CN102154287A - 一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记及其鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记及鉴定方法，本发明对中国对虾耐受高pH特异序列相关扩增多态性（SRAP）标记的筛选、克隆、测序、特异引物设计及特异标记的验证；根据获得的特异序列及设计的特异引物建立了中国对虾耐受高pH性状PCR鉴定方法。建立中国对虾耐受高pH特异SRAP标记筛选方法，从110对SRAP引物组合中筛选到1对引物组合产生1条耐受高pH特异SRAP片段，并首次构建了中国对虾耐受高pH性状PCR鉴定方法。本发明具有先进、稳定、可靠的特点，在中国对虾抗逆选育，增强中国对虾环境适应力，推广养殖面积等方面具有重要应用价值和广阔的应用前景。

Description

一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记及其鉴定方法

技术领域

本发明属于水产生物技术基因工程领域，涉及虾类耐受高pH相关分子标记和遗传鉴定技术，尤其涉及一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记及其鉴定方法。

背景技术

中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）自然资源主要分布在我国的黄、渤海海域及朝鲜半岛沿海。在上世纪90年代初产量达到20万吨以上，连续多年居世界首位，其中中国对虾的养殖产量占全国对虾养殖总产量的70%以上，但1993年遭受白斑病的重创后，对虾养殖生产严重滑坡，年产量长期在5万吨左右徘徊，所造成的经济损失高达上百亿元人民币。养殖过程中出现了生长速度减缓、对病害和环境胁迫抵御能力下降等问题，经分析认为优良种质资源匮乏、病害流行及养殖生态环境恶化是限制中国对虾健康养殖的重要因素，而品种是养殖的基础，因此尽早培育出耐受逆环境能力强、适应范围广的优良新品种（系），对于扩大中国对虾养殖面积，充分利用盐碱滩涂沼泽，提高农民收入，推动经济发展具有重要意义。

pH是中国对虾养殖环境中重要的环境因子，它直接影响对虾的存活、生长和渗透调节等生理功能。在养殖环境中pH受诸多因素的影响，大量换水、阴天暴雨和浮游植物优势种群的突然改变或消失以及水质严重污染等都会导致pH的急剧变化。在水生动物中关于pH的研究集中在对生物机体摄食（Charles L. 1980）、生长、存活、渗透压调节（Geoff L A ,1992; Dawn M. Scott, 2005）、对抗病力影响（J. Castro Rosas, 2005）以及生理生化反应（David L., 1990；Richard. F, 1996；Hugues Lemonnier, 2004；Stephen G. Reid, 2000；Sayyed Mohammad Hadi Alavi, 2005；Ru Liu, 2010）。

序列相关扩增多态性（SRAP）技术是由Li 和Qurios 于2001年研究芸薹属(Brassica species)植物时开发出的新型DNA分子标记技术。其基本原理是借助特定引物对基因组开放式阅读框进行扩增。SRAP技术可较紧密连锁基因组表达序列，有利于目标性状候选基因的筛选，且具有简便、稳定、中等产率、条带易回收、引物成本低以及部分共显性等优点。该技术已广泛应用于植物的遗传多样性分析（Budak H，2004）、杂交优势估计（Riaz A，2001）、比较基因组学研究（Li G，2003）、遗传连锁图谱构建（Lin Z X，2009）及相关基因定位（Alwala，2009）等研究中，但是在水产动物研究领域研究应用还较少，仅在罗氏沼虾(Macrobrachium Rosenbergii)（周劲松，2006）、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)（姚建华，2008）和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)（张志伟，2007；丁炜东，2008）的研究中见过报道。

传统的育种方法主要利用表型差异选择优良性状，但其受环境因素影响和选择强度的限制，对遗传力低的性状选择难度大、选择周期长耗时多，分子育种方法应运而生，而且迅猛发展的分子标记技术为其提供了技术支持。目前中国对虾育种性状的选择包括生长速度(刘萍, 2007; 何玉英, 2007）和抗病力(孟宪红, 2005; Yue Zhiqin, 2005)，而将选育与环境逆因素相结合，进行分子标记辅助育种，目前国内外还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术中利用传统育种方法筛选具有优良性状的中国对虾所存在的难度大且周期长缺陷，提供了一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记及其鉴定方法，可以快速筛选到中国对虾目标性状的基因，利用本发明所述方法可以对中国对虾进行快速筛选，筛选周期较短，且操作简单方便，可以适应行业发展的需要。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

