CN115820874A - 一种决定鸭白羽性状的转座子多态分子标记LTR/Gypsy及鉴定方法 - Google Patents

一种决定鸭白羽性状的转座子多态分子标记LTR/Gypsy及鉴定方法 Download PDF

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王克君
张晨曦
胡晓玉
曹然然
杜文苹
孙桂荣
田亚东
康相涛
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Abstract

本发明提供了一种决定鸭白羽性状的转座子多态分子标记LTR/Gypsy及其在鉴定鸭白羽性状或选育白羽鸭中的应用，所述分子标记位于鸭MITF基因的内含子区域，为插入型多态分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质在鉴定鸭白羽性状或选育白羽鸭中的应用，所述检测物质为扩增所述转座子多态分子标记的等位基因特异性引物，所述引物序列分别包含SEQ IDNO.2、3、4所示的DNA分子。本发明的优势在于：提供的转座子多态分子标记LTR/Gypsy多态性高、基因组分布广泛，采用等位基因特异性引物进行扩增，然后进行电泳检测分析，只需基因组模板，无需特殊设备，带型清晰，能够简单、快速、低成本、精确地检测其插入多态性，可在早期筛选出具有白羽性状的肉鸭，对于我国肉鸭养殖业具有重要意义。

Description

一种决定鸭白羽性状的转座子多态分子标记LTR/Gypsy及鉴 定方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种决定鸭白羽性状的转座子多态分子标记LTR/Gypsy和鉴定方法。
背景技术
我国是世界上最大的水禽生产国之一，遗传资源丰富，且种质特性各异。我国地方鸭羽色多样，而羽毛色素沉积能够影响消费者的消费行为,白羽性状在肉鸭消费市场往往能够获得较高的收益。因此筛选出白羽性状对于我国肉鸭养殖业而言具有重要意义。
MITF基因，全称为小眼畸形转录因子，被认为是成黑色素细胞发育过程中的关键调控基因，对黑色素细胞发育、增殖和存活以及调节相关酶和黑素体蛋白表达来确保黑色素产生具有重要作用。近年来，有研究通过比较北京鸭、家鸭和野鸭全基因组序列，发现北京鸭MITF基因外显子1M和第二外显子间特有的一个约6.6kb插入片段，有可能是导致北京鸭MITF-M转录本表达沉默的关键。
转座子插入多态(Transposon insertion polymorphism，TIP)揭示的是一个位点上的不同等位状态(即转座子的插入和缺失)，产生共显性标记。这种标记可以对特定位点有无转座子的插入进行检测，只需基因组为模板，不需要酶切、加接头等处理，利于自动化操作，特别适合大量样品的分析。可应用于畜禽的分子辅助育种以及遗传进化分析等方面的研究。
目前通常使用长片段PCR扩增的方法对转座子插入多态分子标记进行检测，但该方法扩增时间长且效率极低，对DNA模板及聚合酶的要求高，导致成本增加。为解决长片段PCR扩增的缺点，本发明采用等位基因特异性PCR技术对转座子插入多态分子标记进行检测。
发明内容
为了鉴定鸭白羽性状或选育白羽鸭，本发明提供如下技术方案：
本发明的目的在于提供一种决定鸭白羽性状的转座子多态分子标记LTR/Gypsy，所述分子标记位于鸭MITF基因的内含子区域，具体位置：鸭基因组chr1：5199184-5205876，为插入型多态分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为6693bp。
本发明还提供了如下应用：
本发明提供了检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质在鉴定鸭白羽性状中的应用；
或，本发明提供了检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质在制备鉴定鸭白羽性状产品中的应用；
或，本发明提供了检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质在选育白羽鸭中的应用；
在本发明的实施例中，所述检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质包括下述1)或2)：
1)扩增所述分子标记LTR/Gypsy的等位基因特异性引物；
2)含有所述引物的PCR试剂；
所述引物由如下引物A、引物B组成；
所述引物A由引物6057F和引物8388R组成；引物B由引物557F和引物8388R组成；引物6057F包含SEQ ID NO.3所示的DNA分子；引物557F包含SEQ ID NO.2所示的DNA分子；引物8388R包含SEQ ID NO.4所示的DNA分子。
