctcaaaataagcaaataaaagcactctattttttttccctccatcattgtaatcacttttaattatccccacagagcatcgtaaacttagatgaaggtgctctggtacaagtacaaaactgggatggaaaatcaaccaccataaagagaaaactcgtggatgataagatggtgctcgtgagtatcttctcactacttaattctagatttcagtgctaggtcatcccataatcgttatcctacctagagaaatagacaatcgcccttgtagaatgaaaagttagtctattgggattatggtttcactctgacaattatccttctaagctccgtctaggtatactgtgcccccagcagtattttcttatccctctcaatgtgaaccgtat)，所述核苷酸序列的138位多态性为A/C位点，175位的多态性为A/T位点、353位多态性为G/C位点，387位的多态性为T/C位点和409bp的多态性为T/C位点。在本发明中，所述FABP4基因SNP分子标记的片段优选采用基因合成或PCR扩增的方法得到。本发明对所述基因合成的方案没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因合成公司即可。

本发明提供了一种用于扩增延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。本发明对所述引物对的合成方法没有特殊限制，委托本领域所熟知的基因合成公司合成即可。在本发明实施例中，所述引物对的来源委托生工生物技术有限公司(上海)公司合成。

本发明提供了一种用于检测延边黄牛育肥牛的试剂盒，包括所述的引物对。所述试剂盒优选还包括2×Taq PCR Mastermix。本发明对所述引物对的浓度和体积的用量没有特殊限制，采用本领域所熟知的用量和浓度均可。所述2×Taq PCR Mastermix包括以下组分：PCR缓冲液、Mg²⁺、Taq聚合酶、dNTPs等组分。本发明对所述2×TaqPCR Mastermix的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的2×Taq PCR Mastermix的来源即可。在本发明中，所述2×TaqPCRMastermix购自大连宝生物公司。

本发明提供了所述的FABP4基因SNP分子标记、所述的引物对或所述试剂盒在辅助筛选延边黄牛育肥牛中的应用。

在本发明中，所述筛选延边黄牛育肥牛肉质的方法，优选包括以下步骤：

1)以延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

3)将步骤2)中扩增产物进行测序，得到片段序列；

4)根据所述片段序列中FABP4基因的多态性确定具体基因型；

5)根据不同种类的基因型判断延边黄牛育肥牛的指标：

当基因型为杂合基因型时，选择脂肪含量和大理石花纹等级作为筛选育肥牛的检测指标；

本发明以延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA。所述提取基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因组DNA提取方法即可。在本发明实施例中，提取基因组DNA的方法采用试剂盒方法。所述试剂盒的种类为血液基因组DNA提取试剂盒，所述血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

得到基因组DNA后，本发明对基因组DNA进行质量检测。所述质量检测优选包括纯度检测和完整性检测。所述纯度检测优选在紫外分光光度计上进行，纯度检测的结果显示A₂₆₀/A₂₈₀值处于1.8左右，表明所提取的DNA质量较好。所述完整性检测是将基因组DNA进行电泳，电泳图中DNA分子条带具有很好的完整性并且很清晰、没有发生明显拖尾、没有降解和污染现象，符合下一步PCR扩增要求。

得到合格的基因组DNA后，本发明以提取的基因组DNA为模板，用所述引物对进行普通PCR扩增，得到扩增产物。

在本发明中，所述普通PCR扩增的反应程序优选如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。普通PCR扩增的反应体系优选如下：2×TaqPCRMastermix 10μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O补充至20μl。扩增产物的长度为565bp。

得到扩增产物后，本发明将所述扩增产物进行测序，得到片段序列。

在本发明中，所述测序委托基因测序公司进行。在本发明实施例中，测序是委托生工生物技术有限公司(上海)公司进行测序。

得到片段序列后，本发明根据所述片段序列中FABP4基因的多态性确定具体基因型。

根据片段序列的峰图判断基因型，例如在SEQ ID No.1中，FABP4基因138位出现两个不同碱基的套峰，则判断基因型为AC基因型(见图3-b)。当FABP4基因138位出现一个单峰A时，则判断为基因型为AA基因型(见图3-a)。当FABP4基因138位出现一个单峰C时，则判断为基因型为CC基因型(见图3-c)。

