CN110438242A - 一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物及其应用 - Google Patents
一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物及其应用，包括17对微卫星引物，分别是：NC0lF，NC0lR；NC02F，NC02R；NC03F，NC03R；NC04F，NC04R；NC05F，NC05R；NC06F，NC06R；NC07F，NC07R；NC08F，NC08R；NC09F，NC09R；ZL01F，ZL01R；ZL02F，ZL02R；ZL03F，ZL03R；ZL04F，ZL04R；ZL05F，ZL05R；ZL06F，ZL06R；ZL07F，ZL07R；ZL08F，ZL08R。本发明还提供了上述引物在三疣梭子蟹的群体遗传结构分析中的应用。本发明提供的微卫星标记具有PCR扩增结果稳定、多态性高等特点，可用这些分子标记进行遗传多样性分析、群体遗传结构分析、遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及三疣梭子蟹生物学遗传育种领域，具体地说是一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物及其应用。
背景技术
SSR(Simple sequence repeat)即简单序列重复，又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)，在真核生物基因组中，SSR仅由几个核有酸(1-6个)组成重复单位，如((CT)n，(AC)n，(ACT)n(其中n为重复次数)等，重复次数10-20，同一类微卫星DNA可分布在整个基因组不同位置上，由于重复次数的不同，或重复程度的不完全，而形成每个座位的多态性。每类微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据两端序列设计一对特异引物，扩增每个位点微卫星序列。
目前，SSR也是发展最快、应用最广的一类标记。SSR标记具有以下特点：①在真核生物基因组中广泛分布，大约每隔10-15kb就存在一个微卫星标记；②数量多，具有丰富的多态性；③具有多等位基因的特性，信息含量大；④呈共显性遗传，即能区分纯合子和杂合子；⑤等位基因的分离遵循孟德尔规律；⑥实验操作简单、结果稳定可靠；⑦基于PCR技术，可实现自动化检测；⑧具有连锁不平衡现象；⑨重复性较好。因此，微卫星标记技术目前已广泛地应用于生物DNA指纹图谱、种质资源的鉴定、遗传连锁图谱的构建、遗传多样性、等位基因变异和遗传关系及遗传结构等方面。
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济蟹类，北起中国辽东半岛、南至广东沿海，以及日本、朝鲜、马来群岛、红海等海域均有分布。1981年三疣梭子蟹被列为我国海洋水产养殖对象。近年来由于过度捕捞和环境污染造成三疣梭子蟹野生资源减少，养殖过程中各种病害不断发生。目前，沿海地区工业污染导致水质变差，由此使三疣梭子蟹生存环境遭到破坏，优质亲本数量急剧减少，养殖面积大幅度下降。因此，开发针对分析三疣梭子蟹遗传结构的微卫星引物，采用分子遗传标记的手段分析三疣梭子蟹种质资源现状，研究其种群遗传学以及利用分子标记进行育种，这对了解三疣梭子蟹的遗传多样性和种群结构、有效保护三疣梭子蟹野生资源、开发良种以及保育原种，对生物多样性的保护和生物资源的可持续利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是提供一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物及其应用，以提供一套三疣梭子蟹遗传结构分析的微卫星引物，为三疣梭子蟹遗传多样性、种质资源现状的调查研究以及分子生物学育种提供依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物，包括17对微卫星引物，分别是：
NC0lF：序列如SEQ ID NO.1所示，NC0lR：序列如SEQ ID NO.2所示；
NC02F：序列如SEQ ID NO.3所示，NC02R：序列如SEQ ID NO.4所示；
NC03F：序列如SEQ ID NO.5所示，NC03R：序列如SEQ ID NO.6所示；
NC04F：序列如SEQ ID NO.7所示，NC04R：序列如SEQ ID NO.8所示；
NC05F：序列如SEQ ID NO.9所示，NC05R：序列如SEQ ID NO.10所示；
NC06F：序列如SEQ ID NO.11所示，NC06R：序列如SEQ ID NO.12所示；
NC07F：序列如SEQ ID NO.13所示，NC07R：序列如SEQ ID NO.14所示；
NC08F：序列如SEQ ID NO.15所示，NC08R：序列如SEQ ID NO.16所示；
NC09F：序列如SEQ ID NO.17所示，NC09R：序列如SEQ ID NO.18所示；
ZL01F：序列如SEQ ID NO.19所示，ZL01R：序列如SEQ ID NO.20所示；
ZL02F：序列如SEQ ID NO.21所示，ZL02R：序列如SEQ ID NO.22所示；
ZL03F：序列如SEQ ID NO.23所示，ZL03R：序列如SEQ ID NO.24所示；
ZL04F：序列如SEQ ID NO.25所示，ZL04R：序列如SEQ ID NO.26所示；
ZL05F：序列如SEQ ID NO.27所示，ZL05R：序列如SEQ ID NO.28所示；
ZL06F：序列如SEQ ID NO.29所示，ZL06R：序列如SEQ ID NO.30所示；
