CN106434974B - 一种用于日本沼虾多样性分析的微卫星引物及其用途 - Google Patents
一种用于日本沼虾多样性分析的微卫星引物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于日本沼虾多样性分析的微卫星引物，包括11对微卫星引物，分别是：MN01、MN02、MN03、MN04、MN05、MN06、MN07、MN08、MN09、MN10、MN11；同时本发明还提供了所述的微卫星引物在日本沼虾的群体遗传结构分析中的用途，通过以下方法分析：（a）提取待分析群体基因组DNA；（b）以所述基因组DNA为模板，采用所述的微卫星引物进行PCR分子标记检测；（c）进行遗传结构分析。本发明提供的微卫星引物具有PCR扩增结果稳定、多态性高等特点，可用这些分子标记进行遗传多样性分析、群体遗传结构分析、遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及沼虾生物学遗传育种领域，具体地说是一种用于日本沼虾多样性分析的微卫星引物及其用途。
背景技术
SSR(Simple sequence repeat)即简单序列重复，又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)，在真核生物基因组中，SSR仅由几个核苷酸(1～6个)组成重复单位，如(GA)n、(AC)n、(GAA)n(其中n为重复次数)等，重复次数10～50，同一类微卫星DNA可分布在整个基因组不同位置上，由于重复次数的不同，或重复程度的不完全，而形成每个座位的多态性。每类微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据两端序列设计一对特异引物，扩增每个位点微卫星序列。
目前，SSR也是发展最快、应用最广的一类标记。SSR标记具有以下特点：①广泛分布于整个基因组，甚至是叶绿体基因组和线粒体基因组；②数量众多，表现出高度的多态性；③具有多等位基因的特性，信息量高；④呈共显性遗传，即能区分纯合子和杂合子；⑤等位基因的分离遵循孟德尔规律；⑥基于PCR技术，可实现自动化记录和分析；⑦具有连锁不平衡现象；⑧重复性较好；⑨适合重现群体的历史。因此，微卫星标记技术目前已广泛地应用于生物DNA指纹图谱、种质资源的鉴定、遗传连锁图谱的构建、遗传多样性、等位基因变异和遗传关系及遗传结构等方面。
日本沼虾(Macrobrachium nipponense)自然分布于中国、日本、越南以及俄罗斯远东地区，广泛分布于我国各地淡水区域，河北白洋淀、衡水湖、山东微山湖、江苏洪泽湖都有日本沼虾野生资源的分布，是我国最重要的淡水虾类之一。因其肉质细嫩、美味可口，富含人体必需的维生素、氨基酸以及Mn、Zn等多种微量元素，深受人们喜爱并得到广泛养殖，据《中国渔业年鉴》公布，目前全国养殖日本沼虾年产量约20万吨，年产值近100亿元，日本沼虾养殖已成为我国农业增效、农民增收的重要途径之一。近年来，随着工业化的快速推进，日本沼虾的栖息环境受到人为干扰、破坏和无序开发，使得其群体结构遭到破坏，种质纯度降低，资源量锐减。但是，现有技术中有关于日本沼虾的微卫星标记的相关研究较少。因此，开发针对分析日本沼虾遗传结构的微卫星引物，采用分子遗传标记的手段分析日本沼虾种质资源现状，尽早研究其种群遗传学以及利用分子标记进行育种，这对其日本沼虾野生资源的有效保护具有十分重要的社会价值。
发明内容
本发明的目的就是提供一种用于日本沼虾多样性分析的微卫星引物及其用途，以提供一套日本沼虾遗传结构分析的微卫星引物，为日本沼虾多样性种质资源现状的调查研究以及分子生物学育种提供条件和基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于日本沼虾多样性分析的微卫星引物，包括11对微卫星引物，分别是：
MN01引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
MN02引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
MN03引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
MN04引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
MN05引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
MN06引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
MN07引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
MN08引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；
MN09引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
MN10引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
MN11引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
本发明所提供的所述的微卫星引物可以用于日本沼虾多样性以及群体遗传结构的分析，而且其具有PCR扩增结果稳定，多态性高等特点，可以在日本沼虾的群体遗传构分析中得到应用。
本发明还提供了所述的微卫星引物在日本沼虾的群体遗传结构分析中的用途所采用的具体分析方法，具体步骤包括：
(a)提取待分析群体基因组DNA；
(b)以所述DNA为模板，采用所述的微卫星引物进行分子标记检测；
(c)进行遗传结构分析。
分析方法中：所述的分子标记检测是指采用11对微卫星引物对DNA模板进行PCR扩增，其扩增体系为：
PCR扩增体系如下：
扩增程序为：
其中53-60℃退火30s具体是指：MN01引物的退火温度为56℃、MN02引物的退火温度为54℃、MN03引物的退火温度为60℃、MN04引物的退火温度为59℃、MN05引物的退火温度为54℃、MN06引物的退火温度为60℃、MN07引物的退火温度为53℃、MN08引物的退火温度为54℃、MN09引物的退火温度为54℃、MN10引物的退火温度为55℃、MN11引物的退火温度为54℃。
PCR扩增产物用质量比浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果。
分析方法中：所述进行遗传结构分析是指利用Popgen32对PCR检测的结果进行群体遗传分析，计算等位基因数(Number of Allele，A)、观测杂合度(ObservedHeterozygosity，Ho)和期望杂合度(Expected Heterozygosity，He)，利用U检验进行Hardy-Weinberg平衡，采用Bonferroni方法校正的显著性标准，根据P值判断杂合缺失或过剩；计算群体间Nei’s遗传距离(Genetic distance，DA)，基于DA分别构建系统遗传树，用PIC-CALC软件对各微卫星位点的多态信息含量进行计算。