本发明提供了一种鉴定待测鸭白羽性状的方法，包含如下步骤：检测待测鸭MITF基因内含子区域的转座子多态分子标记LTR/Gypsy，经电泳检测分析，判断基因型；基因型为II的待测鸭具有白羽性状。
本发明提供了一种选育白羽鸭的方法，包含如下步骤：检测待测鸭MITF基因内含子区域的转座子多态分子标记LTR/Gypsy，经电泳检测分析，判断基因型；选育基因型为II的待测鸭进行留种，得到白羽鸭。
在本发明的实施例中，所述检测待测鸭MITF基因内含子区域的转座子多态分子标记LTR/Gypsy的方法包含如下步骤：用由引物A、引物B组成的引物对待测鸭进行等位基因特异性扩增，然后进行电泳检测分析；
若引物A可扩增得到2332bp的电泳条带，引物B无扩增产物，则待测鸭基因型为II；
若引物A可扩增得到2332bp的电泳条带，引物B可扩增得到1139bp的电泳条带，则待测鸭基因型为IW；
若引物A无扩增产物，引物B可扩增得到1139bp的电泳条带，则待测鸭基因型为WW。
本发明还提供了转座子多态分子标记LTR/Gypsy在鉴定鸭白羽性状中的应用，利用检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质进行等位基因PCR扩增，经电泳检测分析，判断基因型，基因型为II的待测鸭具有白羽性状。
本发明还提供了转座子多态分子标记LTR/Gypsy在选育白羽鸭中的应用，利用检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质进行等位基因PCR扩增，经电泳检测分析，判断基因型，选育基因型为II的待测鸭进行留种，得到白羽鸭。
相对于现有技术，本发明的有益效果：
本发明提供的鸭MITF基因转座子多态分子标记LTR/Gypsy多态性高、基因组分布广泛，针对该转座子插入多态性，设计特定的等位基因特异性引物进行扩增，然后进行电泳检测分析，只需基因组模板，无需特殊设备，带型清晰，能够简单、快速、低成本、精确地进行检测，可在早期筛选出具有白羽性状的肉鸭，对于我国肉鸭养殖业具有重要意义。
附图说明
图1为MITF内含子区结构变异两种等位基因基因组测序reads结果比较；
图2为鸭MITF基因内含子区结构变异等位基因的分布；
图3为MITF内含子区结构变异等位基因特异性PCR检测结果；
图4为MITF基因结构变异PCR扩增条件；
图5为采用等位基因PCR检测MITF基因内含子区结构变异基因型分布。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明使用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
白羽鸭包含北京鸭、樱桃谷鸭、奥白星鸭；
非白羽鸭包含中国地方鸭(金定鸭、昆山麻鸭、娄门鸭、缙云麻鸭、沔阳麻鸭、荆江麻鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭和山麻鸭)、野鸭(绿头鸭和斑嘴鸭)。
实施例1——鸭基因组DNA的提取
收集上述14个品种鸭(绿头鸭、斑嘴鸭、金定鸭、昆山麻鸭、娄门鸭、缙云麻鸭、沔阳麻鸭、荆江麻鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、山麻鸭、樱桃谷鸭、奥白星鸭、北京鸭)的鸭群，翅静脉采血，血液放入抗凝管，利用常规的酚仿抽提法提取DNA，并稀释到60ng/ul，作为模板备用。
实施例2——鸭MITF基因内含子区转座子多态分子标记LTR/Gypsy的发现及其与鸭白羽性状的相关性
利用本实验室获得的鸭全基因组重测序数据，通过分析基因组深度和覆盖度的方法鉴定基因组结构变异。采用Fisher’s exact test和分化指数FST方法比较白羽鸭(北京鸭、樱桃谷鸭)与非白羽鸭(中国地方鸭、野鸭)的差异结构变异，其中最为显著的位点定位在鸭MITF基因的内含子区，经一代测序分析发现该结构变异属于转座子插入引起的结构变异，插入的序列5’和3’端各存在1289bp的LTR结构，具有明显的转座子特征。通过基因组测序数据reads比对情况可将该结构变异分为插入型和野生型(见图1)。通过分析该结构变异在白羽鸭品种和非白羽鸭品种的等位基因频率情况，发现插入型等位基因和缺失型等位基因在白羽鸭和非白羽鸭品种中存在差异，白羽鸭品种为100％插入型，非白羽鸭品种中野生型频率高达0.97(见图2)。
实施例3——通过长片段PCR鉴定MITF内含子区转座子多态分子标记LTR/Gypsy引起的两种等位基因
对上述14个不同羽色鸭品种MITF基因内含子区结构变异等位基因进行检测，通过长片段PCR扩增，一代桑格测序对该结构变异进行基因分型，共发现2个等位基因，插入型(I型)：在chr1：5199184-5205876存在插入，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，插入长度为6693bp，野生型(W型)在该位置不存在插入(见图1)。