扩增所述分子标记的SRAP特异引物为：

SEQ ID NO.1：5’-TGAGTCCAAACCGGAAT-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’。

扩增所述分子标记的SCAR特异引物为：

SEQ ID NO.3：5’-GCTCCTTCGGCTTCA-3’；

SEQ ID NO.4：5’-ATCAGGTCGTAATGC-3’。

本发明还提供了一种中国对虾耐受高pH性状的鉴定方法，它包括以下步骤：

(1) 采集中国对虾尾棘肌肉，提取基因组DNA；

(2) 选用SCAR特异引物，对步骤(1)提取的待测样品基因组DNA进行PCR扩增，所述SCAR特异引物为：

SEQ ID NO.3：5’-GCTCCTTCGGCTTCA-3’；

SEQ ID NO.4：5’-ATCAGGTCGTAATGC-3’；

(3) 将步骤(2)所得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，分析其电泳图谱，如扩增出339bp大小的特异片段，则说明待测样品遗传上具有耐受高pH性状；如没有扩增出特异长度大小的特异片段，则说明待测样品遗传上对高pH敏感。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中采用酚氯仿方法提取基因组DNA。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(2)中的PCR反应体系为：总体积20μL，包含1.0U Taq酶，2.0mmol/L的Mg²⁺，40.0ng的模板DNA，0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(2)中的PCR反应程序为：94℃预变性，5min；然后94℃变性0.5min，47.6℃，0.5min，72℃，1min，进行35个循环。72℃延伸5min，4℃保存。

本发明所述中国对虾耐受高pH性状的分子标记的筛选方法采用2001年Li和Qurios发明的SRAP分析方法，首先应用SRAP分子标记技术筛选中国对虾耐受高pH性状的相关特异SRAP标记，克隆测序，进行序列分析后，设计合适的特异引物，将SRAP特异标记转化为稳定方便的SCAR标记，结合这些特异SCAR标记，建立中国对虾耐受高pH性状鉴定方法。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明可在实验室范围内对中国对虾是否耐受高pH性状进行直接检测，不受环境条件和时间的限制。

2、本发明可对中国对虾在各个生长发育时期检测其是否耐受高pH性状，有利于中国对虾育种过程中具备优良性状中国对虾家系或群体的选择。

3、相比于传统的暂养、胁迫试验等操作消耗一周时间和精力，利用本发明进行中国对虾耐受高pH性状检测，可在1天内获得检测结果，省时省力。

4、利用本发明进行中国对虾耐受高pH性状检测，可在遗传上确定个体是否存在耐受高pH基因，与表型上耐受高pH区分开，有利于选育性状的选择。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明中中国对虾高pH胁迫试验的正态分布图。

图2为本发明中胁迫产生的耐受组PCR扩增产物中出现的特异SCAR标记电泳图，339bp的片段表示特异SCAR引物的扩增产物；M表示分子量标准。

图3为本发明中胁迫产生的敏感组PCR扩增产物中出现的特异SCAR标记电泳图，M表示分子量标准。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明的技术方案包括两大步骤：（一）筛选和克隆中国对虾耐受高pH性状相关特异SRAP标记，并转化为特异SCAR标记；（二）建立中国对虾耐受高pH性状的鉴定方法。

（一）筛选和克隆中国对虾耐受高pH性状相关特异SRAP标记，并转化为特异SCAR标记包括以下步骤：

1、中国对虾高pH胁迫试验及其肌肉DNA的提取

1）中国对虾高pH胁迫试验

从试验基地中每家系随机取样50尾健康中国对虾，暂养于室内水泥池对应围格内，严格统一的日常管理。暂养三天后，利用NaOH调节水体pH值为9.2（半致死pH值）进行胁迫试验四次，每24小时一次胁迫试验。胁迫后每隔2h将死亡个体捞出，记录死亡时间。根据攻毒后个体存活时间建立正态分布图，如图1所示，淘汰大多数中间类型，取两端各5个家系混合作为敏感组和耐受组。