本发明提供的微卫星引物具有PCR扩增结果稳定、多态性高等特点，可用这些分子标记进行遗传多样性分析、群体遗传结构分析、遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等，具有很好的应用价值。
附图说明
图1是实施例3中4个地理群体遗传聚类分析结果。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1微卫星引物的获得
日本沼虾购自白洋淀水产市场，在无菌条件下取其肌肉组织，提取肌肉组织总RNA，送生物公司进行转录组测序，获得转录组数据；利用MISA软件对组装得到的长度在1kb以上的unigenes进行SSR的鉴定，识别标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的精确SSR标记的最小重复数分别为9、6、5、4次，利用SSRHunter1.3进行SSR标记的筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物。以筛选到的SSR使用Primer Permier 6进行引物设计；设计的主要参数设置为：引物长度18-25bp为最适长度，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度50-65℃；GC含量一般在40-60％之间，尽量避免二级结构出现。最终筛选出的11对引物序列如表1所示，这11对引物的信息如下。
表1日本沼虾微卫星引物及其对应的指标参数
实施例2利用微卫星引物对日本沼虾遗传结构的分析方法
(1)基因组DNA的提取：参照《分子克隆实验指南》(Sambrook&Russell,2001)提供的酚-氯仿法抽提待分析样品的基因组总DNA。DNA的质量检测：取2μL基因组总DNA用质量比浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，经EB染色、紫外凝胶成像系统成像后观察DNA是否降解以及是否有蛋白质残留；另外，将提取的DNA样品用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定其浓度，并以测得DNA浓度为参考，将基因组总DNA样品统一稀释为50ng/μL。
(2)采用所述的微卫星引物进行分子标记检测：以步骤(1)得到的统一稀释后的基因组总DNA为模板，采用实施例1获得的11对引物对其进行PCR分型检测，其扩增体系和扩增条件如下所示，PCR扩增产物用质量比浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果；通过与pBR322DNA/Msp I marker分子量标准对比估算扩增片段大小范围。
PCR扩增体系如下：
PCR反应程序如下：
(3)根据步骤(2)PCR分型检测结果及其位置确定基因型，利用Popgen32进行群体遗传分析，计算等位基因数(Number of Allele，A)、观测杂合度(ObservedHeterozygosity，Ho)和期望杂合度(Expected Heterozygosity，He)，利用U检验进行Hardy-Weinberg平衡，采用Bonferroni方法校正的显著性标准，根据P值判断杂合缺失或过剩；计算群体间Nei’s遗传距离(Genetic distance，DA)，基于DA分别构建系统遗传树，用PIC-CALC软件对各微卫星位点的多态信息含量进行计算。
实施例3对日本沼虾遗传结构分析的应用
分析群体来自河北白洋淀(BYD)、河北衡水湖(HSH)、山东微山湖(WSH)、江苏洪泽湖(HZH)四个群体的日本沼虾，每个群体取24个样品，共96个样品，按照实施例2中的第(1)提取各样品的基因组总DNA，以基因组总DNA为扩增模板，以实施例1获得的11对微卫星引物进行PCR分型检测，扩增体系、扩增条件和具体扩增步骤同实施例2的第(2)步，得到扩增产物用质量比浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶分离，经银染染色，记录扩增结果，并检测扩增产物的片段大小。其中部分扩增片段分别如SEQ ID NO:23(采用MN01引物扩增)、SEQ ID NO:24(采用MN02引物扩增)、SEQ ID NO:25(采用MN03引物扩增)、SEQ ID NO:26(采用MN04引物扩增)、SEQ ID NO:27(采用MN05引物扩增)、SEQ ID NO:28(采用MN06引物扩增)、SEQ IDNO:29(采用MN07引物扩增)、SEQ ID NO:30(采用MN08引物扩增)、SEQ ID NO:31(采用MN09引物扩增)、SEQ ID NO:32(采用MN10引物扩增)、SEQ ID NO:33(采用MN11引物扩增)。
用11对日本沼虾的微卫星引物对4个群体的日本沼虾野生群体进行了遗传多样性分析，所有的微卫星位点都显示足够的多态性，扩增后各个位点等位位点数及座位多态信息含量如表2所示，11对日本沼虾的微卫星引物扩增获得95个等位位点，平均等位位点数为8.6，位点数介于5～14个，其中MN05获得14个等位片段，等位位点数最多；MN03、MN07和MN11获得5个等位片段，等位位点数最少。Ho值在0.1579～0.7473之间，平均为0.4741；He值在0.2511～0.9027之间，平均值为0.5154，大于平均观测杂合度。11个等位位点的多态信息含量PIC介于0.2420～0.8890，平均值为0.4864。以上数据显示，4个日本沼虾野生群体具有很高的遗传多样性。对44个群体位点组合(4个种群×11个引物)进行Hardy-Weinberg平衡检验，结果见表3，33个群体位点组合符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，其他11个群体位点组合则显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。Hardy-Weinberg平衡检验P值结果显示，白洋淀、微山湖和洪泽湖著偏离Hardy-Weinberg平衡的组合都为3个，微山湖最少为2个。Fis结果证实很多位点存在杂合子不足的现象(Fis>0)。
表2 4个日本沼虾群体的11个微卫星位点汇总统计
表3Hardy-Weinberg平衡卡方检验P值和Fis值
注：Fis代表近交系数；P代表显著偏离Hardy-Weinberg平衡概率值
4个群体间的Nei氏遗传距离和遗传分化指数(FST)如表3和表4所示，经UPGMA聚类分析显示如图1所示，白洋淀和衡水湖群体聚在一起，微山湖和洪泽湖群体进行聚在一起。4个群体的遗传分化指数均介于0.0463～0.1012之间，表明4个群体间存在中等程度的遗传差异，但显著性水平为极显著(P<0.01)。
表4 4个群体间的FST值(对角线下)和Nei’s遗传距离(对角线上)矩阵