ZL07F：序列如SEQ ID NO.31所示，ZL07R：序列如SEQ ID NO.32所示；
ZL08F：序列如SEQ ID NO.33所示，ZL08R：序列如SEQ ID NO.34所示。
本发明提供了上述的引物在三疣梭子蟹的群体遗传结构分析中的应用。
本发明所提供的微卫星引物可以用于三疣梭子蟹遗传多样性以及群体遗传结构的分析，而且其具有PCR扩增结果稳定，多态性高等特点，可以在三疣梭子蟹的群体遗传结构分析中得到应用。
本发明还提供了所述的微卫星引物在三疣梭子蟹的群体遗传结构分析中应用的具体分析方法，具体步骤包括：
(a)提取待分析群体基因组DNA；
(b)以所述DNA为模板，采用所述的微卫星引物进行分子标记检测；
(c)进行遗传结构分析。
分析方法中：所述的分子标记检测是指采用17对微卫星引物对DNA模板进行PCR扩增，其扩增体系为：
扩增程序为：
其中，50-60℃退火具体是指：NC0l标记的退火温度为60℃、NC02标记的退火温度为60℃、NC03标记的退火温度为60℃、NC04标记的退火温度为60℃、NC05标记的退火温度为60℃、NC06标记的退火温度为60℃、NC07标记的退火温度为60℃、NC08标记的退火温度60℃、NC09标记的退火温度为60℃、ZL01标记的退火温度为57.2℃、ZL02标记的退火温度为59℃、ZL03标记的退火温度为57.2℃、ZL04标记的退火温度为60℃、ZL05标记的退火温度为60℃、ZL06标记的退火温度为60℃、ZL07标记的退火温度为60℃、ZL08标记的退火温度为60℃。
PCR扩增产物用质量比浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果。
分析方法中：所述进行遗传结构分析是指利用Popgen32对PCR检测的结果进行群体遗传分析，计算等位基因数(Number of A11ele，A)、观测杂合度(ObservedHeterozygosity，Ho)和期望杂合度(Expected Heterozygosity，He)，利用U检验进行Hardy-Weinberg平衡，采用Bonferroni方法校正的显著性标准，根据P值判断杂合缺失或过剩；计算群体间Nei's遗传距离(Genetic distance，DA)，基于DA分别构建系统遗传树，用PIC-CALC软件对各微卫星位点的多态信息含量进行计算。
本发明提供的微卫星标记具有PCR扩增结果稳定、多态性高等特点，可用这些分子标记进行遗传多样性分析、群体遗传结构分析、遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等，具有很好的应用价值。
附图说明
图1是实施例3中7个地理群体遗传聚类分析结果。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1微卫星标记及引物的获得
三疣梭子蟹购自黄骅三疣梭子蟹原种场，在无菌条件下取其肌肉组织，提取肌肉组织总RNA，送生物公司进行转录组测序，获得转录组数据；利用MISA软件对组装得到的长度在1kb以上的unigenes进行SSR的鉴定，识别标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的精确SSR标记的最小重复数分别为9、6、5、4次，利用SSRHunterl.3进行SSR标记的筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物。以筛选到的SSR使用Primer Permier 6进行引物设计；设计的主要参数设置为：引物长度18-25bp为最适长度，PCR产物片段长度范围90-400bp，最适退火温度55-60℃；GC含量一般在40-60％之间，尽量避免二级结构出现。最终筛选出的17对引物序列，如表1所示，这17对引物的信息如下。
表1三疣梭子蟹微卫星引物及其对应的指标参数
实施例2利用微卫星引物对三疣梭子蟹遗传结构的分析方法
(1)基因组DNA的提取：参照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提供的方法提取基因组总DNA。DNA的质量检测：取2μL基因组总DNA用质量比浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，经EB染色、紫外凝胶成像系统成像后观察DNA是否降解以及是否有蛋白质残留；另外，将提取的DNA样品用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定其浓度，并以测得DNA浓度为参考，将基因组总DNA样品统一稀释为50ng/μL。
(2)采用所述的微卫星引物进行分子标记检测：以步骤(1)得到的统一稀释后的基因组总DNA为模板，采用实施例1获得的17对引物对其进行PCR分型检测，其扩增体系和扩增条件如下所示，PCR扩增产物用质量比浓度为8％的聚丙烯酸胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果；通过与pBR322DNA/MspⅠmarker分子量标准对比估算扩增片段大小范围。
PCR扩增体系如下：
PCR反应程序如下：
(3)根据步骤(2)PCR分型检测结果及其位置确定基因型，利用Popgen32进行群体遗传分析，计算等位基因数(Number of Allele，A)、观测杂合度(ObservedHeterozygosity，Ho)和期望杂合度(Expected Heterozygosity，He)，利用U检验进行Hardy-Weinberg平衡，采用Bonferroni方法校正的显著性标准，根据P值判断杂合缺失或过剩；计算群体间N e i's遗传距离(Genetic distance，DA)，基于DA分别构建系统遗传树，用PIC-CALC软件对各微卫星位点的多态信息含量进行计算。
