CN112725459B - 与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列、引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列、引物及应用，属于虾类分子标记辅助育种技术领域，所述SNP标记的核心序列、引物序列分别如SEQ ID NO.1‑6所示，利用所述引物进行分型的方法如下：提取中国对虾个体基因组DNA，利用SNP标记分型引物，采用荧光定量PCR法对中国对虾个体进行SNP标记分型，确定每个个体的基因型。由于SNP标记FC1516与中国对虾的耐高pH性状密切关联，且该方法是一种建立在DNA水平上的分子标记检测方法，因此可快速、准确地检测该位点的基因型，用以筛选、淘汰对高pH胁迫不耐受或敏感个体，加快中国对虾耐高pH胁迫性状选育进程和准确性。

Description

与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列、引物及应用
技术领域
本发明属于虾类分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列、引物及应用。
背景技术
分子标记辅助育种技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对水产动物的重要经济性状进行遗传改良，具有快速、准确、不受环境条件干扰等优点。
SNP，即单核苷酸多态性，是由美国麻省理工学院的Lander于1996年提出一种遗传标记系统，是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异而使得DNA序列呈现出多态性，常表现为单个碱基的转换或颠换、缺失或者插入，但主要以转换和颠换为主，二者出现的比例为2:1。SNP作为第三代遗传标记，由于其分布密度高、多态性丰富和稳定遗传等特性广泛应用于水产动物的种质资源评价、亲缘关系鉴定、高密度遗传连锁图谱构建以及分子标记辅助育种等领域。
中国对虾是我国黄渤海重要的经济虾类，也是我国北方重要的海水养殖物种，在养殖发展盛期占我国对虾养殖产量的70％，在扩大渔民就业、增加渔民收入和繁荣农村经济发挥了重要作用。但自1993年对虾病毒性疾病暴发以来，中国对虾的养殖总产量急剧下降，直到2000年以后才逐渐恢复生产。
近年来日益增长的市场需求和产业获得的客观利润以及野生资源的不断减少，推动中国对虾养殖业的不断发展，但种质和逆境胁迫等因素依然是制约产业发展的突出问题。虽然我国相继培育出“黄海”系列水产新品种，但其选择目标主要集中在表型值易于度量且遗传力高的生长性状，对于遗传力低、性状测试难度大的抗逆性状选育进展缓慢。因此，采用分子标记辅助育种技术发掘具有优异抗逆性状的种质材料，培育抗逆能力强的中国对虾新那种是当前育种工作的首要任务之一。
关于中国对虾SNP标记的开发多见于SNP标记筛选、开发及群体遗传多样性分析等，可用于种质资源评价及种质材料挖掘的SNP标记数量缺乏。
发明内容
本发明解决的问题在于提供了一种与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列、引物及应用，针对中国对虾耐高pH胁迫性状，开发与其紧密连锁的SNP标记，构建的中国对虾转录组文库中含有的FC1516SNP标记的核心序列，在其序列两端设计SNP标记扩增引物进行特异性扩增，通过设计SNP标记分型引物采用荧光定量PCR法对中国对虾个体进行SNP位点分型，从而快速、准确地检测该位点的基因型，用以筛选、淘汰对高pH胁迫不耐受或敏感个体，加快中国对虾耐高pH胁迫性状选育进程和准确性。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列，所述SNP标记与中国对虾耐高pH胁迫性状相关，所述SNP标记的核心序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，位于该序列自5’端起第1516位核苷酸位点，其碱基为G或T，该位点即为SNP标记FC1516。
本发明提供了用于检测中国对虾SNP标记FC1516的扩增引物，正向引物序列如SEQID NO.2所示5’-ACCAATGGTCTCCCCTTCC-3’；反向引物序列如SEQ ID NO.3所示5’-AATCATCTCATCAGGACTGCTTG-3’。
本发明还提供了一种与中国对虾耐高pH胁迫性状相关的SNP标记分型引物，正向引物序列如SEQ ID NO.45’-CAGAACTTGACAACCTGACCTtTT-3’和SEQ ID NO.55’-CAGAACTTGACAACCTGACCTtTG-3’，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示5’-TCTCATCAGGACTGCTTGTGG-3’。
此外，本发明还提出一种与中国对虾耐高pH胁迫性状相关的SNP标记的检测方法，包括如下步骤：首先提取中国对虾群体间或群体内个体基因组DNA；利用SNP标记分型引物，采用荧光定量PCR法对中国对虾个体进行SNP标记分型，确定每个个体的基因型；SNP标记的GT基因型个体对高pH胁迫的耐受性显著高于GG和TT基因型个体。
进一步的，中国对虾肌肉组织的基因组DNA采用酚-氯仿法进行提取。
进一步的，荧光定量PCR扩增体系为：中国对虾基因组DNA100ng，2×ChamQTM SYBRColor qPCR 10μL，10μM正反引物各1μL；50×ROX II 0.4μL，加灭菌水至20μL；PCR反应程序为：95℃30sec；95℃10sec，60℃30sec，72℃40sec，40个循环；95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec。
本发明还提供所述SNP标记分型引物在中国对虾耐高pH值品种选育中的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