由此以上分析结果可以说明，本发明提供的微卫星引物可以用于日本沼虾多样性以及群体遗传结构的分析，而且本发明提供的微卫星引物具有PCR扩增结果稳定，多态性高等特点，具有很好的应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北大学
<120> 一种用于日本沼虾多样性分析的微卫星引物及其用途
<130>
<160> 33
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
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<213> MN04下游核苷酸
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tgcttcatac aagatggtct ct 22
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ctccttcctg ttgatttctc taactttcta aatcaaatct agcgtattcg gtggtgtgga 120
gagtgatggc agttgagaaa gctactgact tttctgtgaa gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 180
gtgtgtgtgt gtgtgtgtga gtgtgtgtgc acttgtatca aatgcatttg atatatattt 240
ataactattg ccattacaat aatataacct ttatatacac aataactata agagccaaca 300
tgagcttc 308
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acagccattt gtctcagtat ctctccggaa atgtttttta tttctaaata tactttatca 60
ggtgaaggat catcatcatc atcatcatca tcatcatcat catcatcatc atcatcatca 120
taattattga cagtttccag attagtgatt tcaatgcagc ccacaagaat atccttgcta 180
actttcaatc cgcttagaag tgtgtgccta gggtacccat aacccttagt ttggagttgg 240
acaatggaaa tttctttctc aaacaagcta aattcaaact tccctagagc ccatttagga 300
taaataatgg tgggtattct aagaacaatg ttcccccttc tgagagagat ttggtgaagc 360
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tcccatgggc actttctggc acctgcaaac ttgaagccac ttgaggtggt ggtggtggtg 180
gtggtggtgg tggtggtggg gcactggatg gtggttgatc actgtagttc agagcagcat 240
ctaggacttc t 251
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<212> DNA
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<400> 26
aggagtgcct cgtgatggtg cctcaacaga atcagccgga ggaggtcacg atgccggagt 60
tacctgtcac cgacacagct gctgtagtga ctacaacaac agttgtcgag atacagcagc 120
agcagcagca gcagcagcag cagcagcctc agagaagaca caatgccgta gcgcaagaca 180
gcctgccagc ggagatgatg acgaaattgg aaaggcagaa ttcctgtgac agtgtcggca 240
gtctggacga agagggcatt c 261
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gcttccctcc ttgttcatac aacctctaca aatgtttgat gatttttatt attattatta 60
ttattattat tattattatt attattatta ttataattag aaaacagcag tgtttgcctg 120
ttggaat 127
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agatggagcg cctaataaat aagaagacag ccagcagcgg cgctccagtg gggcaaaaat 120
aaataaataa ataaataaat aaataaataa ataaataaat aaataaaagg accatctcgc 180
agatcttcgc tgctttcatc ggcagcaaaa aatgaaacac cgaaacaagc cgttcagtga 240
cgctctgact agaataatcg ttaaaagtaa cgtttggagt gaaatttaca aaagagagag 300
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<212> DNA
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cagtgatacc ccaaagagca aaaagaaagt aaaagagaaa gaagaaaaac atgttagaat 120
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tgatgatgat gatgatgaaa gtgaggatgg aaacacagaa gttaaggaag aatcagacac 240
agaagac 247
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<211> 300
<212> DNA
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<400> 30
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atatgggcaa gtacataaat acatatatat gttcataaat ataagtatac ataggccatt 120
gatttcaaaa ttaggctatt gacaattgga ggtatctggt aaaatgacca gcagtttaca 180
caaatacata catacataca tacatacata catacataca tacatacata catacataca 240
