CN101805787A

CN101805787A - 鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法及其应用

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Publication number: CN101805787A
Application number: CN200910227401A
Authority: CN
Inventors: 韩瑞丽; 康相涛; 陈宏�; 李建群; 李转见; 蓝贤勇
Original assignee: Northwest A&F University; Henan Agricultural University
Current assignee: Northwest A&F University; Henan Agricultural University
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2029-12-09
Also published as: CN101805787B

Abstract

本发明涉及一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法及其应用，所述的检测方法包括以鸡内脂素基因9bp indel位点的位置设计引物；然后进行PCR扩增；通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该基因9bp indel多态性，9bp缺失时为DD基因型，9bp插入时为II基因型，该位点杂合的个体为ID基因型。利用上述检测结果结合鸡经济性状进行关联分析，用于鸡的辅助选择和分子育种。本发明的检测方法无需酶切，节约成本和时间；使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，克服了琼脂糖电泳对小片段核苷酸差异检测的局限性；该方法不仅分辨率高，检测灵敏，判型准确，且该凝胶对染色方法也没有要求，溴化乙啶(EB)染色和银染均可。

Description

鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种鸡内脂素(visfatin)基因9bp indel多态性检测方法，同时还涉及该检测方法的应用，属于鸡遗传育种技术领域。

背景技术

在畜禽的遗传育种中，应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加畜禽生产性能先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与鸡经济性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

单核苷酸多态性(SNP)被认为是继第一代限制性多态性标记、第二代微卫星多态性标记之后的第三代基因遗传标记。通常所说的SNP包括碱基的插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。基因组DNA几个碱基的插入或缺失不同于DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。对于单个碱基的转换(以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)以及颠换(嘌呤与嘧啶互换)所引起多态性的检测方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等。但SSCP操作繁琐、耗时长，影响因素较多，且实验过程中存在假阴性问题，所以，并非理想的SNP检测手段；PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；直接测序技术成本较高。且上述方法不适用于基因组DNA几个碱基的插入/缺失多态的检测，对于基因组DNA序列插入缺失的检测，许多研究运用了PCR-RFLP方法或PCR与琼脂糖检测相结合的方法，PCR-RFLP方法需要一种针对突变位点的特殊的内切酶，且酶切产物最终还需用琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳检测，成本较高，耗时长。PCR与琼脂糖检测的方法可以检测基因大片段序列的插入/缺失，但对于几个bp的插入/缺失难以判型。总之，需要探索一种快速检测基因组DNA序列中几个核苷酸插入/缺失多态的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法。

本发明的技术方案在于采用了一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)依据鸡内脂素基因9bp indel位点在基因组序列中的位置，以鸡内脂素基因序列设计一对引物；

(2)以包含鸡内脂素基因的DNA序列为模板进行PCR扩增；

(3)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测鸡内脂素基因9bp indel多态性，当鸡内脂素基因第10内含子缺失9bp时，其PCR扩增产物为一条带，将其命名为DD基因型；当鸡内脂素基因第10内含子包含9bp的插入时，其PCR扩增产物为一条带，且比DD基因型的PCR扩增产物多9bp，将其命名为II基因型；而该位点杂合的个体，其PCR扩增产物为两条带，将其命名为ID基因型。

步骤(1)中所述的引物序列为：

PF：5′-GTGGTAGTGAGAGATAGCAGAAGG-3

PR：5′-AGTGAGACGCCGTTTCTAGTTC-3′；

由此，步骤(3)中所述的PCR扩增产物的长度分别是DD基因型为273bp，II基因型为282bp，ID基因型为282bp和273bp两条带。

所述的鸡内脂素基因其9bp(‘TAACCTGTG’)indel位点在鸡(Gallus)基因组序列的第26128-26136碱基(如序列表中所示)，其中鸡基因组序列在Genebank中的登陆号为NC_006088。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，所用的凝胶浓度为10％或12％。

本发明的目的还在于提供一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法的应用。

本发明的技术方案还在于采用了一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法的应用，所述的检测方法可用于鸡的辅助选择和分子育种。通过将基因型与鸡的不同性状进行关联性分析，确定基因与性状的对应关系，用于鸡的分子育种。

