CN102140522A

CN102140522A - 一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法

Info

Publication number: CN102140522A
Application number: CN 201110028334
Authority: CN
Inventors: 王艳红; 胡超群; 任春华; 夏建军
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2011-08-03

Abstract

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及仿刺参的EST微卫星标记筛选开发和应用。本发明提供了一种仿刺参AjE101微卫星特异性DNA引物，一种利用上述引物的PCR反应体系以及一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法，包括先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用仿刺参AjE101微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物，然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对产物进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得仿刺参多态性遗传变异图谱。本发明主要应用于仿刺参种质资源和遗传多样性分析，分子群体遗传学，遗传图谱的构建，功能基因的研究。

Description

一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济种仿刺参(Apostichopus japonicus) 的EST (Express Sequence Tag，表达序列标签) 微卫星标记筛选开发和应用。

背景技术

仿刺参为刺参科仿刺参属的动物，俗名刺参。分布于北太平洋区、包括俄罗斯、日本、朝鲜半岛沿岸以及中国，常见于波流静稳、海草繁茂和无淡水注入的港湾内底质为岩礁或硬底。仿刺参是食用海参中品质最好，分布最广，产量最大的一种。在我国，仿刺参养殖业主要分布于辽宁、河北、山东、江苏等地等沿海地区。目前,仿刺参的研究大多是关于仿刺参常规育种、增养殖等领域,关于分子标记方面的研究比较少。开发遗传标记并用于遗传图谱构建、品种鉴定、遗传多样性等方面的研究无疑是解决仿刺参养殖过程中出现问题的一个有效途径之一。

随着仿刺参在分子生物学领域的研究工作不断深入，对仿刺参分子标记的需求也越来越多。遗传改良或品种培育是仿刺参养殖稳定发展的动力，许多研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力等生产性状密切相关，因此，开发仿刺参的分子遗传标记，检测仿刺参遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子标记辅助选育，对于仿刺参的育种和增养殖都具有十分重要的意义。

EST是指通过从cDNA文库中随机挑取的克隆, 进行大规模测序所获得的cDNA的5’或3’端序列，长度一般为150-500 bp。近年来大量快速增长的EST数据已成为SSR的重要来源，约有1％- 5％的EST含有SSR。与gSSR（基因组微卫星）标记相比，从EST序列中中获得EST-SSR标记更经济，更有特点；由于EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星标记会直接和功能基因相关，并有可能和一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱构建以及标记辅助选育都有很高的应用价值；同时，由于不同物种间基因共显性和保守性，从一种物种中开发的EST-SSR可能同时用于近缘的其他物种研究，从而为比较基因组学、同源基因克隆提供新的途径。因此，EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。利用EST微卫星标记，可能把仿刺参重要经济性状与之关联起来，达到分子标记辅助育种的目的，并可进一步进行仿刺参功能基因的研究。目前关于仿刺参EST微卫星标记的研究还很少。

发明内容

本发明的目的是为了简便快速的鉴定仿刺参AjE101遗传标记基因座位的遗传变异图谱，丰富现有的仿刺参微卫星标记，寻找更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记，提供了一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法。

本发明是通过以下方案实现的：

一种仿刺参AjE101微卫星特异性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2所示。

一种利用仿刺参AjE101微卫星特异性DNA引物的PCR反应体系，其特征在于所述的PCR体系为：10×PCR缓冲液：2.0μl；10mM的SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2引物对各：0.2-0.5μl；10mM dNTP：0.4-5μl；ddH₂O：14.6-15.9μl；5U/μl Taq酶：0.2-0.3μl；10ng仿刺参DNA：1-1.5μl。

一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤：先提取仿刺参基因组并稀释备用，再利用仿刺参AjE101微卫星DNA核心序列（AT）n 其中n=22-24，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；然后使用该引物对仿刺参不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测。利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得仿刺参在AjE101遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱（如图1所示）。

AjE101微卫星DNA序列的特异性引物核苷酸序列分别为：正链SEQ ID NO：1：5’-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3’，负链SEQ ID NO：2： 5’-ATGACAAGAAACGGGAGA-3’，退火温度为49-55℃。

其PCR反应加样参数：正反向引物各为0.2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 1.5-2.5 mM Mg²⁺, 0.6 U Taq酶，50-100 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul；使用该引物的时设置PCR程序参数为：94℃预变性2分钟；然后94℃变性30-40秒，45℃-60℃退火30秒，72℃延伸30秒-1分钟，重复此反应35个循环。