tacatgtgaa gcctataaag taacactaac aaaattttgg actgcatttc acctatacca 300
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ccatcataaa gtacagagag acacacacac acacacacac acacacaggg gtcagcctta 120
ctttgaaagg acacatcttg ctatctttct ttaataagta cttgactgtc aattatagtg 180
ctttacacag gaaatatata catataaatt taaatataaa cctccctctt acctttcaag 240
<210> 32
<211> 217
<212> DNA
<213> MN10引物扩增产物
<400> 32
tggagaggga aaggcttcga aagacaaacg gcatatttca aattcaatca aaaacaggaa 60
gagaaaagga aaacggcaga tggtattatt attattatta ttattattat tattattatt 120
attattatac tgaagaaaat gaaagaaata tagaattttg gcagtggcca ataacttaca 180
aaattgacta ctgcaaagat gacctccttg accgacg 217
<210> 33
<211> 286
<212> DNA
<213> MN11引物扩增产物
<400> 33
actgtgccaa tctacctgat ggcccagcct ctcaaatctg gtcccaggtg tcctttttat 60
tgtaaatatg gtattattat tattattatt attattatta ttattattat tattattatt 120
attatattta gtctagcatt ctattccatg gagaattgta attgcaagac aatcatcatt 180
ctactttcta gctcgtctgt cccaagacag cctgaatcat tttatgttgt tattttgtaa 240
atcttaattc tagtttatgt atggagagac catcttgtat gaagca 286
Claims (5)
1.一种用于日本沼虾多样性分析的微卫星引物，其特征在于，包括11对微卫星引物，分别是：
MN01引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:2所示；
MN02引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:4所示；
MN03引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:5所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:6所示；
MN04引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:7所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:8所示；
MN05引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:9所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:10所示；
MN06引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:11所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:12所示；
MN07引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:13所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:14所示；
MN08引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:15所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:16所示；
MN09引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:17所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:18所示；
MN10引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:19所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:20所示；
MN11引物的上游核苷酸序列如 SEQ ID NO:21所示、下游核苷酸序列如 SEQ ID NO:22所示。
2.一种权利要求1所述的微卫星引物在日本沼虾的群体遗传结构分析中的用途。
3.根据权利要求2所述的微卫星引物在日本沼虾的群体遗传结构分析中的用途，其特征在于，通过以下方法分析，具体步骤包括：
（a）提取待分析群体基因组DNA；
（b）以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的微卫星引物进行PCR分子标记检测；
（c）进行遗传结构分析。
4.根据权利要求3所述的微卫星引物在日本沼虾的群体遗传结构分析中的用途，其特征在于，所述PCR的反应体系为10 µL，包括：5 µL 2×Es Taq Master Mix、1 µL 浓度为50ng/µL 的DNA模板、1 µL浓度为2.5 µmol/L的上游引物、1 µL浓度为2.5 µmol/L的下游引物，其余用RNase-Free Water补齐。
5.根据权利要求3或4所述的微卫星引物在日本沼虾的群体遗传结构分析中的用途，其特征在于，所述PCR分子标记检测的扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30 s、53-60℃退火30 s、72℃延伸30s、35个循环；72℃终延伸10min。
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| 日本沼虾三个野生群体亲缘关系分析;范武江等;《水产科技情报》;20131120;第40卷(第06期);281-284 |
| 日本沼虾微卫星引物筛选及群体遗传多样性分析;冯建彬等;《水产学报》;20100515;第34卷(第05期);687-695 |
| 日本沼虾微卫星标记开发、遗传结构分析及性别相关遗传标记筛选研究;赵燕;《中国博士学位论文全文数据库》;20141115;摘要，第27，34-48页 |
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