利用本发明标记能够快速、准确地检测该位点的基因型，用以筛选、淘汰对高pH胁迫不耐受或敏感个体，加快中国对虾耐高pH胁迫性状选育进程和准确性。
附图说明
图1是PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶检测电泳图；
图2是FC1516位点荧光定量PCR反应的生长曲线(基因型从上往下依次为TT、GT、GG)。
具体实施方式
为使本发明的特征及优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细说明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：中国对虾个体基因组DNA的提取
取中国对虾肌肉组织约0.1g于2.0ml离心管中，加入组织裂解液700μL，加入研磨珠，用组织匀浆机匀浆样品；缓缓加入30μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，60℃水浴3h，每30min摇一次，澄清后冷却至室温；加入700μL的酚-氯仿，摇匀后，12000rpm离心15min；取上清加入600μL的酚氯仿异戊醇(25:24:1)，摇匀后，12000rpm离心15min；取上清加入500μL的异丙醇，12000rpm离心10min；挑出DNA用70％的乙醇洗涤，常温干燥，用灭菌水将其稀释成50ng/μL，-20℃保存备用。
实施例2：SNP标记扩增引物的设计
在中国对虾转录组文库中含有FC1516SNP核心序列的基础上，在其两端设计特异性引物，用于扩增出该位点的DNA片段。本发明SNP核心序列两端的特异性引物序列为：正向引物：5’-ACCAATGGTCTCCCCTTCC-3’；反向引物序列为：5’-AATCATCTCATCAGGACTGCTTG-3’。
PCR扩增体系为：中国对虾基因组DNA100ng，10×PCR Buffer 2.5μL，25mM MgCl21.5μL，2.5mM dNTP 2μL，10μM正反引物各2μL；加灭菌水至25μL；PCR反应程序为：94℃变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃10min。PCR反应程序为：94℃变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃10min。
PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳检测确定其特异性后，扩增结果见图1，挑选明亮且单一的条带进行测序。获得中国对虾FC1516SNP位点的核心序列为：
GTGGTGATGATGATAATAATGATGATGATGATGATGATAATATGATGATGATGATAACAAAAAATCTCAAATCACATATTAATCTCCTTTCATATATCATTTCCTCTGTTACTCCTTGCTAATTGCAGCAGCCACAAAGTCTTCCACCTGCTTCTTCACAGCCTGGACTCTCTGAGGTGTTCCATGAGTCTTCTCAAAGTCCAGGAACTTCTTGAAGATCCCGCGCATCTTGCGGATCTTGAGCTTCAGGCCTGTCATGCGTTCCAGGACCGTCCTTGCCCCTTCTATATCTCCGTTCTTGGTCAACAGATCCACATAGACACTCCAAATGTCGATACGTTTGGGATAGTTGCTGAGCAGACTCTCGAACATGGTCCTGCCCCTCTCTGCCTCTCCAAACCTGAATTCAAGCTGCCCAAAGCGGTTGATGAGCTCCACATGATGCTTCTTGTCCAAGGCGATCAGTGCTCTATCCATATACTTTCTGGCTTCATCAAACTTTTTATTTCTATAGAAGAAAATCCCTGCTTTAATCCACACATCCAGCACTTGGCCAAACTTCTTGGTCATAATGTAGTAGATGTTGGAGGCATCCTTAATTTTATCATTCTCAGCATAGACCATAGCCATGGCAAGGTGCACCTGTTGCTCGTCATTTGTGGCCAAAGCCTCACGATACGACGCCTGAACAGTCTCTGCCGTCCCATAGAGCACCTCAAGTCTCAGAATCACTGTCCAGATATTAAGTCTCTCTTGCTCCTCGCGCATGTTGATCACCTGCAGTGCACGCCGGGCAACTGCCTTCGCCTTCTCCATCTCTGCGCTCTCCAGATGGAAGCTAATGAACTGAATCCAAACTGCTGAGGAGTTTGGACTTGTCTGCAAGAGCTCCTCATAGTCCATGGCAGTTTGTGGCAGTCGATCCTTATCCAGCCTTGCACGTTCGAGCTCATGCAGTCGCTGTTCCTCCTGCTTGGCCATGGCCTCACGCTCTGCCTTTGTCATCTTCTTGGTTTTCTTCTTTTTTGCTTCATCCTCCTCTTCCTCTTCACTCTCACTGGACTGCTCCTTGTCCGCAAGAGAGTCTGGGACATCCCATACAAAGCCAGTCCCTACAGAGAGGCATGGCTTCTTGCTCGTCAGTCCAGCATCACTTTCCAAATTTGCATCTTTTACTTCTTCATCCTCCACATTCTTTTCTCTGCCTTTCTTATCTTTCTTCTTCTTTTTCTTTTCTGTTCCCTCATCCTTCTCTGTGGTCTCTGTGTCTATATTACATTCCTCTTCCTTTTTACGTTTCATTCCTTTTTGCTTCTCAGTTTCCTCTATCTTCTTTGTTTGGTCAATGGTTTCTGCTTTCTTTTTGGTTTCTTCATTTTCACCAATGGTCTCCCCTTCCTCATCTTCAGTCTCTTCCTCAGCATTAACCAAGTCTTTGTCAATACGTAGAGTTAGTGTCATCTTCTCTGTCGCTGGGTTCACCTTAGTGATACAGAACTTGACAACCTGACCTATT(G)GTGAAAATTGTATCCAGACTTGTCTCCTTTTCTGATGTGGCTAGGCTCTTGGGTACAAAACCTTTCACATTATTATACATAGCCACAAGCAGTCCTGATGAGATGATTTTCACAATGTACCCCTCTGACACAGTGCCTACCAGATCAGAGTCATATTCAGAGATAACCGGAAACGGTGAGTTGACCAGATGCTTCTTACTTGTGAGCTTGATAATCTTCCTCTCCGGCATCACATGCAACACTCTGCAGTCCAAAACTAAGCCACGGCGATACTTCTTCTCTGGGTTCTTTAACTGTTTATCTAACATCAGGTAATCAATGTGGCCAGAAACCGTCTTGCTGAGGGCCACTAGTACCCCACGGTCTTTGCAGCACTTTACAGTTGCTTGCAGTTTTGCACCTGCTTCTACCTCTTCATAGCTTAACTTCTCTTGCATAGGTTTGGATTTTTTTTTAGGTTTCTTCAACCCGAGTTTTGCCTTGCCATTCATGAGCTTTTCCTTCTTGCCTCCGCTCTTCTCACTGGATGGGCTAACCTCAGACACCAAAGGAACCTGTTCATCTGGTACCTTTTCGCATTCTTCACTAGATTTCTCTGAGCCAAGTTCCTCTTCGCCACTCTTGGGCTTTTTCTTCTTGCCTTTGCTTTTCTTAACCGATGGTTTTACCTCAGACACTGAAGGAACCTGTTCATCTGGTGCCTTTTCGTGATCTTCGCTAGGTTTCTCTGAGCCAAGTTCTGTCTTGCCGCCCTTGAGCTTTTTCTTCTTGCCTTTGCTTTTCTTAACCGATGGTTTTACCTCAGGTTCCAAAGGAGCATGTTCATCTGGTACCTTTTCATGTTTTTCACTAGGTTTCTCCGAGCCAAGTTCCTTCTTGCCACCCTTGCG。
实施例3：中国对虾SNP标记与耐高pH性状的关联分析
中国对虾耐高pH胁迫试验：取400尾健康、无病的中国对虾于室内水泥池暂养三天后，利用0.5mol/L的HCl和1mol/L的NaOH调制海水pH为pH＝9.3±0.05进行胁迫试验；胁迫后每隔4～6h对试验水体的pH进行校正，每隔2h左右将死亡或频死个体捞出，收集最先死亡的48尾对虾作为敏感组，最后死亡的48尾对虾作为耐受组。
SNP标记分型引物的设计：本发明所述SNP标记分型引物，其中正向引物序列：5’-CAGAACTTGACAACCTGACCTtTT-3’和5’-CAGAACTTGACAACCTGACCTtTG-3’；反向引物序列：5’-TCTCATCAGGACTGCTTGTGG-3’。
荧光定量PCR扩增体系为：中国对虾基因组DNA100ng，2×ChamQTM SYBR ColorqPCR 10μL，10μM正反引物各1μL；50×ROX II 0.4μL，加灭菌水至20μL；PCR反应程序为：95℃30sec；95℃10sec，60℃30sec，72℃40sec，40个循环；95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec。
SNP位点与耐高pH性状的关联分析：采用荧光定量法对敏感组和耐受组的中国对虾个体基因组DNA进行扩增，通过荧光定量的生长曲线进行分型，对应的基因型分别为GG、TT和GT，如图2所示。
96个中国对虾样品在FC1516位点的分型结果见下表1。
表1. 96个中国对虾样品在FC1516位点的分型结果
Figure BDA0002730800050000081
由卡方检验结果表明FC1516位点与中国对虾耐高pH性状存在极显著相关P<0.01，且GT基因型个体对高pH胁迫的耐受性显著高于GG和TT基因型个体。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列、引物及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2406
<212> DNA
<213> 中国对虾(Fenneropenaeus chinensis )
<400> 1
gtggtgatga tgataataat gatgatgatg atgatgataa tatgatgatg atgataacaa 60
aaaatctcaa atcacatatt aatctccttt catatatcat ttcctctgtt actccttgct 120
aattgcagca gccacaaagt cttccacctg cttcttcaca gcctggactc tctgaggtgt 180
tccatgagtc ttctcaaagt ccaggaactt cttgaagatc ccgcgcatct tgcggatctt 240
gagcttcagg cctgtcatgc gttccaggac cgtccttgcc ccttctatat ctccgttctt 300
ggtcaacaga tccacataga cactccaaat gtcgatacgt ttgggatagt tgctgagcag 360
actctcgaac atggtcctgc ccctctctgc ctctccaaac ctgaattcaa gctgcccaaa 420
gcggttgatg agctccacat gatgcttctt gtccaaggcg atcagtgctc tatccatata 480
ctttctggct tcatcaaact ttttatttct atagaagaaa atccctgctt taatccacac 540