确定具体的基因型时，本发明根据不同种类的基因型判断育肥牛的指标：当基因型为杂合基因型时，选择脂肪含量和大理石花纹等级作为筛选育肥牛的检测指标。

在本发明中，延边黄牛牛肉的指标优选包括脂肪含量、大理石花纹评级。所述脂肪含量测定优选为索氏提取法。大理石花纹评级的方法优选参考大理石花纹评级图谱(图8)，观察背最长肌横切面，按6个等级评定延边黄牛大理石花纹等级，1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别。通过测定一定数量的延边黄牛的上述6个指标，得到每头延边黄牛的6个指标的数据。然后采用上述方法得到每头延边黄牛的基因型，与肉质性状进行关联分析。

在本发明中，3496bpA/C位点与延边黄牛的脂肪含量呈现显著相关，表现为AC基因型的脂肪含量显著高于AA型和CC型(P＜0.05)，AC基因型的大理石花纹显著优于CC基因型；第3533bpA/T位点与延边黄牛脂肪含量呈显著相关性，表现为AT基因型的脂肪含量显著高于AA型和TT型(P＜0.05)，AT基因型的大理石花纹显著优于TT基因型。第3711bp G/C位点显著影响延边黄牛的脂肪含量，表现为GC基因型的脂肪含量显著高于GG型和CC基因型(P＜0.05)，GC型的大理石花纹要优于CC基因型；3745bp T/C位点与延边黄牛的脂肪含量呈显著相关，表现为TC基因型的脂肪含量显著高于TT型和CC基因型(P＜0.05)，TC基因型的大理石花纹显著优于CC型；第3767bp T/C位点显著影响延边黄牛的脂肪含量，表现为TC基因型的脂肪含量显著高于TT型和CC型(P＜0.05)，TC基因型的大理石花纹显著优于CC基因型。

下面结合实施例对本发明提供的延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、样品采集

本试验牛群体选取吉林省延边畜牧开发集团有限公司延边黄牛阉牛70头，所有试验牛统一标准饲养条件育肥30月龄屠宰，按国家统一标准进行屠宰分割，屠宰前每头牛颈静脉采血25ml，加入抗凝剂，分装-20℃保存备用。

2、参照TIANGEN-血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取延边黄牛DNA样本。紫外分光光度计检测所提取的延边黄牛DNA样品的纯度，确定OD₂₆₀/OD₂₈₀值。琼脂糖凝胶电泳检测：用1％琼脂糖凝胶检测所提的延边黄牛DNA样本，根据片段长度电压电泳30min；凝胶成像系统观察。

紫外分光光度计检测结果显示A₂₆₀/A₂₈₀值处于1.8左右，表明所提取的DNA质量较好。将提取DNA进行电泳，电泳图见图1，DNA分子条带具有很好的完整性并且很清晰、没有发生明显拖尾、没有降解和污染现象，符合下一步PCR扩增要求。

3、DNA扩增引物的选择与设计

参照NCBI提供的牛FABP4基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计FABP4引物(NC_007312.4)，送至生工生物技术有限公司(上海)进行合成。引物序列见表1。

表1基因引物信息

注：F:正向引物，R:反向引物。

4、PCR扩增与产物测序

在冰盒上按照表2反应体系配制溶液。

表2 PCR扩增反应体系

PCR扩增程序：预变性95℃5min；变性94℃30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用凝胶成像系统观察其扩增结果。以延边黄牛血液DNA为模板，扩增FABP4基因，结果显示，FABP4基因引物所扩增出来的片段与所预期的片段长度吻合，可以应用于接下来的测序分析中(见图2)。

5、PCR扩增产物测序

将所有PCR扩增产物及相应引物分装送至生工生物技术有限公司(上海)进行测序。

将扩增FABP4基因的PCR产物进行直接测序，在第三外显子发现5个SNP位点，图3为第3496bpA/C位点扩增产物测序峰图，其中图3-a为AA基因型峰图；图3-b为AC基因型峰图；图3-c为CC基因型峰图。图4为第3533bpA/T位点扩增产物测序峰图，其中图4-a为AA基因型峰图；图4-b为AT基因型峰图；图4-c为TT基因型峰图。图5为第3711bp G/C位点扩增产物测序峰图，其中图5-a为GG基因型峰图；图5-b为GC基因型峰图；图5-c为CC基因型峰图。图6为第3745bp T/C位点扩增产物测序峰图，其中图6-a为TT基因型峰图；图6-b为TC基因型峰图；图6-c为CC基因型峰图。图7为第3767bp T/C位点扩增产物测序峰图，其中图7-a为TT基因型峰图；图7-b为TC基因型峰图；图7-c为CC基因型峰图。