长片段PCR采用如下表3所示的引物557F和8388R，扩增程序如下表1所示，反应体系如下表2所示。
表1为长片段PCR扩增程序
Figure BDA0003895474280000051
表2为长片段PCR扩增的反应体系
Figure BDA0003895474280000052
Figure BDA0003895474280000061
实施例4——采用等位基因PCR技术鉴定MITF内含子区转座子多态分子标记LTR/Gypsy引起的两种等位基因
针对该转座子插入序列，设计特定的等位基因特异性引物，即通过转座子插入两端侧翼区序列设计上下游引物扩增缺失型，在转座子序列上设计第三条引物配合两端的上游或下游引物扩增插入型，引物序列如表3。根据引物设计的物理位置和扩增组合，用由6057F和8388R引物组成的引物A鉴定I等位基因；用由557F和8388R引物组成的引物B鉴定W等位基因；可以得出W等位基因条带大小为1139bp,I等位基因条带大小为2332bp。WW基因型显示一条带为1139bp；IW基因型显示1139bp和2332bp两条带；II基因型显示2332bp一条带(图3)，等位基因特异性PCR扩增条件如图4所示，反应体系如表4所示。
表3为MITF基因结构变异PCR检测引物
引物名称 引物序列(5'--3') 序列名称
557F TCAACTGCTATCCTCTATCAGATTTCAA SEQ ID NO.2
6057F GTGAAGAGAGATGAGAGACACCGTTGG SEQ ID NO.3
8388R GATGTGCGTTGGGCTCGTAGG SEQ ID NO.4
表4为等位基因特异性PCR扩增的反应体系
成分 体积
PCR Mix 10ul
557F/6057F 0.5ul
8388R 0.5ul
DNA 1ul
ddH2O 8ul
总量 20ul
实施例5——采用等位基因PCR技术验证MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy与鸭白羽性状的相关性
以实施例1获得的基因组DNA为扩增模板，采用表3所示的等位基因特异性引物和表4所示的反应体系对上述14个品种鸭基因型进行分型检测，结果显示非白羽鸭品种中，例如家鸭野生祖先绿头鸭和斑嘴鸭，以及地方家鸭(金定鸭、昆山麻鸭、娄门鸭、缙云麻鸭、沔阳麻鸭、荆江麻鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭和山麻鸭)均表现为野生纯合基因型(WW)、插入/野生的杂合基因型(IW)；而白羽鸭品种中，樱桃谷鸭、奥白星鸭和北京鸭均为插入纯合基因型(II)，分布频率如图5所示。
实施例6——MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy及其检测物质的应用
一、MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy及其检测物质在鉴定鸭白羽性状中的应用
步骤1、收集待测鸭群，翅静脉采血，血液放入抗凝管，利用酚仿抽提法提取DNA，并稀释到60ng/ul，作为扩增模板，备用；
步骤2、采用等位基因PCR技术，以稀释的基因组DNA为模板，利用由引物A和引物B组成的引物检测MITF内含子区的转座子多态分子标记LTR/Gypsy，经电泳检测分析，
若引物A可扩增得到2332bp的电泳条带，引物B无扩增产物，则待测鸭基因型为II；
若引物A可扩增得到2332bp的电泳条带，引物B可扩增得到1139bp的电泳条带，则待测鸭基因型为IW；
若引物A无扩增产物，引物B可扩增得到1139bp的电泳条带，则待测鸭基因型为WW；
步骤3、根据基因判型结果，基因型为II的待测鸭具有白羽性状。
二、MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy及其检测物质在选育白羽鸭中的应用
步骤1、收集待测鸭群，翅静脉采血，血液放入抗凝管，利用酚仿抽提法提取DNA，并稀释到60ng/ul，作为扩增模板，备用；
步骤2、采用等位基因PCR技术，以稀释的基因组DNA为模板，利用由引物A和引物B组成的引物检测MITF内含子区的转座子多态分子标记LTR/Gypsy，经电泳检测分析，
若引物A可扩增得到2332bp的电泳条带，引物B无扩增产物，则待测鸭基因型为II；
若引物A可扩增得到2332bp的电泳条带，引物B可扩增得到1139bp的电泳条带，则待测鸭基因型为IW；
若引物A无扩增产物，引物B可扩增得到1139bp的电泳条带，则待测鸭基因型为WW；
步骤3、根据基因判型结果，结合育种程序选择，若选择白羽鸭，则选择基因型为II型的个体留种，从而选育鸭群的羽色性状。