实施例3对三疣梭子蟹遗传结构分析的应用
分析群体来自辽宁大连(DL)、辽宁葫芦岛(HLD)、河北秦皇岛(QHD)、河北黄骅养殖群体(HHYZ)、河北黄骅野生群体(HHYS)、山东东营((DY)、山东蓬莱(PL)七个群体的三疣梭子蟹，每个群体取60个样品，共420个样品，按照实施例2中的第(1)步提取各样品的基因组总DNA，以基因组总DNA为扩增模板，以实施例1获得的17对微卫星引物进行PCR分型检测，扩增体系、扩增条件和具体扩增步骤同实施例2的第(2)步，得到扩增产物用质量比浓度为10％的聚丙烯酞胺凝胶分离，经银染染色，记录扩增结果，并检测扩增产物的片段大小。其中部分扩增片段分别如SEQ ID NO.35(采用NC01引物扩增)，SEQ ID NO.36(采用NC02引物扩增)，SEQ ID NO.37(采用NC03引物扩增)，SEQ ID NO.38(采用NC04引物扩增)，SEQ IDNO.39(采用NC05引物扩增)，SEQ ID NO.40(采用NC06引物扩增)，SEQ ID NO.41(采用NC07引物扩增)，SEQ ID NO.42(采用NC08引物扩增)，SEQ ID NO.43(采用NC09引物扩增)，SEQID NO.44(采用ZL01引物扩增)，SEQ ID NO.45(采用ZL02引物扩增)，SEQ ID NO.46(采用ZL03引物扩增)，SEQ ID NO.47(采用ZL04引物扩增)，SEQ ID NO.48(采用ZL05引物扩增)，SEQ ID NO.49(采用ZL06引物扩增)，SEQ ID NO.50(采用ZL07引物扩增)，SEQ ID NO.51(采用ZL08引物扩增)。
用17对三疣梭子蟹的微卫星引物对7个群体的三疣梭子蟹野生群体进行了遗传多样性分析，所有的微卫星位点都显示足够的多态性，扩增后各个位点等位位点数及座位多态信息含量如表2所示，17对三疣梭子蟹的微卫星标记扩增获得50个等位位点，平均等位位点数为2.9，位点数介于2-4个。Ho值0.0098-0.656之间，平均为0.3402；He值在0.0049-0.6099之间，平均值为0.29，小于平均观测杂合度。17个等位位点的多态信息含量PIC介于0.0099-0.5821，平均值为0.2894。以上数据显示，7个三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性水平较低。对119个群体位点组合((7个种群×17个标记)进行Hardy-Weinberg平衡检验，结果见表3，92个群体位点组合符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，其他27个群体位点组合则显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。Hardy-Weinberg平衡检验P值结果显示，东营群体、黄骅野生群体和秦皇岛群体显著偏离Hardy-Weinberg平衡的组合都为5个，大连群体为4个，黄骅养殖群体和蓬莱群体为3个，葫芦岛群体最少为2个。Fis结果证实很多位点存在杂合子不足的现象(Fis>0)。
表2 7个三疣梭子蟹群体的17个微卫星标记汇总统计
表3 Hardy-Weinberg平衡检验P值和Fis值
注：Fis代表近交系数；P代表显著偏离Hardy-Weinberg平衡概率值
7个群体间的Nei氏遗传距离和遗传分化指数(Fst)如表3和表4所示，经UPGMA聚类分析显示如图1所示，大连和东营的先聚为一类，然后再与蓬莱的聚为一类；葫芦岛和秦皇岛的聚为一类；黄骅野生和黄骅养殖的聚为一类。7个群体的遗传分化指数均介于0.0021-0.031之间，表明7个群体间遗传差异很小，可以不予考虑。
表4 7个群体间的Fst值(对角线下)和Ne i's遗传距离(对角线上)矩阵
由此以上分析结果可以说明，本发明提供的微卫星标记可以用于三疣梭子蟹遗传多样性以及群体遗传结构的分析，而且本发明提供的微卫星标记具有PCR扩增结果稳定，多态性高等特点，具有很好的应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的仟何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北大学
<120> 一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物及其应用
<130> 19.7.22
<160> 51
<170> PatentIn version 3.3
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tagaaggtaa ggactgatgt ttttgtatga gtgggagtcc ctcaggacct gtaaataaga 120
gaatggtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 180
tgtgtaattc actgtttgat ctgctgcact ctctgacgag acagccagac gttaccctac 240
ggaacgagct cagagctcat tgtttccgat cttcggatac gcctga 286
<210> 39
<211> 181
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 39
ctgtctgcct tattcatctc tcttgcttct gtctcgcttt ctgtttgttt tatccatccc 60