2）中国对虾肌肉DNA的提取

按照常规酚氯仿方法从敏感组和耐受组中国对虾尾棘肌肉样品中提取基因组DNA，步骤如下：

a. 取肌肉组织100mg，剪碎后放入1.5ml离心管中，加入pH8.0的TE溶液（10mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA）475μl，切碎剪细；

b. 加入10％（pH7.2）SDS溶液25μl，混匀；

c. 加入10mg/ml RNase 2μl，37℃消化0.5-1h；

d. 加入500μl平衡后的重蒸酚抽提两次，每次10min，12000rpm离心10min，取上清；

e. 加酚：氯仿（1：1）各300μl，抽提一次，10min，12000rpm离心10min，取上清；

f. 加600μl氯仿抽提一次，5min，5000rpm离心10min，取上清；

g. 加入1/25（约20μl）体积的5M的NaCl溶液，混匀后再加入两倍体积（约700μl）-20℃保存的无水乙醇沉淀DNA；

h. 沉淀的DNA用70％的乙醇洗涤过夜，次日离心去乙醇后，静放使残留乙醇挥发完全后，用50μl灭菌水充分溶解，并于65℃水浴中灭活5-10min，-20℃保存备用。

通过琼脂糖电泳和核酸检测仪检测DNA质量，最终将DNA稀释为160ng/μL。

2、分群分析法（BSA）基因池的建立和SRAP引物的筛选

1）分群分析法（BSA）基因池的建立

提取胁迫试验获得的敏感组和耐受组样本肌肉DNA，各20份，每份样本取10μLDNA溶液混合构成相应的敏感池和耐受池。

2）SRAP引物的筛选

SRAP引物都是“填充序列+核心序列+选择性碱基”组成，正反向引物分别依靠“核心序列（CCGG和AATT）”结合扩增基因组的开放阅读框（ORFs）和启动子、内含子，获得基于内含子和外显子的SRAP多态性标记，根据已报道的科研文献筛选获得10条正向引物和11条反向引物，正向引物与反向引物两两配对组合产生110对引物组合，引物见表1。

表1   SRAP引物编号及序列

以所述110对SRAP引物（10条正向引物与11条反向引物，共110对引物组合）分别对两个DNA池进行PCR扩增，根据BSA池是否出现差异条带，筛选合适引物以进行群体扩增分析。

20μL的PCR反应体系为：1.0U Taq酶，2.0mmol/L的Mg²⁺，40.0ng的模板DNA，0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；前5个循环程序：94℃，1min；35℃，1min；72℃，1min。随后35个循环：94℃，1min；50℃，1min；72℃，1min。72℃延伸10min，4℃保持。

3、耐受高pH性状的相关特异SRAP标记的筛选

SRAP标记筛选包括以下步骤：1）敏感组和耐受组DNA的SRAP-PCR扩增；2）PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；3）电泳条带分析。

1）敏感组和耐受组DNA的SRAP-PCR扩增

反应条件和反应体系同SRAP引物的筛选中反应体系和反应程序。

PCR扩增结束后，向产物中加入4μL Loading Buffer（10mmol/L EDTA [0.5mol/L,PH=8.0]，98%甲酰胺，0.025%溴芬兰，0.025%二甲苯青）。混匀后放-20℃冰箱备用。

2）PCR扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

预电泳：800V预电泳30min，使温度达到50℃。

电泳：1000V恒压电泳90min

银染法染色：将凝胶板置于1.5L醋酸溶液（10%）中固定，轻轻摇荡30min；用1.5L双蒸水漂洗3次，每次2min；在1.5L新配的染色液中（0.1%AgNO3，2.25ml 37%甲醛），轻轻摇荡30min；用1.5L双蒸水漂洗，时间不超过10秒；在1.5L显影液中（显影液含无水Na₂CO₃ 45g，Na₂S₂O₃ 300μl，37%甲醛2.25ml。提前配制，4℃冰箱中预冷）轻轻摇荡，直至出现带纹；在1.5L 10%醋酸溶液中定影5min；用1.5L双蒸水漂洗5min；室温下自然晾干后采集图像并记录结果。

3）电泳条带分析

采用上海生物工程公司合成的SRAP引物，对中国对虾敏感组和耐受组各30个样本进行SRAP扩增分析。扩增产物的电泳图谱如图2和3所示，最后获得一个引物组合再扩增出耐受高pH特异SRAP片段序列。具体为：编号M2E4的引物组合（引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）在所有耐受组个体中扩增出一个480bp大小的特异片段，而在敏感组所有样本中未出现，因此将这类只在耐受组出现，而不在敏感组中出现的特异片段作为耐受高pH性状相关特异SRAP片段。