atccagcact tggccaaact tcttggtcat aatgtagtag atgttggagg catccttaat 600
tttatcattc tcagcataga ccatagccat ggcaaggtgc acctgttgct cgtcatttgt 660
ggccaaagcc tcacgatacg acgcctgaac agtctctgcc gtcccataga gcacctcaag 720
tctcagaatc actgtccaga tattaagtct ctcttgctcc tcgcgcatgt tgatcacctg 780
cagtgcacgc cgggcaactg ccttcgcctt ctccatctct gcgctctcca gatggaagct 840
aatgaactga atccaaactg ctgaggagtt tggacttgtc tgcaagagct cctcatagtc 900
catggcagtt tgtggcagtc gatccttatc cagccttgca cgttcgagct catgcagtcg 960
ctgttcctcc tgcttggcca tggcctcacg ctctgccttt gtcatcttct tggttttctt 1020
cttttttgct tcatcctcct cttcctcttc actctcactg gactgctcct tgtccgcaag 1080
agagtctggg acatcccata caaagccagt ccctacagag aggcatggct tcttgctcgt 1140
cagtccagca tcactttcca aatttgcatc ttttacttct tcatcctcca cattcttttc 1200
tctgcctttc ttatctttct tcttcttttt cttttctgtt ccctcatcct tctctgtggt 1260
ctctgtgtct atattacatt cctcttcctt tttacgtttc attccttttt gcttctcagt 1320
ttcctctatc ttctttgttt ggtcaatggt ttctgctttc tttttggttt cttcattttc 1380
accaatggtc tccccttcct catcttcagt ctcttcctca gcattaacca agtctttgtc 1440
aatacgtaga gttagtgtca tcttctctgt cgctgggttc accttagtga tacagaactt 1500
gacaacctga cctattgtga aaattgtatc cagacttgtc tccttttctg atgtggctag 1560
gctcttgggt acaaaacctt tcacattatt atacatagcc acaagcagtc ctgatgagat 1620
gattttcaca atgtacccct ctgacacagt gcctaccaga tcagagtcat attcagagat 1680
aaccggaaac ggtgagttga ccagatgctt cttacttgtg agcttgataa tcttcctctc 1740
cggcatcaca tgcaacactc tgcagtccaa aactaagcca cggcgatact tcttctctgg 1800
gttctttaac tgtttatcta acatcaggta atcaatgtgg ccagaaaccg tcttgctgag 1860
ggccactagt accccacggt ctttgcagca ctttacagtt gcttgcagtt ttgcacctgc 1920
ttctacctct tcatagctta acttctcttg cataggtttg gatttttttt taggtttctt 1980
caacccgagt tttgccttgc cattcatgag cttttccttc ttgcctccgc tcttctcact 2040
ggatgggcta acctcagaca ccaaaggaac ctgttcatct ggtacctttt cgcattcttc 2100
actagatttc tctgagccaa gttcctcttc gccactcttg ggctttttct tcttgccttt 2160
gcttttctta accgatggtt ttacctcaga cactgaagga acctgttcat ctggtgcctt 2220
ttcgtgatct tcgctaggtt tctctgagcc aagttctgtc ttgccgccct tgagcttttt 2280
cttcttgcct ttgcttttct taaccgatgg ttttacctca ggttccaaag gagcatgttc 2340
atctggtacc ttttcatgtt tttcactagg tttctccgag ccaagttcct tcttgccacc 2400
cttgcg 2406
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accaatggtc tccccttcc 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcatctca tcaggactgc ttg 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagaacttga caacctgacc tttt 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagaacttga caacctgacc tttg 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctcatcagg actgcttgtg g 21

