CN114410806A

CN114410806A - 凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合及应用

Info

Publication number: CN114410806A
Application number: CN202210263206.8A
Authority: CN
Inventors: 王佳佳; 李吉涛; 李健; 刘萍; 王琼; 秦桢
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2021-05-18
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2042-03-17
Also published as: CN114410806B; CN113151503A

Abstract

本发明涉及一种凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合及应用，属于分子生物学技术领域，微卫星分子标记的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1‑14所示，所述微卫星分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15‑42；微卫星分子标记稳定扩增且具有多态性的，可用于凡纳滨对虾种质资源遗传多样性和遗传结构分析及家系鉴定，为凡纳滨对虾的遗传改良提供新的工具。

Description

凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合及应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾，其野生群体主要分布于墨西哥至秘鲁太平洋沿岸，具有温度、盐度适应性广，生长速度快，抗病力强等优点。自1988年引入我国并开展养殖以来，凡纳滨对虾已经发展成为我国重要的经济虾类，产量占海水养殖虾类总量的70％。目前，我国已成为世界上凡纳滨对虾养殖产量最高的国家。然后随着养殖产量的增大，随之而来的问题增多，种虾常年累代近交养殖、育种保种技术落后以及病害检验检疫松懈等导致其遗传多样性降低、种质退化严重、病害暴发频繁等现象发生，这对我国对虾养殖业的经济效益及可持续发展造成了严重的影响。因此，在凡纳滨对虾遗传选育过程中，及时评估已有群体的遗传资源现状，认清不同群体甚至个体间的分子遗传背景差异，制定合理配种方案，是优化国内凡纳滨对虾种质的有效途径。

遗传多样性是评估遗传资源状况的有效途径，其中基于微卫星标记的遗传多样性分析是最常用且有效的分子标记方法。微卫星标记凭借其多态性高、信息量多、重复性强、技术难度低等优点，被广泛应用于水产动物的遗传结构分析、种质评价及亲子鉴定等研究。因此在全基因组水平上筛选微卫星标记对于全面系统评估群体的多样性和遗传结构具有十分重要的价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合及应用，即筛选获得稳定扩增且具有多态性的微卫星分子标记，并应用于凡纳滨对虾群体遗传多样性、遗传结构分析以及家系鉴定等。

本发明首先提供一种凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合，所述微卫星分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15-42所示。

进一步，所述凡纳滨对虾多态性微卫星分子标记引物组合对应的微卫星分子标记的名称分别为：Lv01、Lv03、Lv09、Lv12、Lv18、Lv55、Lv99、Lv106、Lv119、Lv1291、Lv1292、Lv3201、Lv3202和Lv1969，微卫星分子标记的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1-14所示。

本发明还提供的所述微卫星分子标记引物组合的应用，所述应用为凡纳滨对虾的家系鉴定、遗传多样性及遗传结构分析，其具体的操作方法如下：

(1)提取凡纳滨对虾待检测样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用微卫星分子标记的引物组合进行PCR扩增，获得PCR产物；

(3)对PCR扩增产物进行多态性检测后，根据扩增产物的分子量大小明确凡纳滨对虾个体的基因型，并计算其遗传参数。

进一步，所述对Lv01、Lv18、Lv119和Lv3201位点的上游引物的5’端用FAM进行荧光标记，Lv03、Lv55、Lv1291和Lv3202位点的上游引物的5’端用HEX进行荧光标记，Lv09、Lv99、Lv1292和Lv1969位点的上游引物的5’端用ROX进行荧光标记，Lv12和Lv106、位点的上游引物的5’端用TAMRA进行荧光标记；所述PCR扩增完成后，具有不同5’端荧光标记的Lv01、Lv03、Lv09和Lv12的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv18、Lv55、Lv99和Lv106的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv119、Lv1291、Lv1292的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv3201、Lv3202和Lv1969的PCR产物混合到一个PCR管中检测。