SEQ ID NO.1：5’-TGAGTCCAAACCGGAAT-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’。

4、特异SRAP标记的克隆测序

包括以下步骤：1）特异条带的回收；2）特异条带的克隆测序。

1）特异条带的回收

SRAP扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，用干净刀片切下耐受高pH性状相关特异条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收提取特异条带DNA，-20℃冷冻保存以备用。用此特异片段所对应的SRAP引物以及同样的PCR条件分别进行两次SRAP-PCR扩增。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离检测，确认目的片段大小后，在紫外灯照射下利用干净解剖刀片将特异片段从凝胶中切下，通过凝胶回收试剂盒（TianGen公司）回收特异片段DNA备用。

2）特异条带的克隆测序

将回收的特异片段连接到pMD18-T载体（TaKaRa公司）后，采用商用试剂盒的操作方法转化于感受态大肠杆菌TOP10细胞（TianGen公司），采用SRAP-PCR法（反应体系和反应程序同上）筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物长度，符合目的长度的样品即为阳性克隆。

选取阳性克隆样品，送至上海生物工程公司测序。共有序列同源性比对和相似性搜索采用NCBI上的BLAST软件进行，在GenBank中未找到高同源（均小于﹤10%）序列，说明这一序列为中国对虾的新序列，该特异DNA片段仅出现于耐受高pH的中国对虾样品中，而在对高pH敏感的中国对虾样品中不存在，因此该特异DNA片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：5）可作为中国对虾耐受高pH性状相关分子标记。

所述中国对虾耐受高pH相关分子标记可用于中国对虾耐受高pH性状的遗传鉴定，从而进行中国对虾新品种（系）的遗传选育。

5、转化为特异的SCAR标记

根据测序获得的特异片段序列，利用Primer Premier5.0软件设计特异引物，序列表如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，扩增目的条带大小为339bp。引物交由上海生工合成。将这些引物对重新采集自试验材料的基因组DNA进行PCR扩增，检验所获标记的特异性与稳定性。

引物1 SEQ ID NO.3序列：5’-GCTCCTTCGGCTTCA-3’

引物2 SEQ ID NO.4序列：5’-ATCAGGTCGTAATGC-3’。

PCR反应体系：总体积20μL，包含1.0U Taq酶，2.0mmol/L的Mg²⁺，40.0ng的模板DNA，0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物。

PCR反应程序：94℃预变性，5min；然后94℃变性0.5min，47.6℃，0.5min，72℃，1min，进行35个循环。72℃延伸5min，4℃保存。

扩增结果显示：该特异引物扩增后获得一条350bp左右的片段，经回收、测序、比对后发现与目的片段为同一序列。该特异条带在中国对虾高pH耐受组中出现频率为54.2%，而在高pH敏感组中均为出现，多态片段在敏感组和耐受组中出现明显差异，因此可作为中国对虾抗高pH性状选择的候选遗传标记。

（二）建立中国对虾耐受高pH性状的鉴定方法

1、取样及基因组DNA提取

采集中国对虾尾棘肌肉，按常规方法提取基因组DNA。

2、PCR反应：

选用设计的SCAR特异引物（引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4），对步骤1提取的待测样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系及扩增条件可采用市售的PCR试剂盒。

PCR反应体系：总体积20μL，包含1.0U Taq酶，2.0mmol/L的Mg²⁺，40.0ng的模板DNA，0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物。

PCR反应程序：94℃预变性，5min；然后94℃变性0.5min，47.6℃，0.5min，72℃，1min，进行35个循环。72℃延伸5min，4℃保存。

3、PCR扩增结果判读：根据每个样品的扩增结果来判断其是否耐受高pH：若扩增出339bp大小的特异片段，则说明待测样品为遗传上具有耐受高pH性状；如果没有扩增出特异长度大小的特异片段，则认为遗传上对高pH敏感，通过这种方法可实现中国对虾耐受高pH性状的遗传鉴定，为中国对虾抗逆新品种（系）的进一步遗传选育提供技术手段。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记及其鉴定方法