所述的性状为经济性状，包括体尺性状、屠宰性状和肉质性状。

鸡内脂素基因的9bp插入或缺失位于扩增的目的片段282bp的109-117位置上，II基因型插入了9bp的‘TAACCTGTG’序列，DD基因型相应位置缺失了9bp的‘TAACCTGTG’序列。在F₂资源群体中，F0、F2代中DD基因型的个体很少，而且在F₁世代中没有发现DD基因型，visfatin基因9bp indel的I等位基因频率变化幅度为0.724-0.879，D等位基因频率变化幅度在0.121-0.276之间，说明II基因型为优势基因型。在9bp indel多态性与经济性状的关联性分析表明：9bpindel多态性与鸡的重要体尺性状有显著关联，D等位基因即9bp indel的缺失不利于鸡骨骼的生长发育。

本发明的检测方法用PCR扩增然后聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，相对于PCR-RFLP方法，节约了购买内切酶的成本，且大大节约了酶切的时间；又克服了琼脂糖电泳对小片段核苷酸差异检测的局限性；该方法不仅分辨率高，检测灵敏，判型准确，且该凝胶对染色方法也没有要求，无论是溴化乙啶(EB)染色还是银染方法都适合；使用分子标记的方法辅助选择育种，比常规育种方法准确性高、缩短世代间隔、减少育种群饲养量、降低饲养成本。

附图说明

图1为实验群体构建简单示意图；

图2为鸡visfatin基因9bp indel多态性PCR产物电泳检测图；其中泳道6为DNA Marker，泳道1、2、5、8为II基因型的PCR产物条带(282bp)，泳道3、4为ID基因型的PCR产物条带(282bp和273bp)，泳道7为DD基因型的PCR产物条带(273bp)；

图3为鸡visfatin基因9bp indel基因型测序图，其中(a)中下划线部分表示‘TAACCTGTG’序列的插入，(b)中箭头表示‘TAACCTGTG’序列的缺失位点。

具体实施方式

本发明的实施例部分包括实施例、验证实施例、应用实施例，各实施例是为了更清楚的说明本发明，并不以任何形式限制本发明的范围。

首先介绍本发明所用的鸡实验群体的构建：采用的固始鸡-安卡鸡资源群按以下设计方案组建，试验共建立7个家系，其中正交系4个(全同胞家系)：安卡鸡

×固始鸡♀，反交系3个(2个全同胞家系、1个半同胞家系)：固始鸡

×安卡鸡♀(见图1)。F₀代是从蛋肉兼用型固始鸡和肉用型安卡鸡纯系钟分别选取种鸡，按公母鸡1∶6比例配组而成，要求所选公母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正，以保证F₁代个体在各个位点的杂合。从每个家系的F₁后代中选留一只公鸡，按公母1∶9比例与其他家系母鸡交配产生F₂代，要求与配公母鸡之间没有亲缘关系，F₁代的种用母鸡也尽量散布在各个家系中，选种时尽量选择外貌表现丰富，呈现杂合的个体，保证F₂代性状产生较大分离。该群体共包括F₀代42只鸡，F₁代70只鸡，F₂代860只鸡，其中有效个体数为964只。

鸡血样基因组DNA的制备：以构建完成的固始鸡-安卡鸡资源群共964只鸡为材料，使用常规方法从这964只鸡的翅静脉采集血样，并分离纯化血样基因组DNA，电泳检测基因组DNA的质量，并用分光光度计检测DNA的浓度。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至100ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

实施例1

本发明方法对鸡visfatin基因9bp indel多态性的检测

(1)依据鸡内脂素基因9bp indel位点在基因组序列中的位置，以鸡内脂素基因序列设计一对引物，引物序列为：

PF：5′-GTGGTAGTGAGAGATAGCAGAAGG-3

PR：5′-AGTGAGACGCCGTTTCTAGTTC-3′；

(2)以固始鸡-安卡鸡资源群中964只鸡的翅静脉血样基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为25μL，具体加样量如表1所示，其中所使用的Taq DNA聚合酶、10×Buffer和MgCl₂均购自MBI Fermentas。