进一步，所述的PCR反应体系包括10μL 2×Reaction Mix，0.4μL Golden DNAPolymerase(TIANGEN)，2μL DNA模板，1μL正向引物，1μL反向引物，5.6μL去离子水。

PCR反应程序如下：95℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明首次基于凡纳滨对虾全基因组序列信息，开发具有多态性且稳定扩增的微卫星分子引物，可用于凡纳滨对虾种质资源遗传多样性和遗传结构分析及家系鉴定，为凡纳滨对虾的遗传改良提供新的工具。

附图说明

图1凡纳滨对虾Lv01位点的部分STR检测结果；

图2凡纳滨对虾Lv03位点的部分STR检测结果；

图3凡纳滨对虾Lv09位点的部分STR检测结果；

图4凡纳滨对虾Lv12位点的部分STR检测结果；

图5凡纳滨对虾Lv18位点的部分STR检测结果；

图6凡纳滨对虾Lv55位点的部分STR检测结果；

图7凡纳滨对虾Lv99位点的部分STR检测结果；

图8凡纳滨对虾Lv106位点的部分STR检测结果；

图9凡纳滨对虾Lv119位点的部分STR检测结果；

图10凡纳滨对虾Lv1291位点的部分STR检测结果；

图11凡纳滨对虾Lv1292位点的部分STR检测结果；

图12凡纳滨对虾Lv3201位点的部分STR检测结果；

图13凡纳滨对虾Lv3202位点的部分STR检测结果；

图14凡纳滨对虾Lv1969位点的部分STR检测结果；

图15凡纳滨对虾群体聚类分析。

具体实施方式

以下的实施例对本发明作进一步描述，是对本发明进行说明而非对其加以限定。下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店可以购买得到的。

实施例1

1.凡纳滨对虾DNA的提取

参照传统的酚氯仿的方法提取凡纳滨对虾肌肉组织的DNA。取凡纳滨对虾的肌肉组织0.05g放在2ml的离心管中，加入500μl裂解缓冲液，加入15μl蛋白酶K用于除去蛋白质，60℃水浴锅中消化温育1-2h；待澄清后，冷却5分钟，加入等体积(500μl)的酚氯仿异戊醇(25：24:1)，充分混匀；室温12000g离心15分钟，吸取上清400μl，加入等体积的冷的异丙醇(-20℃)，上下颠倒10次，出现白色絮状的沉淀；用95％的乙醇洗涤DNA，加入灭菌的双蒸水溶解。用1％琼脂糖胶检测DNA的质量，测定浓度后，把DNA稀释到50ng/μl，4℃或者-20℃保存备用。

2.微卫星多态性位点检测

根据凡纳滨对虾的基因组筛选微卫星位点，根据微卫星位点设计引物，并检测引物的多态性，共获得具有多态性的引物14对。14个微卫星位点分别为Lv01、Lv03、Lv09、Lv12、Lv18、Lv55、Lv99、Lv106、Lv119、Lv1291、Lv1292、Lv3201、Lv3202和Lv1969；所述微卫星分子标记Lv01的重复序列为(GGA)6；

所述微卫星分子标记Lv03的重复序列为(GA)13；

所述微卫星分子标记Lv09的重复序列为(TG)7；

所述微卫星分子标记Lv12的重复序列为(GA)67；

所述微卫星分子标记Lv18的重复序列为(TTTTG)5；

所述微卫星分子标记Lv55的重复序列为(AC)27；

所述微卫星分子标记Lv99的重复序列为(TCT)5；

所述微卫星分子标记Lv106的重复序列为(AG)9；

所述微卫星分子标记Lv119的重复序列为(GT)7；

所述微卫星分子标记Lv1291的重复序列为(GAT)5；

所述微卫星分子标记Lv1292的重复序列为(CCT)6；

所述微卫星分子标记Lv3201的重复序列为(TC)26；

所述微卫星分子标记Lv3202的重复序列为(AG)26；

所述微卫星分子标记Lv1969的重复序列为(CA)7。

所述的凡纳滨对虾14对微卫星分子标记的多态性引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.15-42所示，具体如表1。