6、FABP4基因遗传效应统计分析

FABP4基因第3496bpA/C位点的基因频率和基因型频率的计算结果见表3，该位点检测到三种基因型，表现为AC基因型出现的频率最高，CC型出现的频率最低，等位基因A为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算FABP4基因第3496bpA→C位点的相关参数，如表4所示，该位点的多态信息含量为0.25＜PIC＝0.3701＜0.5，处于中度多态。

表3延边黄牛FABP4基因3496bpA→C位点的基因频率及基因型频率

表4延边黄牛FABP4基因3496bpA→C位点的遗传变异参数

FABP4基因3533bpA/T位点的基因频率和基因型频率计算结果见表5，该位点检测到三种基因型，表现为AT基因型出现的频率最高，TT基因型出现的频率最低，等位基因A为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算FABP4基因3533bpA/T位点的相关参数，如表6所示，该位点的多态信息含量为0.25＜PIC＝0.3648＜0.5，处于中度多态。

表5延边黄牛FABP4基因3533bpA/T位点的基因频率及基因型频率

表6延边黄牛FABP4基因3533bpA/T位点的遗传变异参数

FABP4基因3711bp G/C位点的基因频率和基因型频率计算结果见表7，该位点检测到三种基因型，表现为GG基因型出现的频率最高，CC基因型出现的频率最低，等位基因G为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算FABP4基因第3711bp G/C位点的相关参数如表8所示，该位点的多态信息含量为0.25＜PIC＝0.3546＜0.5，处于中度多态。

表7延边黄牛FABP4基因第3711bp G/C位点的基因频率及基因型频率

表8延边黄牛FABP4基因第3711bp G→C位点的遗传变异参数

FABP4基因第3745bp T/C位点的基因频率和基因型频率计算结果见表9，该位点检测到三种基因型，表现为TT基因型出现频率最高，CC型出现的频率最低，等位基因T为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算FABP4基因第3745bp T/C位点的相关参数如表10所示，该位点的多态信息含量为0.25＜PIC＝0.3546＜0.5，处于中度多态。

表9延边黄牛FABP4基因第3745bp T/C位点的基因频率及基因型频率

表10延边黄牛FABP4基因第3745bp T/C位点的遗传变异参数

FABP4基因第3767bp T/C位点的基因频率和基因型频率计算结果见表11，该位点检测到三种基因型，TC基因型出现的频率最高，CC型出现的频率最低，等位基因T为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算FABP4基因第3767bp T/C位点相关参数如表12所示，该位点的多态信息含量为0.25＜PIC＝0.3648＜0.5，处于中度多态。

表11延边黄牛FABP4基因第3767bp T/C位点的基因频率及基因型频率

表12延边黄牛FABP4基因第3767bp T/C位点的遗传变异参数

实施例2

1、试验动物与样品采集

本试验牛群体选取吉林省延边畜牧开发集团有限公司延边黄牛阉牛70头，所有试验牛统一标准饲养条件育肥30月龄屠宰，按国家统一标准进行屠宰分割，采集12到13肋间背最长肌，用于测定肉质性状。

2、牛主要性状指标的测定

(1)脂肪含量测定：索氏提取法

脂肪的质量分数按式(1)计算：

式中：M为试样质量，g；M1为抽提后质量，g；M2为抽提前质量，g。

(2)大理石花纹评级

参考大理石花纹评级图谱(见图8)，观察背最长肌横切面，按6个等级评定延边黄牛大理石花纹等级，1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别。