表1PCR反应体系

PCR反应程序为：95℃预变形5分钟；然后94℃变性30秒，72℃退火延伸60秒，30-35个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存或待温度降至4℃直接电泳检测。通过PCR扩增共获得964份包含鸡visfatin基因9bp indel位点的扩增片段。

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增片段：使用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，其中所使用的方法均为常规的电泳方法及银染方法，然后照相，通过其带型分析相应的基因型，各基因型的带型如图2所示(图2仅示例显示7个样本的检测带型图)，其中泳道6为DNA Marker，泳道1、2、5、8为II基因型的PCR产物条带(282bp)，泳道3、4为ID基因型的PCR产物条带(282bp和273bp)，泳道7为DD基因型的PCR产物条带(273bp)，即当PCR扩增产物为一条带，大小为273bp时，该样本的9bp indel记录为DD基因型；当PCR扩增产物为一条带，大小为282bp时，该样本的9bp indel记录为II基因型；当PCR扩增产物为两条带，大小分别为282bp和273bp时，该样本的9bp indel记录为ID基因型。

实施例2

本发明方法对鸡visfatin基因9bp indel多态性的检测，所用引物同实施例1的引物，以固始鸡-安卡鸡F₂代资源群964只鸡的翅静脉血样基因组DNA进行PCR扩增其中所采用的方法同实施例1，只是电泳检测时使用的是12％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，同实施例1的方法记录各鸡样本个体所对应的该基因的基因型。

验证实施例

利用ABI 3730测序仪对代表性的不同基因型个体选取9份(3种类基因型各选3个重复)PCR产物分别进行测序，鸡visfatin基因9bp插入的测序结果如图3(a)所示，9bp缺失的测序结果如图3(b)所示。测序结果与聚丙烯酰胺凝胶电泳判别的基因型完全相同，证实了本检测方法的有效性和准确性。

应用实施例1

鸡visfatin基因9bp indel位点的基因型频率统计分析

本方法中检测的基因，其结果是共显性等位基因，故表型频率和基因型频率一致。基因频率的计算公式为：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N，式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因；N为检测群体的总数量。依据实施例1和实施例2所记录的数据进行鸡visfatin基因9bp indel位点的基因型频率统计分析，结果见表2，由表中数据可知，在F₂资源群体中，F0、F2代中DD基因型的个体很少，而且在F₁世代中没有发现DD基因型，其中I等位基因频率变化幅度为在0.724-0.879，D等位基因频率变化幅度在0.121-0.276之间，说明II基因型为优势基因型。

表2F2资源群体中visfatin基因9bp indel等位基因的频率分布表

应用实施例2

鸡visfatin基因9bp indel多态性与鸡经济性状的关联分析

基因型数据：以实施例1和实施例2所获得的F₂资源群体中各鸡样本个体所对应的9bp indel多态性数据为准。

经济性状57项：33项体尺性状，13项屠宰性状，11项肉质性状，具体的性状指标及测量时间如下：双周末测定体重、每4周测量体尺指标，84日龄屠宰时测定屠宰指标及肉质指标共57项指标。33项体尺性状分别为0，2，4，6，8，10，12周的体重；4，8，12周的胫长、胫围、胸角度、骨盆宽、体斜长、胸宽、胸深、胸骨长；13项屠宰指标包括宰前活重、屠体重、全净膛重、半净膛重、胸肌重、腿肌重、脂肪带宽、皮下脂厚、头重、肝重、心重、肌胃重、脾重；11项肉质性状包括胸腿肌的PH、剪切值、系水力、肌纤维密度、肌纤维直径和胸肌肌内脂肪含量。

