CN117265088A - 一种仿刺参性别特异性分子标记及其筛选方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种仿刺参性别特异性分子标记及其筛选方法、应用。首次将基因组结构变异联合基因组覆盖度应用于仿刺参性别特异性分子标记的筛选，并提供基于该性别特异性分子标记鉴定仿刺参性别的方法。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的性别特异性分子标记可应用于生产及实验中仿刺参性别的鉴定，其效果具有准确性和高效性，经验证准确率达100％。本方法可在具有同形性染色体如仿刺参等物种的性别标记筛选和性别决定研究中得到广泛应用，试剂、技术要求简单，流程清晰，结果直观，预测准确；筛选性别标记速度快，可实现大批量处理，为仿刺参等具有同形性染色体的水产物种的性别鉴定、遗传育种工作奠定了基础。

Description

一种仿刺参性别特异性分子标记及其筛选方法、应用

技术领域

本发明涉及DNA分子标记技术领域，涉及水生生物性别特异性分子标记筛选及性别鉴定领域，具体涉及一种仿刺参性别特异性分子标记及其筛选方法、应用。

背景技术

仿刺参(学名：Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门海参纲，具有极高的经济价值，被誉为“参中之冠”。在海水养殖、良种繁育以及科学实验研究中均需要进行性别鉴定。仿刺参为雌雄异体，但通过表型观察无法对其性别进行准确的鉴定，并且仿刺参具有同形性染色体，在核型和基因序列等方面具有很高的相似性，很难简易地通过性染色体比较来区分性别。DNA分子标记是性别鉴定的重要工具，目前关于仿刺参性别特异性分子标记以及通过基因组结构变异(SV)联合基因组覆盖度(Coverage)筛选DNA分子标记的方法尚未报道，因此，若能提供一种可准确鉴定仿刺参性别的特异性分子标记，以及可以应用于具有同形性染色体的水生动物基于基因组结构变异(SV)联合基因组测序深度筛选性别特异性分子标记的可靠流程，对于推动仿刺参的育种工作将具有重要的意义。

目前对于性别特异性分子标记的筛选方法主要有三种：基于SNP密度鉴定性别、基于性别特异性遗传关联位点来识别性别连锁区域，基于基因组覆盖度(Coverage)鉴定性别。基于SNP密度的性别鉴定方法是根据两条性染色之间SNP密度的不同进行性别鉴定，如在XY型性染色体中，Y染色体中新分化的区域SNP密度应高于X染色体上对应的同源区域，Y染色体上退化的区域SNP密度应低于雌性基因组上对应的区域，该方法更适用于具有分化早期性染色体的物种。基于性别特异性遗传关联位点的性别鉴定方法：对基因组进行简化基因组测序(RAD-seq)，通过比较雌雄之间简化基因组测序标签来筛选性别特异性位点，如在XY型染色体中，RAD-seq标签在某些个体中没有而在另一些个体中有，这个位点就可以被列为Y特异性的候选位点。因此该方法也可在同形性染色中鉴定出性别特异性标签，但其遗传分型方法比较复杂，且存在缺失数据的情况，从而导致假阳性，无法准确的鉴定物种性别。基于基因组覆盖度(Coverage)鉴定性别的方法是利用雌雄之间性染色体倍数的差异进行性别鉴定。该方法只能找到性别存在差异的区域范围，无法进行准确定位。综上，现有的技术手段较难从具有同形性染色的仿刺参中筛选到准确率高的性别特异性分子标记，因此亟需开发仿刺参性别标记筛选的新方法，为仿刺参进行远缘杂交、编辑育种、种质管理等奠定坚实的基础。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种仿刺参性别特异性分子标记及其筛选方法和应用。

本发明技术方案如下：

本发明首先提供一种仿刺参性别特异性分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，本发明公开用于扩增所述仿刺参性别特异性分子标记的引物，上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

另一方面，本发明还提供一种仿刺参性别特异性分子标记的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)将雄性和雌性仿刺参样品进行基因组重测序，将获得的数据对比到参考基因组，去除重复，对基因组进行基因组结构变异(SV)以及基因组覆盖度(Coverage)的预测；

(2)对每个样本进行基因组结构变异(SV)的基因分型以及各位点覆盖深度的统计；

(3)统计所有雄性和雌性仿刺参特异的基因组结构变异(SV)和基因组覆盖深度差异，先通过基因组覆盖深度差异划定雌雄差异区域范围，进一步通过基因组结构变异(SV)进行准确定位，从而确定仿刺参雄性特异性分子标记。