Claims (5)

1.用于检测与中国对虾耐高pH相关的SNP标记FC1516的引物，其特征在于所述SNP标记FC1516与中国对虾耐高pH胁迫性状相关，所述SNP标记FC1516所在基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述SNP标记FC1516位于该序列自5’端起第1516位核苷酸位点，其碱基为G或T；所述引物的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一组权利要求1所述SNP标记FC1516的分型引物，其特征在于正向引物序列如SEQ IDNO.4 和SEQ ID NO.5 所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种权利要求1所述SNP标记FC1516的检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：首先提取中国对虾群体间或群体内个体基因组DNA；利用权利要求2所述的分型引物，采用荧光定量PCR法对中国对虾个体进行SNP标记分型，确定每个个体的基因型；SNP标记的GT基因型个体对高pH胁迫的耐受性显著高于GG和TT基因型个体。
4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述荧光定量PCR的扩增体系为：中国对虾基因组DNA 100ng，2×ChamQTM SYBR Color qPCR 10μL，10μM正反引物各 1μL；50×ROX II 0.4μL，加灭菌水至20μL；PCR反应程序为：95℃ 30sec；95℃ 10sec，60℃ 30sec，72℃ 40sec，40个循环；95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15 sec。
5.权利要求2所述SNP标记FC1516的分型引物在中国对虾耐高pH值品种选育中的应用。
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Application publication date: 20210430

Assignee: CHANGYI HAIFENG AQUACULTURE Co.,Ltd.

Assignor: YELLOW SEA FISHERIES Research Institute CHINESE ACADEMY OF FISHERY SCIENCES

Contract record no.: X2023980032134

Denomination of invention: Core sequence, primer and application of SNP marker related to high pH tolerance of Penaeus chinensis

Granted publication date: 20220429

License type: Common License

Record date: 20230215