关联分析：选取其中有完整经济性状的849个个体的基因型和经济性状数据进行关联分析，利用SPSS(16.0)软件进行分析，确保每个性状数据呈正态分布，再利用最小二乘法分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应和多重比较法比较各基因型间的差异。分析结果见表3和表4(部分没有显著相关的分析结果未列出)，结果表明：9bp indel多态性与鸡的12周胫长达到了极显著的相关水平(P＜0.01)，与4周胸角度和8周胫长及12周胸角度达到了显著的相关水平(P＜0.05)。II基因型个体的8周胫长和4周胸角度显著的高于DD基因型个体的8周胫长(P＝0.037)和4周胸角度(P＝0.049)，II基因型个体的的12周胸角度显著的高于DD基因型个体12周胸角度(P＝0.036)。II基因型和ID基因型个体的12周胫长极显著高于DD基因型个体12周胫长(P＝0.007)。由此看出，9bp indel多态性与鸡的重要体尺性状有显著相关性，D等位基因即9bp的缺失不利于鸡骨骼的生长发育。在鸡的分子育种中，在育种群后代1-3周龄的时候即可对其进行基因型的分析，首选留下II基因型，对于DD基因型的个体可以直接舍弃，而ID基因型可以依据所要留种的数量选留或者舍弃，极大的提高了选育的准确性，并可缩短世代间隔、减少育种群饲养量、降低饲养成本。

表3F₂资源群体中visfatin基因9bp indel多态与鸡生长性状的关联分析

^A，B同一行上标不同者表明达到了极显著水平(P＜0.01).

^a，b同一行上标不同者表明达到了不显著水平(P＜0.05).

¹n为不同基因型的个体数目

²BW4，BW6，BW8，BW10和BW12为4，6，8，10，12周体重；SL4，SL8和SL12为4，8，12周胫长；CD4；CD8和12＝4，8，12周胸宽；PA4，PA8和PA 12＝4，8，12周胸角度；BSL4，BSL8和BSL 12为4，8，12周体斜长。

表4F2资源群体中visfatin基因9bp indel多态与鸡屠宰肉质性状的关联分析

¹n为不同基因型的个体数目。

²CW＝屠宰重；SEW＝半净膛重；EW＝全净膛中；BMW＝胸肌重；LMW＝腿肌重；FBW＝脂肪带宽；SFT＝皮下脂厚；LSF＝腿肌剪切值；BSF＝胸肌剪切值；LWLR＝腿肌失水率；BWLR＝胸肌肌失水率；LFD＝腿肌纤维密度；BFD＝腿肌纤维密度；BIMF＝胸肌肌内脂肪。

本发明所涉及的核酸序列表如下：

<110>河南农业大学西北农林科技大学

<120>鸡内脂素基因9bp插入/缺失多态的快速检测方法及其应用

<160>1

<210>1

<211>282

<212>DNA

<213>鸡(Gallus)

<220>

<221>mutation

<222>(109)...(117)

<400>1

gtggtagtga gagatagcag aaggtgaaag gatatcgtgg cagccacgag ctctagtctc 60

atcagtcttg atttgggtcc tcgcaattga gtttgtatgt aatttgtgta acctgtgttg 120

tttgttcatt gaccaaatcc gcatcgctaa atcaatggtg tttcttgcag gatctccttc 180

atacggtatt taagaacggg aaagtaacga agtcatactc atttgatgaa gtaaggcaaa 240

atgccaggct gaagaacagt gaactagaaa cggcgtctca ct 282

Claims

1.一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(2)以包含鸡内脂素基因的DNA序列为模板进行PCR扩增；

2.根据权利要求1所述的一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的引物序列为：

PF：5′-GTGGTAGTGAGAGATAGCAGAAGG-3

PR：5′-AGTGAGACGCCGTTTCTAGTTC-3′；

3.根据权利要求1所述的一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法，其特征在于：所述的鸡内脂素基因其9bp indel位点在鸡基因组序列的第26128-26136碱基，其中鸡基因组序列在Genebank中的序列号为NC_006088。

4.根据权利要求1所述的一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法，其特征在于：所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，所用的凝胶浓度为10％或12％。

5.一种如权利要求1所述的一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法的应用，其特征在于：所述的检测方法可用于鸡的辅助选择和分子育种。

6.根据权利要求5所述的一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法的应用，其特征在于：通过将基因型与鸡的不同性状进行关联性分析，确定基因与性状的对应关系，用于鸡的分子育种。

7.根据权利要求6所述的一种鸡内脂素基因9bp indel多态性检测方法的应用，其特征在于：所述的性状为经济性状，包括体尺性状、屠宰性状和肉质性状。