进一步说明：基因组结构变异(SV)，包括删除、插入、重复、倒位和易位5种类型。基因组结构变异(SV)识别主要是将全基因组测序得到的序列reads与参考基因组进行比对，随后识别不和谐的特征或模式，这些特征或模式可以诊断出不同类别的基因组结构变异(SV)；基因组覆盖度(Coverage)，将clean reads与参考基因组进行mapping，统计出各位点的覆盖度差异，从而找出雌雄间的覆盖度差异位点。

优选的，在步骤(1)中，将获得的数据用BWA软件对比到参考基因组，获得对比结果。

优选的，所述对基因组进行基因组结构变异(SV)预测为：使用结构变异鉴定软件Delly、Manta、Smoove多款软件联合预测基因组结构变异(SV)，将每个样本预测的基因组结构变异(SV)文件进行合并；使用BAMStats检测基因组覆盖度(Coverage)。

进一步说明：Delly整合了短插入配对、长距离mate-pairs和分割读比对，以单核苷酸的分辨率准确地划分基因组重排，适合性染色体上性别特异性分子标记的识别，可以最大限度的检测到候选基因组结构变异(SV)；Manta识别各基因组中DEL变异、INS变异、INV变异、BND变异、DUP变异，可以快速检测基因组结构变异；Smoove是简化集成基因组结构变异检测与基因分型算法，可以识别各基因组中DEL变异、INS变异、INV变异、BND变异、DUP变异。受限于高通量测序数据读长与系统性测序误差的限制，采用单一结构变异检测工具识别各样本基因组中的结构变异往往存在敏感性与准确性较低的问题，采用多软件联合检测基因组结构变异(SV)将有效挖掘每个样本基因组中多种类型结构变异，解决只使用单一软件存在的问题。BAMStats是建立在Picard Java API上的简单软件工具，可以计算并以图形方式显示从SAM/BAM文件进行质量控制评估时得到的各种指标，为覆盖范围，起始位置，MAPQ值，映射的读取长度和编辑距离提供描述性统计信息。

优选的，所述对每个样本中基因组结构变异(SV)进行基因分型为：使用Delly软件根据合并后的基因组结构变异(SV)位点列表对每个样本进行基因分型；统计各位点的覆盖深度。

优选的，在步骤(3)中，使用Bcftools软件合并每个样本基因分型后的文件，统计分析找到基因组结构变异(SV)中性别特异性的分子标记；统计雄性覆盖度大于0，雌性等于0的位点。

优选的，本发明还提供了采用所述的筛选方法得到的仿刺参雄性特异性分子标记。

另一方面，本发明提供所述仿刺参性别特异性分子标记在仿刺参雌雄性别鉴定中的应用。

优选的，所述的应用包括以下步骤：

(1)合成用于扩增所述仿刺参性别特异性分子标记的引物对1，以及用于扩增雌雄共有分子标记的引物对2；所述引物对1的上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示；所述雌雄共有分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

(2)以仿刺参基因组DNA为模板，采用引物对1和引物对2进行PCR扩增，得扩增产物；

(3)对PCR扩增产物进行电泳检测；若扩增出269bp的条带和478bp的条带，则为雄性仿刺参个体；若扩增出269bp的条带但无478bp条带，则为雌性仿刺参个体。

与现有技术相比，本发明的有益成果在于：

本发明提供的性别特异性分子标记可应用于仿刺参性别鉴定，其效果具有准确性和高效性，经验证准确率达100％。

本发明首次将基因组结构变异(SV)联合基因组覆盖度(Coverage)应用于仿刺参性别特异性分子标记的筛选，该筛选流程可应用于具有同形性染色体的物种性别特异性分子标记的筛选。

附图说明

图1为本发明实施例对单核苷酸多态性(SNP)与基因组结构变异(SV)联合基因组覆盖度(Coverage)应用于仿刺参性别特异性分子标记筛选效力的比较。

图2为本发明实施例通过基因组结构变异(SV)联合基因组覆盖度(Coverage)筛选性别特异性分子标记的流程图。

图3为本发明实施例所提供的雄性特异性分子标记在仿刺参群体遗传性别鉴定的结果示意图，其中1-12为雄性个体，13-24为雌性个体，所有个体均能扩增出269bp的内参条带，所有雄性个体均能扩增出478bp的条带。M表示100bp DNA ladder。