表1 14个微卫星位点对应的引物序列。

3.凡纳滨对虾基因型及数据分析

在获得14对微卫星位点后，进行荧光标记引物的合成，所述引物序列由生物工程(上海)股份有限公司合成，使用引物组合对30个凡纳滨对虾进行PCR扩增，PCR反应体系包括10μL 2×Reaction Mix，0.4μL Golden DNA Polymerase(TIANGEN)，2μL DNA模板，1μL正向引物，1μL反向引物，5.6μL去离子水。反应程序如下：95℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。具有不同5’端荧光标记的Lv01、Lv03、Lv09和Lv12的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv18、Lv55、Lv99和Lv106的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv119、Lv1291、Lv1292的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv3201、Lv3202和Lv1969的PCR产物混合到一个PCR管中检测。使用ABI 3730XL测序仪(Applied Biosystems,美国)获得180个凡纳滨对虾每个SSR位点的基因型信息。

等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)使用POPGENE version 1.32(Yeh,1999)进行计算；据Botstein等(1980)计算多态性信息含量(PIC)的方法(Botstein et al.,1980)，利用PIC-CALC软件计算每个SSR位点的多态性信息含量。

由图1-14、表2可看出，本发明的14个微卫星标记在供试的凡纳滨群体中都出现多态性。14个SSR位点共检测出208个等位基因，等位基因数范围为6～25个，平均每个位点有14.9个等位基因；有效等位基因数的范围为2.472～12.946个，平均每个位点有6.055个；观测杂合度的范围为0.112～0.994，平均观测杂合度为0.462；期望杂合度的范围为0.234～0.925，平均期望杂合度为0.736；多态信息含量的范围为0.226～0.918，平均多态信息含量为0.711。根据Botstein等的标准，多态信息含量≥0.05为高度多态，本发明有12个位点为高度多态性位点。由此可见，本发明的这14个微卫星标记可提供丰富的遗传信息，能用于研究凡纳滨对虾种群遗传多样性评估、遗传结构分析和个体遗传关系分析等。

表2 14个多态性微卫星位点的遗传信息

实施例2使用14个多态性微卫星引物进行凡纳滨种群多样性及结构分析

实验所用凡纳滨对虾分别取自3个国内养殖群体(CT、CG和CH群体)和3个国外养殖群体(FO、FM和FT)，每个群体被选取30尾，合计180尾凡纳滨对虾样品。分别剪取适量的肌肉组织，置于2mL无菌的离心管中，保存于95％酒精，带回实验室用于DNA提取和分析。提取DNA的方法、PCR扩增体系、PCR反应条件、基因型检测同实施例1。

等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、遗传一致度、遗传距离和Nei氏遗传距离使用POPGENE version 1.32(Yeh,1999)进行计算；据Botstein等(1980)计算多态性信息含量(PIC)的方法(Botstein et al.,1980)，利用PIC-CALC软件计算每个SSR位点的多态性信息含量；根据Nei氏遗传距离，采用Mega6.0软件的非加权配对算术平均法来构建群体间聚类图。

凡纳滨对虾不同群体的遗传多样性参数如表3所示，国外群体FT群体的期望杂合度、多态信息含量最高，国内群体CH的等位基因数和有效等位基因数最高，国内群体CG的等位基因数、杂合度和多态信息含量最低。说明FT群体具有较高的杂合度、CH群体具有较多的遗传信息，而CG群体的杂合度和遗传信息都较少。

表3 6个凡纳滨对虾群体的遗传特性

如表4所示，根据Wright的建议，FM和FT间的遗传分化水平最低(Fst＝0.0133)，且国外3个群体间的遗传分化水平均为低程度的遗传分化(Fst<0.05)。国内群体CG和国外群体FO群体间的遗传分化水平最高(Fst＝0.0814)。