3、FABP4基因多态性与肉质性状关联分析

通过对FABP4基因多态性与延边黄牛肉脂肪含量、大理石花纹、性状进行关联分析，结果见表13～17，可知，第3496bpA/C位点与延边黄牛的脂肪含量呈现显著相关，表现为AC基因型的脂肪含量显著高于AA型和CC型(P＜0.05)，AC基因型的大理石花纹显著优于CC基因型；第3533bpA/T位点与延边黄牛脂肪含量、呈显著相关性，表现为AT基因型的脂肪含量显著高于AA型和TT型(P＜0.05)，AT基因型的大理石花纹显著优于TT基因型；第3691bpG/A位点显著影响延边黄牛脂肪含量，表现为，GA基因型的脂肪含量显著高于GG型和AA基因型(P＜0.05)。第3711bp G/C位点显著影响延边黄牛的脂肪含量，表现为GC基因型的脂肪含量显著高于GG型和CC基因型(P＜0.05)，GC型的大理石花纹要优于CC基因型；第3745bp T/C位点与延边黄牛的脂肪含量呈显著相关，表现为TC基因型的脂肪含量显著高于TT型和CC基因型(P＜0.05)，TC基因型的大理石花纹显著优于CC型；第3767bp T/C位点显著影响延边黄牛的脂肪含量，表现为TC基因型的脂肪含量显著高于TT型和CC型(P＜0.05)，TC基因型的大理石花纹显著优于CC基因型。

表13 FABP4基因A3496C位点多态性与肉质性状的关联分析

注：表中肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)

表14 FABP4基因A3533T位点多态性与肉质性状的关联分析

表15 FABP4基因G3711C位点多态性与肉质性状的关联分析

表16 FABP4基因T3745C位点多态性与肉质性状的关联分析

表17 FABP4基因T3767C位点多态性与肉质性状的关联分析

4、FABP4基因SNPs连锁不平衡(LD)分析利用SHEsis软件分析FABP4基因第3496bpA/C位点、第3533bpA/T位点、第3711bp G/C位点、第3745bp T/C位点、第3767bp T/C位点的连锁状态。连锁不平衡分析结果如表18、图9(Site1-5分别代表第3496bpA/C、第3533bpA/T、第3711bp G/C、第3745bp T/C、第3767bp T/C)所示，5个SNP位点处于强连锁不平衡状态，具有相似的遗传效应。且其中第3533bpA/T位点与第3767bp T/C位点、第3711bpG/C位点与第3745bp T/C位点为连锁完全不平衡(r²值为1)，可作为一个整体遗传，观察一个标记位点便可得到另一个标记的全部信息。

表18 FABP4基因连锁不平衡分析结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 延边大学

<120> 延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 565

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acccctatga tgctattcca cataaattta ttatctatat tctttcacag tatttttttt 60

tcaaatgcat gtttgtataa tattctgatc ataatataca tgtaattttg tatgttgttt 120

ttggcattca ttgttttctt ttgcaacatt ttcttgtaat ttagaattgc taagtacctc 180

aaaataagca aataaaagca ctctattttt tttccctcca tcattgtaat cacttttaat 240

tatccccaca gagcatcgta aacttagatg aaggtgctct ggtacaagta caaaactggg 300

atggaaaatc aaccaccata aagagaaaac tcgtggatga taagatggtg ctcgtgagta 360

tcttctcact acttaattct agatttcagt gctaggtcat cccataatcg ttatcctacc 420

tagagaaata gacaatcgcc cttgtagaat gaaaagttag tctattggga ttatggtttc 480

actctgacaa ttatccttct aagctccgtc taggtatact gtgcccccag cagtattttc 540

ttatccctct caatgtgaac cgtat 565

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acccctatga tgctattcca ca 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atacggttca cattgagagg ga 22

Claims

1.一种延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记，其特征在于，含有位于FABP4基因第3496bp的多态性为A/C位点、第3533bp的多态性为A/T位点、第3711bp的多态性为G/C位点、第3745bp的多态性为T/C位点和第3767bp的多态性为T/C位点的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的FABP4基因SNP分子标记，其特征在于，含有如序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的138位多态性为A/C位点，175位的多态性为A/T位点、353位多态性为G/C位点，387位的多态性为T/C位点和409bp的多态性为T/C位点。

3.一种用于扩增延边黄牛肉质相关的FABP4基因SNP分子标记的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

4.一种用于检测延边黄牛育肥牛的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×Taq PCR Mastermix。

6.权利要求1或2所述的FABP4基因SNP分子标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4或5所述试剂盒在辅助筛选延边黄牛育肥牛中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述筛选延边黄牛育肥牛的方法，包括以下步骤：

1)以延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，用权利要求3所述的引物对进行普通PCR扩增，得到扩增产物；

3)将步骤2)中扩增产物进行测序，得到片段序列；

4)根据所述片段序列中FABP4基因的多态性确定具体基因型；

5)根据不同种类的基因型判断延边黄牛育肥牛的指标：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中普通PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤2)中普通PCR扩增的反应体系：2×TaqPCR Mastermix 10μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O补充至20μl。