<160>  5     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

tgagtccaaa ccggaat                                          17

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

gactgcgtac gaatttga                                          18

<210>  3

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

gctccttcgg cttca                                             15

<210>  4

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

atcaggtcgt aatgc                                             15

<210>  5

<211>  480

<212>  DNA

<213>  Fenneropenaeus chinensis

<400>  5

atttgagtcc aaaccggagc tgtggctgct gctctgacta cggccaccaa ctggagcgcc   60

aagtccctgt cgtacatgtc aaggaactgt tcttaagaaa gaccctgtgg tgttcatcag    120

ctccttcggc ttcactgtgt tggcgtccgg cggagaggca tgtttgtgag gggcatcctt    180

cctcttcgga gggggcccca ggtttcccct tatggaagag agcagtcctt atcactttcg    240

acgaccccct ggcccctgag ggtcacattc actttcagta aacttcgtat aaaagtcctc    300

catgataata caaaccgtag taacaaatgc ataaatgcgt gttactatga aacctgcaaa    360

attacactag atattatgca tgttataagt gtgccaaact tcagttggta tattttttcc    420

cttgcattta taatggaccc tgtgcattac gacctgatat caaattcgta cgcagtcaat    480

SEQUENCE LISTING

 

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记及其鉴定方法

<160>  5    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

tgagtccaaa ccggaat                                          17

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

gactgcgtac gaatttga                                          18

 

<210>  3

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

gctccttcgg cttca                                             15

 

<210>  4

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

atcaggtcgt aatgc                                             15

 

<210>  5

<211>  480

<212>  DNA

<213>  Fenneropenaeus chinensis

<400>  5

atttgagtcc aaaccggagc tgtggctgct gctctgacta cggccaccaa ctggagcgcc   60

aagtccctgt cgtacatgtc aaggaactgt tcttaagaaa gaccctgtgg tgttcatcag    120

ctccttcggc ttcactgtgt tggcgtccgg cggagaggca tgtttgtgag gggcatcctt    180

cctcttcgga gggggcccca ggtttcccct tatggaagag agcagtcctt atcactttcg    240

acgaccccct ggcccctgag ggtcacattc actttcagta aacttcgtat aaaagtcctc    300

catgataata caaaccgtag taacaaatgc ataaatgcgt gttactatga aacctgcaaa    360

attacactag atattatgca tgttataagt gtgccaaact tcagttggta tattttttcc    420

cttgcattta taatggaccc tgtgcattac gacctgatat caaattcgta cgcagtcaat    480

Claims (7)

1.一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记，其特征在于扩增所述分子标记的SRAP特异引物为：

SEQ ID NO.1：5’-TGAGTCCAAACCGGAAT-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’。

3.根据权利要求1所述的一种中国对虾耐受高pH性状的分子标记，其特征在于扩增所述分子标记的SCAR特异引物为：

SEQ ID NO.3：5’-GCTCCTTCGGCTTCA-3’；

SEQ ID NO.4：5’-ATCAGGTCGTAATGC-3’。

4.一种中国对虾耐受高pH性状的鉴定方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1) 采集中国对虾尾棘肌肉，提取基因组DNA； 

(2) 选用SCAR特异引物，对步骤(1)提取的待测样品基因组DNA进行PCR扩增，所述SCAR特异引物为：

SEQ ID NO.3：5’-GCTCCTTCGGCTTCA-3’；

SEQ ID NO.4：5’-ATCAGGTCGTAATGC-3’；

(3) 将步骤(2)所得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，分析其电泳图谱，如扩增出339bp大小的特异片段，则说明待测样品遗传上具有耐受高pH性状；如没有扩增出特异长度大小的特异片段，则说明待测样品遗传上对高pH敏感。

5.根据权利要求4所述的一种中国对虾耐受高pH性状的鉴定方法，其特征在于所述步骤(1)中采用酚氯仿方法提取基因组DNA。

6.根据权利要求4所述的一种中国对虾耐受高pH性状的鉴定方法，其特征在于所述步骤(2)中的PCR反应体系为：总体积20μL，包含1.0U Taq酶，2.0mmol/L的Mg²⁺，40.0ng的模板DNA，0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物。

7.根据权利要求4所述的一种中国对虾耐受高pH性状的鉴定方法，其特征在于所述步骤(2)中的PCR反应程序为：94℃预变性，5min；然后94℃变性0.5min，47.6℃，0.5min，72℃，1min，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

Images