如表5所示，6个群体间的遗传距离介于0.142-0.485。CG与FO群体间的遗传距离最远(0.485)，遗传相似度最低(0.616)。FT和FM间的遗传距离最近(0.142)，遗传相似度最高(0.868)。如图2所示，根据Nei氏遗传距离构建的UPGMA聚类树，所有群体分为两大类，FM首先与FT聚为一类，再与FO聚为一类，最后与CT聚为一大类；CG与CH群体聚为一大类。

表4 6个凡纳滨群体的遗传分化指数

表5凡纳滨群体间的遗传一致性和遗传距离

注：对角线上方为遗传一致度，下方为遗传距离

1微卫星位点lv01：

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2微卫星位点lv03

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3微卫星位点lv09

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4微卫星位点lv12

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5微卫星位点lv18

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6微卫星位点lv55

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7微卫星位点lv99

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8微卫星位点lv106

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9微卫星位点lv119

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11微卫星位点lv1292

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12微卫星位点lv3201

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微卫星位点lv3202

tgtccacattacatacaagggaagatttatattttagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagaaaatatgcagagtaggccaaatactgatattaacataataatatatgaatatctctccttcaattttctcttactggtgactggacacattatgatgtgtgtatttgcaaaagtaattgtacaattgtgtgcctttaacccatt

14微卫星位点lv1969

aagaggcactgaccactttatcaacacagaaaaattgccaacacaaacttccaaatctttcaaatctgagggcaaacaaaacaaattcataattataaaaatatttgtgaccaactaaccaaattcttttaagccacatcatgatgaggtatcaaattcaagctgtatgtcaacttaaacaagagcacatgcacacttgaacacacatatacacgcacacgcaccacacacacacacatgcacccacacacacacaacacacatacacacatgcaagcctatacaaatacaatttacttattgttttaattcaaagaaaatcaaaacaactgtaactacccctccaattcgagtact。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合及应用

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 210

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

gaggacgacc ttgatgatga catagccttc ctcgaggaag aggactacga agatggggaa 60

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<210> 2

<211> 156

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

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<210> 3

<211> 265

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 3

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<210> 4

<211> 366

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 4

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<210> 5

<211> 290

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 5

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<210> 6

<211> 302

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 6

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ca 302

<210> 7

<211> 357

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 7

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<210> 8

<211> 242

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 8

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<210> 9

<211> 137

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 9

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 10

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<210> 11

<211> 255

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 11

atttcccaac ttccacccca tcatctttct caatcttccc tctcctccac ctcctcctcc 60

tcctcctctt cctcttcctc gattcatttc atcctccatt ctattgcttc tcctcttctc 120

cttcatttcc tccttcctct ctcctttctt ccttgaccca tttcatcctc cttcctactg 180

cttctccttc tcttctgctt ctcctcctct tctccatcct tcttcctcga ttcatttcat 240

tctcccttct attgc 255

<210> 12

<211> 311

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 12

ccttgggact tagcgttgga aagaaatacc cttactcttt ttccactccg agaaatagtg 60

actttaaatt taagtatttg ctgttatatt tattctttgg cattctctct ctctctctct 120

ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctcttctc ctcctcctgt ctctctcgcc 180