tgtagttcct gtgtagctgt ctatttgttt attcatctct ctctctctct ctctcttgtt 120
taattattca ttcacacatt ctagtcattt gtttacttgt ttgctatcta ccgcttatct 180
g 181
<210> 40
<211> 207
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 40
agcacatcct cctcaacatt gaacgactcc acatggtttt ggaggagatg gtggtggcag 60
gagagctact tgaaccctct attagaaatg ctctgagtcc catacagatg ttagatacta 120
tctcctccag ataatgcacc cctgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgctgggt 180
gggaaaaaag taggtagatg gatgtgt 207
<210> 41
<211> 272
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 41
gagccataca gagcacatca ttgaaagcat ccagtttttg tttgctacat tttgtatgaa 60
gctgaattac actgcttttc atgatgcctg aagatttgga atttcagtct aatgtgattg 120
caaatcttac tttcataatt atattttccc agatatatag tatgtataca gtaagaccac 180
cggtaagatc accacaactg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtc 240
gatgtgcgtg ctcatgtatg tatgtgcgtg tg 272
<210> 42
<211> 291
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 42
ttgtcctcca ttgactgtag ttattaattt ggttcatctt aggtgggctg ggctcttgtt 60
aacactgatc ctttattagt atcatcatta tttttattat tattattatt tttgcttatt 120
attattatta ttattattat tattattatt gtttcctaaa caacttaccc aacaaaaaga 180
caatttaatt tgtaatagaa agacaaaagt ctctagttta caaatataag tttctaatca 240
acttgcatat ctttttatta cttaaattat ttgaggcttg atacttcagt t 291
<210> 43
<211> 239
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 43
caccattgcc atcaccatca tcatcattac tgcaacacca gcagcggtaa taccagttgt 60
aacatcagct gtaaatgtcc tttattcatg aaaagattag atgatcgcga ttctgacgct 120
ccagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 180
agagagagag tcgtaccgct tctctttctc ctcttccact ttctcgtctc ttcctcagg 239
<210> 44
<211> 106
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 44
tcctcacttc atctcattcc ctgcaccgct cactccctct gtctgtctgt ctgtctgtct 60
gcaccaagcc catctggcat ataccccaga caaggtacca catgca 106
<210> 45
<211> 194
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 45
agggtgctct gataacagct gatatcatga agccatctgc cactgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtaa ggtaggtgat gcatgtataa 120
gcaggtacta tagttagccc tgtactagac gcttaatgaa tgtttacaag actgccggga 180
tgactgctga gttt 194
<210> 46
<211> 153
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 46
tgtgcaccaa ctcactcgaa cacttcattt ccctcctctt tgtctgtcct aaaactgctt 60
cactgcttca gccagccttt actagtctct actctgttgt tgttgttgtt gttcctcctt 120
actcgtgccc aaagtcacaa acactcgcac cac 153
<210> 47
<211> 198
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 47