图4为未区分性别的仿刺参的群体遗传性别鉴定结果示意图，共14只个体。其中1、2、4、5、6、8、9、10、13号个体能扩增出478bp条带的为雄性仿刺参个体，其他无478bp条带的个体为雌性仿刺参个体。

图5为未区分性别的仿刺参样本性腺组织学切片结果图，1、2、4、5、6、8、9、10、13号个体为精巢，3、7、11、12、14号个体为卵巢。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

以某一批次仿刺参为例，分别将雌性和雄性各30只仿刺参样品通过Illumina平台进行测序，获得数据，将数据使用BWA mem比对上参考基因组，获得比对结果。

将比对结果使用Samtools sort根据大小进行排序；排序后的结果使用Samtoolsfixmate为排序后的比对结果配对坐标后；再次使用Samtools sort根据坐标进行排序；接着使用Samtools markdup标记出重复的比对；为了便于快速访问使用Samtools index为bam文件创建索引。

根据参考基因组，对每一个仿刺参样本的bam文件使用Delly、Manta、Smoove多款软件联用预测去除重复后的基因组结构变异(SV)；研究的变异类型包括50bp-200bp片段的插入或缺失、串联重复、染色体倒位、染色体异位以及形式复杂的各种嵌合性变异等。使用Delly merge将每个仿刺参样本预测基因组结构变异(SV)得到的bcf文件合并到一起；根据合并后的基因组结构变异(SV)列表对每个仿刺参样本的基因组结构变异进行基因分型；根据参考基因组，使用BAMStats检测基因组覆盖度(Coverage)。

最后将进行基因分型后每个仿刺参样本得到的vcf文件使用Bcftools merge合并到一起，联合各位点覆盖深度，对最终结果进行统计分析，结果如图1所示。

发现一段只存在于仿刺参雄性个体的基因组结构变异(SV)，位于6号染色体。核苷酸序列为SEQ ID NO:1：

CCCCACACCGTTCAATTCAACAGCTACTTCACTCCATAAGGAGTGTAGCGAATTAGCTACGAGAGCCGCTTTATTTTGCGATTTGGTCTTAGTCGCTGCTGCAGTGGATATAGGTTGGTTATCGTTACGTACAAGTTTTGCCTTGACATATAACTCTATAGCTGTAATATCAATATATTGATCCCCTCTAGCAGGAAGAACAAATTGATAAGGTGTACTTTGTAGATTACCGTTAGGACTAATTCTATTAATTTCCTTAGCTACAATCCCTCCTTGAATAGGTGGAACACCGAACATACTCATGGAGCTTTTCGTCCACGCGCCCGGTACACCCGATAAAGTTGGGGCAGTTGCCATGTTTTAGAGGATATCTTTAAGTACCTTTTTTGCAAGACGCGCAGTAGTAGCCCGACGCTTATGTTTACGTTTTTTCCCAAGAGCTCCCCTGCCAGCGCGTCGTCGCCTTCTCAGACAAACC。

同时通过对雌性和雄性各30只仿刺参的全基因组重测序数据进行单核苷酸多态性(SNP)比对分析，结果如图1所示，仿刺参各染色体上的SNP在雌雄之间没有显著差异，无法根据SNP精确定位性别特异性分子标记。进一步证明了基因组结构变异(SV)联合基因组覆盖度(Coverage)方法的有效性和准确性。

验证试验1

为了进一步证明本发明筛选得到分子标记的准确性，将在仿刺参个体中筛选得到的分子标记应用到仿刺参性别鉴定中。

受检仿刺参样品取材：采集在养殖场排精排卵后区分性别的雄性、雌性仿刺参各12只。

DNA提取：采用经典的CTAB法提取仿刺参肌肉的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对所提的DNA进行质量检测。

引物合成：根据获得的雄性特异性片段设计雄性特异性引物对Aj-M(用于检测序列为SEQ ID NO:1的片段，结合雌雄共有分子标记(SEQ ID NO：4)设计引物对Ref。具体序列见下表：

PCR扩增：将采集的仿刺参样品提取的DNA与上述引物进行PCR扩增。反应体系为：DNA模板(50ng)1μL；上游引物(2μM)1μL；下游(2μM)1μL；PCR酶mix 10μL；灭菌水补至20μL。PCR反应程序为，1.95℃3min；2.95℃15s；3.51℃20s；4.72℃30s；2-4 30个循环；5.72℃10min；4℃保存PCR反应产物。