ctcgctcgcg ttctcataca atctttactt cccaaattcc tctaagagct ggagagctac 240

ccacattatg tactactacc gatctatctt ctgaaccaag agaacaatca tgcctttctc 300

cctatcgtta c 311

<210> 13

<211> 336

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 13

tgtccacatt acatacaagg gaagatttat attttagaga gagagagaga gagagagaga 60

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 120

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180

gagagagaga gaaaatatgc agagtaggcc aaatactgat attaacataa taatatatga 240

atatctctcc ttcaattttc tcttactggt gactggacac attatgatgt gtgtatttgc 300

aaaagtaatt gtacaattgt gtgcctttaa cccatt 336

<210> 14

<211> 357

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 14

aagaggcact gaccacttta tcaacacaga aaaattgcca acacaaactt ccaaatcttt 60

caaatctgag ggcaaacaaa acaaattcat aattataaaa atatttgtga ccaactaacc 120

aaattctttt aagccacatc atgatgaggt atcaaattca agctgtatgt caacttaaac 180

aagagcacat gcacacttga acacacatat acacgcacac gcaccacaca cacacacatg 240

cacccacaca cacacaacac acatacacac atgcaagcct atacaaatac aatttactta 300

ttgttttaat tcaaagaaaa tcaaaacaac tgtaactacc cctccaattc gagtact 357

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaggacgacc ttgatgatga ca 22

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgcctcgtaa tcttcgcc 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcttagcgtt tcaaacagac 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agaggggaaa gaagaatgt 19

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgtatgtgc ctgtatggat gta 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aagtagaggc agtacacgaa cat 23

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gccacccatc agcaaacat 19

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gacctgcctc gttcttctca 20

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcgcttcagt gggagtgg 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

acccgaacag cgaacacc 18

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccttctccct cagcaacaca g 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgacggtaag gaacgccaat 20

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

taaatctgtc tatctatcgg tctg 24

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gcgacatctg aacattagtg a 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gacatattcg gcgatctgtg t 21

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agcatcacct ttgcgttca 19

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaaactaact gcaaccggc 19

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aagttcatgg tggctttgtc t 21

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cgtcttgatt gccgtgtaa 19

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tcttcttcgc ccacttgtt 19

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atttcccaac ttccacccc 19

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gcaatagaag ggagaatgaa atg 23

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ccttgggact tagcgttgg 19

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gtaacgatag ggagaaaggc at 22

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tgtccacatt acatacaagg ga 22

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

aatgggttaa aggcacacaa 20

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

aagaggcact gaccacttta tc 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

agtactcgaa ttggaggggt a 21

Claims

1.一种凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合，其特征在于所述微卫星分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15-42所示。

2.根据权利要求1所述的一种凡纳滨对虾微卫星标记的引物组合，其特征在于所述凡纳滨对虾多态性微卫星分子标记引物组合对应的微卫星分子标记的名称分别为：Lv01、Lv03、Lv09、Lv12、Lv18、Lv55、Lv99、Lv106、Lv119、Lv1291、Lv1292、Lv3201、Lv3202和Lv1969，微卫星分子标记的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1-14所示。

3.权利要求1所述微卫星分子标记引物组合的应用，其特征在于所述应用为凡纳滨对虾的家系鉴定、遗传多样性及遗传结构分析，其具体的操作方法如下：

(1)提取凡纳滨对虾待检测样品的基因组DNA；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于在步骤(2)对Lv01、Lv18、Lv119和Lv3201位点的上游引物的5’端用FAM进行荧光标记，Lv03、Lv55、Lv1291和Lv3202位点的上游引物的5’端用HEX进行荧光标记，Lv09、Lv99、Lv1292和Lv1969位点的上游引物的5’端用ROX进行荧光标记，Lv12和Lv106、位点的上游引物的5’端用TAMRA进行荧光标记；所述PCR扩增完成后，具有不同5’端荧光标记的Lv01、Lv03、Lv09和Lv12的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv18、Lv55、Lv99和Lv106的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv119、Lv1291、Lv1292的PCR产物混合到一个PCR管中检测，具有不同5’端荧光标记的Lv3201、Lv3202和Lv1969的PCR产物混合到一个PCR管中检测。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的PCR反应体系包括10μL 2×ReactionMix，0.4μL Golden DNA Polymerase，2μL DNA模板，1μL正向引物，1μL反向引物，5.6μL去离子水；PCR反应程序如下：95℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。