PCR产物的检测：基因组DNA模板进行PCR扩增，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，利用长度差异为50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker（上海生工）作为分子量标记，扩增产物用6%-8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳统进行检测，电压是8V/cm： PCR产物中加上变性Buffer 之后95℃变性5分钟，之后立刻置于冰上降温，使用微量进样器上样5ul，85 W 恒功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，约120 分钟，电泳完毕之后用EB（终浓度是0.5μg/ml）染色30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析多态性，确定各个个体的基因型，并进一步得到AjE101遗传标记基因座位的多态性图谱。

本发明适用于仿刺参种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群体遗传学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究，进一步用于辅助仿刺参分子遗传育种和养殖。

现有的仿刺参微卫星标记还不够丰富，建立仿刺参遗传连锁图谱，物理图谱，以及QTL定位需要更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）本发明可以简便快速的鉴定仿刺参AjE101微卫星遗传标记基因座位的遗传变异图谱，方法简便，所得结果可直观的检测出仿刺参每个个体的基因型。

（2）本发明的核心是AjE101微卫星DNA标记的特异性引物，其核苷酸序列为：正链5’-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3’，负链 5’-ATGACAAGAAACGGGAGA-3’，退火温度为49℃，可在仿刺参总群检测中呈现高度遗传变异的多态性。

（3）本发明主要应用于仿刺参种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群体遗传学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究。

附图说明

图1 本发明的AjE101微卫星DNA标记在24尾仿刺参个体中的基因型图谱。

具体实施方式

实施例1

1. 提取仿刺参的DNA

本实验所取的仿刺参材料是随机提取24个DNA样品，从冷冻的肌肉组织中提取DNA。剪取100mg肌肉组织，剪碎后置于0.7 ml的抽提缓冲液(6 M Urea（尿素），10 mM Tris-HCI．125 mM NaCI（氯化钠），1% SDS（十二烷基肌硫酸钠），10 mM EDTA（乙二胺四乙酸），pH=7.5) 中，加入终浓度为0.1 mg/ml 的蛋白酶K (20 mg/ml)，37℃消化一夜。用苯酚：氯仿(1：1) 抽提反应物三次，提取上清液用等体积的氯仿抽提一次。取上清液用异丙醇进行沉淀，然后溶解于500 1μl×TE (10 mM Tris.HCI，1 mM EDTA，pH =8.0) 中。用RNase (20 μ g/m1) 37℃ 处理DNA样品1小时，然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化用苯酚/氯仿抽提一次、氯仿抽提一次。然后提取上清液加入两倍体积的无水乙醇和十分之一倍体积的3M NaAc（醋酸钠）, 摇匀之后12000rpm离心收集DNA, 再用70％乙醇洗涤两次，待乙醇完全蒸发之后，加入50μl 1×TE于－20℃保存待用。

2. PCR扩增

PCR的反应条件是：50ng仿刺参基因组DNA，引物SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO： 2各1μΜ、0.2mMdNTP、1×PCR buffer、1.5mM的Mg2＋、0.5UTaq酶。PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30秒，Tm50℃退火30秒，72℃延伸1分钟，反应进行35个循环。4℃保存PCR产物。

3. 电泳检测

PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压是8V/cm,电泳完毕之后用EB（终浓度是0.5μg/ml）染色30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果（如图1所示）。

该试验结果说明AjE101是一个多态性丰富的标记可以用于群体遗传学的分析，并且特异性很好。

实施例2

微卫星位点的筛选及其多态标记的确定

1. 微卫星位点的来源和微卫星序列的筛选

从NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库搜集并下载（以FASTA格式）已有的EST序列，利用SSRhunter软件逐一查找分析所得的5736个序列，对2－6个碱基重复单元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离。采用软件DNAstar中的SeqMan对含有微卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。

2. 微卫星标记引物的设计

在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNAstar中的Primerselect设计引物；引物要求满足以下条件：（1）引物长度为17－25bp；（2）GC含量要求大于40％；（3）退火温度大于40℃；（4）预期的PCR产物长度为100－300bp。设计的引物为：正链5’-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3’，负链 5’-ATGACAAGAAACGGGAGA-3’。