agctttgctg gcagagaagt tggagatata ggtaaatttt atcataactg aaatgtaatt 60
gtgccatcat catcatcatc atcatcatca tcatcatcat cattataata tgagtgaaaa 120
cagttttctt ccctggaaga tgcactatac acaggtatag gtactgtgcg cataagtatt 180
gagcgcagaa agtaccgt 198
<210> 48
<211> 163
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 48
agaatgttgc catggctgga acacttcaac aacgggtgca agtttgcagc cacgaatccg 60
gtggtggtgg tggtggtggt gcagagcctg ctgcatgaaa tggaggtgtc tgagtgacta 120
ctcaacactc agtctccacc tcaccaacgc actgatacag ggt 163
<210> 49
<211> 145
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 49
cccgcccctg tacattttca gtgtaatttt acattgccaa attaataaac cgtatattat 60
tattattatt attattatta ttatctttat gattttacgc tgaaatcaat ttaacaaaga 120
tggccgacca ccaagcctac caaca 145
<210> 50
<211> 175
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 50
tccagtacgc acagcatcag caccaccatc aggatggcaa tcacaatatc tgcaacacgt 60
ggcgctctca ccacctcacc atcacgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcacttg 120
cttgcatgta tgtgatgcat tagtggattg aaaattgtcg ctgactgttc gttct 175
<210> 51
<211> 115
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹
<400> 51
gcttctgctg ctggtcctta ctagaatttg gtaagcctga caatcaatca accaaccaac 60
caaccaacca accaactaac tgcctacatc aactacatgc tcagcaatgt ctggt 115
Claims (3)
1.一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物，其特征在于，包括17对微卫星引物，分别是：
NC0lF：序列如SEQ ID NO.1所示，NC0lR：序列如SEQ ID NO.2所示；
NC02F：序列如SEQ ID NO.3所示，NC02R：序列如SEQ ID NO.4所示；
NC03F：序列如SEQ ID NO.5所示，NC03R：序列如SEQ ID NO.6所示；
NC04F：序列如SEQ ID NO.7所示，NC04R：序列如SEQ ID NO.8所示；
NC05F：序列如SEQ ID NO.9所示，NC05R：序列如SEQ ID NO.10所示；
NC06F：序列如SEQ ID NO.11所示，NC06R：序列如SEQ ID NO.12所示；
NC07F：序列如SEQ ID NO.13所示，NC07R：序列如SEQ ID NO.14所示；
NC08F：序列如SEQ ID NO.15所示，NC08R：序列如SEQ ID NO.16所示；
NC09F：序列如SEQ ID NO.17所示，NC09R：序列如SEQ ID NO.18所示；
ZL01F：序列如SEQ ID NO.19所示，ZL01R：序列如SEQ ID NO.20所示；
ZL02F：序列如SEQ ID NO.21所示，ZL02R：序列如SEQ ID NO.22所示；
ZL03F：序列如SEQ ID NO.23所示，ZL03R：序列如SEQ ID NO.24所示；
ZL04F：序列如SEQ ID NO.25所示，ZL04R：序列如SEQ ID NO.26所示；
ZL05F：序列如SEQ ID NO.27所示，ZL05R：序列如SEQ ID NO.28所示；
ZL06F：序列如SEQ ID NO.29所示，ZL06R：序列如SEQ ID NO.30所示；
ZL07F：序列如SEQ ID NO.31所示，ZL07R：序列如SEQ ID NO.32所示；
ZL08F：序列如SEQ ID NO.33所示，ZL08R：序列如SEQ ID NO.34所示。
2.一种权利要求1所述的引物在三疣梭子蟹的群体遗传结构分析中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下方法分析，具体步骤包括：
（a）提取待分析群体基因组DNA；
（b）以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1的微卫星引物进行PCR分子标记检测；
（c）进行遗传结构分析。
Priority Applications (1)
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