Claims (10)

1.一种决定鸭白羽性状的转座子多态分子标记LTR/Gypsy，其特征在于：所述分子标记位于鸭MITF基因的内含子区域，为插入型多态分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质在鉴定鸭白羽性状中的应用，其特征在于：所述分子标记位于鸭基因组chr1：5199184-5205876，为插入型多态分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质在制备鉴定鸭白羽性状产品中的应用，其特征在于：所述分子标记位于鸭基因组chr1：5199184-5205876，为插入型多态分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质在选育白羽鸭中的应用，其特征在于：所述分子标记位于鸭基因组chr1：5199184-5205876，为插入型多态分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质包括下述1)或2)：
1)扩增所述分子标记LTR/Gypsy的等位基因特异性引物；
2)含有所述引物的PCR试剂；
所述引物由如下引物A、引物B组成；
所述引物A由引物6057F和引物8388R组成；引物B由引物557F和引物8388R组成；引物6057F包含SEQ ID NO.2所示的DNA分子；引物557F包含SEQ ID NO.3所示的DNA分子；引物8388R包含SEQ ID NO.4所示的DNA分子。
6.一种鉴定待测鸭白羽性状的方法，其特征在于，包含如下步骤：检测待测鸭MITF基因内含子区域的转座子多态分子标记LTR/Gypsy，经电泳检测分析，判断基因型；基因型为II的待测鸭具有白羽性状。
7.一种选育白羽鸭的方法，其特征在于，包含如下步骤：检测待测鸭MITF基因内含子区域的转座子多态分子标记LTR/Gypsy，经电泳检测分析，判断基因型；选育基因型为II的待测鸭进行留种，得到白羽鸭。
8.根据权利要求6-7任一所述的方法，其特征在于：所述检测待测鸭MITF基因内含子区域的转座子多态分子标记LTR/Gypsy的方法包含如下步骤：用权利要求5中所述引物对待测鸭进行等位基因特异性扩增，然后进行电泳检测分析；
若引物A可扩增得到2332bp的电泳条带，引物B无扩增产物，则待测鸭基因型为II；
若引物A可扩增得到2332bp的电泳条带，引物B可扩增得到1139bp的电泳条带，则待测鸭基因型为IW；
若引物A无扩增产物，引物B可扩增得到1139bp的电泳条带，则待测鸭基因型为WW。
9.权利要求1所述转座子多态分子标记LTR/Gypsy在鉴定鸭白羽性状中的应用，其特征在于，利用检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质进行等位基因PCR扩增，经电泳检测分析，判断基因型，基因型为II的待测鸭具有白羽性状。
10.权利要求1所述转座子多态分子标记LTR/Gypsy在选育白羽鸭中的应用，其特征在于，利用检测鸭MITF基因中转座子多态分子标记LTR/Gypsy的物质进行等位基因PCR扩增，经电泳检测分析，判断基因型，选育基因型为II的待测鸭进行留种，得到白羽鸭。
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