扩增结果检测及性别鉴定：配置1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳结构如图3所示：所有个体均能扩增出269bp的共有条带，能扩增出478bp条带的为雄性仿刺参个体，无478bp条带的个体为雌性仿刺参个体，成功区分仿刺参雌雄个体，对仿刺参性别鉴定的准确率达100％。

验证实验2

选取了14只未进行性别区分的仿刺参个体，对所述的雄性特异性分子标记鉴定仿刺参性别的有效性及普适性进行验证。

DNA提取：采用经典的CTAB法提取仿刺参肌肉的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对所提的DNA进行质量检测。

PCR扩增：利用引物对Aj-M和引物对Ref对上述14只仿刺参基因组进行扩增。扩增步骤参照验证实验1中记载的方法。

扩增结果检测及性别鉴定：配置1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳结构如图4所示：所有个体均能扩增出269bp的共有条带，1、2、4、5、6、8、9、10、13号个体能扩增出478bp条带的为雄性仿刺参个体，其他无478bp条带的个体为雌性仿刺参个体。

性腺组织学判定：将上述14只仿刺参性腺置于4％多聚甲醛中固定过夜，使用梯度甲醇进行脱水，二甲苯、石蜡透明透蜡，将组织进行石蜡包埋，使用切片机进行石蜡切片，用伊红/苏木精染色后，在显微镜下进行观察，判定仿刺参的性别。根据切片结果显示的生殖细胞类型，1、2、4、5、6、8、9、10、13号个体为精巢，3、7、11、12、14号个体为卵巢，与PCR结果一致，如图5所示。

本验证实验的仿刺参雄性特异性分子标记PCR结果与性腺组织学切片判定结果一致，证明基于基因组结构变异(SV)筛选得到的性别特异性分子标记可以成功鉴定具有同形性染色体如仿刺参等动物的性别鉴定，本发明提供的方法试剂、技术要求简单，流程清晰，结果直观，预测准确。

以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种仿刺参性别特异性分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.用于扩增权利要求1所述仿刺参性别特异性分子标记的引物，其特征在于，上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种仿刺参性别特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将雄性和雌性仿刺参样品进行基因组重测序，将获得的数据对比到参考基因组，去除重复，对基因组进行基因组结构变异及基因组覆盖度的预测；

(2)对每个样本进行基因组结构变异的基因分型以及各位点覆盖深度的统计；

(3)统计所有雄性和雌性仿刺参特异的基因组结构变异及雄性有且雌性没有的覆盖深度位点，分析确定仿刺参雄性特异的分子标记。

4.根据权利要求3所述的仿刺参性别特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，在步骤(1)中，将获得的数据用BWA软件对比到参考基因组，获得对比结果。

5.根据权利要求3所述的仿刺参性别特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，

所述对基因组进行基因组结构变异的预测为：使用结构变异鉴定软件Delly、Manta、Smoove多款软件联合检测基因组结构变异，将每个样本预测的基因组结构变异文件进行合并；对基因组覆盖度的预测为：使用BAMStats检测基因组覆盖度。

6.根据权利要求3所述的仿刺参性别特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，所述对每个样本中基因组结构变异进行基因分型为：使用Delly软件根据合并后的基因组结构变异位点列表对每个样本进行基因分型。

7.根据权利要求3所述的仿刺参性别特异性分子标记的筛选方法，其特征在于，在步骤(3)中，使用Bcftools软件合并每个样本基因分型后的文件，统计分析找到仿刺参中雄性特异的分子标记，即仿刺参中雄性特有的基因组结构变异片段；统计分析找到仿刺参中雄性覆盖度大于0，雌性覆盖度等于0的位点。

8.采用权利要求3至权利要求7任一项所述的筛选方法得到的仿刺参性别特异性分子标记。

9.权利要求1或权利要求8所述仿刺参性别特异性分子标记在仿刺参雌雄性别鉴定中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成用于扩增权利要求1所述仿刺参性别特异性分子标记的引物对1，以及用于扩增雌雄共有分子标记的引物对2；所述引物对1的上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示；所述雌雄共有分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

(2)以仿刺参基因组DNA为模板，采用引物对1和引物对2进行PCR扩增，得扩增产物；

(3)对PCR扩增产物进行电泳检测；若扩增出269bp的条带和478bp的条带，则为雄性仿刺参个体；若扩增出269bp的条带但无478bp条带，则为雌性仿刺参个体。