3. 引物的优化

对AjE101 Tm值进行优化（50℃）。扩增反应分别用MJ-100 PCR仪，PCR程序为：94℃变性2分钟之后进入循环，94℃变性30或者40秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行35个循环。反应体系为20μl：其中含有正反向引物0.2μΜ、0.2mMdNTP (四种脱氧核苷酸的混合物)、1×PCR buffer、1.5 mM的Mg^2＋、0.6UTaq酶，模板量分别是50ng。模板是随机的5个仿刺参样本。扩增得到的产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳－银染检测，选取无或杂带少、特异性产物较高的PCR对应的温度作为最佳的退火温度，对应的最佳Mg^2＋的浓度是2.0mM。

10×PCR buffer含有100 mM Tris-HCL(三羟基甲基氨基甲烷—盐酸pH9.0),500 mM KCL (氯化钾pH9.0),1% Triton X-100（曲拉通X-100）

4. 微卫星位点的确定

AjE101用50℃和Mg^2＋ 2.0mM 选取20个个体检测这些微卫星标记的多态性。PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应进行35个循环。反应体系为20μl：其中含有正反向引物0.2μΜ、0.2mMdNTP、1×PCR buffer、1.5mM的Mg^2＋、Taq酶，模板量分别是100ng。PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺电泳，电压是1－8V/cm, 电泳完毕之后用EB (溴化乙锭，终浓度0.5μg/ml) 染色30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性，最后筛选出1个位点作为仿刺参微卫星标记，标记的具体信息如表一。

表一. 开发获得的1个仿刺参（Apostichopus japonicus）的EST-SSR标记

实施例3

微卫星位点的筛选及其多态标记的确定

1 微卫星位点的来源和微卫星序列的筛选

2微卫星标记引物的设计

3引物的优化

对AjE101 Tm值进行优化（50℃）。扩增反应分别用Bio-Rad 200 PCR仪，PCR程序为：94℃变性2分钟之后进入循环，94℃变性40秒，51℃退火30秒，72℃延伸1分钟，反应进行30个循环。反应体系为20μl：其中含有正反向引物0.2μΜ、0.2mMdNTP、1×PCR buffer、2.0 mM的Mg^2＋、0.5UTaq酶，模板量分别是100ng。模板是随机的5个仿刺参样本保存在95%的乙醇中，扩增得到的产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳－银染检测，选取无或杂带少、特异性产物较高的PCR对应的温度作为最佳的退火温度，对应的最佳Mg^2＋的浓度是2.0mM。

4 引物的应用

PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺电泳，电压是8V/cm, 电泳完毕之后用EB (溴化乙锭，终浓度0.5μg/ml) 染色30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性，最后筛选出1个位点作为仿刺参微卫星标记，标记的具体信息如表一。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagccgtttc atccttca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacaagaa acgggaga 18

Claims

1.一种仿刺参AjE101微卫星特异性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2所示。

2.一种利用如权利要求1所述DNA引物的PCR反应体系，其特征在于所述的PCR体系为：10×PCR缓冲液：2.0μl；10mM的SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2引物对各：0.2-0.5μl；10mM dNTP：0.4-5μl；ddH₂O：14.6-15.9μl；5U/μl Taq酶：0.2-0.3μl；10ng仿刺参DNA：1-1.5μl。

3.一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤：先提取仿刺参基因组并稀释备用，再利用仿刺参AjE101微卫星DNA核心序列（AT）n 其中n=22-24，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；然后使用该引物对仿刺参不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于其PCR反应加样参数为：正反向引物SEQ ID NO：1-2各为0.2 uM, 0.2 mM dNTP, 1×PCR 缓冲液, 1.5-2.5 mM Mg²⁺, 0.6 U Taq酶，50-100 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul；使用该引物的时设置PCR程序参数为：94℃预变性2分钟；然后94℃变性30-40秒，45℃-60℃退火30秒，72℃延伸30秒-1分钟，重复此反应35个循环。

5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于对PCR产物的检测：基因组DNA模板进行PCR扩增，其产物在6%~8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥后在扫描保存图片，分析多态性，得到各个个体的基因型，并进一步确定AjE101遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于在PCR产物的检测中利用长度差异为50 bp的DNA 梯型及PBR322 标记作为电泳的分子量标记；电泳的电压为1－8V/cm。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于PCR扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染系统进行检测： PCR产物中加上变性缓冲液之后95℃变性5分钟，之后立刻置于冰上降温，使用微量进样器上样5ul，85 W 恒功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，120 分钟后，用终浓度0.5μg/ml的溴化乙锭染色30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果。